úvodem varia

M. Červenková, P. Kušnierová,
Š. Štěpánková,
1. Abstrakt
Práce je věnována problematice matrixových
metaloproteináz se zaměřením na matrixové metaloproteinázy 2, 3, 9 a asymetrického
dimethylargininu, metodám stanovení těchto
enzymů a jejich metabolitů a stanovení jejich referenčních intervalů. Matrixové metaloproteinázy
jsou proteolytické enzymy podílející se na štěpení
bílkovin extracelulární matrix. Jejich význam je
možné spatřovat např. při regeneraci tkání, hojení, zánětu. Asymetrický dimethylarginin vzniká
při metabolizaci bílkovin z argininu působením
enzymů methyltransferáz. Přirozeně se vyskytuje v lidském organismu a významně brání
tvorbě oxidu dusnatého. Volba těchto enzymů
a jejich metabolitů vychází z jejich provázanosti
s kardiovaskulárními onemocněními, stenózami
a in stent restenózami. V případě matrixových
metaloproteináz spočívá konkrétní vazba v tom,
že zvýšená aktivita právě těchto enzymů a jejich
metabolitů byla prokázána uvnitř aterosklerotických plátů v porovnání s hodnotami matrixových
metaloproteináz u normální arteriální stěny.
Rovněž mechanické poškození koronární artérie
vyvolává expresi matrixových metaloproteináz
a zvyšuje jejich aktivitu. Pokud se jedná o asymetrický dimethylarginin, ten prostřednictvím
nitroxidsyntázy ovlivňuje nejen reaktivitu, ale
taktéž strukturu cév. Po poškození endotelu se
zvyšuje intracelulární koncentrace asymetrického dimethylargininu v buňkách překrývajících
defekt, čímž se snižuje také vazodilatační schopnost těchto buněk. Stupeň poškození endotelové
funkce a intracelulární koncentrace asymetrického dimethylargininu přímo souvisí s tloušťkou
intimy postižené cévy. Zvyšující se koncentrace
asymetrického dimethylargininu odráží zvyšující
se riziko aterosklerózy.
2. Teoretická část
2.1 Metaloproteinázy
Matrixové metaloproteinázy (MMPs) jsou zinek
dependentní enzymy patřící do skupiny proteáz.
Jsou secernovány buňkami v neaktivní formě, teprve
proteolytickým procesem dochází k jejich aktivaci.
Jejich schopnost spočívá v proteolytickém štěpení
téměř všech složek extracelulární matrix (ECM).
Účastní se v podstatě všech biologických procesů,
při kterých dochází k degradaci a remodelaci ECM.
Může se jednat jak o procesy fyziologické (hojení
ran, angiogeneze a další), tak také procesy patologické (kardiovaskulární onemocnění, nádorová
onemocnění a další) [1-4].
Z obecného úhlu pohledu mají MMPs schopnost
zcela rozkládat kolagen i většinu ostatních komponent ECM, modifikují rozpustné proteiny, cytokiny,
chemokiny a taktéž zajišťují fyziologickou remodelaci ECM [5-8]. Účastní se řady fyziologických procesů, při nichž dochází k degradaci pojivové tkáně,
také procesů zánětlivých, degenerativních a maligních spojených se zvýšenou syntézou, degradací
nebo porušenou maturací a organizací ECM [8].
Význam MMPs lze spatřovat také v oblasti hojení
ran, obnově tkání v návaznosti na jejich poškození
(např. infarkt myokardu), při progresi onemocnění,
jakými jsou artritida, chronické ulcerace tkání, nadměrné množství tuku v tepnách [2,3,5,9].
MMPs a jejich aktivita jsou regulovány na několika
úrovních, transkripční, post-transkripční a posttranslační úrovni. Mimo to jsou regulovány prostřednictvím svých vnitřních inhibitorů, tkáňových
metaloproteinázových inhibitorů (TIMPs) a jejich
intracelulární a extracelulární lokalizací [10].
úvodem
varia
Stanovení
referenčních
hodnot matrixových
metaloproteináz 2,
3, 9 a asymetrického
dimethylargininu
(bakalářská práce)
2.2 Asymetrický dimethylarginin
Asymetrický dimethylarginin (ADMA) vzniká při
metabolizaci bílkovin působením enzymů methyltransferáz. Je metabolitem L-argininu. V lidském
organismu se vyskytuje přirozeně a v poměrně značném množství. Hromadí se v buněčném cytosolu
a z něj je uvolňován do plazmy. Hlavní metabolická
degradace probíhá hydrolýzou na dimethylamin a Lcitrulin, reakci katalyzuje enzym dimethylarginin
dimethylaminohydroláza. Právě aktivita tohoto
enzymu se jeví jako klíčová pro regulaci koncentrace ADMA a tím ovlivnění funkce endotelu (příp.
endotelových buněk) [11-13].
ADMA inhibuje nitroxidsyntázu (NOS), čímž
nepřímo brzdí produkci oxidu dusnatého (NO),
příp. jeho radikálu (NO·), který vzniká dvoustupňovou reakcí z L-argininu působením NOS. Kromě
asymetrického dimethylargininu způsobuje inhibici
syntézy NO také další derivát L-argininu, a to NG-
33
monomethyl-L-arginin (L-NMMA). Vzhledem
k tomu, že koncentrace ADMA v krvi je desetkrát
vyšší než koncentrace tohoto druhého derivátu
(L-NMMA), je za hlavní inhibitor NOS považován
ADMA [11].
úvodem
varia
Zvýšená koncentrace ADMA v plazmě je sama
o sobě jedním z nejsilnějších ukazatelů rizika kardiovaskulární příhody. Mimo to jsou zvýšené hladiny
ADMA v plazmě prokazovány u pacientů s hypercholesterolémií, hypertenzí, chronickým ledvinovým selháním a dalšími poruchami [14,11,12].
2.3 Spojitost matrixových metaloproteináz a asymetrického dimethylargininu s aterosklerózou,
kardiovaskulárním rizikem a stenózou
V patogenezi aterosklerózy lze za klíčové elementy
považovat dysfunkci endotelu, zánět, dyslipidémii
a autoimunitní reakce. MMPs, endopeptidázy s proteolytickou aktivitou, stejně jako TIMPs, byly navrženy
na faktory, které přispívají k patogenezi aterosklerózy,
přičemž klíčová úloha MMPs v procesu aterogeneze byla potvrzena rovněž studiemi [15]. Uvnitř
aterosklerotických plátů byla prokázána zvýšená
aktivita několika MMPs (MMP-1, MMP-3, MMP-13)
v porovnání s hodnotami MMPs u normální arteriální stěny. Zároveň při těchto procesech dochází ke
změně jejich koncentrace v krevním řečišti [8,16].
Úlohu důležitého markeru plní rovněž asymetrický
dimethylarginin. Konkrétně ve vztahu k prognóze
rizika kardiovaskulárních onemocnění a komplikací,
u pacientů s hypercholesterolémií, hypertenzí, chronickým ledvinným selháním a dalšími poruchami.
ADMA vzniká při metabolizaci bílkovin. V důsledku
toho, že inhibuje nitroxidsyntázu, brzdí produkci oxidu dusnatého. Zvýšená koncentrace ADMA v plazmě
také vede k poškození funkce cévního endotelu.
Nedostatečné působení NO a dysfunkce endotelu
má následně dopad na zvýšené riziko koronárních
příhod, vznik aterosklerózy, diabetu, hypertenze,
poškození různých orgánů [14,11,12].
Přínos MMPs a ADMA lze spatřovat jak v jejich
diagnostické hodnotě, tak také v prognostické
[12,17]. Jednou z celé řady oblastí, kde tyto markery
sehrávají významnou roli z hlediska své vypovídací
schopnosti, jsou tak stenózy a in stent restenózy.
Při postižení koronární artérie je jako hlavní revaskularizační technika využívána implantace stentu,
přičemž limitující faktor pro její použití představuje
právě in stent restenóza [18].
34
3. Experimentální část
Cílem této práce bylo vybrat vhodnou populaci pro
stanovení referenčních mezí, stanovit koncentrace
matrixových metaloproteináz (MMP-2, MMP-3,
MMP-9) a asymetrického dimethylargininu.
Do studie bylo zahrnuto celkem 180 probandů Krevního centra Fakultní nemocnice Ostrava, kteří byli
před odběrem krve seznámeni se záměrem studie
a následně podepsali informovaný souhlas.
3.1 Stanovení koncentrace vybraných matrixových
metaloproteináz a asymetrického dimetylargininu
K analýze prováděné v rámci této práce byla použita imunochemická metoda ELISA. Analyzovány
byly vzorky plazmy a séra 180 jedinců, při analýze
MMP-2, MMP-3, MMP-9 byla využita plazma, při
analýze ADMA sérum. Pro stanovení koncentrace
matrixových metaloproteináz a asymetrického
dimethylargininu byly použity diagnostické soupravy firmy BioVendor - Laboratorní medicína a.s.,
Brno, Czech Republic. Ke statistickému zpracování
dat a k výpočtu referenčních intervalů sledovaných
markerů byly použity statistické programy MedCalc
Version 14.12., NCSS 2007 a Cbstat5, R software. Při
výpočtu referenčních hodnot byla sledována závislost parametrů na pohlaví a věku [14,19-21].
3.2 Určení referenčního intervalu
Pro zpracování získaných experimentálních dat byla
pro určení referenčních intervalů použita přímá
(induktivní) metoda. Tato metoda je založena na statistickém zpracování naměřených referenčních hodnot,
přičemž získaná data lze vyhodnotit jedním ze dvou
postupů – parametrickým nebo neparametrickým.
4. Výsledky, statistické zpracování
dat
K základním předpokladům o datech patří normalita, nezávislost a homogenita, tzn. nepřítomnost
vybočujících měření, odlehlých dat a hrubých chyb.
Výpočet referenčních mezí vychází z předpokladu,
že data mají symetrické, normální (Gaussovo) rozdělení, data musí vykazovat normalitu a symetrii.
Ke statistickému hodnocení dat byly z řady testů
normality použity dva, a to momentový test normality, který matematicky hodnotí současně špičatost
a šikmost, a D´Agostiniho test, který je zdokonalením momentového testu, je podstatně citlivější
a posuzuje výběrové momenty dat. Tab. 1 shrnuje
výsledky statistické analýzy.
Při výpočtu referenčních mezí byl použit parametrický i neparametrický postup. Získané výsledky
jsou shrnuty v tab. 2.
5. Závěr
V návaznosti na provedenou analýzu imunochemickou metodou ELISA byly stanoveny referenční
intervaly pro předem vybrané enzymy, a to MMP-2,
MMP-3 a MMP-9 v plazmě a pro ADMA v séru
v závislosti na věku a pohlaví.
Tab. 1 Statistické hodnocení
Statistické
testy
MMP-2
MMP-3
MMP-9
ADMA
MMP-3
(muži)
MMP-3
(ženy)
Šikmost
Významná
Významná
Špičatost
Významná Nevýznamná Významná Nevýznamná Nevýznamná Nevýznamná
Významná Nevýznamná Nevýznamná Nevýznamná
Testy normality
Momentový
Nepřijata
Přijata
Nepřijata
Přijata
Přijata
Přijata
D’Agostiniho
Nepřijata
Přijata
Nepřijata
Přijata
Přijata
Přijata
Pozn. Statistická významnost na hladině α=0.05
Tab. 2 Referenční meze
Dolní mez
2,5% kvantil
90% interval
spolehlivosti
Horní mez
97,5% kvantil
90% interval
spolehlivosti
110,0
97,1-124,1
590,9
520,8-670,0
Parametricky
(mocn. transf.)
113,9
93,8-133,9
636,1
536,8-735,4
Neparametricky (Bootstrap)
MMP-3 (µg/l)
(n=60) MUŽI
16,99
14,98-19,14
41,09
37,65-44,67
Parametricky
(Mocn. transf.)
MMP-3 (µg/l)
(n=60) ŽENY
11,71
10,37-13,15
30,06
27,17-33,16
Parametricky
(mocn. transf.)
MMP-9 (µg/l)
(n=60) MUŽI
34,0
37,6-37,9
135,6
106,1-176,6
Parametricky
(mocn.transf.)
MMP-9 (µg/l)
(n=60) ŽENY
25,8
22,8-29,4
145,0
104,6-206,3
Parametricky
(mocn.transf.)
0,227
0,189-0,267
0,877
0,812-0,945
Parametricky
(mocn. transf.)
0,238
0,205-0,272
0,849
0,735-0,963
Neparametricky (bootstrap)
MMP-2 (µg/l)
(n=180)
ADMA (µmol/
l) (n=120)
Analýza prokázala, že hodnoty MMP-2 v plazmě
nejsou závislé na pohlaví ani na věku. V literatuře
nebyla nalezena analogická data pro možnost srovnání výsledků s provedenou analýzou.
V případě hodnot MMP-3 v plazmě byla prokázána statisticky významná závislost na pohlaví.
Ve srovnání s dostupnými studiemi [22,23] byly
v našem souboru prokázány vyšší koncentrace
MMP-3 v plazmě. Tato skutečnost může být
způsobena použitím odlišných diagnostických
souprav.
Hodnoty MMP-9 v plazmě vykazovaly nižší koncentraci u žen ve srovnání s muži. Iizasa et al. studoval
plazmatickou koncentraci MMP-9 u 138 zdravých
dobrovolníků za použití jednokrokové enzymové
imunoanalýzy (Fuji Chemical Industries, Toyama,
Japan). Stanovili normální hodnoty MMP-9 v plaz-
Typ výpočtu
úvodem
varia
Analyt (jednotky, počet)
mě, které byly nižší než námi vypočtené hodnoty.
Navíc autoři neuvedli věkový rozsah zdravých
dobrovolníků ani blíže nespecifikovali použitý primární materiál, jen uvedli, že se jednalo o plazmu.
Další publikované práce prokázaly, že naměřené
koncentrace MMP-9, jakož i jiné MMPs v krvi jsou
výrazně závislé na postupu odběru vzorků a na typu
antikoagulačního činidla [24-26]. Takové rozdíly
v metodice by mohly být základem pozorovaných
rozdílů mezi výsledky těchto studií.
Analýzou ADMA v séru bylo zjištěno, že jeho
koncentrace není závislá na pohlaví ani na věku.
Ve srovnání s publikovanými daty [27,28] Ekim
et al., Celik et al., dosáhly koncentrace ADMA
v rámci provedené analýzy vyšších hodnot. Rozdíly
mohou plynout z použití odlišných diagnostických
souprav.
35
úvodem
varia
36
6. Použitá literatura
1. Gerlach R. F., Demacq C., Jung K., Tanus-Santos
J. E. Rapid separation of serum does not avoid
artificially higher matrix metalloproteinase
(MMP)-9 levels in serum versus plasma, Clinical
Biochemistry, 2007, 40, s. 119-123.
2. Nagase H., Visse R., Murphy G. Structure and
function of matrix metalloproteinases and
TIMPs, Cardiovascular Research, 2006, 69, s.
562-573.
3. URL: <http://lekarske.slovniky.cz/lexikonpojem/endopeptidazy> [cit. 2014-03-05]
4. Brinckerhoff C. E., Matrisian L. M. Matrix
metalloproteinases: a tail of a frog that became
a prince, Nature reviews. Molecular cell biology,
2002, 3(3), s. 207-214.
5. Roy R., Yang J., Moses M. A. Matrix Metalloproteinases As Novel Biomarkers and Potential
Therapeutic Targets in Human Cancer, Journal
of Clinical Oncology, 2009, 27(31), s. 52875297.
6. Tveita A., Rekvig O. P., Zykova S. N. Glomerular
matrix metalloproteinases and their regulators
in the pathogenesis of lupus nephritis, Arthritis
Research & Therapy, 2008, 10(6):229, DOI:
10.1186/ar2532.
7. Newby A. C. Metalloproteinase Expression in
Monocytes and Macrophages and its Relationship to Atherosclerotic Plaque Instability,
Arterioscler Thrombosis, and Vascular Biology,
2008, 28, s. 2108-2114.
8. Kukačka J., Zikmundová K., Kotaška K., Halačová M., Vajtr D., Průša R. PAPP-A a matrixové
metaloproteinázy 3 a 9 u pacientů se smíšenou
dyslipoproteinémií, Klinická biochemie a metabolismus, 2/2007, 15(36), 2, s. 85-88.
9. Malik J., Stulc T., Ceska R. Matrix metalloproteinases in isolated hypercholesterolemia,
International Angiology, September 2005, 24(3),
s. 300-303.
10. Kandasamy A. D., Chow A. K., Ali M. A. M.,
Schulz R. Matrix metalloproteinase-2 and
myocardial oxidative stress injury: beyond the
matrix, Cardiovascular Research, 2010, 85, s.
413-423.
11. Široká R., Racek J., Filipovský J. Asymetrický
dimethylarginin (ADMA), Klinická biochemie
a metabolismus, 2005, 13(34), 3, s. 131-134.
12. Nový marker kardiovaskulárního rizika: asymetrický dimethylarginin, Medicína odborné fórum
lékařů a farmaceutů, 2002, 2, Roč. IX, s. 11.
13. Vargová V., Pytliak M., Mechírová V., Fedačko J.
Koncentrácie asymetrického dimethylarginínu
ako marker kardiovaskulárneho rizika, Cardiology, 2008; 17(4), s. 157-161.
14. Product Data Sheet, ADMA ELISA, Cat. No.:
REA201/96, BioVendor – Laboratorní medicína
a.s. verze 08 260912.
15. Musial K., Zwolińska D. Matrix metalloproteinases (MMP-2,9) and their tissue inhibitors
(TIMP-1,2) as novel markers of stress response
and atherogenesis in children with chronic
kidney disease (CKD) on conservative treatment, Cell Stress and Chaperones, 2011, 16, s.
97-103.
16. Koh K. K., Ahn J. Y., Jin D. K., Han S. H., Kim
H. S., Choi I. S., Ahn T. H., Shin E. K., Jeong
E.-M. Comparative effects of statin and fibrate
on nitric oxide bioactivity and matrix metalloproteinase in hyperlipidemia, International
Journal of Cardiology, 2004, 97, s. 239-244.
17. Gerlach R. F., Uzuelli J. A., Souza-Tarla C. D.,
Tanus-Santos J. E. Effect of anticoagulants on the
determination of plasma matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 activities, Analytical
Biochemistry, 2005, 344, s. 147-149.
18. Ge J., Shen Ch., Liang Ch., Chen L., Qian J., Chen
H. Elevated matrix metalloproteinase expression after stent implantation in associated with
restenosis, International Journal of Cardiology,
2006, 112, s. 85-90.
19. Product Data Sheet, Human Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) ELISA, Cat. No.: BBT0459R,
BioVendor – Laboratorní medicína a.s., version
51 021112 46.
20. Product Data Sheet, Human Matrix Metalloproteinase-3 (MMP-3) ELISA, Cat. No.:
RIM001R, BioVendor – Laboratorní medicína
a.s., ENG.001.A.
21. Product Data Sheet, Human Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) ELISA, Cat. No.:
RBMS2016/2R, BioVendor – Laboratorní
medicína a.s.
22. Ribbens C., Martin y Porras M., Franchimont
N., Kaiser M. J., Jaspar J. M., Damas P., Houssiau F. A., Malaise M. G. Increased matrix
metalloproteinase-3 serum levels in rheumatic
diseases: relationship with synovitis and steroid
treatment. Annals of the Rheumatic Diseases,
2002, 61, s. 161-166.
23. Brennan F. M., Browne K. A., Green P. A., Jaspar
J. M., Maini R. N., Feldmann M. Reduction
of serum matrix metalloproteinase 3 in rheumatoid arthritis patients following anti-tumor
necrosis factor-a (cA2) therapy. British Journal
of Rheumatology, 1997, 36, s. 643-650.
27. Ekim M., Sekeroglu M. R., Balahoroglu R.,
Ozkol H., Ekim H. Roles of the oxidative stress
and ADMA in the development of deep venous
thrombosis. Biochemistry Research International, 2014, Article ID 703128, http://dx.doi.
org/10.1155/2014/703128.
28. Celik M., Cerrah S., Arabul M., Akalin A. Relationship of asymmetric dimethylarginine levels
to macrovascular disease and inflammation
markers in type 2 diabetic patients. Journal of
Diabetes Research, 2014, Article ID 139215,
http://dx.doi.org/10.1155/2014/139215.
úvodem
varia
24. Mannello F. Effects of blood collection methods
on gelatin zymography of matrix metalloproteinases. Clinical Chemistry, 2003, 49, s. 339340.
25. Jung K., Meisser A., Bischof P. Blood sampling
as critical preanalytical determinant to use circulating MMP and TIMP as surrogate markers
for pathological processes. International Journal
of Cancer, 2005, 116, s. 1000-1001.
26. Jung K., Gerlach R. F., Tanus-Santos J. E. Preanalytical pitfalls of blood sampling to measure
true circulating matrix metalloproteinase 9 and
tissue inhibitor of matrix metalloproteinases.
Clinica Chimica Acta, 2006, 373, s. 180-181.
37