GENOVÉ TERAPIE GENOVÉ TERAPIE

15/03/2010
GENOVÉ TERAPIE
přístup léčby nebo prevence genově
podmíněných nemocí změnou exprese
genů člověka
GENOVÉ TERAPIE
• zatím ve většině případů pouze v experimentálním stádiu
• GENOVÁ TERAPIE SOMATICKÁ – genom nemocného je
pozměněn, ale změna není přenášená do další generace
• GENOVÁ TERAPIE ZÁRODEČNÁ
genom je změněn přímo ve vajíčku nebo
spermii a změna je přenášená do dalších
generací, zatím neprobíhá u člověka a
vyšších obratlovců
(celosvětové moratorium)
1
15/03/2010
GENOVÉ TERAPIE
a) změna v jednom genu
srpkovitá anémie
— jednobodové mutace, např
např..
b) multigenové poruchy — mutace ve více genech často se
uplatňuje i vliv prostředí, např
např.. srdeční poruchy,
cukrovka, nebo rakovina
c) mitochondriální poruchy — mutace v mitochondriální
etá , způsobují
působuj po
poruchy
uc y řady
ady o
orgánů
gá ů
DNA,, letální,
d) chromozomální abnormality — ztráta či zmnožení
celých či částí chromozomů, např.
např. Downův syndrom
GENOVÉ TERAPIE
In vivo
Ex vivo
2
15/03/2010
Metody
Metod
y doručení genu do tkáně
injekce čisté DNA přímo do nádoru injekční stříkačkou
genetické dělo DNA obalující zlaté partikule a vstřelená
do
epidermis – silné heliové dělo
(nepoužívá se pro nádory)
lipofekce DNA obalená do lipozomů
intravaskulárně, intratracheálně, perorálně)
a
dodána
do
tkáně
biologickými vektory
virálního původu
V současné době nejpoužívanější
nejefektivnější způsob terapie
a
metod
etody
y doručení genu do tkáně
VIRÁLNÍ VEKTORY:
virus,
oncoRETROVIRY (virus Rousova sarkomu kuřat,
Moloney murine leukaemia virus )
- jsou schopny atakovat pouze
y (neprochází kompaktní
dělící se buňky
jadernou membránou)
- napadají především T-lymfocyty
- pouze ex-vivo terapie a náhodná
integrace do hostitelského genomu
- maximální velikost transgenu do
7.5 kbp
- retroviry nezpůsobují lyzi buňky
3
15/03/2010
metod
etody
y doručení genu do tkáně
VIRÁLNÍ VEKTORY:
onco RETROVIRY
cis pozice: musí být přítomný na virionu
LTR long terminal repeats – potřebné
pro integraci do host.genomu a zároveň
funguje jako promotor
ψ – potřebný pro obalování genomové
RNA do virionů
selekční marker
trans pozice: jsou přítomné na jiné
DNA, např. již v genomu napadené
buňky: gag, pol, env – obalový protein, RT,
přenášeč přes sodíkovou pumpu host.buňky
5’ LTR ψ Packaging transgen Neor 3’ LTR
• balicí buňka je nakažená wild-typovým virem (pomocný retrovirus) a do
jejího genomu se zabudovávají geny pro infekčnost virové částice
• pak je do této buňky plasmidem přenesen konstrukt nesoucí virové balící
(packaging) úseky, transgen a selekční marker po integraci do genomu se
vyselektují
neomycinem
balící
buňky
produkující
viriony
jak
rekombinantního tak pomocného viru.
4
15/03/2010
metod
etody
y doručení genu do tkáně
VIRÁLNÍ VEKTORY:
onco RETROVIRY
PROBLÉM: pomocný virus soutěží s transgenním, což vede k poklesu
účinnosti
infekce sousedních hostitelských buněk pomocným virem může aktivovat
protoonkogeny
ŘEŠENÍ: nejdřív se vytvoří pomocné buňky, které
pomocným virem, který má inaktivován balící signál ψ
jsou
infikovány
linie těchto pomocných buněk je pak napadená rekombinantním retrovirem,
který má funkční balicí signál ψ
PRAXE: odebereme kostní dřeň pacienta, buňky kultivujeme in vitro,
provedeme jejich infekci,
infekci vyselektujeme stabilní linii produkující viriony
nesoucí transgen a intravenózně vneseme zpět do pacienta.
NEBEZPEČÍ: infekce sousedních hostitelských buněk pomocným virem
může aktivovat protoonkogen, tím že se zabuduje do jeho blízkosti a začne
ho přepisovat
transgenová virová DNA se zabuduje do genu pro nádorový supresor a
inaktivuje ho
metod
etody
y doručení genu do tkáně
VIRÁLNÍ VEKTORY:
LENTIVIRY
mohou nahradit klasické retroviry, jelikož jsou schopny infikovat a
integrovat svůj genom do nedělících buněk např. neurony, makrofágy,
hematopoetické kmenové buňky a buňky svalů a jater
• lentiviry také mohou vyvolat AIDS u člověka
• delece v LTR, není schopen produkovat infekční částice ale schopen
integrace
• kočičí lentivirus který neúčinkuje na člověka
FIV – feline immunodeficiency virus
Wang, G., et al.(1999). Feline immunodeficiency
virus vectors persistently transduce nondividing
airway epithelia and correct the cystic fibrosis
defect. J.Clin.Invest.104:55-62.
5
15/03/2010
metod
etody
y doručení genu do tkáně
VIRÁLNÍ VEKTORY:
ADENOVIRY
• dsDNA viry
• napadají všechny typy buněk
g j do genomu
g
hostitele
• virální DNA se neintegruje
• exprese je silná ale pouze dočasná (max. měsíc)
• způsobují silnou imunitní odpověď (exprese wild-type proteinů virové
částice)
• nová generace adenovektorů neobsahující přirozené geny
• nejsou vhodné pro léčbu nádorových buněk protože ty na ně nemají
receptory
metod
etody
y doručení genu do tkáně
VIRÁLNÍ VEKTORY:
Adeno Asociated viruses (AVV)
• dsDNA viry
• nikdy nespojovány s lidskými nemocemi
p
j všechny
y typy
ypy buněk
• napadají
• virální DNA se může integrovat do genomu hostitele na
specifickém místě (u člověka na konci 19tého
chromozomu)
AAV
• exprese je ale slabá a vektory mají malou kapacitu 4kb
• nezpůsobují silnou imunitní odpověď
Adenovirus
Retrovirus/Lentivirus
nahá DNA
6
15/03/2010
metod
etody
y doručení genu do tkáně
vektor
kapacita
snadnost
produkce
integrace
do
genomu
trvání
exprese
transdukce
nedělících
se buněk
existující
imunita
bezpečnost
přeno
s do
potom
stva
nevirální
bez
limitu
+++
zřídka
dočasná
++
ne
+++
ne
onkoretroviry
8 kb
++
ano
stabilní
-
ne
inserční
mutagenese
aktivace
onkogenů
může
lentiviry
8 kb
+
ano
stabilní
++
ne
inserční
mutagenese
aktivace
onkogenů
může
adenoviry
30 kb
+
ne
dočasná
+++
ano
hyperimunitní
odpověď
ne
adeno
asociated
virus
AAV
4.6 kb
+
možná
dlouhotrvající
++
slabá
+++
může
Herpes
viry
150 kb
+
ne
dočasná
++
ano
hyperimunitní
odpověď
ne
nemoci v současnosti léčené genovou terapií
př. ve fázi klinického testování
nemoc
defekt
těžká imunodeficience
(SCID)
cílové buňky
adenin deaminasa
hemofilie
krevní faktor VIII a IX
Cystická fibrosa
transmembránový regulátor CF
deficience na
alfa antitrypsin
rozedma plic
rakovina
Neurologické nemoci
Parkinson, Alzheimer
kardiovaskulární nemoci
infekční nemoci
AIDS, hepatitis B
nespecifické
degradace neuronů
arterosklerosa
četnost
buňky kostní dřeně
T-lymfocyty
játra, svaly
1/1.000.000
1/1.000.000 muži
plicní alveoly
1/2.500
plicní alveoly
1/3.500
mnoho
neurony v mozku
cevní endotel
1/4
1/250
½
T-lymfocyty, makrofágové b.
7
15/03/2010
http://www.wiley.co.uk/genetherapy/
clinical/
SCID severe combined imunodeficiency
těžká imunodeficience
•
•
•
•
•
Jedna z forem se projevuje nedostatkem aktivního enzymu
adenosine deaminasy (ADA)
adenosin se nepřeměňuje
p
j na inosin ale vzniká deoxyadenosin,
y
, který
ý
inhibuje metabolismus deoxyribonukleotidu
tato nedostatečnost způsobuje zpomalení dělení rychle se
poliferujících buněk jako jsou T-lymfocyty
výrazně zvýšená náchylnost k infekcím
bubble boy disease
8
15/03/2010
SCID severe combined imunodeficiency
těžká imunodeficience
•
•
•
od 80let se tato nemoc lečí transplantací kostní dřeně (neúspěšné)
1986 se začaly podávat injekce hovězí ADA stabilizované PEG
intramaskulárně (nutno podstupovat každé dva týdny, ADAGEN®), často
končilo hemofilií pacienta
1990 první pokus genové terapie na člověku 4leté dívce Ashanti DeSilva.
Její T-lymfocyty byly upraveny ex-vivo normálním ADA pomocí vektoru
odvozeného od MoMLV. (William Anderson, Michael Blaise, and Ken
Culver)
•nutno podstupovat každý rok, životnost transformovaných
T-leukocytů (6-12 měsíců). Dívka stále žije.
• u dalších pacientů, kombinovaná léčba s
ADAGENem
• 2002 -5 chlapců s vážnější X-vázanou SCID
podstoupilo genovou terapií ex-vivo, u
čtyřech se do roka stav výrazně zlepšil, u
dvou z nich bohužel propukla leukémie.
• pokusy pozastaveny a zdokonaluje se
metodika, transgen se zabudovává do
genomu T-leukocytu s oblibou do blízkosti
onkogenu.
PG1
Cystická fibróza
• mutace v iontovém přenašeči CFTR transmembrane
conductance regulator
• nejvíce postihuje plicní alveoly, střevní epitel a pankreas –
zvýšena produkce hlenu, citlivost k plicním infekcím.
• výhodou
h d
pro terapii je že stačí pouze několik
k l k molekul
l k l
proteinu na buňku aby se jí vrátila normální funkčnost.
• úspěšné
pokusy
v
kulturách
a
na
myších
transformovaných pomocí liposomů
• u lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru
nesoucího transgen CFTR do nosu, účinné v plicích,
nepůsobí na slinivku
9
Snímek 18
PG1
he CFTR is found in the epithelial cells of many organs including the lung, liver, pancreas, digestive
tract, reproductive tract, and skin. Normally, the protein moves chloride ions (with a negative charge)
out of an epithelial cell to the covering mucus. This results in an electrical gradient being formed and
in the movement of (positively charged) sodium ions in the same direction as the chloride via a
paracellular pathway. Due to this movement, the water potential of the mucus is reduced, resulting
in the movement of water here by osmosis and a more fluid mucus.
Petr Galuszka; 29/04/2009
15/03/2010
nemoci v současnosti léčené genovou terapií
2003 – asi 330 povolených protokolů (přes 6.OOO pacientů)
Dědičné monogenické nemoci
ADA deficience, Alpha-1 antitrypsin deficience, OTC deficience, chronic
granulomatous
disease,
hemofilie,
cystická
fibróza,
vrozená
hypercholesterolemie, Fanconiho anemie, Gaucherova choroba,
Hunterův syndrom, Parkinsonova nemoc
infekční nemoci
HIV
získané nemoci
artritida
ostatní
rakovina 70% všech protokolů
kardiovaskulární nemoci
rizika
1999 první případ zbytečného úmrtí po genové terapii
geneticky podmíněná nemoc: deficience ornitin transkarbamylasy
močovinový cyklus: odbourávání amoniaku
klasická léčba: dieta na proteiny s
nízkým obsahem aminokyselin
bohatých na dusík + dodatečně
podávaný citrulin
mortalita 50%
pacienti se dožívají pokročilého
věku
k
19-letý pacient zemřel po genové
terapii provedené adenovirovým
vektorem
10
15/03/2010
PG2
Alzheimerova choroba
• 2001 jako transgen použit NGF – nerve growth
factor z myši (zvyšuje vitalitu neuronů)
• z pacientů byly odebrány fibroblasty, ex vivo
infikovány AAV nesoucí NGF
• fibroblasty z pokožky lze snadno transformovat
a nemají tendenci se nekontrolovatelně množit v
systému neuronů, kde mají nedostatek místa
• neurochirurgicky pak byly voperovány do
buněk cholinergického systému (jeho buňky
produkují acetylcholin – neurotransmiter)
• u pacientů demence zpomalena o 50%, jeden
zemřel při pokusu provést operaci bez narkózy
• efekt není dlouhotrvající, připravuje se virem
zprostředkovaná
dk
terapie
i
Dr. Mark Tuszynski
Alzheimerova choroba
příčiny: Dr. Karen Asheo (2006)
•nadměrná aktivita genu APP amyloid precursor protein
•transgenní myši s tímto lidským genem – výrazně zhoršená paměť již ve
středním
tř d í věku
ěk
•produktem enzymu APP je beta-amyloid (peptid cca 40 ak)
•nadměrná aktivita genu APP již kolem 30 roku věku člověka vytváří shluky
beta amyloidů (dodekamery), které se hromadí mezi neuronovými spoji
(synapse)
•projevuje
p j
j se jjako vynecháy
vání paměti, v pokročilém
věku Alzheimerova choroba
11
Snímek 21
PG2
v roce 2008 přimá in vivo injekce AAV with NGF do mozku
Petr Galuszka; 29/04/2009
15/03/2010
genetický základ rakoviny
PROTOONKOGEN – strukturní gen kódující protein podílející se na dělení
buňky (značka: c-onc)
typy:
geny kódující růstové faktory (např. cytokiny) (c-sis)
geny
g
y kódující
j receptory
p y růstových
ý
faktorů ((c-erbB-1))
geny kódující G-proteiny (přenašeče extracelulárních signálů, c-ras)
geny kódující proteinové kinasy (c-src, onkogen Rousova sarkomu)
geny kódující transkripční faktory (c-fos, c-jun)
aktivace na ONKOGENY:
mutací
p
)
zmnožením ((zesílení exprese)
translokací (nejčastěji mezi chromozomy 8 a 14)
retrovirální transdukce (přenesením z virového genomu)
onkogeny nejsou dědičné, s výjimkou jednoho RET –onkogen, odpovědný za
medulární karcinom štítné žlázy
genetický základ rakoviny
NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny)
• kódují proteiny, které v somatických buňkách potlačují jejích proliferaci a
udržují je v G0 fázi.
• nejznámější p53 protein kódovaný TP53 genem, aktivuje inhibitor CDK
• přirozeně se v buňkách výrazně zvyšuje jeho exprese po radiaci či působení
dalších karcinogenních látek, nazýván také jako „strážce genomu“
• mutací ztrácí aktivitu a buňky se začnou dělit i během UV radiace a genom
mutuje.
• mutované supresorové geny se většinou
dědí, jejich projev je recesivní, u potomku
nesoucí jednu zmutovanou alelu je daleko
větší pravděpodobnost že jim zmutuje i
druhá a p53 přestane být funkční.
Mutantní formy supresorových genů
vznikají
v
zárodečných
buňkách.
(tzv.PREDISPOZICE K RAKOVINĚ)
• mutace TP53 genu je zodpovědná za 70%
všech nádorů tlustého střeva, 50% nádorů
plic a 40% nádorů prsu.
12
15/03/2010
genetický základ rakoviny
NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny)
• 2002 připravená myš overexprimující p53 protein (předpokládalo se že
myš bude odolná vůči rakovině)
+ myš byla čtyřikrát odolnější k rakovině než kontrola
-
zkrácený životní cyklus o 20%
měknutí kostí, rozpad orgánů, zvýšená náchylnost k psychickému
stresu, vypadávaní srsti
předpoklad: hyperaktivita p53 „vysaje“ z těla všechny kmenové
buňky dříve než u kontrolní myši
PG3
genetický základ rakoviny
NÁDOROVÉ SUPRESOROVÉ GENY (antionkogeny)
• kódují
j p
proteiny,
y, které v somatických
ý
buňkách p
potlačují
j jjejích
j
proliferaci a
p
udržují je v G0 fázi.
• pRB protein – pojmenován podle toho že byl objeven v souvislosti s
dětským retinoblastomem
• blokuje buněčný cyklus tím, že inhibuje transkripční faktor E2F
• E2F aktivuje všechny geny, které jsou aktivní v S-fázi
• mutace v pRB proteinu byla prokázána u 4O% typů nádoru u člověka
13
Snímek 26
PG3
roteiny patřící do p16 rodiny inhibují především aktivitu komplexů cdk4 a cdk6 s cykliny D, které se
podílejí na fosforylaci nádorového supresoru Rb (protein retinoblastomu). Fosforylace proteinu Rb je
kritickým krokem při regulaci jeho antionkogenního účinku a buňky, které jsou zablokovány v G1 fázi
buněčného cyklu, se vyznačují přítomností hypofosforylované formy tohoto proteinu. Tato forma
proteinu Rb tvoří komplexy s celou řadou pozitivních transkripčních faktorů jako jsou proteiny rodiny
E2F, kontroluje jejich funkci, brání transkripci DNA a tím vyvolává zastavení buněčného cyklu v G1/S
kontrolním bodě. Je-li protein Rb hyperfosforylován, jsou transkripční faktory E2F z tohoto komplexu
uvolněny a je umožněno započetí transkripce a další průběh buněčného cyklu
Petr Galuszka; 29/04/2009
15/03/2010
genetický základ rakoviny
obecně lze tvrdit, že většina rakoviny je způsobená poruchou funkce
protein kinas podílejících se na regulaci buněčného cyklu
inhibitory různých typu kinas jsou nejčastěji používaná kancerostatika
•
•
•
•
•
látky extrahované ze sójí genistein a daidzein
kurkumin
tokoferol sukcinát (vitamín E)
beta-karoten
antioxidanty
y – selen, resveratrol ze zeleného čaje
j inhibují
j oxidanty,
y
které aktivují regulační centra protein kinas typu C
genetický základ rakoviny
ONKOGENNÍ VIRY
inzerční aktivace protoonkogenu (pouze u zvířat)
DNA přepsaná z retroviru se začlení před protoonkogen a začne jej svým
silným promotorem přepisovat
transdukce akutně transformujícími retroviry (pouze u zvířat)
• virový genom se integruje do blízkosti protoonkogenu
• integrovaný genom se přepisuje do primárního transkriptu ohraničeného
LTR sekvenci, může však vznikat i delší primární transkript nesoucí exony
protoonkogenu
• oba transkripty se sbalí do stejného virionu
g
rekombinaci během RT p
při napadení
p
host.buňky
y
• dochází k nelegitimní
LTR
gag
pol
env
LTR
LTR
gag
pol
env
LTR
LTR
gag
v-onc
pol
v-onc
LTR
14
15/03/2010
genetický základ rakoviny
ONKOGENNÍ VIRY
• tento nově vzniklý rekombinatní virus je defektní v replikaci, je schopen
infikovat další hostitelské buňky pouze v přítomnosti pomocného viru
• protoonkogen prodělává během replikace viru spoustu mutací až zmutuje
v onkogen
př. virus Rousova sarkomu kuřat (RSV)
virus ptačí myeloblastózy (AMV)
Moloneyův virus myší leukemie (MVML)
karcinogeneze navozena virovými geny (adenoviry)
• některé DNA viry obsahují geny jejíchž produkty narušují regulaci
buněčného dělení - aktivace S fáze
• proteiny většinou zesilují funkci transkripčních faktorů nebo vytěsňují
regulační proteiny buněčného cyklu
• SV40 opičí virus
• nebylo prokázáno vyvolání rakoviny těmito typy virů u člověka
PG2 PG1
genetický základ rakoviny
viry způsobující rakovinu u lidí nesou informaci pro onkogen
asi 20% veškerých karcinogenních onemocnění je způsobeno viry
T-leukémie (HTLV virus – onco retrovirus)
• infekce probíhá během porodu nebo kojení
• mezii dospělými
d
ělý i se přenáší
ř áší sex.stykem
t k
z muže
ž na žženu
• virus potřebuje dlouhé latentní období (30 let)
• největší výskyt Japonsko, Karibská oblast a střední Východ (asi
každý 500 člověk infikován)
• nemoc propuká pouze u 1% infikovaných
• v Evropě kolem 10 infikovaných jedinců na 100.000 obyvatel
• retrovirus, kromě pol gag a env genů nese informaci pro proteiny
p40tax a p21rex, ty mohou transaktivovat protoonkogeny, nebo
některé
ěkt é d
další
lší regulační
l č í proteiny
t i
čl
člověka
ěk
virus hepatitidy B (HBV) - hepadnavir
- způsobuje akutní infekce
- v chronické podobě mohou přecházet v nádor jater (hepatom)
spojený s cirhózou
- na světě v současné době napadeno cca čtvrt miliardy lidí
endemické oblasti – hlavní příčina úmrtnosti (1/4 miliónu ročně)
15
Snímek 30
PG1
Včasné očkování proti hepatitidě B může zabránit rakovině jater. Chronická žloutenka typu B je totiž v
60-82 % případů příčinou jejího vzniku. Jako ochranu před rakovinou ho doporučují odborní lékaři i
nový Evropský kodex proti rakovině, kde je zahrnuto mezi deset nejdůležitějších bodů preventivní
ochrany.
galuszka; 30/04/2009
PG2
Genom
HBV patří mezi nejmenší DNA viry (obsahuje zhruba 3200 párů bazí) s cirkulární dsDNA. Díky
omezené genetické výbavě kóduje jen několik proteinů: Nukleokapsidový protein (HBsAg), který je
nezbytný pro sestavování virionu a tvoří složku nukleokapsidy. Dále je kódován rozpustný antigen
HbeAg, který je uvolňován z buňky a koluje ve vysokém titru v séru. Tento antigen potlačuje imunitní
reakci vůči viru. Genom viru umožňuje vytvářet rovněž tři obalové proteiny, všechny glykosylované.
Jsou podstatou povrchového antigenu HBsAg a označují se S, M a L protein. Z proteinů S a M jsou
tvořeny malé kulovité a vláknité částice, kterých je v infikované buňce stokrát více než kompletních
virionů a které ve významném množství kolují v krvi. M a L proteiny jsou významné pro přilnutí
virionu k hepatocytu. Nestrukturální proteiny HBV jsou dva: Pol protein (virová polymerasa) a HBx
protein vyvolávající transkripci v buňěčném jádře a replikaci HBV.
Antigenní struktura
Povrchový protein S nese tři antigenní determinanty: antigen „a“, další se vyskytuje ve specifitě „d“
nebo „y“ a poslední „w“ nebo „r“. Kombinací těchto determinant můžeme dostat devět subtypů HBV.
Určitý subtyp je typický pro narkomany, jiný pro homosexuály.
Množení viru
Replikace HBV začíná vazbou virionu na receptor hepatocytu. Uvolní se DNA viru a ta se dostává k
jádru buňky, působí jako virový minichromosom. Ten je přepisován do čtyř sad různě velkých molekul
RNA, z nich pak translací vznikají virové proteiny. Největší z těchto molekul je pregenomová RNA (pg
RNA), slouží jako matrice pro reversní transkripci virového genomu. Virus tedy sice patří mezi DNA
viry, ale ale replikuje svůj genom reversní transkripcií pgRNA. Na rozdíl od retrovirů se ale pro vznik
produktivní infekce nemusí integrovat do buněčného genomu. Protože se tedy při replikaci HBV
přepisuje virová DNA do RNA a ta zpět do DNA, vznikají tak logicky mutace s větší pravděpodobností.
Známý je tzv. precore mutant, který má potlačenou tvorbu HbeAg a je podstatně virulentnější,
protože je rezistentní k interferinu. Často odpovídá za fulminantní průběh infekce. Mutací může být
rovněž postižena „a“ determinanta. Rezistentní mutanty vznikají při terapii lamivudinem.
Onkogenita HBV
Chronická infekce HBV vede k jaterní cirhóze a následně k hepatocelulárnímu karcinomu. Většina
nádorů obsahuje virovou DNA, přičemž integrace HBV DNA předchází nádorovému množení buněk.
Pravděpodobně proteiny HBV nemají onkogenní účinek. Riziko spíše představuje situace, kdy
regenerují hepatocyty po infekci a to zvyšuje riziko vzniku nádorové buňky.
galuszka; 30/04/2009
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny
využití onkoretrovirálních vektorů
doručení nemutovaného
supresorového genu p53
doručení konstruktu zajišťující
zastavení exprese onkogenu
(antisense konstrukt)
principy genové terapie rakoviny
doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin
16
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny
SEBEVRAŽEDNÉ GENY
principy genové terapie rakoviny
SEBEVRAŽEDNÉ GENY
gangcyklovir ------------hsv-tk---------→ gangcyklovir trifosfát
(analog dTTP blokuje syntézu DNA)
17
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny
DALŠÍ SEBEVRAŽEDNÉ GENY
transgen kóduje pro-drug
jed
mechanismus
cytosin deaminasa
5-fluorocytosin
5-fluorouracyl
antagonista pyrimidinu, blokuje
RNA a DNA syntézu
nitroreduktasa
nitrobenzyloxykar
bonylantracyklin
antracyklin
DNA crosslinker
karboxyl esterasa
CPT-11
SN38
inhibitor topoisomerasy
cytochrom P450
cyklofosfoamid
fosfoamid
DNA alkylační činidlo
linamarasa
amygdalin
kyanid
blokátor dýchacího řetězce
kondiční exprese sebevražedného genu pod specifickým promotorem
aktivním pouze v rychle se dělících nádorových buňkách (např. promotor
erbB-3 genu způsobující ptačí erytroblastózu)
principy genové terapie rakoviny
ONKOLYTICKÉ VIRY
18
15/03/2010
principy genové terapie rakoviny
ONKOLYTICKÉ VIRY
• nádorové buňky jsou cíleně ničeny lytickými viry
• 1956 bylo pozorováno že nádor ustupuje po virové infekci
• první klinicky testovaný virus byl defektní herpesvirus G207, který měl
d f k í vlastní
defektní
l
í ribonukleotid
ib
kl id reduktasu
d k
a mohl
hl se tudíž
díž replikovat
lik
pouze
v dělících se buňkách, měl deleci také v genu způsobující virulenci
ICP35.4 a tím byl oslaben a proto bezpečný
• proběhla I a II fáze klinického testování
• adenoviry aby se mohli množit v buňkách potřebují blokovat p53 protein
(ten je nepřítomný v nádorových buňkách)
• adenovirus ONYX-015 má deletovaný gen pro protein, který blokuje p53
• tento adenovirus proto nemůže atakovat zdravé buňky ale pouze nádorové
• v klinických testech zatím ne moc účinné
HLAVNÍ PROBLÉM: imunitní systém člověka okamžitě virus ničí, proto
málo účinné
principy genové terapie rakoviny
HIV může sloužit pro léčbu rakoviny (2005)
• HIV virus byl mutován byl mu odebrán gen způsobující propuknutí AIDS
• do genomu HIV byl naklonován sebevražedný gen (např. hsvTK)
• gen pro plášťový protein HIV byl nahrazen genem pro plášťový protein
Sindbis viru (hmyzí virus), který specificky rozpoznává P-glykoproteiny na
povrchu buněk
• většina
nádorových
buněk
obsahuje na povrchu právě Pglykoproteiny
• dál přidali gen pro luciferasu
aby mohli infekci sledovat
• testování
á í na myši
ši napadené
d é
buňkami
metastázujícího
melanomu,
které
byly
naklonovány tak aby nesly na
povrchu
lidské
Pglykoproteiny.
19
15/03/2010
genová terapie rakoviny plic a vaječníku
•
•
•
•
první klinické testy (1999) – 19 pacientů v pokročilém stádiu
intratumorálně dostávali injekci nemutovaného genu pro p53 v
adenovirálním vektoru (3 dávky během měsíce), současně byla
prováděna terapie ozařováním
výsledek:
2 pacienti zemřeli během pokusu
u 10 pacientů nemoc postoupila do pokročilejšího stádia
1 zůstal ve stejném stavu
u 4 došlo k mírnému zlepšení
u 2 došlo k výraznému zlepšení
totéž u 25 pacientek v pokročilém stádiu rakoviny vaječníku (2001),
(2001)
7 přežilo terapii
genová terapie AIDS
HIV virus – lentivirus ze skupiny retrovirů
ssRNA – 9.8 kbp
gag, pol, env – proteiny společné pro všechny
retroviry
tat, rev, vpu, vif, nef, vpr – specifické
regulační proteiny HIV viru
20
15/03/2010
genová terapie AIDS
existuje několik postupů genové terapie, které jsou v první fázi klinického
testování
1.antisense RNA proti genu CRR5 receptoru, který váže HIV virus a
1.antisense
umožňuje mu vstup do buňky T
T-lymfocytu.
lymfocytu. Byly vytvořeny CD4
CD4+ (typ T
Tlymfocytu) odolné vůči infekci HIV, kterým byl vnesen antisense
konstrukt pomocí lentiviru – 5 dobrovolníkům v pokročilém stadiu AIDS
byly vstřiknuty tyto buňky
genová terapie AIDS
2. terapie pomocí ribozymu
RIBOZYM – je malá molekula RNA s katalytickou funkcí
byl vytvořen ribozym specifický vůči tat
genu HIV viru
• vzhledem k velmi rychlým a častým
mutacím mezi jednotlivými variantami HIV
viru musí být vybrána velmi konservativní
sekvence
• pro
doručení
byl
použit
MoMVL
retrovirální systém
• I fáze klinického testování 2003-4
21