Základní principy vývoje nových léčiv (OCH/ZPVNL)

Univerzita Palackého v Olomouci
Přírodovědecká fakulta
Základní principy
výzkumu nových léčiv
Radim Nencka
Olomouc 2015
Recenzenti: Ing. Ivan Rosenberg, CSc.
RNDr. Lucie Brulíková, Ph.D.
Skripta vznikla v rámci realizace projektu OP VK CZ.1.07/2.2.00/28.0184 s názvem „Inovace
ve vzdělávání v chemii a biologii s ohledem na aktuální trendy v biomedicinálním výzkumu“.
1. vydání
© Radim Nencka, 2015
© Univerzita Palackého v Olomouci, 2015
Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní,
správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost.
ISBN 978-80-244-4538-0
Předmluva
Tento text byl připraven jako podklad kurzu „Základní principy vývoje nových léčiv“ věnovaného
studentům magisterského studia v oborech Organická chemie a Bioorganická chemie na
Přírodovědecké fakultě Univerzity Palackého. Snahou bylo shrnout nejdůležitější znalosti, které by
měl každý vědec zabývající se medicinální chemií ovládat. Při přípravě tohoto textu byl kladen
důraz zejména na praktické aspekty této práce, a na rozdíl od většiny českých učebnic a skript
věnovaných farmaceutické chemii zde není podrobně rozebírána syntéza a použití jednotlivých
skupin léčiv. Jako vodítko pro sestavení těchto skript bylo použito několik výborných anglicky
psaných učebnic, jmenovitě:
1. Wermuth, C. G. The Practice of Medicinal Chemistry, 3rd ed.; Elsevier Science: 2008.
2. Patrick, G. L. An Introduction to Medicinal Chemistry, 4th ed.; Oxford University Press,
Oxford, New York 2009.
3. Silverman, R.S. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, 2nd ed.; Elsevier
Science: 2004.
3
Obsah
Předmluva ............................................................................................................................................ 3
1. Úvod do výzkumu nových léčiv ...................................................................................................... 6
1.1.
Základní pojmy...................................................................................................................... 6
1.2.
Názvy léčiv ............................................................................................................................ 7
1.3.
Onemocnění a výzkum léčiv ................................................................................................. 8
2. Biologické cíle léčiv (drug targets) ................................................................................................ 11
2.1. Enzymy jako biologické cíle léčiv .......................................................................................... 12
3.
2.2.
Receptory............................................................................................................................. 16
2.3.
Jaderné receptory................................................................................................................. 19
2.4.
Transportéry jako biologické cíle léčiv ............................................................................... 19
Výzkum léčiv .............................................................................................................................. 22
3.1.Přístupy k výzkumu léčiv ......................................................................................................... 22
4.
Identifikace biologických cílů .................................................................................................... 23
4.2. Vztah genů a potenciálních molekulových biologických cílů................................................. 24
4.3. Přístupy k odhalení nových biologických cílů ........................................................................ 25
4.4. Bioinformatika......................................................................................................................... 25
4.5. Metodiky moderní genomiky a proteomiky ............................................................................ 25
5.
6.
Validace biologického cíle ......................................................................................................... 30
5.1.
Yeast two-hybrid systém ..................................................................................................... 30
5.2.
Antisense oligonukleotidy ................................................................................................... 31
5.3.
RNA interference (RNAi) ................................................................................................... 31
5.4.
Využití „knock-outovaných“ organismů ............................................................................. 31
Objev Hitu .................................................................................................................................. 32
6.1.
Biologický test (assay, bioassay)......................................................................................... 32
6.2. Strategie objevu hitů 1 - Screening ......................................................................................... 33
6.3. Strategie objevu hitů 2 – využití biologických informací ....................................................... 35
6.5. Strategie objevu hitů 3 – design analog................................................................................... 36
6.6. Strategie objevu hitů 4 – racionální design léčiv .................................................................... 38
7.
Od hitu k leadu............................................................................................................................ 49
7.1.Struktura hit-to-lead procesu .................................................................................................... 49
7.2. Vztah mezi strukturou a aktivitou ........................................................................................... 50
7.3. Interakce proteinu s ligandem ................................................................................................. 50
4
7.4. Typy molekulárních interakcí mezi proteiny a ligandy........................................................... 52
7.5. Interakce jednotlivých funkčních skupin a ověření významu pro vazbu na molekulový cíl .. 56
8. Strategie optimalizace hitu (leadu) ................................................................................................ 64
8.1. Homologie ............................................................................................................................... 64
8.2. Izosterie a bioizosterie ............................................................................................................. 70
8.2.1. Klasické bioizostery.......................................................................................................... 71
8.2.2. Neklasické bioizostery ...................................................................................................... 73
8.2.3. Dělení bioizosterů podle funkčních skupin ...................................................................... 73
8.3. Záměna skeletu jako strategie přípravy nových funkčních derivátů ....................................... 84
9. Rigidizace struktury v SAR ........................................................................................................... 88
10. Chiralita a její vliv na aktivitu léčiv ............................................................................................. 90
10.1. Chirální záměna („chiral switch“) ......................................................................................... 94
11. Optimalizace leadu ....................................................................................................................... 95
11.1. Absorpce látky....................................................................................................................... 96
11.1.1. Orální dostupnost a její predikce ..................................................................................... 98
11.2. Distribuce látek v organismu ................................................................................................. 99
11.3. Metabolismus léčiv a dalších látek ...................................................................................... 100
11.3.1. Metabolismus fáze I ................................................................................................... 101
11.3.2. Metabolismus fáze II .................................................................................................... 104
11.3.3. In vitro testy pro predikci metabolické stability ........................................................... 107
11.4. Vylučování (exkrece) potenciálních léčiv ........................................................................... 108
11.5. Důležité fyzikálněchemické a ADME parametry užívané v raných fázích výzkumu a vývoje
léčiv .............................................................................................................................................. 108
12.
Medicinálně chemické přístupy k optimalizaci ADME vlastností látek............................... 111
12.1. Optimalizace absorpce ........................................................................................................ 111
12.2. Optimalizace metabolismu .................................................................................................. 113
12.3.
Proléčiva ........................................................................................................................ 116
Použitá literatura .............................................................................................................................. 121
5
1. Úvod do výzkumu nových léčiv
1.1.
Základní pojmy
Výzkum nových léčiv je multioborová disciplína, která vyžaduje rozsáhlé znalosti jak v oborech
chemických tak i medicínských. Přestože se procesu výzkumu léčiv účastní vědci z řady různých
oborů, centrální roli sehrávají medicinální chemici, kteří se hlavní měrou podílí na návrhu a syntéze
potenciálně biologicky aktivních léčiv.
Medicinální chemie se označuje také jako farmaceutická chemie (přestože někdy bývá
farmaceutická chemie považována pouze za podmnožinu medicinální chemie). Podle IUPAC je
definována jako disciplína na bázi chemie, zahrnující také aspekty biologických, medicinských a
farmaceutických věd, která se zabývá vynalézáním, objevováním, designem, identifikací a
přípravou biologicky aktivních látek, studiem jejich metabolismů, interpretací mechanismů jejich
účinků na molekulární úrovni a sestavením strukturně-aktivitních vztahů.
S procesem výzkumu léčiv souvisí také některé důležité pojmy, které bývají někdy v literatuře
zaměňovány nebo ne zcela přesně interpretovány, jako jsou:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Biologický cíl léčiva (drug target) je buněčná nebo molekulární struktura, jejíž interakce
s léčivem vyvolává žádoucí odezvu.
Hit je sloučenina, která je schopna vyvolat u vybraného biologického cíle požadovanou
odpověď, přičemž nemá analogický precedent. Jedná se o látku, která je většinou získaná
pomocí screeningu. Aktivita není potvrzená a může být pouze artefaktem.
Validovaný hit je sloučenina s potvrzenou identitou, čistotou.
Lead je látka, která má potvrzenou aktivitu vůči biologickému cíli našeho zájmu. Jedná se o
látku, která má dostatečný potenciál pro další chemickou modifikaci a optimalizaci. Může
mít již částečně optimalizovanou strukturu a výhodou je alespoň částečná znalost strukturně
aktivitních vztahů. Z pohledu farmaceutického průmyslu by měla být struktura
patentovatelná a pokud možno synteticky dostupná.
Preklinický kandidát je sloučenina vykazující optimalizovanou interakci s biologickým
cílem, ale také vhodné fyzikálně-chemické a farmakokinetické parametry.
Léčiva jsou definovaná zákonem č. 378/2007 Sb., „o léčivech a o změnách některých
souvisejících zákonů“, jako všechny léčivé přípravky a léčivé látky.
Léčivé přípravky jsou tímto zákonem definovány jako látky nebo kombinace látek určené
lidem i zvířatům upravující nebo obnovující fyziologické funkce, ale také určené pro
stanovení diagnózy nebo prezentované jako látky a jejich kombinace s léčebnými nebo
preventivními vlastnostmi.
Léčivé látky jsou součásti léčivého přípravku, které způsobují jeho účinek.
Pomocné látky nemají vlastní účinek, ale usnadňují nebo umožňují výrobu, případně
příznivě ovlivňují farmakokinetické vlastnosti léčivých látek.
Uvedení nového léčiva na trh v současnosti trvá zhruba 10 až 15 let a je velmi finančně náročné.
Ukazuje se, že velké farmaceutické firmy v průměru vydají 5 miliard dolarů na uvedení jednoho
léčiva na trh, zatímco u malých firem jsou tyto náklady menší, a to v rozmezí 350 milionů až 1
miliarda dolarů (Tabulka 1).
Celý proces je rozdělován na dvě části – výzkum a vývoj. Výzkum léčiv (nebo také vyhledávací
výzkum, z angl. „drug discovery“) je fáze, ve které dochází k identifikaci biologických cílů, syntéze
a screeningu nových látek („hit finding“ a „hit validation“), selekci lead struktury a její
optimalizaci. Doba trvání této fáze je značně rozličná, obvykle se uvádí dva až pět let. Tato skripta
jsou věnována především právě výzkumu nových léčiv. Fáze vývoje léčiv se dělí na preklinické
hodnocení (1 až 5 let), které zahrnuje jak farmakokinetické a farmakodynamické studie, tak
toxikologické sledování preklinického kandidáta.
6
Tabulka 1 Náklady na výzkum a vývoj léčiv podle počtu léčiv přivedených na trh1
Počet schválených léčiv jednu
farmaceutickou společností
Náklady na jedno léčivo (miliony $)
Medián
5459
5151
1803
351
8 až 13
4 až 6
2 až 3
1
Průměr
5998
5052
2303
953
Toxikologické studie jsou prováděny jak in vitro, tak in vivo minimálně na dvou zvířecích
modelech. Sleduje se akutní, subakutní i chronická toxicita, teratogenita a reprodukční funkce,
stejně jako mutagenita a kancerogenita látek. Hlavní částí procesu vývoje léčiv je klinické
hodnocení, které většinou trvá zhruba 6 až 7 let a je zahájeno předložením potřebných materiálů
založených na preklinických studiích příslušné autoritě, kterou je FDA (Úřad pro kontrolu potravin
a léků, U.S. Food and Drug Administration), v České republice pak SŮKL (Státní ústav pro
kontrolu léčiv) a v Evropské unii EMA (Evropská léková agentura, European Medicines Agency).
Tato přihláška do klinických zkoušek je v USA nazývána Investigational New Drug (IND) a u nás
Oznámení o záměru provést klinickou zkoušku.
Klinické hodnocení léčiv probíhá ve třech fázích:
 Fáze 1 je prováděna na 20-80 zdravých dobrovolnících a trvá přibližně 6-9 měsíců. Cílem
fáze 1 je zjištění rozdílné toxicity u lidí v porovnání s pokusnými zvířaty. Determinuje se
závislost počtu vedlejších účinků na zvolené dávce.
 Fáze 2 se provádí na 100-500 pacientech trpících chorobou, pro kterou je léčivo indikováno
a trvá většinou 6 měsíců až 3 roky. Cílem této fáze je ověření účinnosti léčiva a jeho
bezpečnosti. Jedna skupina pacientů dostává léčivo a druhá placebo, obvykle jsou tyto
studie randomizované (pacienti dostávají léčivo nebo placebo na základě náhodného
výběru). Většina těchto studií je také dvojitě zaslepená („double-blinded“) s tím, že ani lékař
ani pacient neví, jestli dostávají léčivo nebo placebo.
 Fáze 3 se účastní 1000-5000 pacientů trpících chorobou, pro kterou je léčivo indikováno a je
většinou nejdelší (1-4 roky). Jedná se o podrobnou studii účinnosti a bezpečnosti
experimentálního léčiva. Většinou se jedná o dvojitě zaslepené randomizované studie.
Pokud projde látka úspěšně všemi třemi klinickými fázemi, následuje schválení léčiva, které je
založeno na žádosti o schválení léčiva. Tento rozsáhlý dokument obsahuje všechny informace
získané v průběhu vývoje léčiva týkající se jak bezpečnosti, tak účinnosti. Musí obsahovat
jednoznačný důkaz, že léčivo má deklarovaný efekt, je v rámci dané indikace dostatečně bezpečný a
nevykazuje závažné vedlejší účinky. V USA se tento dokument označuje jako New Drug
Application (NDA) a v České republice Žádost o registraci léčivého přípravku. Nicméně, léčivo je
hodnoceno a sledováno i po svém uvedení na trh. Tato fáze se označuje jako postmarketingové
sledování léčiva (angl. Postmarketing surveillance (PMS)). Zde se jedná zejména o sledování
nežádoucích vedlejších účinků, které nebyly zachyceny v klinických zkouškách. V případě
závažných důvodů může být léčivo staženo z trhu.
1.2.
Názvy léčiv
Jedním z problémů, se kterým se u léčiv někdy setkáváme, je jejich správné názvosloví. Jedna
léčivá látka může být charakterizována několika různými názvy. Předně může být její chemická
struktura popsána chemickým názvem podle IUPAC názvosloví. U složitějších látek je ale tento
název příliš dlouhý a pro všední použití nepraktický. Často je proto využíváno triviálního nebo
7
semitriviálního názvosloví. V dnešní medicinálně chemické praxi je však velice časté použití pouhé
kódové značky, která byla zavedena většinou již při syntéze nebo byla látce přidělena v průběhu
biologického screenování. V případě, že se látka etabluje jako klinický kandidát a projde částí
klinických testů, je ji přidělen objevitelem nebo výrobcem „pracovní název“. Pod tímto názvem je
látka dále vyvíjena a absolvuje většinou zbytek klinických zkoušek. Výrobce nebo objevitel pak
zažádá o uznání takovéhoto názvu u Světové zdravotnické organizace (WHO), která na základě
zhodnocení a návrhu WHO Expert Advisory Panel on the International Pharmacopoeia and
Pharmaceutical Preparations rozhodne o vhodnosti udělení názvu, který se označuje Mezinárodní
nechráněný název, International Nonproprietary Name (INN). Tento název je pak používán pro
danou sloučeninu obecně a je veřejně přístupný (není chráněn a není vlastnictvím farmaceutické
firmy). Při uvedení na trh pak uděluje výrobce látce obchodní název, který je chráněn pro použití
konkrétní společností. Na obalu léčiva pak většinou najdeme názvy dva - obchodní název a INN
(např. Brufen® a ibuprofen).
1.3.
Onemocnění a výzkum léčiv
Jak akademická pracoviště, tak farmaceutické firmy se primárně zaměřují na výzkum léčiv
potenciálně aktivních proti onemocněním, které trápí největší část populace. To je samozřejmě
motivováno jak filantropií, tak příslibem finančního zhodnocení investovaných prostředků.
Potřebnost daného léčiva můžeme odhadnout z četnosti diagnostikovaných případů a počtu úmrtí na
dané onemocnění (s ohledem na to, že některá onemocnění můžou být velmi četná, přestože nejsou
fatální). Z tabulky 2 vyplývá, že mezi nejčastější diagnostikovaná onemocnění patří choroby
kardiovaskulárního ústrojí, především hypertenze.
Následují onemocnění horních cest dýchacích, problémy s pohybovým aparátem, diabetes mellitus
a nádorová onemocnění. Mezi dvě hlavní příčiny úmrtí potom patří opět kardiovaskulární a
nádorová onemocnění (Obr. 1). Tyto choroby způsobují takřka polovinu úmrtí vůbec. Z těchto
údajů a z tabulky 3 věnované nejčastěji předepisovaným skupinám léků pak vyplývá, že počet
diagnostikovaných onemocnění značně koreluje s počtem předepisovaných léčiv. Není také
překvapivé, že nejrozsáhlejší finanční prostředky jsou vydávány na léčbu nádorových onemocnění.
Přestože tabulka konkrétních nejprodávanějších léčiv na světě se každý rok mění a proto tato data
nejsou v tomto textu uvedena, v první desítce jsou většinou právě aktuálně úspěšné preparáty
používané u kardiovaskulárních onemocnění, diabetu, astmatu, ale také žaludečních vředů a
psychických onemocnění.
Přestože onemocnění, která trápí hlavní část populace, patří mezi ta nejčastěji zkoumaná a je na ně
vyvíjeno zdaleka nejvíce léčiv, je nezbytné zajistit také léčbu méně častých onemocnění, která
závažným způsobem sužují minoritní části populace. Pokud se jeden případ onemocnění vyskytuje
na méně než 2000 lidí, je toto onemocnění označováno jako vzácné onemocnění (orphan nebo rare
disease). Příkladem vzácného onemocnění je sklerodermie. Jedná se o autoimunitní onemocnění,
které je většinou charakterizováno tuhnutím vaziva ve škáře a podkoží, ale může napadat i orgány.
Hlášeno je 42 případů na 100 000 obyvatel.2 Vývoj léčiv na tato onemocnění by byl za normálních
podmínek ztrátový, a proto je již od osmdesátých let minulého století podporován.
Vývoj léčiv označovaných jako „orphan drugs“ byl nejdříve podporován v USA pomocí „Orphan
Drug Act“ zákona vydaného v roce 1983 umožňujícího zvýhodnění investorů, kteří se podílejí
právě na projektech spojených s léčbou těchto vzácných onemocnění. Toto zvýhodnění může mít
různé formy, jako daňové úlevy, prodloužení patentové ochrany a práv na prodej léčiva nebo nižší
poplatky za registrační řízení. Podobné podpory se později dostalo léčbě vzácných onemocnění také
v Evropě. V současné době je podpora rozšířena také o speciální grantové programy zaměřené na
tato onemocnění a jejich prevenci.
8
Tabulka 2. Dvacet nejčastějších diagnóz u ambulantních vyšetření ve Spojených státech v roce
2010.3
Primární diagnostická skupina
Rutinní vyšetření dětí
Esenciální hypertenze
Artropatie a příbuzná onemocnění
Akutní onemocnění horních cest
dýchacích (bez faringitidy)
Poruchy páteře
Diabetes mellitus
Zhoubná nádorová onemocnění
Revmatismus (bez onemocnění zad)
Těhotensví (normální)
Obecné lékařské vyšetření
Gynekologické vyšetření
Následné vyšetření
Zánět středního ucha a eustachovy
trubice
Specifické procedury a doplňková péče
Astma
Onemocnění srdce (bez ischemických)
Poruchy metabolismu lipidů
Šedý zákal
Alergická rýma
Benigní novotvary
Další diagnózy
Procentuální
zastoupení celkově
Procentuální
zastoupení ženy
4,4
3,9
3,6
3,2
3,7
3,5
3,7
3,2
Procentuální
zastoupení
muži
5,4
4,4
3,4
3,3
3,1
3,0
2,9
2,2
2,1
2,0
1,6
1,5
1,5
2,9
2,5
2,5
2,4
3,6
1,5
2,8
1,6
1,1
3,5
3,8
3,4
1,9
2,5
1,4
1,9
1,4
1,4
1,2
1,2
1,1
1,1
1,1
56,5
1,3
1,4
1,2
0,9
1,2
1,0
1,1
56,9
1,6
1,5
1,3
1,6
1,0
1,2
1,0
56,9
Obr. 1. Procentuální distribuce deseti nejčastějších příčin smrti u jednotlivých pohlaví4
9
Tabulka 3. Nejčastěji předepisovaná a prodávaná léčiva podle terapeutických skupin.5
Deset nejčastěji předepisovaných léčiv podle
terapeutických skupin (USA 2012)
Deset nejdůležitějších terapeutických skupin
s ohledem na tržby (USA 2012)
Pořadí
Terapeutická skupina
1
Antihypertenziva
Počet
vydaných
předpisů
(v milionech)
656
2
Analgetika (bolest)
472
2
329
3
268
255
3
4
5
6
Látky ovlivňující
mentální zdraví
Antibakteriální látky
Regulace lipidů
Další látky ovlivňující
CNS
Prodeje
(v
miliardách
US$)
25,9
Pořadí
Terapeutická skupina
1
4
5
Protinádorová léčba
Látky ovlivňující mentální
zdraví
Látky ovlivňující
respirační onemocnění
Antidiabetika
Analgetika (bolest)
189
6
Regulace lipidů
16,9
23,5
22,1
22,0
18,2
7
Antidiabetika
174
7
Látky ovlivňující
autoimunitní onemocnění
14,8
8
Látky ovlivňující
respirační
onemocnění
Antiulcerózní látky
159
8
Antihypertenziva
13,6
157
9
11,7
Látky ovlivňující
nervový systém
156
10
Látky proti HIV/AIDS
Látky ovlivňující ADHD
(Attention Deficit
Hyperactivity Disorder)
9
10
10
10,4
2. Biologické cíle léčiv (drug targets)
V souvislosti s biologickými nebo molekulárními cíli léčiv je nutné se zmínit o Paulu Ehrlichovi.
Tento německý vědec jako první navrhl vztah mezi interakcí léčiva a jeho vazbou na „receptor“
(resp. biologický cíl léčiva). Mimo to je ho možné považovat i za jednoho z průkopníků screeningu.
Se svým japonským kolegou Sahachirem Hatou otestovali více než 900 sloučenin na myších a díky
tomu objevili salvarsan – první opravdu účinný lék proti syfilidě. V roce 1910 se slavarsan dostal
do běžné praxe a znamenal okamžitý úspěch.
Dnes již dobře víme, že léčivé látky interagují (obvykle prostřednictvím nevazebných interakcí)
s jinými molekulami, v převážné většině s proteiny. Tato vazba většinou vyvolá signalizaci na
úrovni buněk (např. sekreci, kontrakci nebo specifickou změnu metabolismu), která se projeví na
orgánové úrovni jako kýžená odezva (např. změna kardiovaskulární nebo trávící funkce). Obecně je
také možné říci, že léčivo nevytváří žádnou novou funkci, ale zvyšuje nebo snižuje funkci
existující.
Projekt mapování lidského genomu započal v roce 1990 na U. S. Department of Energy (DOE) a
National Institutes of Health (NIH) a podařilo se ho zvládnout již v roce 2003 tedy o 2 roky dříve,
než bylo původně plánováno a to díky rychlému pokroku v technologii sekvenování genů. Projekt
stál 437 miliónů dolarů (~ 9 miliard korun). Tento výzkum mimo jiné predikuje existenci množství
proteinů, u nichž neznáme jejich strukturu ani funkci, a které mohou sloužit jako potenciální
biologické cíle pro terapii. Předpokládá se, že těchto potenciálních cílů využitelných v terapii je 2
až 3 tisíce (někdy je uváděno až 8 tisíc). Současná léčiva využívají cca 330 molekulárních cílů,
z nichž 270 je kódováno lidským genomem a 60 patogenními organismy. Největší podíl léčiv náleží
do kategorie malých molekul, tedy molekul, které nemají oligomerní nebo polymerní charakter
(jako peptidy a nukleové kyseliny).
Hlavní biologické cíle můžeme rozdělit podle umístění a funkce na:
1) Cíle uvnitř buněk
a. Enzymy
b. Jaderné (nukleární) receptory
c. Nukleové kyseliny
2) Cíle na povrchu buněk
a. Přenašeče (transportéry)
b. Iontové kanály
c. Receptory
3) Další mechanismy účinků (např. antacida - neutralizují HCl v žaludku)
Obr. 2. Biologické cíle nízkomolekulárních látek v klinické praxi v roce 2002.6
11
2.1. Enzymy jako biologické cíle léčiv
Enzymy jsou proteinové biokatalyzátory, které hrají centrální roli ve velké většině dějů, které se
odehrávají v buňkách našeho těla. Přestože některé ribonukleové kyseliny, označované jako
ribozymy, mají také katalytickou funkci, jejich role jako biologických cílů léčiv je zcela marginální.
Enzymy jsou společně s receptory vůbec nejdůležitějšími biologickými cíli léčiv (Obr. 2). Tato
exkluzivní role enzymů v medicinální chemii je dána možností ovlivnění množství klíčových
chemikálií v našich buňkách, inhibicí enzymů, které katalyzují syntézu těchto látek, nebo se podílí
na jejich rozkladu. Inhibicí funkce enzymů nezbytných pro život bakteriálních a virových patogenů,
můžeme znemožnit jejich replikaci v našem těle.
Transformace substrátů na produkty probíhá v katalytickém nebo aktivním místě enzymu, které má
specifický tvar a obsahuje vhodné aminokyselinové zbytky pro vazbu substrátu. Při dané reakci
dochází ke konformační změně enzymu (může být i poměrně výrazná), která umožňuje urychlení
cílené reakce na základě specifických elektronových vlivů aminokyselinových zbytků (případně
koenzymů nebo iontů kovů přítomných v aktivním místě enzymu).
Přestože jsou známy také aktivátory některých enzymů, které zvyšují účinnost enzymatických
reakcí, jejich farmaceutické využití je v porovnání s inhibitory enzymu, tedy látkami, které snižují
aktivitu enzymů, zcela zanedbatelné. Podle vratnosti vazby inhibitoru a enzymu je dělíme na
ireverzibilní a reverzibilní.
Reverzibilní inhibitory se váží na enzymy nekovalentě zejména pomocí nevazebných interakcí.
Naproti tomu ireverzibilní inhibitory, vytvářejí s cílovým enzymem velmi pevnou, nejčastěji
kovalentní, vazbu.
Reversibilní inhibitory
Pro pochopení těchto procesů je důležitá znalost jejich kinetiky. Podrobný popis kinetiky
enzymových reakcí a jejich vztah k inhibici enzymů je možné nalézt ve většině vysokoškolských
učebnic biochemie, a bude proto v tomto textu zmíněna jen okrajově.
Rovnice 1. Rovnice Michaelise a Mentenové. Vmax je mezní (limitní) rychlost enzymatické reakce a
KM je Michaelisova konstanta vyjadřující koncentraci substrátu při polovině mezní rychlosti reakce.
A
B
Obr. 3 Vliv koncentrace substrátu na rychlost enzymem katalyzované reakce a LineweaverůvBurkeho graf.
12
Koncentrační závislost enzymatické reakce na množství substrátu je pro většinu enzymatických
reakcí důležitých pro medicinální chemii vyjádřena rovnicí Michaelise a Mentenové. Graficky se
tento vztah vyjadřuje buď jako závislost rychlosti reakce na koncentraci substrátu (Obr. 3 A) nebo
pomocí dvojitě reciproké závislosti 1/v na 1/[S] označované jako Lineweaverův-Burkeho graf (nebo
plot), který se často využívá pro snadné určení KM a Vmax, jejíchž poměr je roven směrnici přímky
grafu.
Rozlišujeme čtyři základní typy inhibitorů enzymu podle jejich vlivu na kinetiku enzymové reakce:
1. Kompetitivní inhibitory
nesnižují mezní rychlost enzymatické reakce (Vmax = V’max), ale zvyšují Michaelisovu konstantu
(K’M > KM). V tomto případě spolu většinou soupeří substrát s inhibitorem o vazbu v aktivním
místě. Kompetitivní inhibitory často strukturně připomínají substrát (Obr. 4 A). Pokud zvýšíme
dostatečně koncentraci substrátu, substrát vytěsní inhibitor z vazby s enzymem a reakce bude
probíhat nejvyšší možnou rychlostí (Vmax). Pro popis afinity (účinnosti) kompetitivních inhibitorů
k enzymům se v praxi používají zejména hodnoty Ki a IC50.
Ki je inhibiční disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor a vyjadřuje poměr molárních
koncentrací enzymu a inhibitoru v disociovaném a nedisociovaném stavu (Rovnice 1). Pomocí této
hodnoty můžeme vyjádřit vztah mezi Michaelisovou konstantou za přítomnosti inhibitoru (K’M) a
bez něj (KM). Tato hodnota je nezávislá na koncentraci substrátu. Konstanta K’M je také někdy
označována jako zdánlivá Michaelisova konstanta (ang. apparent Michaelis constant KappM).7
A
B
C
D
Obr. 4. Změny závislosti rychlosti enzymatické reakce na koncentraci substrátu u A) kompetitivní,
B) nekompetitivní, C) akompetitivní a D) smíšené inhibice.
13
Rovnice 2. Vztahy mezi disociační konstantou inhibitoru Ki, Michaelisouvou konstantou KM,
zdánlivou Michaelisovou konstantou K’M a IC50.
Na rozdíl od Ki není hodnota střední
inhibiční koncentrace (IC50) přímým
vyjádřením afinity inhibitoru k enzymu, ale
vyjadřuje koncentraci inhibitoru která je
nutná k dosažení 50% maximální dosažitelné
inhibice enzymu. K určení IC50 se užívá tzv.
dose-response curve, která vyjadřuje
závislost aktivity enzymu na koncentraci
inhibitoru. V praxi je většinou založena na
měření katalytické aktivity enzymu (např.
pomocí radioizotopově značeného substrátu)
při deseti různých koncentracích inhibitoru za
určitý čas při určité koncentraci enzymu a
substrátu.
Na rozdíl od Ki je tato hodnota závislá na
koncentraci substrátu. Vztah mezi Ki a IC50 je
vyjádřen pomocí Rovnice 2.
Obr. 5. Vyjádření střední hodnoty inhibice
IC50 pomocí dose-response curve.
Obr. 6. Struktura atorvastatinu a jeho role v inhibici biosyntézy cholesterolu.
14
Typickým příkladem kompetitivního inhibitoru je atorvastatin. Jedná se o zástupce velmi úspěšné
třídy léčiv, statinů, které snižují hladinu cholesterolu pomocí inhibice hydroxymetylglutarylkoenzym A (HMG-CoA) reduktasy. Tento enzym hraje centrální roli v biosyntéze cholesterolu.8, 9
Atorvastatin je jedním z nejvíce prodávaných léčiv na světě i u nás.
2. Nekompetitivní inhibitory
Nekompetitivní inhibitory nevyvolávají změnu Michaelisovy konstanty (K’M = KM), ale snižují
mezní rychlost reakce (V’max < Vmax). Mezi nekompetitivní inhibitory patří některé alosterické
inhibitory, tedy inhibitory, které se vážou na jiném místě než substrát tzv. alosterické centrum.
U nekompetitivní inhibice nezáleží na tom, je-li navázán substrát nebo ne (Obr. 4 B). Příkladem je
suramin, který byl identifikován jako nekompetitivní alosterický inhibitor falcipainu-2, enzymu
klíčového pro Plasmodium falciparum původce malárie.10 Alosterické inhibitory mohou inhibovat
enzymy kompetitivně i akompetitivně.
3. Akompetitivní inhibitory
Tyto látky snižují mezní rychlost i Michaelisovu konstantu, které zůstávají ve stejném poměru
(Vmax/V´ = KM/K´M). K tomuto typu inhibice dochází, pokud se inhibitor váže na komplex enzymsubstrát a zabraňuje průběhu katalytické reakce. Na rozdíl od nekompetitivní inhibice musí dojít
k vytvoření komplexu enzymu se substrátem. Díky tomu není možné snížit aktivitu enzymu
zvýšením koncentrace substrátu jako u kompetitivních inhibitorů.
4. Inhibitory vykazující smíšený typ inhibice
O tomto typu inhibice mluvíme v případě, že se mění i mezní rychlost i Michaelisova konstanta a
poměr není stejný. Může docházet jak ke snižování, tak ke zvyšování Michaelisovy konstanty.
Ireverzibilní inhibitory
Ireversibilní inhibitory jsou látky, které po vazbě na cílový enzym nemohou disociovat, a enzym
nemůže být z komplexu enzym-inhibitor uvolněn.
I mezi ireverzibilními inhibitory můžeme rozlišovat několik typů v závislosti na charakteru jejich
interakce s enzymem:
1. Inhibitory fungující jako afinitní značky (inhibitory směřované do aktivního místa)
Tento typ ireversibilních inhibitorů se váže v aktivním centru enzymu nebo v jeho blízkosti silnou
kovalentní vazbou. K vazbě dochází mezi nukleofilní skupinou (např. SH, NH2, OH) enzymu
a reaktivním centrem inhibitoru. Příkladem tohoto typu inhibitorů je aspirin, který acetyluje
serinovou hydroxylovou skupinu v aktivním centru prostaglandinsynthasy, klíčového enzymu
syntézy prostaglandinů.
2. Sebevražedné inhibitory (inhibitory založené na mechanismu katalyzované reakce)
Tyto látky jsou bez přítomnosti enzymu nereaktivní a mohou připomínat svou strukturou substrát
enzymu. V průběhu interakce s enzymem dochází na základě katalytické účinnosti enzymu k jejich
aktivaci a navázání v aktivním místě enzymu. Tím dochází k trvalému zablokování aktivního centra
a „sebevraždě enzymu“. Tradičním příkladem takovýchto inhibitorů jsou penicilíny a cefalosporiny,
které se váží ireverzibilně na D-ala-D-ala-peptidasu, enzym nezbytný pro stavbu buněčné stěny
bakterií. Specifickým příkladem sebevražedného inhibitoru je allopurinol, který je nejdříve
metabolizován na alloxantin. Tato látka se váže koordinačně kovalentní vazbou na atom
molybdenu, který je klíčový pro funkci xantinoxidasy, enzymu zodpovědného za ukládání krystalků
kyseliny močové v kloubech pacientů trpících dnavou artritidou.
15
Obr. 7. Antibiotikum cefalotin se váže kovalentní vazbou na D-ala-D-ala-peptidasu. Tento
cefalosporin mimikuje přirozený substrát tohoto enzymu, ale díky reaktivnímu -laktamovému
kruhu se na něj pevně váže.
Inhibitory tranzitního stavu
Specifickým případem kompetitivních inhibitorů jsou inhibitory tranzitního stavu.11 Enzymy
urychlují reakce snižováním aktivační bariéry vedoucí k vytvoření (přechodného) tranzitního stavu.
V průběhu toho procesu dochází k velmi pevné vazbě mezi labilním tranzitním stavem (poločas
~10-13s) a enzymem. Stabilní analoga tranzitního stavu s ideální geometrií a elektrostatickými
vlastnostmi by se měla vázat na enzym mnohem pevněji než substrát. Předpokládá se, že zvýšení
afinity může být úměrné enzymem zprostředkované akceleraci reakce.12 Tyto inhibitory mohou být
principiálně jak reverzibilní tak ireverzibilní. Přesto většina dnes známých sloučenin na této bázi
patří mezi reverzibilní kompetitivní inhibitory. Jedním z příkladů inhibitorů tranzitního stavu je
oseltamivir (Tamiflu®), který inhibuje neuraminidasu (NA) viru chřipky, enzym, který umožňuje
novým virovým částicím uvolnění z hostitelské buňky.13
Obr. 8. Tranzitní stav štěpení sialylglykosidů v průběhu uvolňování chřipkových virionů z buněk.
Oseltamivir efektivně inhibuje enzym neuraminidasu, která tento proces katalyzuje.
2.2. Receptory
Receptory jsou proteiny integrované do plazmatické membrány buněk, které zprostředkovávají
přenos signálu z vnějšího prostředí do buňky. Látky, které se váží na receptory, nazýváme ligandy a
mohou jimi být neurotransmitery, hormony, růstové faktory, ale také léčiva. Vazba léčiva může
stimulovat nebo potlačovat přirozenou funkci receptoru. Podle toho můžeme léčiva působící na
receptory rozdělovat do několika skupin (Obr. 9):14
1. Agonista receptoru
Látky, které stimulují funkci receptoru a tím mimikují funkci přirozeného ligandu nazýváme
agonisty receptoru. Tyto látky většinou připomínají svou strukturou přirozený ligand receptoru a
vyvolávají obdobnou odpověď. Přirozené ligandy mohou sloužit jako vhodný výchozí bod pro
16
design těchto látek. Pro kvantifikaci odpovědi receptoru na stimuly vyvolané ligandem používáme
střední účinnou (efektivní) koncentraci EC50, která je obdobou hodnoty IC50 u enzymů a vyjadřuje
koncentraci, při které je dosaženo 50% maximální odpovědi receptoru. Agonista receptoru může
být:
a) Plný agonista, tedy látka vyvolávající plnou odpověď receptoru.
b) Parciální agonista, který i při plné saturaci receptoru vyvolává pouze částečnou odpověď.
Tento typ agonistů se chová do určité míry jako agonista i jako antagonista. Přestože může
zabraňovat vazbě přirozeného ligandu na receptor, vyvolává částečnou aktivační odpověď.
2. Antagonista receptoru
Jako antagonisty receptorů označujeme látky, které inhibují efekt přirozeného ligandu nebo
agonisty. V případě, že není přítomen přirozený ligand receptoru, se účinek antagonisty prakticky
neprojeví. Antagonisty dělíme na:
a) Kompetitivní antagonisty. Kompetitivní antagonisté se většinou váží na stejné místo jako
přirozený ligand, ale nevyvolávají žádnou odpověď receptoru. Při zvyšování koncentrace
přirozeného agonisty dochází k jejich kompetitivnímu vyvazování z vazby na receptor a
dojde ke znovudosažení maximální odpovědi receptoru.
b) Nekompetitivní antagonisty. Tyto látky se váží většinou v alosterickém místě receptoru a
způsobují konformační změnu tohoto proteinu, která zabraňuje vazbě přirozeného ligandu
nebo agonisty do aktivního místa receptoru. Díky tomu nedochází k obnovení funkce
receptoru po zvýšení koncentrace agonisty.
3. Inverzní agonista
Inverzní agonisté jsou látky, které se váží do stejného místa jako agonisté, ale vyvolávají opačný
efekt. Tento jev je způsoben takzvanou bazální aktivitou receptoru, která může být v důsledku
vazby inverzního agonisty zcela potlačena.
Obr. 9. Přehled efektů jednotlivých typů ligandů na aktivitu receptorů. Pokud se přirozený ligand
váže na receptor a vyvolá odpověď odpovídající křivce B (zelená), pak agonista s vyšší aktivitou
bude mít křiku A (červená), kompetitivní antagonista vyvolá v přítomnosti tohoto přirozeného
ligandu posun křivky doprava (křivka C, modrá), zatímco nekompetitivní antagonista vyvolá
snížení efektu ligandu (křivka D, fialová). Pokud není přítomen přirozený ligand nebo agonista,
antagonista nevykazuje žádný efekt (křivka F, oranžová). Parciální agonista, vyvolá efekt
odpovídající křivce E (žlutá) i v nepřítomnosti ligandu. Inverzní agonisté způsobí opačný efekt než
agonista (dochází k inhibici i bazální aktivity receptoru – křivka G, černá).
17
Tabulka 4. Podle struktury a funkce rozlišujeme několik základních typů receptorů, na které může
být cílen design nových ligandů. Tabulka znázorňuje jejich stručný přehled.
Typ receptoru a struktura
Funkce
Receptory s vnitřním iontovým
kanálem - kanály řízené ligandy
Tyto receptory mají vazebné místo pro
ligand (většinou neurotransmiter).
Jejich aktivací dochází k otevření
iontového kanálu, které vede ke změně
polarity membrány.
Receptory s enzymovou aktivitou
Tyto transmembránové glykoproteiny
mají vlastní enzymatickou aktivitu.
K aktivaci enzymatické podjednotky
dochází v důsledku konformační změny
proteinu v důsledku vazby agonisty.
Tato změna je často spojena
s dimerizací receptorových proteinů.
Receptory spřažené s různými
cytosolovými proteiny
Jedná se většinou o glykoproteiny, které
v průběhu vazby ligandu často
dimerizují. Tato změna vede k aktivaci
cytosolových proteinů, jako jsou kinasy
nebo transkripční faktory, které jsou
s nimi spojeny přímo nebo
prostřednictvím dalších proteinů.
Receptory spřažené s G proteinem
(GPCR – G protein-coupled
receptors)
Aktivace receptoru vede ke
konformační změně, která mechanicky
aktivuje G-protein. Alfa a gama
podjednotky G proteinu jsou kovalentně
vázány na lipidové ocásky, které drží
GPCR v plazmatické membráně. Bez
signálu se alfa podjednotka váže s GDP.
Aktivace GPCR vede k výměně GDP za
GTP a uvolnění podjednotky alfa
z komplexu. Podjednotka alfa s
navázaným GTP putuje po plazmatické
membráně a může regulovat aktivitu
cílových proteinů v plazmatické
membráně. Takto aktivovaný protein
dává signál dalším komponentům
signalizační kaskády). Alfa podjednotka
nakonec rozštěpí GTP na GDP a spojí
se s podjednotkami beta-gama – pokud
zůstává GPCR aktivován, tak se může
celý proces opakovat.
Příklady
a) P2X pro ATP
b) Glutamátové ionotropní
receptory
c) Rodina „Cys-loop“ receptorů
 Nikotinové
acetylcholinové
receptory
 Serotoninové 5-HT3
receptory
 GABAA receptory
 Glycinové receptory
a)
Receptory s
guanylátcyklasovou aktivitou
b) Receptory se serin/threonin
kinasovou aktivitou
c)
Receptory s tyrosin
kinasovou aktivitou
Receptory spřažené s:
a) cytosolovou kinasou JAK
b) tyrosin kinasami (Src,
Zap70/Syk, Btk)
c) serin/threonin kinasou IRAK
d) caspasami a NFB
e) Receptory celulární adheze
Tyto receptory patří mezi jedny z
nejdůležitějších biologických cílů
terapie vůbec (cca 30% léčivých
látek na trhu). Až 860 genů
kóduje GPCR – 50% jsou
receptory čití. Předpokládá se
přes 350 zástupců pro endogenní
mediátory (180 GPCR je
aktivováno dobře známými
ligandy). Jeden mediátor může
aktivovat několik GPCR.
Mezi ligandy patří:
 Biogenní aminy
 Peptidy
 Aminokyseliny
 Lipidy
 Nukleosidy/tidy
 Proteasy
 Ionty
Tato představa mechanismu účinků inverzních agonistů je do značné míry zjednodušena.15
-Karboliny byly prvními látkami, u kterých byl inverzní agonismus pozorován. Tyto ligandy
18
GABAA receptorů vyvolávají opačný efekt v porovnání s benzodiazepiny, a jejich efekt je stejně
jako u benzodiazepinů inhibován antagonistou flumazenilem.15 GABAA receptory patří mezi
receptory s vnitřním iontovým kanálem (Tabulka 4) a jejich endogenním ligandem je kyselina aminomáselná (GABA), která patří k hlavním inhibičním neurotransmiterům v centrální nervové
soustavě. Benzodiazepiny účinek GABA na receptory zvyšují a vyvolávají sedativní účinek a
používají se jako anxiolytika, látky proti úzkosti. -Karboliny mohou naopak úzkost vyvolávat.16
2.3. Jaderné receptory
Specifickým typem receptorů jsou jaderné (nukleární) receptory, které se nenacházejí na povrchu
buněk na membránách, ale jsou umístěny v cytosolu. Jedná se vlastně o ligandy řízené transkripční
faktory, které ovlivňují průběh genové exprese a tím hrají centrální roli v procesu reprodukce,
vývoje, metabolismu a homeostázy buněk. Lidské buňky obsahují 48 genů pro nukleární receptory.
Po průniku přes buněčnou membránu se ligand váže na ligand-vážící doménu nukleárního receptoru
v cytoplazmě. Tato vazba ligandu iniciuje konformační změnu receptoru, která může vést
k přímému ovlivnění transkripce po translokaci komplexu do jádra, kde nukleární receptory
interagují se specifickými úseky chromozomů pomocí domény vážící se na DNA (DNA-binding
domain). Vazba ligandu na nukleární receptor může také vyvolat vazbu dalších regulačních molekul
(kofaktorů), které umožňují stimulaci nebo útlum exprese patřičných genových produktů.17, 18
„Superrodina“ jaderných receptorů zahrnuje receptory pro:
 steroidní hormony
 hormony štítné žlázy
 retinoidy
 „seco-steroidy“ – vitamín D
 „orphan“ receptory – ligandy pro tyto receptory nejsou známé
Jaderné receptory patří mezi slibné biologické cíle pro řadu onemocnění včetně diabetu a několika
druhů rakoviny, ale také různých metabolických onemocnění a Alzheimerovy choroby.19 Jedním
z příkladů léčiv založených na interakci s jadernými receptory je chemoterapeutikum tamoxifen,
které působí jako antagonista estrogenových receptorů a využívá se při léčbě estrogendependentních nádorů, zejména nádorů prsu.20
2.4. Transportéry jako biologické cíle léčiv
Transportéry (nebo také membránové přenašeče) jsou proteiny, které jsou schopny přemisťovat
ionty, živiny a metabolity přes biologické membrány. Tyto proteiny vykazují schopnost saturace a
substrátovou specificitu. Přenašeče se nacházejí jak na povrchu buněk, tak na membránách
mitochondrií a dalších organel.
Mezi farmakologicky důležité transportéry patří:
a) přenašeče iontů (pumpy)
Přenašeče iontů jsou transmembránové proteiny, které umožňují pohyb iontů proti koncentračnímu
gradientu. Jedná se o aktivní transport a tyto proteiny jsou buď ATPasy anebo dochází ke
kotransportu iontů přičemž jeden je hnaný gradientem. Například sodíkové kationty jsou aktivně
vylučovány z buněk Na+/K+ ATPasou a je jim do buněk dovoleno se vrátit pomocí kotransportérů.
Vzniklý koncentrační gradient Na+ dodává energii pro konformační změnu těchto proteinů a
umožňuje přenos (kotransport) dalších iontů např. draselných kationtů proti jejich koncentračnímu
spádu. Tyto přenašeče jsou nezbytné pro zachování správné rovnováhy elektrolytů v buňkách a
jejich funkce je klíčová pro přenos signálů po membránách i v dalších významných procesech.
19
Mezi pumpy, na které účinně cílí současná farmakoterapie, patří např.:


Na+ / K+ pumpa také označovaná jako „sodíková pumpa“. Tato ATPasa je biologickým
cílem srdečních glykosidů, jako jsou digitoxin a digoxin, které byly původně objeveny
v náprstnících (Digitalis lanata a Digitalis purpurea).
H+ / K+ pumpa, která je označována jako „protonová pumpa“. Omeprazol, jedno z vůbec
nejčastěji užívaných léčiv na světě, inhibuje funkci této pumpy v žaludeční sliznici a tím
způsobuje snížení produkce kyseliny chlorovodíkové a používá se jako antiulcerózum, tedy
látka proti žaludečním vředům. Omeprazol obsahuje chirální atom síry a používá se jak ve
formě racemátu, tak jako čistý (S) enantiomer (viz. Chirální záměna). V kyselém prostředí
dochází k přesmyku molekuly za vzniku reaktivního intermediátu, který vytváří kovalentní
vazbu s proteinem protonové pumpy (Obr. 10).
Obr. 10. Aktivace omeprazolu v kyselém prostředí.


Na+/Cl- kotransporter je cílem thiazidových diuretik.
Na+/K+/Cl- kotransporter je cílem furosemidu, který má také diuretické účinky.
b) Přenašeče neurotransmiterů
Tyto transportéry přenášejí neurotransmitery ze synaptické štěrbiny zpět do neuronů (re-uptake
neurotransmiteru). Jsou to velmi důležité biologické cíle psychofarmak. Existuje více než dvacet
typů těchto přenašečů (Tabulka 5).
Tabulka 5. Přenašeče neurotransmiterů21
Substrát
Noradrenalin
Dopamine
Serotonin
GABA
GABA/betain
Glycin
Taurin
Prolin
L-Glutamate
Vesikulární monoaminy
Vesikulární acetylcholin
Vesiculární GABA/glycin
Vesiculární glutamát
Počet podtypů
4
2
5
2
3
Název
NET
DAT
SERT
GAT1–GAT4
BGT-1
GLYT1 and GLYT2
RB16a
PROT
EAAT1–EAAT5
VMAT-1–VMAT-2
VAChT
VGAT
VGLUT1–VGLUT3
Farmakologicky relevantní jsou především transportéry monoaminů – noradrenalinu (NET),
serotoninu (SERT) a dopaminu (DAT). Látky inhibující vychytávání neurotransmiterů ze
synaptické štěrbiny do presynaptického zakončení zvyšují množství neurotransmiterů v synaptické
štěrbině. Tyto látky jsou využívány především jako antidepresiva, jejich 1. generace (tricyklická
antidepresiva) a 2. generace byly neselektivní. Jako 3. generaci antidepresiv označujeme selektivní
inhibitory zpětného vychytávání serotoninu (SSRI) např. sertralin nebo fluoxetin.
20
c) Přenašeče glukózy
Přenášejí glukózu a některé další hydrofilní látky do buněk. Buněčné membrány takřka všech
nádorových buněk obsahují více těchto proteinů v porovnání se zdravými tkáněmi. Rychlý růst
nádorů je závislý na dodávce energie v podobě glukózy a její nedostatek vede k inhibici proliferace
a smrti buněk nádorů. Inhibitory některých těchto přenašečů mají proto potenciální využití
v protinádorové terapii.22
d) ABC Transportéry (ATP Binding Cassette Transporters)
ABC transportéry jsou jednou z největších rodin přenašečů a proteinů vůbec. V současné době se o
nich nejčastěji mluví v souvislosti s mnohočetnou lékovou rezistencí u nádorových onemocnění
(multidrug resistence).23
2.5. Iontové kanály
Existuje celá řada iontových kanálů. Jedná se o proteiny, které umožňují průchod iontů přes
plazmatickou membránu, díky vodou naplněným pórům které obsahují. Studie lidského genomu
předpokládají, že naše buňky obsahují více než 400 různých iontových kanálů.24 Poruchy iontových
kanálů jsou velmi často zodpovědné za onemocnění, a to jak daná poruchou genetického kódu jako
je například cystická fibróza25 nebo epilepsie26, tak průjmová onemocnění indukovaná účinkem
toxinů na iontové kanály27.
Iontové kanály většinou dělíme podle toho, na základě jakého stimulu dochází k jejich otevírání,
nebo podle iontů, které propouštějí.
Podle spouštěcího mechanizmu můžeme rozdělit iontové kanály následovně:
a) Napěťově řízené kanály
Tato skupina iontových kanálů je z farmakologického hlediska nejdůležitější. Jejich otevření je
závislé na elektrickém potenciálu na membráně a patří sem:
 Na+ - sodíkové kanály Nav, jejich blokátory se požívají jako:
o Lokální anestetika (lidokain)
o Antiarytmika (chinidin, prokainamid)
o Antiepileptika (fenytoin, lamotrigin)
2+
 Ca - vápníkové kanály Cav jako terapeutika se používají blokátory:
o Cav1 kanálů, které jsou lokalizované v srdečním a hladkém svalstvu. Jejich blokátory
se používají jako antihypertenziva např. nifedipin, verapamil, diltiazem.
o Cav2 kanálů, které umožňují kontrolu neurotransmiterů na presynaptickém stupni.
Příkladem je léčivo ziconotid, které je indikováno na chronickou bolest.
o Cav3 kanálů, které v poslední době získaly určitou pozornost jako potenciální cíle
pro kardiovaskulární onemocnění, epilepsii a spánkové poruchy.
+
 K - draselné kanály jsou poměrně heterogenní skupinou iontových kanálů s velkým
potenciálem pro vývoj nových terapeutik.
o ATP-dependentni KATP je cílem pro sulfonylmočoviny (např. tolbutamid), které
stimuluji sekreci inzulinu blokací tohoto typu draselných kanálů v pankreatických βbuňkách.
b) Světlem řízené iontové kanály
c) Kanály řízené mechanicky
d) Kanály řízené cyklickými nukleotidy jsou typ iontových kanálů, který je potenciálně
využitelný pro vývoj nových terapeutik. Některé cAMP řízené kanály mohou sloužit jako
biologické cíle pro snížení srdečního rytmu u anginy pectoris.
e) Kanály řízené ligandy (viz. Receptory s vnitřním iontovým kanálem)
21
3. Výzkum léčiv
3.1.Přístupy k výzkumu léčiv
Většina v současnosti běžně používaných léčiv nebyla objevena na základě racionálního výzkumu,
ale byla získaná spíše náhodou, empirickým pozorováním a opakovanými pokusy na cílových
proteinech, buňkách a zvířecích modelech. Notoricky známým a výmluvným příkladem je objev
penicilínu Alexandrem Flemingem. Empirie a síla pozorovaní jsou proto velmi důležitou součástí
objevování jak nových látek, tak jejích molekulárních cílů.
Snahu o racionální přístup k vývoji léčiv můžeme pozorovat zhruba od poloviny minulého století.
Tato cesta k léčivům začíná identifikací nových molekulárních biologických cílů, které hrají
významnou úlohu v patogenezi určitého onemocnění. Smysluplný výzkum by se měl zabývat pouze
cíli, které mají nepopiratelnou relevanci k danému onemocnění, tedy takovými, jejichž interakce
s léčivy vyvolá žádoucí změnu.
Přístup k výzkumu léčiv, při kterém nejdříve hledáme relevantní biologický cíl onemocnění a pro
tento konkrétní cíl pak hledáme vhodné látky, které s ním interagují, je znám pod názvem „targetbased drug discovery“ tedy výzkum léků založený na biologickém cíli. Jeho rozvoj je spojen
s obrovským pokrokem v biochemii a molekulární biologii.
Přestože farmaceutický průmysl investoval nemalé úsilí a finanční prostředky do vývoje takovýchto
racionálních metodik výzkumu, bilancování nad úspěšností tohoto principu ukázalo, že většina látek
označovaných jako první ve své třídě (first-in-class) byla v období mezi lety 1999-2008 objevena
na základě přístupu jiného, označovaného jako phenotypic drug discovery nebo fenotypový
výzkum léčiv. Jedná se o metodiku, při níž je látka aplikovaná na buňky nebo celé živé organismy
a pozorována její odezva. Je-li dosaženo pomocí studované látky žádoucího efektu, může být dále
vyvíjena.28
Přestože jsou tyto dva přístupy koncepčně odlišné, mají řadu společných kroků. Dále se budeme
věnovat především postupu začínajícího od identifikací biologického cíle „target-based drug
discovery“. Pozornost bude věnována také odlišnostem fenotypového výzkumu léčiv. Na oba tyto
přístupy navazují preklinické a klinické zkoušky léčiv – vývoj léčiv.
Obr. 11. Dva současné přístupy k výzkumu léčiv.
22
4. Identifikace biologických cílů
4.1. Vlastnosti optimálního biologického cíle
Cesta celého procesu výzkumu léčiv začíná rozhodnutím, které onemocnění chceme léčit. Mělo by
se samozřejmě jednat o onemocnění, pro které zatím vhodnou léčbu nemáme (unmet medical need),
současná léčba je nedostatečná nebo přináší závažné vedlejší účinky. Našim druhým úkolem je najít
vhodný biologický cíl, který je relevantní pro dané onemocnění.
Optimální biologický cíl by měl mít několik základních charakteristik:
1. Biologický cíl má významnou roli v patofyziologii onemocnění a musí významně
ovlivňovat cílené onemocnění.
2. Vliv modulace daného biologického cíle je méně významný za fyziologických podmínek
než za nemoci.
3. Výhodou může být známá krystalová struktura potenciálního cíle případně jiná strukturní
informace (např. NMR struktura, homologní model atd.).
4. Zásadní je možnost připravit metodu pro testování malých molekul (biotest, bioassay),
díky které budeme schopni identifikovat úvodní látky (hity) s požadovanou biologickou
odezvou.
5. Klíčovou může být také selektivita cíle:
 Mezidruhová selektivita hraje významnou roli v léčbě infekčních onemocnění.
Naší primární snahou je najít biologický cíl mikrobiálních onemocnění, který je buď
zcela odlišný od struktur lidských buněk např. lidských enzymů, nebo vykazuje
významnou selektivitu vůči mikrobiálním funkčním prvkům např. významná
selektivita antivirotik vůči virovým polymerasám v porovnání s polymerasami
lidskými.
 Neuniformní exprese biologického cíle v jednotlivých tkáních může být zásadní
pro onemocnění, která postihují jen konkrétní orgány nebo tkáně. V současné době
se například vyvíjí léky proti chronické lymfatické leukemii a některým druhům
non-Hodgkinova lymfomu založené na inhibici PI3K, enzymu který výrazným
způsobem zasahuje do PI3K-Akt signalizační kaskády, nejčastěji zmutované dráhy u
nádorových onemocnění. Tato izoforma PI3K je exprimována především
v leukocytech a umožňuje tak cílit pouze na tuto postiženou tkáň.29
 Výhodou může být také selektivita k několika různým cílům, které vykazují
synergický efekt proti danému onemocnění. Tuto vlastnost označujeme jako
multitargeting. Jedním z významných úspěchů současné terapie nádorových
onemocnění byl objev imatinibu. Tato látka byla původně vyvíjena jako inhibitor
nereceptorové tyrosin kinasy ABL, mutované u chronické myeloidní leukemie. Až
později se ukázalo, že tako unikátní látka cílí také na další proteinové kinasy a díky
tomu může být požívaná v dalších indikacích, a dochází k potenciaci jejího účinku.30
6. Je samozřejmě výhodou, pokud je naše znalost molekulární biologie cíle na takové úrovni,
že jsme schopni predikovat potenciální vedlejší účinky a případně přímo diskvalifikovat
nevhodný biologický cíl.
23
7. Z hlediska potenciálního využití léčiva v klinické praxi je nutné brát v úvahu také otázku
duševního vlastnictví (IP, intellectual property) a možnost patentovatelnosti malých
molekul, které s vybraným biologickým cílem interagují.
4.2. Vztah genů a potenciálních molekulových biologických cílů
Zmapování lidského genomu přineslo obrovské množství dat o potenciálních biologických cílech
pro různá onemocnění.31 Množství genů kódujících proteiny je výrazně nižší než se původně
předpokládalo a je odhadováno na 19000.32 Otázkou zůstává jak tento obrovský soubor dat
interpretovat a vybrat z něj vhodné molekulové cíle, které splňují výše jmenované předpoklady.
Biologickými cíli léčiv nejsou přímo geny, ale proteiny, které jsou těmito geny kódovány. Cesta od
genu k funkčnímu proteinu není v lidských buňkách triviální. V principu probíhá syntéza proteinů
v lidském těle podle centrálního dogmatu molekulární biologie. DNA je přepsána do mRNA (v
procesu zvaném transkripce) a následně přeložena pomocí tří nukleotidových písmen tvořících
kodon do primární struktury proteinu, sekvence aminokyselin. V eukaryotických buňkách, a tedy i
v lidských buňkách, je tento proces složitější. Geny totiž nejsou složeny pouze z úseků, které kódují
sekvenci mRNA, která bude ribozomem použita pro syntézu proteinu, ale obsahuji také části, které
jsou po transkripci z tzv. pre-mRNA vystřiženy. Dochází tedy k posttranskripční modifikaci. Části
genů, které kódují funkční část mRNA, nazýváme exony a části, které jsou při posttranskripční
modifikaci vystřiženy říkáme introny. Rozstřižení a zpětné spojení pre-mRNA na mRNA se
označuje jako splicing. Transkriptom je pojem používaný pro soubor všech molekul mRNA
v určitém organismu nebo určité buňce. Na rozdíl od genomu je jeho rozsah a složení značně
závislé na endogenních i exogenních faktorech a dochází k jeho dynamické přeměně v průběhu
vývoje organismu.
Obr. 12. Centrální dogma molekulární biologie a modifikace v eukaryotických buňkách.
Tím však celý proces nekončí, takto upravená mRNA je přeložena do primární struktury proteinu.
Proteiny jsou pak dále upravovány v procesu, který označujeme jako posttranslační modifikace.
Mezi takovéto modifikace patří například částečná proteolýza, tedy rozštěpení proteinu, nebo
chemické modifikace jako jsou fosforylace/defosforylace nebo glykosylace. Existuje však mnoho
24
dalších modifikaci, které významným způsobem ovlivňují chování a aktivitu jednotlivých proteinů
a regulují jejich funkci. Výsledkem je pravděpodobně více než 1 milion různě modifikovaných
proteinů, které se mohou vyskytovat v lidských buňkách.33 Soubor všech proteinů označujeme po
vzoru genomu a transkriptomu jako proteom.
4.3. Přístupy k odhalení nových biologických cílů
Jak již bylo řečeno, díky rozluštění struktury lidského genomu máme k dispozici informaci o
genech. Některé geny a jejich strukturu jsme již znali a rozumíme jejich struktuře i funkci. Na
základě podobnosti genových sekvencí můžeme přejímat funkci genů neznámých – k tomu můžeme
využívat bioinformatických metodik. Na druhé straně existuje celá řada metodik, díky nimž
můžeme odhalovat nové biologické cíle na úrovni mRNA nebo i na úrovni proteinů.
Díky široké komplexitě převodu genetické informace na funkční proteiny by bylo nejlepší cílit
přímo na vybrané proteiny, případně jejich aktivaci nebo aktivní formu. Pro tyto účely budeme
muset ještě vyvinout dokonalejší a rychlejší technologie pro přímou identifikaci proteinů jako
biologických cílů. Naše současná dovednost nám umožňuje velmi rychle studovat mRNA a na
základě těchto poznatků definovat potenciální molekulové cíle. V této části se zaměříme na některé
běžně používané metodiky pro identifikaci a validaci biologických cílů.
4.4. Bioinformatika
Bioinformatika hraje bezesporu velmi důležitou roli v získávání informací o potenciálních
molekulových cílech pro budoucí terapii.
V prvé řadě se využívá bioinformatických přístupů ke hledání schody nebo podobnosti neznámých
genových sekvencí se známými rodinami genů. Cílem tohoto průzkumu jsou zejména geny patřící
do rodin genů, které kódují proteiny již používané jako biologické cíle. Mezi běžné metody sloužící
k vyhledávání podobností sekvencí patří BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)34 a FASTA
(Fast Alignment)35. Nalézt takovéto homology již známých genů je poměrně jednoduché pokud je
identita sekvencí vyšší než 30%.
Velmi efektivní se ukázal tento přístup pro identifikaci nových členů receptorů spřažených s Gproteinem, ale taky členů rodiny proteinových kinas. V případě receptorů spřažených s G-proteinem
bylo využito skutečnosti, že až jedna třetina genů, které tyto receptory kódují, mají pouze jeden
exon, což přispělo k jednoduššímu vyhledávání příslušných sekvencí. Vedlo to také
k bezprecedentní situaci, kdy víme o existenci některých receptorů, ale neznáme ani jejich přirozené
ligandy ani jiné agonisty nebo antagonisty – jedná se o takzvané sirotčí (orphan) receptory.
4.5. Metodiky moderní genomiky a proteomiky
Jednou z možností, jak vyhledávat nové potenciální biologické cíle je porovnávání exprese
jednotlivých genů u zdravých a nemocných (např. rakovinných) buněk. Srovnávaní buněk můžeme
provádět na úrovni genomu, transkriptomu i proteomu. Se stoupající komplexností těchto systémů
(DNA <mRNA <proteiny) stoupá také obtížnost podrobné analýzy. Genomika, transkriptomika i
proteomika, vědy které se těmito systémy zabývají, zaznamenaly v posledních letech nebývalý
rozvoj a je více než pravděpodobné, že v blízké budoucnosti sehrají zásadní roli v diagnostice a
cílené terapii a to zejména u nádorových onemocnění. Tyto metodiky umožní v budoucnu cílenou
individuální terapii na základě detailní znalosti pochodů ve zdravých a patologicky změněných
buňkách.
25
1. Identifikace molekulárních cílů na úrovni genomu
Sekvenování další generace (next generation sequencing, NGS) je prvním krokem k opravdu
personalizované léčbě pacientů, ale také k odhalení nových molekulárních cílů léčiv. Tato metodika
může být využita u onemocnění, která vyvolávají poruchy na úrovni genomu, jako jsou například
nádorová onemocnění. Většina nádorových onemocnění somatických buněk je provázena řadou
mutací, ale pouze některé z nich fungují jako spouštěče nádorového bujení. Tyto mutace se označují
jako řídící mutace („driver mutations“). V posledních několika letech bylo využito NGS pro
odhalování takovýchto mutací. Na základě těchto objevů můžeme identifikovat proteiny, jejichž
funkce je v důsledku těchto mutací ovlivněna, a cílit terapii právě na ně.36, 37 Mezi nejznámější
technologie používané v současné době pro NGS patří Ion torrent, Illumina a Pacific Biosciences
sekvenátory.38
2. Identifikace cílů na úrovni transkriptomu
Velmi elegantní a inovativní přístup ke studiu přítomnosti mRNA v buňkách umožnil vynález
DNA microarray, někdy nazývaných DNA mikročipy. Jedná se vlastně o malé sklíčko (velikosti
asi mikroskopického sklíčka), které je rozděleno na velké množství políček, z nichž na každém je
několik kopií (11-16) oligonukleotidu (25-60-ti mer). Díky precizní robotizaci je možné na jedno
takovéto sklíčko umístit až 30 tisíc těchto sad sekvenčně odlišných oligonukleotidových řetězců. 39
DNA mikročipy mají mnoho různých použití v molekulární biologii a medicíně. Například mohou
být použity pro hledání mutací genů, ke kvantifikaci exprese genu v jednotlivých buňkách nebo
tkáních atd. Ve výzkumu nových biologických cílů se tato technologie nejčastěji používá pro
porovnání hladiny mRNA ve zdravých tkáních a tkáních v určitém patologickém stavu. Výsledkem
takovéto analýzy je soubor genů (většinou desítky až stovky), jejichž exprese může být změněna
v důsledku sledovaného patologického stavu.
Obr. 13. DNA mikročipy.
Na Obr. 13 je schematicky znázorněn průběh experimentu porovnávajícího expresi mRNA ve dvou
typech buněk (např. zdravé a patologicky změněné):
A) V prvním kroku experimentu je možné provést několika různými způsoby izolaci RNA
z jednotlivých preparátů. Jedním z nich je extrakce lyzátu buněk směsí chloroformu a fenolu
v přítomnosti guanidinium thiokyanátu. Centrifugací je rozdělena vodná a organická fáze.
Směs chloroformu a fenolu denaturuje proteiny a při slabě kyselém pH je DNA na rozdíl od
RNA nedisociovaná a přechází do organické fáze. RNA je pak možné snadno odebrat
s vrchní vodnou fází.
B) V dalším kroku je pomocí reverzní transkripce připravena komplementární cDNA, případně
je množství nukleové kyseliny amplifikováno pomocí PCR. cDNA je v tomto kroku také
označena fluorescenční značkou, každý ze dvou vzorků je označen jiným barvivem (často
zeleně či červeně fluoreskujícím).
26
C) Takto připravené vzorky mohou být smíchány a aplikovány na DNA mikročip. Vzorky
z fyziologických tkání a patologických tkání je možné porovnávat i paralelně. Mikročip se
po určitou dobu (zpravidla přes noc) inkubuje za stanovených podmínek (rotace, teplota).
Během inkubace dochází k hybridizaci vláken cDNA s vlákny DNA zakotvenými na čipu.
Nespecificky vázané zbytky vzorku se odstraní opláchnutím a ty molekuly cDNA, které jsou
komplementární k oligonukleotidovým sekvencím na čipu, zůstanou navázány, zatímco
ostatní se odplaví.
D) Čip se osuší a podrobí detekci ve fluorescenčním skeneru. Celý čip se osvítí laserem, což
vyvolá excitaci fluorescenčních značek a emitované světlo se pak zaznamená a
vyhodnocuje. Pomocí fluorescenční odezvy lze kvantifikovat i relativní množství
hybridizované cDNA.
E) Výsledkem celého procesu je soubor dat ukazující, které molekuly mRNA jsou
exprimovány v buňkách zdravých i nemocných, a které jsou pouze v jednom typu buněk.
V našem modelovém případě se geny exprimované pouze v prvním vzorku projeví zeleně,
zatímco v druhém červeně, pokud jsou exprimované v obou vzorcích tak bude fluorescence
kombinací, a bude se jevit jako žlutá. Na základě podrobné analýzy této informace můžeme
predikovat, které proteiny jsou klíčové pro daný patologický stav, a můžeme takto
selektovat vhodné molekulární biologické cíle pro terapii daného onemocnění.
Hlavními výhodami této technologie jsou:
 Rychlost metodiky a paralelní skenování vysokého počtu mRNA (High-throughput)
 Široké pokrytí genomu
 Malé množství vzorku
 V porovnání se sekvenováním genomu – nižší cena a délka trvání experimentu
Nevýhody pro identifikaci cíle:
 Množství mRNA nemusí korelovat s množstvím proteinu, který je exprimován
 Nezohledňuje posttranslační modifikace a interakce proteinu
3. Identifikace na úrovni proteomu
Přestože sekvenování DNA a profilování mRNA přináší významný pokrok a urychlení vyhledávání
potenciálních biologických cílů, hladiny těchto nukleových kyselin nemusí vždy odpovídat
exprimovaným proteinům a jejich množství. Pouze metody proteomiky jsou schopny přesně určit a
kvantifikovat proteiny zodpovědné za určitý projev ve fenotypu. Metody proteomiky užívané pro
identifikaci molekulárních cílů můžeme rozdělit do tří skupin. Jsou to:
A) Klasické metody využívající gely
Nejčastější gelovou metodou používanou v současné proteomice je 2D gelová elektroforéza (2DPAGE).40 Po extrakci proteinů z biologického materiálu (provádí se řadou postupů od jednoduché
precipitace směsí trichloroctové kyseliny a acetonu, po složité metodiky umožňující šetrnou izolaci
většiny proteinů)41, 42, následují dvě fáze gelové separace podle isoelektrického bodu (pI) a podle
jejich molekulové hmotnosti (SDS PAGE). V první fázi dochází k takzvané izoelektrické fokusaci
využívající gel s imobilizovaným pH gradientem (tento gelový proužek je označován jako IPG
strip), na kterém protein putuje do místa s takovým pH, které odpovídá jeho izoelektrickému bodu.
Takto rozdělené proteiny jsou následně denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) případně
dalšími činidly (β-merkaptoetanolem). Díky této denaturaci dojde k potlačení terciární a sekundární
struktury proteinu (protein se „narovná“) a naváže se na něj takové množství SDS molekul, které
proporcionálně odpovídá jeho molekulové hmotnosti. Náboje proteinu jsou takto efektivně
maskovány SDS skupinami a jejich množství je úměrné velikosti proteinu. Proto je rozdělení
27
proteinů v druhé dimenzi odpovídající jejich molekulové hmotnosti.43 Tato technika umožňuje
efektivní rozdělení stovek různých proteinů najednou, přičemž mohou být odlišeny jak různé
proteiny, tak jejich posttranslační modifikace.
Proteiny mohou být na gelu vizualizovány mnoha barvícími metodikami (Coomassie, stříbro,
Flamingo, SYPRO). Pro identifikaci je nejvhodnější kombinace 2D-PAGE s hmotnostní
spektrometrií (MALDI-TOF, MS/MS), která následuje po vyříznutí vybraného proteinu z gelu a
jeho digesci pomocí trypsinu.
Tato metodika může být vhodně využita k profilování exprese proteinu v jednotlivých tkáních nebo
buňkách a to jak po kvalitativní, tak kvantitativní stránce. V současně době je analýza prováděna
pomocí komerčně dostupného programu, který znatelně urychluje celý postup (např. Image Master
2D Platinum, PDQuest, Z4000, Phoretix 2D Advanced a další).40
B) Metody využívající moderní chromatografické postupy v kombinaci s pokročilými metodami
hmotnostní spektrometrie – „shotgun metody“
Mezi shotgun metodiky často používané v proteomice paří:
 LC-MS/MS - Kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RPHPLC) kombinovaná s MS/MS analýzou umožňující identifikaci proteinu o velmi nízkých
koncentracích.
 Multidimenzionální technologie pro identifikaci proteinů (MudPIT, Multidimensional
protein identification technology). Tato technologie obchází 2D-PAGE a využívá
dvoudimenzionální separaci pomocí kapalinové chromatografie po přímém rozštěpení
proteinů trypsinem. Proteiny jsou rozděleny pomocí dvou stacionárních fází - silného
iontoměniče kationtů a reverzní fáze. Tímto procesem je dosaženo rozdělení proteinů jak
podle náboje, tak podle hydrofobního charakteru.44
 Metody využívající izotopové značení - Izotopově kódované afinitní značky (ICAT,
isotope-coded affinity tags) se používají pro kvantifikaci proteinů například u patologicky
změněných buněk. Princip metody je založen na porovnávání dvou vzorků (např. normální a
rakovinné buňky), z nichž jeden je označen značkou s izotopem uhlíku 12C a druhý
s izotopem 13C. Díky odlišné molekulové váze takto označeného proteinu, muže být míra
exprese tohoto proteinu porovnána v průběhu jednoho měření pomocí LC-MS/MS analýzy.
Podobně funguje také metodika ICPL (isotope-coded protein labels).
C) Proteinové mikročipy – „protein microarrays“
Proteinové mikročipy fungují na obdobném principu jako DNA mikročipy s tím rozdílem, že na čip
nejsou vázány oligonukleotidové řetězece, ale komponenty vážící proteiny (protilátky, aptamery,
jiné proteiny pro sledování protein-proteinových interakcí, substráty enzymu a podobně). V případě
identifikace biologických cílů se jedná zejména o protilátky, přičemž postup pro identifikaci
proteinů je velmi obdobný jako v případě DNA mikročipů. Oproti jednoduchému provedení DNA
mikročipů je v tomto případě příprava mikročipů značně obtížnější.45
4.6. Dekonvoluce biologických cílů ve fenotypovém výzkumu léčiv
Na rozdíl od výzkumu založeného na biologickém cíli je u fenotypového přístupu identifikace
(dekonvoluce) biologického cíle druhou fází výzkumu, která následuje po screeningové fázi. Také
metodiky odhalení biologického cíle jsou odlišné. Většina těchto metodik je založena na faktu, že
v této fázi výzkumu je již známa molekula, která s daným biologickým cílem interaguje, zatímco
není znám tento biologický cíl. Většina metodik pro dekonvoluci biologického cíle látek získaných
fenotypovým screeningem je proto založena na afinitě nebo aktivitě dané molekuly vzhledem
k potenciálnímu biologickému cíli.
Mezi nejdůležitější používané metodiky patří přístupy založené na chemické proteomice:
28
A) Afinitní chromatografie a příbuzné metodiky
Tyto techniky jsou založené na imobilizaci screeningového hitu na pevné fázi a následné inkubaci
takto vázané molekuly s potenciálními biologickými cíli (např. s buněčným lyzátem).
Neinteragující buněčné komponenty jsou následně odstraněný opakovaným vymýváním, zatímco
interagující proteiny zůstávají navázány na imobilizovaném ligandu. Tyto vázané proteiny jsou
následně vymyty pomocí specifických technik (např. pomocí roztoku volného ligandu) a protein
(nebo proteiny) jsou identifikovány většinou pomocí shotgun metodik zmíněných výše.
Alternativou k tomuto klasickému provedení afinitní chromatografie může být použití
modifikovaného hitu obsahujícího skupinu vhodnou pro „click“ reakce (azid, alkin). Tím můžeme
ulehčit interakci ligandu s potenciálním molekulovým cílem a k „vychytání“ komplexu ligand-cíl
využijeme např. mědí katalyzovanou „click“ reakci.
Tento alternativní způsob byl doplněn možností vytvoření pevné kovalentní vazby mezi ligandem a
cílem založené pomocí fotoreaktivní skupiny zavedené do struktury ligandu (Obr. 14).46
Obr. 14. Afinitní přístupy k dekonvolucibiologického cíle.46
B) Aktivitní proteinové profilování (ABPP, activity-base protein profiling)
Aktivitní proteinové značky (activity based probes, ABP) jsou analogické poslednímu příkladu
afinitních metod. Jedná se o malé molekuly, které jsou specifické pro určitou skupinu enzymů
(proteasy, hydrolasy, atd.), na které se mohou kovalentně vázat do aktivního místa. Mají většinou tři
části - reaktivní skupinu specifickou pro daný enzym (většinou elektrofilní skupinu reagující
s nukleofilními aminokyselinami v aktivním místě např. cysteinem a serinem), linker, a
reportérovou skupinu (biotin, fluorescenční značku). Nejsou specifické pro jeden enzym, ale pro
celou skupinu enzymů.
29
5. Validace biologického cíle
Nedostatečná validace biologického cíle je považována za primární příčinu selhání kandidátů
v pozdních fázích klinického vývoje, které má za následek hlavní ekonomické ztráty. Validace cíle
je proto jeden z klíčových okamžiků v rozhodovacím procesu ve farmaceutickém průmyslu.
Validace biologického cíle obvykle zahrnuje tato prověření:




Daný biologický cíl se vyskytuje v buňkách nebo tkáních, které mají relevanci k danému
onemocnění.
Může být ovlivněn molekulou, která má charakter léčiva.
Může být připraven screeningový test pro tento cíl.
Musí vykazovat požadovaný fenotyp na buněčných nebo zvířecích modelech.
Přestože plná validace cíle proběhne vlastně až při klinických zkouškách, vyloučení
neperspektivních cílů na začátku procesu je jednou z hlavních výzev současného výzkum a vývoje
léčiv. Základem celého procesu je hluboká znalost funkce biologického cíle v buňce a organismu,
která musí být založena jak na pozorováních in vitro, tak in vivo.
Mezi postupy používané ve validačním procesu in vitro, patří metodiky sledující interakce mezi
proteiny, které mohou identifikovat potenciální toxicitu účinku na biologický cíl. Při validaci
biologických cílů se v tomto kontextu uplatňují zejména proteinové mikročipy (viz. výše) a yeast
two-hybrid system (viz. níže). Metody potlačování nebo naopak zvýšené exprese konkrétních
proteinů v buňkách slouží k pochopení funkce biologických cílů jak v kontextu jednotlivých buněk,
tak i na úrovni organismů. Použití knock-out genů, antisense oligonukleotidů a RNA interference
patří mezi stěžejní postupy, které za tímto účelem využíváme.
5.1.
Yeast two-hybrid systém
Jedná se o nástroj používaný v molekulární biologii pro studium protein-proteinových interakcí u
eukaryotických proteinů pomocí kvasinek. Základní princip této metodiky je založen na
rekonstrukci funkčního transkripčního faktoru kvasinek, který má dvě nepostradatelné části. Jsou to
DNA vazebná doména (DBD) zajištující lokalizaci na specifickém místě DNA a aktivační doména
(AD), vlastní katalytická doména umožňující transkripci. Transkripce genu je zahájena, pokud jsou
tyto dvě domény v dostatečné blízkosti, ale nemusí spolu přímo interagovat. Při jejich úplném
oddělení dochází k inaktivaci transkripčního faktoru. To umožňuje fúzování jak DBD tak AD
s jedním proteinem a sledovaní jejich chování. Pokud spolu proteiny interagují, domény se
dostatečně přiblíží a dochází k aktivaci transkripčního faktoru a transkripci cílového genu.
Protein fúzovaný s DBD doménou označujeme jako „bait“ protein (z anglického návnada). Tím
může být právě náš potenciální biologický cíl. AD je pak fúzována s knihovnou potenciálních
interakčních partnerů, tyto proteiny označujeme jako „prey“ proteiny (z anglického kořist). Detekci
takovéto odpovědi pak pozorujeme jako růst určité kolonie kvasinky (například v prostředí bez
esenciální aminokyseliny), nebo pomocí specifické enzymové aktivity (např. vznik modrého
zbarvení kolonie v důsledku aktivace -galaktosidasy, která rozštěpí X-Gal na galaktózu a modré
barvivo). Pokud používáme knihovnu cDNA pro expresi neznámých integrujících pray proteinů,
musíme následně proteiny poskytující pozitivní odezvu izolovat a identifikovat. Výhodami tohoto
30
procesu je jednoduchost provedení a nízké náklady, možná automatizace celého procesu a
identifikace i poměrně slabých interakcí. Na druhé straně, tyto metodiky poskytují často falešně
pozitivní výsledky, způsobené nespecifickou vazbou prey proteinu nebo schopností indukovat
transkripci bez efektivní interakce s bait proteinem.47
5.2.
Antisense oligonukleotidy
Základní koncept využití antisense oligonukleotidů je velmi jednoduchý. Sekvence nukleové
kyseliny (většinou modifikované DNA), která je komplementární s mRNA, se na ní může navázat.
Takto vzniklý duplex mRNA s antisense oligonukleotidem může a) zabránit translaci genetické
informace do proteinu a b) může být rozpoznán RNasou H, která mRNA rozštěpí. Přirozená DNA
je málo stabilní a vykazuje některé toxické efekty (např. poruchu krvetvorby)48, proto se dnes
využívají především modifikované oligonukleotidy, a to jak v části fosfátové, tak v části cukerné.
Pomocí těchto oligonukleotidů můžeme selektivně zabránit expresi určitého proteinu jak
v buněčných kulturách, tak v celých organismech, a sledovat význam daného proteinu pro daný
patologický stav a posoudit případnou toxicitu způsobenou jeho nedostatkem. Primáni příčinou
omezeného použití antisense oligonukleotidů jako terapeutik je jejich omezená biologická
dostupnost.49
5.3.
RNA interference (RNAi)
RNA interference je proces, jímž buňky regulují genovou expresi v posttranskripční fázi
(posttranscriptional gene silencing). Podobně jako antisense technologie je tento proces založen na
komplementaritě nukleových kyselin a rozštěpení cílové mRNA. Jedná se o přirozený proces, který
buňky běžně využívají, a pro který mají specifický aparát. Tento mechanismus může být spuštěn
jak endogenními RNA molekulami označovanými jako microRNA (miRNA), u kterých se
předpokládá, že regulují expresi až třiceti procent našich genů. Spuštěn může být také exogenními
dvouvláknovými RNA molekulami, které označujeme jako short interfering RNA (siRNA). Tyto
siRNA jsou využívány v procesu validace biologických cílů pro utlumení genové exprese (knockdown) sledovaného proteinu a identifikaci jeho funkce v buňkách a celých organismech.
5.4.
Využití „knock-outovaných“ organismů
Přestože metodiky uváděné výše nám mohou poskytnout mnoho užitečných informací o funkci a
interakcích biologického cíle s dalšími proteiny, nejdůležitější pro validaci biologického cíle jsou
zvířecí modely. V tomto procesu jsou dnes využívány organismy jako jsou octomilka (Drosophila
melanogaster), háďátko obecné (Caenorhabditis elegans) nebo zebřička - dánio pruhované (Danio
rerio). Nejdůležitější jsou ale modely savčí, zejména myší. V současné době jsme schopni vnášet
specifické genové modifikace do genomu myší pomocí embryonálních kmenových buněk a cíleně
připravovat modifikované organismy, které mohou sloužit jako modely různých patologických
stavů. Za objev této technologie získali Mario R. Capecchi, Martin J. Evans a Oliver Smithies
v roce 2007 Nobelovu cenu v oblasti medicíny a fyziologie. Takto modifikované organismy
označujeme jako cíleně „knock-outované“(KO) a tento proces označujeme jako cílení genů („gene
targeting“). Bohužel zatím nejsme schopni tuto metodologii v plném rozsahu přenést na další
relevantní modely jako je potkan. Alternativou k této cílené mutagenezi je náhodná mutageneze
prováděná např. alkylačními činidly. Proces náhodného knock-outu je označován jako „gene
trapping“.50-52
31
6. Objev Hitu
Biologický test (assay, bioassay)
6.1.
V předchozí kapitole jsme si řekli, že mezi základní vlastnosti biologických cílů, které hledáme,
patří možnost připravit biologický test (biotest, assay nebo také bioassay), pomocí kterého bude
možné vyhledávat nové látky s definovanou aktivitou a určit její míru. Jinými slovy biotest sleduje,
zda má látka danou biologickou aktivitu a determinuje rozsah této aktivity. Systematické
vyhledávání látek, které vykazují nadprahovou odezvu v takovém biotestu označujeme jako
screening.
Biologické testy můžeme rozdělit podle provedení na in vitro nebo in vivo.
Mezi in vitro metodiky řadíme:
1) Biochemické testy, které využívají purifikované proteiny získané rekombinantní
technologií a následnou purifikaci. Jako expresní systémy se používají rychle rostoucí
bakteriální, hmyzí nebo savčí buňky. Biochemické testy se využívají zejména u enzymů,
ale také u receptorů. Jedná se o testy, u kterých je sledována afinita potenciálních ligandů
k danému proteinu.53
2) Buněčné testy, u kterých se využívají:
a) nezměněné buňky,
b) patologicky poškozené buňky např. nádorové (mohou sloužit jak pro cílený výzkum, tak
pro fenotypový screening),
c) savčí buňky (např. ovariální buňky křečíka čínského CHO), ve kterých je uměle zvýšena
exprese sledovaného proteinu. Tato technologie se obecně používá u membránových
receptorů, iontových kanálů a nukleárních receptorů,
d) mikrobiální buňky (bakteriální kultury, kvasinky) nebo buňky napadené buněčnými
parazity (viry).
In vivo metodiky hledání hitů jsou v současné době zaměřené na fenotypový screening, kde se jako
modelové organismy užívají zejména octomilky (Drosophila melanogaster), dánio pruhované
(Danio rerio) nebo drápatky vodní (Xenopus laevis).54
U některých onemocnění je poměrně obtížné používat relevantní biochemické testy nebo buněčné
modely, a je nutné použít modely zvířecí. Trendem posledních deseti let v tomto oboru je
nahrazování savčích modelů (myší) za jednodušší zvířecí modely jako dánia.55 Tento proces je
označován jako replacement. U těchto organismů mohou být genetickou manipulací navozeny
patologické stavy odpovídající stavům u člověka (např. zánět)56, případně jim může být
transplantována část lidské tkáně (např. tkáň nádorová)57.
Výhodou je hlavně jejich použitelnost v paralelních automatizovaných screeningových testech, ale
také nižší náklady a nenáročnost chovu. U těchto modelů je výhodou přímé testování toxicity
použitých látek.
Samozřejmou komplikací biotestů prováděných přímo na zvířatech je etický aspekt spojený se
skutečností, že zvíře trpí. Všichni pracovníci proto musí podstoupit speciální kurz, a experimenty
musí být schváleny etickou komisí. Dalším problémem je, že pozorované farmakokinetické i
32
farmakodynamické parametry mohou být u pokusných zvířat jiné než u člověka a pozorovaná
fenotypová odpověď může být způsobena nezávislými faktory.
6.2. Strategie objevu hitů 1 - Screening
Existuje řada metodik používaných pro identifikaci nových hitů a také mnoho měřítek, podle
kterých můžeme screeningové metody rozdělovat.
Podle množství látek, které jsme schopni otestovat rozlišujeme:
1) Low-throughput screening (LTS), za který považujeme veškeré metody prováděné na
malém množství vzorků, maximálně do 10 000 bodů testu provedených za jeden den. LTS
je velmi často prováděný na akademických pracovištích konvenčními metodikami „na
stole“.
2) High-throughput screening (HTS) je rychlé (většinou in vitro) testování zahrnující 10 000
– 100 000 bodů testu za den, které je prováděno roboticky na destičkách („plate“) s 384mi,
1536ti nebo 3456ti jamkami. Odhaduje se, že se v roce 1990 otestovalo cca 200 000
sloučenin za rok, v 1995 už 6 milionů sloučenin za rok, v roce 2000 už to bylo asi 50
milionů sloučenin za rok.
HTS je poměrně mladá disciplína a její počátky bychom nalezli v devadesátých letech
dvacátého století. Od té doby se výrazně změnily jak testovací postupy a technologie při
nich používané, tak přístup k testovaným látkám. V devadesátých letech byla příprava testu
oddělená od vlastního HTS procesu, pracovalo se v 96-ti jamkových destičkách. Většina
skupin v té době měla k dispozici pouze malé knihovny látek (50-300 tisíc látek).
S přístupností HTS technologie se ale přístup farmaceutických firem začal rapidně měnit, a
tyto společnosti začaly budovat první opravdu rozsáhlé knihovny sloučenin (500 tisíc až 1,5
milionu sloučenin). Tento přístup sebou přinesl nutnost zvýšení objemu testovaných vzorků,
zlepšení automatizace a koordinaci HTS s přípravou biologických testů. Po roce 2000 se
v HTS testovalo podle logiky „vše nebo nic“. Přestože v současnosti řada projektů vyžaduje
screenování celé knihovny látek, je zde zřetelná snaha nacházet racionální omezení tohoto
procesu. Hlavním hlediskem se stává kvalita získaných hitů a její validace.
3) Ultra high-throughput screening (uHTS), za který se považují screeningové testy nad
100 000 sloučenin za den.
Podle metody screeningu můžeme rozeznat:
1) Náhodný screening, u kterého se testují většinou všechny látky knihovny, protože nemáme
představu, jaké látky by se mohly na daný biologický cíl vázat.
Obr. 15. Struktura sloučenin získaných náhodným screeningem a screeningem intermediátů
syntézy.
33
S příchodem HTS a uHTS se stal tento přístup velmi přínosným a poskytujícím řadu hitů,
které mohou být využity v dalších stupních výzkumu nových léčiv. Díky screenování jak
přírodních, tak syntetických látek byla takto objevena celá řada léčiv a skupin léčiv (např.
antibiotika streptomycin a tetracyklin a také celá skupina hypolipidemik statinů).
Jeho podmnožinou je také screening intermediátů syntézy, mezi kterými jsou často
nalézány biologicky aktivní látky. Příkladem byl objev merkaptopurinu při syntéze
inhibitorů dihydrofolatreduktasy. Optimalizace jeho struktury vedla k objevu jeho proléčiva
azathioprimu, který se používá jako imunosupresivum.
2) Cílený screening („focused/targeted screening“), který využívá pouze zúženou skupinu
látek vybranou na základě racionálních vědomostí (virtuální screening) nebo přímém
zaměření knihovny (na kinasy zaměřená knihovna u kinas, nukleotidová knihovna u
virových polymeras). V některých případech jsou testy velmi nákladné (na druhé straně
mohou poskytovat exkluzivní informace související např. s mechanismem účinku) a tímto
způsobem můžeme výrazně snížit jejich finanční náročnost.
3) Screenování starých léčiv na nové biologické cíle („drug repurposing screen“, „drug
repositioning screen“), které je jedním z moderních trendů směřující ke zvýšení efektivity
farmaceutického výzkumu. Tento přístup je možné využívat na několika úrovních, může
využívat nejen schválené látky, ale také látky v pozdních fázích klinického vývoje a látky,
která byly vyřazeny z klinických zkoušek v důsledku nedostatečného účinku u původní
indikace. Schválená látka může být rovnou využita jako klinický kandidát, nebo může být
její struktura dále upravována s vědomím, že látka má požadované farmakokinetické
parametry, které umožňují její další vývoj. Tato optimalizace je pak někdy nazývána jako
„selective optimization of side activities (SOSA)“.58 Příkladem tohoto přístupu je výzkum
nových antagonistů endotelinových receptorů typu A. Tyto receptory jsou zodpovědné za
vasokonstrikční efekt endotelinů a jejich antagonisté mohou být využiti v léčbě ischemické
choroby srdeční. Při úvodním screenování bylo využito známých antibakteriálních látek a
jako hit byl identifikován sulfathiazol. Optimalizace struktury vedla k vysoce účinnému
derivátu BMS-207940.59
Hlavními výhodami této metodiky je znalost farmakologického profilu látek a jejich
toxicity. Tyto informace mohou drastickým způsobem snížit náklady na celý proces
výzkumu a vývoje léčiva. Používání těchto léčiv také umožňuje jejich opětovné patentování
pro nové indikace a prodloužení jejich přínosu pro danou společnost.
Obr. 16. Příklad využití SOSA přístupu při identifikaci nových hitů.
34
6.3. Strategie objevu hitů 2 – využití biologických informací
Z historického hlediska je využití biologických informací nejstarším přístupem k výzkumu léčiv.
Informace založené na pozorování účinků látek u lidí, zvířat a mikroorganismů byly a stále jsou
jedním z nejhodnotnějších zdrojů léčiv.
A) Pozorování u lidí
a) Etnofarmakologie využívající letitých zkušeností tradiční medicíny je do dnes jedním
z nejvyužívanějších zdrojů potenciálních látek využitelných pro farmaceutický výzkum a
vývoj. Tento přístup stojí za objevem řady dodnes používaných látek nebo jejich derivátů.
Mezi takto objevené látky patří např. digitalis, chinin, curare, kokain, reserpin atd. Hlavním
úskalím této metodiky je jednak časová náročnost sběru dat a nízká důvěryhodnost zdrojů.
V případě úspěšné identifikace aktivní látky (nebo směsi látek) je nezbytná purifikace,
identifikace aktivní složky a její totální syntéza pro ověření struktury. Jedním
z modernějších příkladů využití tradiční medicíny je objev analogů artemisininu, který je
aktivní látkou pelyňku ročního (Artemisia annua), a který byl pro své antimalarické
vlastnosti znám v čínské medicíně již před naším letopočtem. Jeho semisyntetický derivát
artemether je dnes jedním z nejdůležitějších antimalarik používaných proti multirezistentním kmenům (Obr. 17).60
Obr. 17. Struktura artemisininu, aktivní látky pelyňku ročního, která sloužila jako hit při designu
artemetheru jejího semisyntetického analogu.
b) Klinické pozorování je spojeno se sběrem dat a identifikací vedlejších účinků klinicky
používaných léčiv nebo látek v klinických testech. Přestože klinický sběr dat je primárně
orientován na odhalení negativních vedlejších účinků, může být velmi účinným zdrojem
informací vedoucích k získání nových výchozích struktur, jejichž optimalizací mohou být
připravena léčiva s jinou indikací. Například vedlejším účinkem morfinu je potlačení kašle
(funguje jako antitusikum) a na jeho základě byl vyvinut dexomethorfan (Obr. 18).
Obr. 18. Optimalizace klinicky pozorovaných vedlejších účinků u morfinu. Přímý „drug
repurposing“ u tenofoviru.
c) Nové použití starých léčiv (drug repurposing nebo drug repositioning) je možné
v případě, že léčivo vykazuje dostatečný účinek v jiné indikaci a je možné jej pro ni použít
přímo. Příkladem úspěšného „drug repurposingu“ je využití tenofoviru, který byl původně
35
schválen v roce 2001 pro léčbu HIV/AIDS, pro léčbu hepatitidy typu B (HBV). U pacientu
trpících koinfekcí HIV/HBV vykazoval tenofovir nejen podstatné zlepšení HIV infekce, ale
také velmi dobré výsledky proti HBV s prakticky nulovým vznikem rezistence, přestože se
na základě in vitro studií předpokládalo, že účinek tenofoviru proti HBV je příliš omezený.
Tenofovir byl schválen v roce 2008 i pro léčbu HBV infekce a dodnes je lékem s nejnižší
mírou rezistence vůči tomuto onemocnění.
d) Průmyslové chemikálie jako zdroj nových léčiv stojí za objevem účinků disulfiramu,
který byl původně používán jako antioxidat při výrobě gumy a dnes se používá jako
podpůrná léčba alkoholismu. Tato látka působí jako inhibitor acetaldehyddehydrogenasy a
způsobuje nauzeu (pocit na zvracení) a zvracení po požití alkoholu. Klasickým příkladem je
také nitroglycerín.
B) Pozorování na zvířatech
Pozorování na zvířatech patří k základním metodikám používaných ve farmacii od pradávna.
Mezi zajímavé objevy, které byly učiněny na zvířatech, patří třeba objev warfarinu, nejčastěji
používané antikoagulační látky na světě. Za objevem této látky stojí pozorování úmrtí dobytka
v Kanadě a na severu USA ve dvacátých letech minulého století. Jako příčina těchto úmrtí byla
identifikována látka z plesnivého sena obsahujícího rostlinu komonici bílou (Melilotus alba),
které bylo v nelehké době, těsně po hospodářské krizi, zkrmováno. Touto látkou byl dikumarol.
Původně se měla tato látka používat jako rodenticid (jed proti krysám), ale účinky dikumarolu
byly příliš pomalé a studiem obdobných kumarinových derivátů byl získán warfarin. Od
poloviny padesátých let minulého století se pak tato látka ukázala jako vhodný prostředek k
zamezení vzniku trombóz (Obr. 19).61
Obr. 19.
Jak jsme si již řekli, v poslední dekádě zaznamenal rozkvět také screening na menších
živočišných druzích, jako je dánio pruhované, který přináší příslib objevu nových léčiv zejména
proti psychiatrickým, nervosvalovým, ale i autoimunitním onemocněním.
C) Pozorování na mikroorganismech
Díky pozorování na mikroorganismech byla objevena celá řada antibiotik, včetně nejznámějšího
z nich - objevu penicilinu
6.5. Strategie objevu hitů 3 – design analog
Jako nepřímý zdroj hitů může úspěšně sloužit také akademická a patentová literatura. V mnoha
případech je na akademické půdě prováděn základní biologický výzkum, který nemá ambice dovést
látky do klinických studií a je spíše orientován na pochopení buněčných pochodů, avšak přináší
zajímavé poznatky o struktuře ligandů a látek potenciálně využitelných ve farmaceutickém
výzkumu. Takováto metodika byla užita například při identifikaci prvních plných antagonistů
estrogenů a objevu fulvestrantu.62 Z literatury bylo známo, že do pozice 7 estradiolu je možné
zavést dlouhý řetězec bez ztráty vazby na estrogenový receptor, tento fakt byl původně využit pro
36
afinitní izolaci estrogenového receptoru, později ale vedl k objevu prvních antiestrogenů užívaných
např. v terapii rakoviny prsu. 63
Enormní konkurenční tlak nutí farmaceutické firmy velmi bedlivě sledovat konkurenty a snažit se
v případě objevu nové látky s unikátním mechanismem účinku (tzv. „first-in-class“), flexibilně
zareagovat, využít všechny dostupné informace a přinést látku s obdobnými účinky na trh v co
nejkratší době (tato analoga pak nazýváme „me too“). Tlak na přípravu těchto látek je o to větší o
co lukrativnější segment trhu se jedná. V některých případech je očividná snaha vyhnout se pouze
patentovým restrikcím při zachování nebo zvýšení účinnosti léčiva.
Obr. 20. Design analog založený na hitech z literatury.
Analoga dělíme do tří základních typů:
a) Opravdová analoga („true analogues“), které se vyznačují jak funkční, tak strukturní
podobností. Příkladem mohou být inhibitory fosfodiesterasy typu 5, pro terapii erektilní
disfunkce.
Obr. 21. Sildenafil a jeho analoga.
b) Strukturní analoga („structural analogues“), která mají strukturní podobnost, ale odlišné
farmakologické vlastnosti. Jednoduchým příkladem jsou steroidní hormony estradiol a
testosteron, jejichž účinky na lidské tělo jsou diametrálně odlišné.
Obr. 22. Steroidní hormony rozhodující o sekundárních pohlavních znacích.
Design analog vycházející z hitů nalezených v literatuře má velmi důležitou funkci a řadu
pozitivních aspektů jako je zlepšení vlastností původní látky, využití stávajících informací o
farmakologii a toxikologii, možnost srovnání s výchozí látkou při klinických testech,
37
finančně výhodný vývoj, ale může také vést k objevu nové aktivity. Na druhé straně, pokud
se nejedná o jeho čistou formu (jako u fluvestrantu), tak postrádá originální intelektuální
vklad. U „me too“ léčiv existuje možnost zkřížené rezistence, přestože neslibují stejný
farmakologický profil. Zavádění takového léčiva vyžaduje značné marketingové úsilí díky
zvýšené konkurenci.
Obr. 23. Příklady strukturních a funkčních analog.
c) Funkční analoga („functional analogues“), nemají strukturní podobnost, ale vykazují
obdobné farmakologické vlastnosti. Učebnicovým příkladem jsou sedativa diazepam,
zolpidem a zopiklon.
6.6. Strategie objevu hitů 4 – racionální design léčiv
Přestože byl racionální přístup k terapii vždy snem farmaceutů a lékařů, o racionalizaci přístupů
k vývoji nových léčiv můžeme mluvit až od poloviny minulého století, kdy nám pokrok
v biochemii a molekulární biologii začal poskytovat dostatek informací o funkci buněk a patogenezi
některých onemocnění na molekulární úrovni.
A) Racionální přístup založený na přirozených ligandech a mediátorech
Jedním z těchto milníků byl objev neurotransmiterů, který je spojen s objevem jednoho z prvních
léčiv, které považujeme za navržené na racionálním základě – L-DOPA.
Obr. 24. Enzymy účastnící biosyntézy a rozpadu dopaminu v mozku, patří mezi nejdůležitější
biologické cíle, které našly využití v současné léčbě parkinsonismu.
38
Tato látka se používá k léčbě Parkinsonovy choroby, která představuje druhé nejčastější
neurodegenerativní onemocnění. Toto onemocnění je charakterizováno ztrátou dopaminergních
neuronů v oblasti substantia nigra (součást bazálních ganglií ve středním mozku) a inkluzemi
v neuronech, které jsou tvořeny nerozpustnými proteinovými agregáty (označovanými jako Lewyho
tělíska). Parkinsonova choroba vede k progresivní poruše hybnosti charakterizované třesem,
sníženou pohyblivostí a ztuhlostí.64
Objev dopaminu jako neurotransmiteru učinil v roce 1958 Arvid Carlsson a získal za něj Nobelovu
cenu za fyziologii nebo lékařství v roce 2000.
Obr. 25. Inhibitory enzymů účastnících se na degradaci L-DOPA a dopaminu, používané v léčbě
Parkinsonovy choroby.
Nicméně význam dopaminu pro Parkinsonovu chorobu odhalil v šedesátých letech Oleh
Hornykiewicz, který jako první prokázal deficit dopaminu v mozku pacientů s tímto onemocněním
a také poprvé experimentoval s racemickou DOPA (dihydroxyfenylalanin) jako léčbou. L-DOPA je
aminokyselina, která na rozdíl od dopaminu přechází přes hematoencefalickou bariéru a je DOPAdekarboxylasou přeměňována na dopamin v mozku, přestože je značné množství L-DOPA
rozloženo před přechodem do mozku (až 95%). Proto se v současné terapii L-DOPA používá
v kombinaci s periferními inhibitory DOPA-dekarboxylasy jako jsou S-(-) karbidopa, benserazid a
inhibitory dalších enzymů účastnících se degradace dopaminu, kterými jsou katechol-Omethyltransferasa (COMT) a monoaminooxidasa-B (MAO-B).65
B) Structure-Based Drug Discovery (SBDD) – výzkum léků založený na struktuře biologického
cíle
Tento přístup vyžaduje strukturní informaci (X-ray strukturu, protein NMR) biologického cíle nebo
jeho aproximaci v podobě modelu. Protipólem SBDD je v moderní medicinální chemii LigandBased Drug Discovery (LBDD) – výzkum léků založeného na struktuře ligandu, u kterého není
známa strukturní informace biologického cíle.
Jako klasický příklad přístupu založeného na struktuře biologického cíle je často uváděn objev
inhibitorů angiotensin konvertujícího enzymu (ACE), respektive objev kaptoprilu. Zavedení těchto
látek do klinické praxe znamenalo významný posun v léčbě hypertenze. Mechanismus účinků
těchto látek je založen na inhibici renin-angiotensinového systému, který je za fyziologických
podmínek aktivován v případě, že dojde k poklesu tlaku. Renin je proteasa, která se při poklesu
39
krevního tlaku uvolňuje z ledvin do krevního řečiště a štěpí angiotenzinogen (jeden z globulinů
plazmy) na angiotensin I, který má slabě vasokonstrikční účinky. Tento dekapeptid se pak pomocí
angiotensin konvertujícího enzymu (který se vytváří v plicích), dále štěpí na oktapeptid, angiotensin
II, který vykazuje silně vasokonstrikčními účinky. Objev kaptoprilu má velmi zajímavou historii.
V roce 1960 přišel do laboratoře Johna Vana na Royal College of Surgeons of England brazilský
post-doc dr. Sergio Ferreira, který sebou přivezl výtažek z jedu brazilského hada křovináře žararaka
(Bothrops jararaca), který silně zvyšoval účinky bradykininu.
Obr. 26. Princip inhibice renin-angiotensinového systému pomocí ACE inhibitorů.
Už v té době Ferreira předpokládal, že inhibuje enzym, který způsobuje jeho rozklad. Ve Vanově
laboratoři pak zjistil, že tento výtažek silně inhibuje ACE, a byl schopen z něj izolovat aktivní látku
nonapeptid. Vane byl v té době také konzultantem ve firmě Squibb a představil jim tuto látku jako
potenciální vhodný lék pro esenciální hypertenzi. Vědci ve společnosti Squibb tento peptid
nasyntetizovali a ověřili jeho strukturu i ACE aktivitu. Tento peptidový lék ale nebyl vhodný pro
orální podání. Vědci ve Squibbu vzali v úvahu, že se jedná o metalloproteasu obsahující zinek
s podobnými vlastnostmi jako má kravská karboxypeptidasa A a připravili model aktivního místa
enzymu. Na rozdíl od karboxypeptidasy A, která odstraní pouze poslední aminokyselinu ze
štěpeného peptidu, ACE odštěpí dvě poslední aminokyseliny.
Obr. 27. Model inhibice karboxypeptidasy A, a podle něj navržený model aktivního místa ACE.
40
Podle jejich modelu má interakce enzymu s peptidem tři centra vazby:
a) Elektrofilní centrum, které vyváří iontovou vazbu s karboxylovou funkční skupinou.
b) Centrum umožňující vodíkovou vazbu s amidem C-koncové částí peptidového řetězce.
c) Atom zinku, který koordinuje jako Lewisovská kyselina karboxylovou skupinu v místě
štěpení.
Na základě takto připraveného modelu navrhli deriváty sukcinylprolinu jako potenciální inhibitory
ACE. Prolinový karboxyl se váže s elektrofilním místem, amidová funkce vytváří vodíkovou vazbu
a karboxyl sukcinátu se koordinuje se zinkem. Další optimalizací struktury připravili derivát
kaptopril. Kaptopril má ale některé vedlejší účinky jako například nepříjemnou kovovou chuť a
společnost Merck vyvinula na základě kaptoprilu svůj preparát enalapril, který je proléčivem vlastní
aktivní látky enalaprilatu.
Obr. 28. Od derivátů N-sukcinylprolinu k léčivům kaptorpil a enalapril.
Snaha o pochopení mechanismu účinku a interakce s biologickým cílem je v současnosti běžnou
součástí procesu výzkumu léčiv. Hlavním směrem dnešního racionálního přístupu k výzkumu léčiv
je ale jejich výzkum s pomocí výpočetní techniky (Computer-aided drug design, CADD). Tento
přístup je specifický pro daný biologický cíl, a v porovnání s HTS může vést k významnému
snížení nákladů a urychlení procesu objevu hitů. První pokusy o využití počítačů k návrhu
výchozích struktur pro farmaceutický výzkum nacházíme na přelomu 80. a 90. letech minulého
století.
Dva hlavní směry tohoto přístupu jsou:
 Virtuální screening
 De novo design
Obr. 29. Dělení přístupů k virtuálnímu screeningu vychází ze znalosti struktury cíle nebo aktivních
ligandů.
41
Virtuální screening (VS) je dnes již etablovaná metodika, díky které můžeme výrazným způsobem
redukovat počet sloučenin screenovaných v biologickém testu.
Obecně se dá říci, že zdaleka ne všechny látky, které virtuálním screeningem identifikujeme jako
aktivní respektive vážící se na daný biologický cíl (tzv. virtuální hity), aktivitu skutečně vykazují.
Na druhé straně, pravděpodobnost objevu hitu (hit rate) se značně zvyšuje. V porovnání s HTS, u
kterého se uvádí průměrná úspěšnost 0,01-0,14% je úspěšnost virtuálního screeningu
v biologických testech až 40% (přičemž 1-10% se uvádí jako realistická očekávaná
pravděpodobnost objevu hitu).
Existují tři základní metodiky používané pro virtuální screening:
a) VS založený na dockingu (Docking-based virtual screening)
Tento typ screeningu je založen na opakovaném dockingu jednotlivých látek databáze. Jako
docking označujeme proces predikce preferované konformace a postavení ligandu ve vazebném
místě makromolekuly (nejčastěji proteinu). Jako scoring označujeme vyjádření síly této interakce,
v některých případech se dá označit jako predikce vazebné energie ligandu k makromolekule.
Pomocí této tzv. skórovací funkce (scoring function) můžeme jednotlivé ligandy seřadit podle
pravděpodobné síly vazby na makromolekulu, tento proces je označován jako ranking.66 Relativní
afinita sledovaného ligandu může být předpovězena validací skórovací funkce pomocí ligandů se
známými afinitami k danému molekulárnímu cíli.
Obr. 30. Schematické znázornění procesu virtuálního screeningu pomocí opakovaného dockingu.
Pro praktické provedení virtuálního screeningu založeného na struktuře cíle musíte znát strukturu
tohoto cíle. Tuto strukturu můžeme získat na základě vlastních experimentů (krystalografie,
proteinová NMR), nebo můžeme vycházet ze struktury, která byla publikována, a je uložena
v některé z veřejně dostupných databází.67
Mezi nejdůležitější databáze, ve kterých jsou uloženy struktury známých proteinů a jejich komplexů
s ligandy patří:



RCSB Protein Data Bank (http://www.pdb.org/)
Worldwide Protein Data Bank (wwPDB, http://www.wwpdb.org)
EMDataBank (http://www.emdatabank.org/)
42
V případě, že nemáme k dispozici potřebnou strukturu, je možné ji na základě známých struktur
modelovat. Homologní modely jsou založeny na obdobnosti sekundární a terciární struktury
proteinu (folding) u proteinů ze stejné rodiny, které vykazují strukturní podobnost (similarity), a
vychází z experimentálně získaných struktur takovýchto příbuzných proteinů (ty potom označujeme
jako templáty).68 Pro přípravu homologního modelu je možné využít řadu volně dostupných
softwarových balíčků a webových aplikací:





Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/)
ModWeb (https://modbase.compbio.ucsf.edu/modweb/)
Robetta (http://www.robetta.org/)
Modeller (http://salilab.org/modeller/)
Protein Model Portal (http://www.proteinmodelportal.org/)
Druhou nezbytnou komponentou pro provedení virtuálního screeningu je databáze
optimalizovaných 3D struktur ligandů. Často se jedná o databázi interní, která zahrnuje všechny
dostupné látky na daném pracovišti (3D databáze interní knihovny látek). K přípravě 3D struktury
lze využít běžně dostupných chemických programů, jako jsou ChemBioDraw, ACD/ChemSketch,
ale je možné ji také automatizovat (přestože je výsledek vždy vhodné vizuálně validovat zejména
při převodu z formátů jako jsou SMILES). Existuje také řada volně dostupných databází
obsahujících struktury ligandů, které jsou komerčně dostupné. Tyto chemikálie je pak nutné pro
následnou evaluaci biologické aktivity zakoupit. Mezi tyto databáze ligandů paří např.:




ZINC – otevřená databáze komerčně dostupných látek pro virtuální screening
PubChem 3D
NCI Open Database
Komerční databáze
Samotný screening se provádí pomocí softwaru, který má přímo integrovanou možnost screeningu
nebo opakovaným využitím dockingu jednotlivých molekul databáze. Pro některé volně dostupné
programy (DOCK, AutoDock) jsou dostupné nadstavby, které umožňují virtuální screening.
Existuje řada programů, které je možné použít pro virtuální screening.






Glide (http://www.schrodinger.com/Glide/)
FlexX (http://www.biosolveit.de/FlexX/)
Fred (http://www.eyesopen.com/oedocking)
Gold (http://www.ccdc.cam.ac.uk/Solutions/GoldSuite/Pages/GOLD.aspx)
Dock (http://dock.compbio.ucsf.edu/)
AutoDock (http://autodock.scripps.edu/)
Screening může mít několik stupňů, např. méně přesné screenování větší knihovny látek a přesnější
modelování skupiny látek identifikované v tomto prvním kole, eventuálně zkřížený screening
pomocí dvou různých dockovacích algoritmů (programů). Získané virtuální hity mohou být dále
procesovány pomocí dalšího filtrování a sortování. Například mohou být vytvořeny klastry
obdobných struktur (a v biologickém screeningu použity pouze vybrané látky z těchto klastrů)
případně mohou být filtrovány látky na základě predikce biologické dostupnosti (modelování
ADMET). Tato fáze screeningu je většinou společná i pro všechny další diskutované přístupy
k virtuálnímu screeningu.
43
b) VS založený na farmakoforu (Pharmacophore-based virtual screening)
Virtuální screening 3D farmakoforů může být založen jak na struktuře receptoru (resp.
makromolekuly), tak na struktuře ligandu. Jako farmakofor označujeme postavení sterických a
elektronových chemických determinantů (např. H-vazby, náboje, lipofilní části), které jsou
nezbytné pro optimální interakci ligandu s biologickým cílem, vedoucí ke kýžené biologické
odpovědi. Nejedná se tedy o konkrétní molekulu, ale o abstraktní model založený na 3D rozložení
center, které jsou zásadní pro interakci s biologickým cílem, konkrétně skupin chovající se jako:





Donory vodíkové vazby
Akceptory vodíkové vazby
Nabité části molekuly
Aromatické kruhy
Hydrofobní části molekul
A
B
C
Obr. 31. Příklad schematického vyjádření farmakoforu blokátorů a aktivátorů CLC-K Cl- iontových
kanálů (A) a aktivního blokátoru těchto kanálů založený na tomto farmakoforu (B).69 Jednoduchý
manuálně vytvořený farmakoforový model pro virtuální screening (Discovery Studio 4.1
Visualiser).
Přestože se farmakoforové modely vytvářejí spíše na základě porovnání strukturních prvků
aktivních ligandů (ligand-based pharmacophore modeling), model farmakoforu můžeme vytvořit i
na základě struktury makromolekuly (proteinu). Vlastní screening porovnává tyto strukturní prvky a
jejich prostorové uspořádání s vybranou 3D databází. Pro přípravu farmakoforu lze použít ligandy,
u kterých víme, že mají potřebnou aktivitu pro daný biologický cíl, a to jak interní, tak externí
(databáze, literatura). Pro přípravu farmakoforů založených na struktuře proteinu nebo komplexu
protein-ligand můžeme opět využít volně dostupné zdroje, jako je pdb databáze. Existují také
vhodné metodiky, díky kterým je možné takto vytvořený model validovat. Také databáze
screenovaných molekul mohou být stejné jako u screeningu založeného na dockingu.
Mezi programy, které se hojně využívají pro farmakoforové modelování a screening patří:








Catalyst/Discovery Studio
LigandScout
MOE
Phase
E-Pharmacophore
PharmDock
Pharmer
PharmaGist
44
Získané virtuální hity jsou rovněž procesovány, a následně evaluovány v biologických testech.
c) VS tvarové podobnosti (Shape-based similarity screening)
Hlavním cílem této metodiky je rychlý virtuální screening knihoven sloučenin a nalezení
virtuálních hitů, které mají podobnou strukturní a elektrostatické vlastnosti jako výchozí derivát.
Tato metoda umožňuje analogii i jedné molekuly na základě jejího tvaru. Další atributy této
metodiky jsou velmi podobné s farmakoforovým screeningem.
Obr. 32. Princip virtuálního screening založeného na tvarové podobnosti.
Mezi software používaný pro screening založený na strukturní podobnosti paří:




ROCS (http://www.eyesopen.com/rocs)70
LIGSIFT (http://cssb.biology.gatech.edu/LIGSIFT)71
PAPER (https://simtk.org/home/paper)72
USRCAT (https://bitbucket.org/aschreyer/usrcat)73
De novo design74 je druhým možným přístupem k vytváření nových hitů, který je založen na
návrhu zcela nových sloučenin. I v tomto případě můžeme rozdělit proces podle toho, zda vychází
ze struktury biologického cíle nebo ligandu. Většina automatických technik de novo designu
vyžaduje znalost biologického cíle, ideálně komplex proteinu s ligandem. Pozice ligandu pak
definuje přesné vazebné místo a protein zaujímá specifickou konformaci nezbytnou pro vazbu
ligandu. Tímto ligandem může být také přirozený ligand, který se snažíme nahradit (např. ATP u
kinas).
Existuje několik různých algoritmů, které využívají programy pro automatický de novo design
ligandů. Vždy je nejdříve odstraněn původní ligand, jsou identifikovány vazebné aminokyseliny
v aktivním místě, a těch je využito pro návrh nových látek. Látky jsou designovány tak, aby měly
správný tvar a velikost, a aby zároveň poskytovaly potřebné interakce s těmito klíčovými rezidui.
Nové molekuly mohou být konstruovány buď výstavbou z jednotlivých atomů, nebo pomocí
fragmentů. Starší metodiky založené na výstavbě z atomů trpí zejména díky zdlouhavosti metodiky
a návrhu sloučenin, které není možné syntetizovat. Proto je v současné době jedním z hlavních
používaných přístupu design založený na fragmentech. Používá jak přístup spojený s růstem
fragmentů, tak s jejich spojováním (viz dále).
Mezi software pro de novo design ligandů patří:



LEGEND (nejstarší založený na výstavbě pomocí jednotlivých atomů,
http://www.immd.co.jp/en/product_2.html)75
LUDI (dnes součást Discovery Studio, http://accelrys.com/products/discovery-studio/)76
LigBuilder (http://ligbuilder.org/index.html)77
45


GANDI (http://www.biochem-caflisch.uzh.ch/download/)78
e-LEA3D (http://chemoinfo.ipmc.cnrs.fr/eDESIGN/index.html)79
d) Objev hitů pomocí testování fragmentů (Fragment-Based Drug Discovery, FBDD)
Fragmentový přístup se dnes používá nejen pro návrh nových ligandů s pomocí výpočetních metod,
ale stal se také jednou s důležitých technik medicinální chemie. Principem této techniky je hledání
malých molekul (fragmentů nebo epitopů), které se budou vázat do aktivního centra cíleného
proteinu (nejčastěji enzymu). Přestože vazba jednotlivých fragmentů může být relativně slabá,
dalším opracováním molekuly je možné připravit látky s velmi vysokou afinitou k vybranému
biologickému cíli. 80
Metody využívané u fragmetového přístupu
Jednou z významných analytických metodik, které se uplatňují v FBDD je proteinová NMR,
využívající proteiny značené 15N a 13C. Nejjednodušší a méně ekonomicky náročné je značení
pomocí 15N, které se provádí pomocí exprese cílového proteinu v bakteriích pěstovaných
v minimálním objemu média, které obsahuje 15NH4Cl. Dvojité značení 15N a 13C je obdobně
prováděno expresí v médiu, které obsahuje jak 15N značený chlorid amonný, tak 13C značenou
glukózu. Díky tomuto značení můžeme jednoduše měřit 2D NMR spektra těchto prvků a na jejich
základě přiřadit signály jednotlivým aminokyselinám. Takto připravený enzym je screenován
s nízkomolekulárními fragmenty (většinou do MW=300) a v případě, že dochází k vazbě, která se
projeví na posunu signálů v místě vazby, získáváme informaci nejen o tom, že se daný fragment
váže, ale také o místě vazby.81
Specifickou technikou používanou pro identifikaci vhodných fragmentů je tethering, který využívá
cysteinového rezidua v blízkosti aktivního místa enzymu (přirozeně přítomného, nebo zavedeného
pomocí specifické mutace jiného rezidua). Takto modifikovaný protein se pak nechá reagovat
s knihovnou fragmentů obsahujících disulfidovou vazbu za slabě redukčních podmínek. Díky
rychlé výměně thiol-disulfid tvoří cysteinové reziduum vazbu s každým fragmentem a dochází
k testování všech přítomných fragmentů. Většina z nich nevytváří dostatečný počet nevazebných
interakcí s okolními proteiny a jsou rychle vyměněny. Ty fragmenty, které ale mají dostatečnou
afinitu k proteinu, jsou vůči redukčnímu působení odolnější a díky vytvoření chemické rovnováhy
budou majoritní navázanou složkou na cysteinovém reziduu. Pokud mají jednotlivé fragmenty
unikátní molekulovou hmotnost, lze takto získanou směs analyzovat pomocí hmotnostní
spektrometrie, a identifikovat potřebný fragment.82
Obr. 33. Princip tetheringu.
Mezi další metodiky uplatňované v analýze výsledků testování fragmentů patří rentgenová
strukturní analýza (X-ray), hmotnostní spektrometrie (MS) a využití vazebných biotestů.
Velmi často se využívá také kombinace těchto metod.
Příprava nových látek pomocí fragmentového přístupu má tři základní postupy:80
46
a) Spojování fragmentů (fragment linking)
Tato technika se snaží nalézt dva nebo více fragmentů, které se budou vázat na specifické, ale
odlišné části aktivního centra. Tyto fragmenty mají zanedbatelnou nebo slabou aktivitu samy o sobě
(váží se pouze v části aktivního centra), ale větší molekuly vzniklé spojením epitopů se mohou
vázat do celého aktivního centra a mohou vyvolat žádoucí účinek v potřebné míře.
U tohoto postupu se nejdříve hledá první fragment (epitop) který se váže do aktivního místa.
Následně se hledání opakuje a hledá se druhý epitop, který se váže v jiném místě aktivního centra
(lze to provést v přítomnosti prvního epitopu, aby se zabránilo vazbě ve stejném místě). Oba
fragmenty se následně optimalizují a spojí.
Obr. 34. Spojování fragmentů.
Tento postup byl úspěšně využit při designu nových inhibitorů thymidylátsyntasy (Obr. 35),
enzymu klíčového pro pyrimidinový metabolismus, které mohou nalézt aplikaci v terapii rakoviny a
některých infekčních onemocnění. V tomto případě bylo využito tetheringu pro identifikaci jednoho
z fragmentů a jako druhý byl využit původní přirozený ligand metylentetrahydrofolát.83
Obr. 35. Využití spojování fragment pro přípravu nových inhibitorů thymidylátsyntasy.
b) Vývoj fragmentů (Fragment evolution)
U tohoto postupu využíváme růst („grow“) respektive skladbu finální molekuly z jednoho
fragmentu. Na začátku identifikujeme pouze jeden fragment, který se váže v aktivním místě a ten
pak postupně nahrazujeme větší a větší molekulou obsahující tento fragment, ale vážící se i na další
části aktivního centra. Tento postup je dnes asi nejpoužívanější, a jeho příkladem je použití
nízkoafinitního screeningu fragmentů v kombinaci s rentgenovou strukturní analýzou a SBDD,
který použili vědci ze společnosti Plexxikon Inc. pro přípravu nových inhibitorů fosfodiesterasy 4
PDE4 s potenciálně protizánětlivým účinkem (Obr. 37).84, 85
47
Obr. 36. Vývoj fragmentů.
Obr. 37. Nové inhibitory PDE 4 založené na vývoji fragmentů.
c) Samoskladba fragmentů (Fragment self-assembly)
Tento přístup je založen spojování jednotlivých fragmentů in situ a využívá usnadnění interakce
dvou reagujících partnerů, pokud jsou navázány na cílový protein (vazba takovýchto partnerů je
termodynamicky zvýhodněna). K vazbě může docházet reverzibilně, pak mluvíme o dynamické
kombinatoriální chemii, nebo ireverzibilně např. pomocí „click“ chemie.
Obr. 38. Samoskladba fragmentů.
In situ click chemie může být využita například pro přípravu vysoce účinných inhibitorů HIV-1
proteasy, přestože v tomto případě byla reakce ověřena až retrospektivně na základě známého
inhibitoru připraveného klasickou kombinatoriální chemií. 86, 87
Obr. 39. In situ příprava inhibitorů HIV-1 proteasy.
48
7. Od hitu k leadu
Objev hitu je pro výzkum nových léčiv velmi důležitý, přesto většina hitů nemá optimální
farmakodynamické ani farmakokinetické vlastnosti. V tomto bodě přichází na řadu medicinální
chemie, jejímž úkolem je optimalizace struktury hitu do podoby nové látky, která vychází ze
struktury hitu, a které říkáme lead.
Farmakodynamickými parametry v tomto případě rozumíme zejména, jakým mechanismem účinku
látka působí a jaká je závislost tohoto efektu na jeho dávce. Optimalizací farmakodynamických
parametrů je myšleno zvyšování (optimalizace) interakce látky s jejím molekulárním cílem,
případně zvyšování selektivity k vybranému molekulárnímu cíli. Optimalizací farmakokinetických
parametrů se pak rozumí úprava látky tak, aby byla schopna se ke svému molekulárnímu cíli dostat
a působit na tento cíl po potřebnou dobu. Jedná se o optimalizaci vlastností látky týkající se
základních farmakokinetických dějů v těle - absorpce, distribuce, metabolismu a eliminace.
Z pohledu moderního přístupu k výzkumu léčiv je možné považovat farmakokinetický příspěvek za
stejně důležitý jako příspěvek farmakodynamický, přestože v akademickém sektoru je většinou
klade důraz na farmakodynamickou složku. Tento proces může být pro jednotlivé farmaceutické
společnosti individuální a může se také podstatně lišit u jednotlivých projektů.
7.1.Struktura hit-to-lead procesu
Jak jsme si již řekli, v současné době jsou hity nejčastěji objeveny na základě HTS mezi
sloučeninami, které jsou zařazeny v rozsáhlých knihovnách vzorků. Hit je poté validován v dalším
kole screeningu a následně je určena hodnota IC50. Pokud je takto stanovená závislost aktivity na
dávce potvrzena, je většinou ověřena také chemická struktura, a to zejména proto, že látky mohou
být rozložené nebo kontaminované. Nejčastější používanou analytickou metodikou je kombinace
kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS). Takto ověřeným strukturám se
říká validovaný hit.
V následné fázi bývá hit ověřen v buněčných testech. Přestože neúspěch v této části nemusí látku
úplně diskvalifikovat pro další použití a musí být pečlivě vyhodnocen, ne všechny látky mají
vhodné fyzikálně chemické předpoklady pro prostupnost do buněk. Dále se v této části zjišťuje
selektivita těchto látek (např. v kinasovém testu), zjištění logP a předběžné zjištění toxicity. Z této
fáze vychází vhodná látka jako kvalifikovaný hit.
Aby se z této látky stal lead, měla by splňovat několik základních požadavků:
 Byla účinná v relevantním buněčném testu.
 Měla vhodné fyzikálně chemické parametry.
 Vykazovala přijatelné farmakologické předpoklady jak in vitro tak in vivo.
 Umožňovala jasnou patentovou strategii.
 Výhodné je pokud už v této fázi známe základní vztah mezi strukturou a aktivitou této látky
(SAR).
Například společnost Schering AG, která je dnes součástí Bayer HealthCare Pharmaceuticals měla
definována kritéria pro lead strukturu takto:88
 Vhodné vlastnosti molekuly:
o Molekulární váha: 200-500.
o logP/logD: -1-5.
49




o Počet donorů vodíkových vazeb: 0-5.
o Počet akceptorů vodíkových vazeb: <10.
o Rozpustnost ve vodě: > 5mg.l-1 (nebo 10 × IC50).
Preferované farmakodynamické vlastnosti:
o Účinnost: IC50 = 100-1000nM.
o Aktivita v buněčném testu.
o Selektivita: závislá na projektu (>10 ×).
Přijatelné farmakokinetické parametry (viz dále):
o Permeabilita přes Caco2 buňky: >100 cm.s-1×10-7.
o Stability v mikrozomech (myších, potkaních nebo lidských): 50-80 %R30min.
o In vivo charakteristika (potkan):
 Plazmatická clearance: <50 ml.min-1.kg-1.
 Distribuční objem: 1-10 l.kg-1.
 Orální dostupnost: >25 %.
Potenciál chemické optimalizace:
o Dostupnost.
o Možná modifikovatelnost (pokud možno paralelní syntézou).
o Dostupný strukturně aktivitní vztah.
Patentovatelnost:
o Zřejmá patentová strategie.
7.2. Vztah mezi strukturou a aktivitou
Strukturně-aktivitní závislost (z angl. Structure-activity relationship) je běžně známá pod
zkratkou SAR. Na základě studie závislosti mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou
můžeme odhalit, které skupiny jsou v molekule nezbytné pro interakci s biologickým cílem, a které
ne. Důležité mohou být také skupiny, které napomáhají látce překonávat biologické bariéry při cestě
ke svému biologickému cíli a zabraňují jeho předčasné metabolizaci. Postupnou syntézou látek
s obměněnými funkčními skupinami můžeme zjistit, které skupiny jsou pro interakci nezbytné a
které jsou postradatelné. Tento postup vyžaduje evaluaci biologické aktivity všech takto
syntetizovaných látek a jejich srovnání s originální strukturou. Jestliže daný analog vykazuje
znatelně vyšší nebo nižší aktivitu, pak se jedná o prvek důležitý. Pokud se aktivita výrazně nemění,
pak daný strukturní prvek pro aktivitu zásadní není. Parametry této studie je třeba přizpůsobit
náročnosti syntézy jednotlivých derivátů. Na základě podrobné SAR studie můžeme usuzovat, která
část molekuly může být modifikována tak, aby bylo dosaženo optimálních farmakologických
vlastností jak s ohledem na účinnost a selektivitu, tak potenciální přístup léčiva k biologickému cíli.
Úplné pochopení vztahu mezi aktivitou látky a její strukturou může přinést korelace výsledků
takovéto studie s krystalovou strukturou jednoho nebo více připravených ligandů s cílovým
proteinem získanou pomocí rentgenové strukturní analýzy. Takto korelovaná data mohou plně
osvětlit, které skupiny hrají důležitou strukturní roli a proč.
7.3. Interakce proteinu s ligandem
Aktivní místo proteinu, do kterého se ligandy váží, je charakterizováno aminokyselinovými zbytky,
které vytvářejí určitý třírozměrný tvar a mají funkční skupiny, které jim dávaní příslušné vlastnosti
a možnosti interakce:
o Nesou kladný náboj (Arg, His, Lys)
o Nesou záporný náboj (Asp, Glu)
o Nesou polární skupiny (Asn, Gln, Ser, Thr)
o Nesou hydrofobní skupiny (Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp)
50
o Další (Cys, Sec, Gly, Pro)
Malé molekuly se proto váží s proteiny na základě kombinace:
o Tvarové komplementarity
o Energeticky výhodné interakce
Z termodynamického pohledu je vazba ligandu a proteinu děj, při kterém dochází k ustavení
rovnováhy mezi komplexem protein-ligand (P – L) a volnými reagujícími partnery proteinem (P) a
ligandy (L). Tento děj je charakterizován rovnovážnou konstantou Ka, která je dána poměrem
rovnovážných koncentrací komplexu ke koncentracím volných komponent tohoto procesu. Z logiky
věci je dosaženo rovnovážné koncentrace ve chvíli, kdy se koncentrace komplexu (ani reaktantů)
v čase nemění a platí tedy Rovnice 3A a 3B (kde kon je rychlostní konstanta vzniku komplexu P-L
zatímco koff je konstanta jeho disociace). Rychlost a síla vazby ligandu a proteinu bude tím větší,
čím větší bude tato asociační rovnovážná konstanta Ka. U disociační rovnovážné konstanty Kd je
tento vztah opačný (Rovnice 3C). Rovnovážná disociační konstanta je také ve vztahu ke Gibbsově
energii G (Rovnice 3D, R je konstanta ideálního plynu a T je teplota). Jako u všech rovnovážných
vztahů dochází k vazbě ligandu a proteinu pouze v případě, že dochází k uvolnění energie a G má
zápornou hodnotu.
Obr. 40. Schematické znázornění procesu vazby ligandu na protein.
Rovnice 3
51
Celková uvolněná vazebná energie resp. změna Gibbsovy energie (G) je dána entalpickým (H) a
entropickým (S) příspěvkem při stanovené teplotě (T). Entalpický příspěvek vyjadřuje sílu a
specificitu interakce mezi ligandem a proteinem, a zahrnuje iontové, halogenové a vodíkové vazby
stejně jako další vazebné interakce. Entropická část vyjadřuje celkovou dynamiku tohoto systému a
její změny odrážejí ztrátu pohyblivosti v důsledku snížení stupňů volnosti rotačních a vibračních
pohybů. Také solvatace a s ní spojené efekty mohou značně ovlivnit entropický příspěvek k volné
energii.89
Přestože při designu nových ligandů bývá často kladen důraz na entalpickou složku energie,
entropická složka by se neměla zanedbávat. Konformační změny, solvatace a vzdálené interakce
mohou hrát ve vazbě důležitou roli.
7.4. Typy molekulárních interakcí mezi proteiny a ligandy
a) Iontové (elektrostatické) interakce jsou jedny z nejsilnějších vazeb, které mezi sebou
molekuly ligandu a proteinu vytvářejí. Tyto interakce se vytvářejí mezi skupinami s opačným
nábojem. Poskytují je pozitivně i negativně nabité aminokyseliny jak mezi sebou, tak s opačně
nabitými skupinami ligandu. Síla těchto interakcí závisí na prostředí a vzdálenosti.
V hydrofobním prostředí je silnější. Tento fakt může být příznivý pro vazbu P-L díky vyšší
hydrofobicitě vazebného místa v porovnání s povrchem. Závislost síly na vzdálenosti je méně
výrazná než u ostatních interakcí a iontová vazba je často iniciující interakcí. Předpokládá se, že
iontové páry v proteinech mají stabilizující charakter, pokud je jejich vzdálenost do 5 Å.90
b) Vodíková vazba je přitažlivá interakce mezi atomem vodíku vázaném na atomu s vyšší
elektronegativitou X--H+ a dalším atomem nebo částí molekuly (většinou elektronegativním
atomem nesoucí volný elektronový pár nebo násobnou -vazbou) :Y-. Vodíková vazba je také
oficiálně definována IUPAC91 a znázorňuje se X-H···Y-Z. Funkční skupina X-H je označována
jako donor vodíkové vazby (hydrogen bond donor, HBD) a funkční skupina Y jako akceptor
vodíkové vazby (hydrogen bond acceptor, HDA). Některé skupiny mohou fungovat jako HBD i
HBA. Síla vodíkové vazby je značně variabilní, ale zvyšuje se s elektronegativitou atomu X.
Úhel mezi X-H···Y je většinou lineární, a čím bližší je 180° tím je vazba silnější a kratší (<150°
mají slabší H-vazby).91. Síla vodíkové vazby koreluje s její vzdáleností. U interakcí biomolekul
s ligandy se většinou setkáváme se středně silnými nebo slabými vodíkovými vazbami. Proto se
zde nepotkáme s vazbami silnějšími než 16 kcal.mol-1 a kratšími než 2,5 Å (vzdálenost
heteroatomů X---Y resp. 1,5 Å H···Y). Na druhé straně, vodíkové vazby delší než 3,0-3,2 Å
jsou pouze slabé a nemají větší energii než 4 kcal.mol-1.92-94
Obr. 41. Vztah vzdálenosti a vazebné energie vodíkové vazby.
V reálné medicinální chemii se setkáváme s akceptory vodíkových vazeb, které mají elektrofilní
atom nesoucí volný elektronový pár na atomu dusíku, kyslíku, síry nebo halogenu (F, Cl, Br).
Skupiny, které mají elektronově bohatý dusíkový atom, jehož volný elektronový pár není
zapojen do konjugace, mohou být velmi dobrým akceptorem vodíkové vazby.
52
Alifatické terciární aminy jsou lepší HBA než amidy a aniliny, v důsledku konjugace a
stabilizace rezonancí.
Na rozdíl od dusíku může kyslíkový atom akceptovat až dvě vodíkové vazby díky dvěma
volným elektronovým párům. Obecně
platí, čím větší je elektronová hustota na
akceptoru vodíkové vazby, tím silnější
vazbu může poskytovat (COO- vs.
COOH). Vazebné vlastnosti
karbonylových derivátů závisí na funkční
skupině, která je na ně vázána.
Přestože síra může rovněž poskytovat
Obr. 42. Vodíková vazba dusíkatých a
dva elektronové páry a chovat se jako
kyslíkatých akceptorů.
akceptor vodíkové vazby její volné
elektronové páry jsou umístěny 3p
orbitalech ([Ne]3s23p4), které jsou větší a více rozptýlené v porovnání s 2p orbitalu u dusíku a
kyslíku a méně efektivně interagují s malými s orbitaly vodíku.
Tabulka 6. Síla akceptoru vodíkové vazby často pozorovaných v krystalových strukturách.93
Acyklické akceptory vodíkové vazby
Typická síla akceptoru
(pKXHY)
Amid
2,2-2,6
Keton
1,1-1,2
Sulfon
1,1
Sulfonamid
1,0
Ether
1,0-1,2
Planární heterocykly obsahující akceptor H vazby
Typická síla akceptoru
(pKXHY)
N-alkylimidazol (N)
2,72
Pyridin (N)
1,86
Oxazol (N)
1,67
Pyrazin (N)
0,92
Furan (O)
-0,4
Obr. 43. Přehled běžných HBA skupin a srovnání jejich relativní síly.
Také atomy fluoru vázané v organických sloučeninách jsou, přes svou vysokou
elektronegativitu a dostatek volných elektronových párů, považovány spíše za špatné akceptory
vodíkové vazby 95. Přesto tato vazba bývá poměrně často pozorována v krystalových
strukturách, a u některých ligandů je považována, za příčinu zvýšení jejich afinity k proteinu.93,
53
96
Vodíkové vazby, ve kterých se fluor vyskytuje jako akceptor H-vazby vykazují nižší energie
(cca 2-3 kcal.mol-1).95, 97
 – systémy alkinů a aromátů mají sice vysokou elektronovou hustotu, ale náboj je rozptýlen.
Tyto systémy proto poskytují interakce jen se silnými HBD jako jsou alkylamoniové ionty
(HN+R3).
Jako donory vodíkové vazby mohou přirozeně vystupovat pouze skupiny, na které je vodík
vázan. Pro skupinu X-H platí, že čím je X silněji elektronegativní atom tím silnější je donor
vodíkové vazby. Proto mohou být např. amoniové kationty nesoucí alespoň jeden vodík velmi
silnými donory vodíkových vazeb v porovnání se sekundárními a terciárními aminy. Aminy a
aniliny jsou považovány za horší donory vodíkových vazeb než alkoholy a fenoly, ale
aromatické deriváty jsou lepšími HBD než jejich alifatické deriváty. Obecně, čím kyselejší
vodík je, tím je lépe poskytován také do vodíkové vazby.
c) Halogenová vazba se ve spojitosti s interakcí mezi ligandy a makromolekulami vztahuje na
vazbu mezi chlorem, bromem nebo jódem a elektronově bohatým atomem. Je to důsledkem
anizotropie elektronové distribuce. Přestože mají tyto halogeny tři volné elektronové páry,
částečný záporný náboj není rozdělen rovnoměrně, ale tvoří obvodový pás a nechává kladný
elektrostatický potenciál lokalizovaný na hrotu. Tato oblast s částečným kladným nábojem je
označována jako „-hole“ a díky ní mohou halogeny tvořit nevazebné interakce s elektronově
bohatými atomy např. kyslíky karbonylových skupin. Stejně jako vodíková vazba je i
halogenová vazba silně orientována a většinou uzavírá úhel 140° - 180° s vazbou C-X.
Vzdálenost je kratší než van der Waalsův poloměr (činí přibližně 3.30 Å pro Cl..N, 3.40 Å pro
Br..N, 3.53 Å pro I..N, 3.27 Å pro Cl..O, 3.37 Å pro Br..O, 3.50 Å pro I..O, 3.55 Å pro Cl..S,
3.65 Å Br..S a 3.78 Å pro I..S). Síla halogenové vazby je tím větší, čím silněji elektronegativní
je atom, na který je halogen vázaný a roste také v závislosti na hybridizaci uhlíku na kterém je
halogen vázán (C(sp)–X > C(sp2)–X > C(sp3)–X). Síla poskytované halogenové vazby klesá
v řadě I > Br > Cl.
Obr. 44. Schematické znázornění „-hole“ na hrotu halogenového atomu.
d) Dipól-dipólová interakce jsou založeny na permanentním dipólu v důsledku rozdílné
elektronegativity atomů. Klasickým příkladem dipól-dipólové interakce je interakce mezi
dvěma vhodně postavenými molekulami karbonylových derivátů, která je vyvolána
permanentními dipóly na těchto skupinách souvisejícími s vyšší elektronegativitou kyslíku
v porovnání s uhlíkem.98 V důsledku přítomnosti peptidické vazby a dalších polárních skupin
můžeme pozorovat řadu dipól-dipólových interakcí i při interakci ligandu s proteiny. Pokud je
postavení obou dipólů vhodné, může účinně zvýšit afinitu ligandu k proteinu, ale v opačném
případě může také vést k repulzi shodně nabitých částí molekuly.
Síla této interakce je výrazně závislá na vzdálenosti a klesá kvadraticky při vzdalování obou
dipólů. Přestože dipól-dipólová interakce se obecně užívá pro vysvětlení těchto vazeb u
proteinů, poslední výzkumy ukazují, že při interakci karbonylů může značnou roli sehrávat také
54
delokalizace elektronů volného elektronového páru kyslíku (n) do antivazebných orbitalů (*)
druhého karbonylu.99
Obr. 45. Schematické znázornění interakce dipólů ligandu a proteinu.
U interakce karbonylových sloučenin a alkyl nebo arylhalogenidů jsou v krystalových
strukturách pozorovány interakce, při kterých jsou dipóly navzájem kolmé.93, 100
Obdobná vazba byla pozorována také u dvou molekul obsahujících karbonylové funkční
skupiny.101, 102 V takovém případě nemůže docházet k jejich příspěvku k vazbě. Tento typ
nevazebné interakce se proto v současné době označuje také ortogonální dipolární (nebo
multivalentní) interakce.103 Tyto výzkumy naznačují, že naše chápání těchto slabších vazebných
interakcí ještě není úplné a můžeme na tomto poli očekávat další objevy.
e) Ion-dipólové interakce jsou silnější než dipól-dipólové interakce a méně závislé na
vzdálenosti. Tato interakce může být pozorována u kladně i záporně nabitých skupin. V praxi je
možné tuto interakci pozorovat například při interakci kvartérních amoniových solí
(protonovaných alifatických aminů) s karbonylovými skupinami peptidických vazeb nebo
aromatických kruhů.
Obr. 46. Příklady možných ion-dipólových interakcí.
f) Disperzní interakce (Londonovy síly, někdy van der Waalsovy síly) zprostředkovávají
interakci mezi hydrofobními regiony molekul, jako jsou alifatické substituenty nebo
uhlovodíkový skelet. Disperzní interakce vznikají na základě neuniformního rozložení elektronů
v okolí nenabitých atomů, čímž dochází ke vzniku dočasných dipólů. Dipól v jedné molekule
může generovat dipól i v té druhé a mezi nimi vzniká slabá interakce. Tento proces je do značné
míry dynamický a jeho síla rychlé klesá se zvyšující se vzdáleností. Ligand se proto musí
k proteinu přiblížit (většinou na základě jiných iniciujících interakcí). Přestože jsou ale tyto síly
slabé (většinou se uvádí méně než 1 kcal.mol-1)89, jejich součet může mít výrazný podíl na
vazbě ligandu k proteinu.
g) Odpudivé van der Waalsovy síly mají repulzní charakter a jsou způsobeny nadměrným
přiblížením dvou molekul nebo skupin, při kterém nedochází ke vzniku dipólu. Za tento
odpudivý efekt je zodpovědná repulze mezi elektrony při překryvu jednotlivých elektronových
obalů.
55
h) Hydrofobní interakce. Hydrofobní části jak makromolekuly, tak ligandu odpuzují vodu a
roztoku nejsou v pravém slova smyslu solvatovány. Molekuly vody kolem nich musejí vytvářet
organizovanější interakce mezi sebou a dochází tak ke snížení entropie, která není preferována.
V průběhu interakce ligandu s proteinem se hydrofobní části orientují k sobě a dochází
k uvolnění struktury vody. Tento děj vede ke zvýšení entropie a ke zvýšení množství celkové
uvolněné energie. Přestože mají tyto interakce jen malé hodnoty energie, jejich součet může být
pro vazbu zásadní.
i) Interakce mezi aromatickými jádry (-stacking) jsou pro vazbu mezi ligandy a proteiny
velmi důležité zejména pokud aktivní centrum proteinů obsahuje aromatická rezidua
(fenylalanin, tyrosin, tryptofan). Teoretické i experimentální důkazy ukazují, že aromatická
jádra spolu vytvářejí přitažlivé interakce, pokud spolu tvoří paralelně posunuté páry (Obr. 47B)
nebo pár ve tvaru T (Obr. 47C).104 Tato preference je dána delokalizací  elektonů nad a pod
aromatický kruh, která vede ke vzniku částečného záporného náboje v této oblasti, a odhaluje
částečný kladný náboj na hranách aromátů. Oba preferované typy této energetické interakce
mají přibližně stejnou vazebnou energii odpovídající 2,7 kcal.mol-1.104
A
B
C
Obr. 47. -Stacking aromatických jader A) nepreferovaný paralelní par; B) preferovaný paralelně
posunutý pár C) pár ve tvaru T.
j) Role vody pro vazbu ligand-protein. Solvatace hraje v průběhu interakce mezi proteiny a
ligandy zásadní roli. Makromolekula i ligand jsou před vzájemnou vazbou solvatovány. Aby
spolu mohly interagovat, jednotlivé molekuly vody musí být odstraněny – musí dojít
k desolvataci, pro kterou je nezbytná energie. Pokud je ale tato energie vetší než energie
výsledné vazby, je vazba neúčinná, a tedy k ní nedochází. Z praktického hlediska může být
proto žádoucí odebrat některé polární skupiny z molekuly ligandu (pokud nejsou pro vazbu
nepostradatelné) abychom usnadnili desolvataci, a zvýšili tím afinitu ligandu a proteinu.
V případě, že je nutné zvýšit polaritu molekuly (v důsledku špatné rozpustnosti ve vodě),
musíme umisťovat polární skupiny na molekulu ligandu tak, aby směřovaly ven z aktivního
místa a jejich desolvatace nebyla nezbytná.
7.5. Interakce jednotlivých funkčních skupin a ověření významu pro vazbu na molekulový cíl
Pochopení interakcí jednotlivý funkčních skupin je zcela zásadní pro porozumění interakcí mezi
biomakromolekulami a léčivy nebo ligandy obecně. Z pohledu medicinální chemie je také klíčové
pro interpretaci strukturních informací získaných pomocí rentgenové strukturní analýzy nebo
nukleární magnetické resonance. V případě, že takovouto informaci nemáme k dispozici, je
nezbytné ověřit význam jednotlivých skupin pomocí jejich vhodné derivatizace a srovnání
biologických aktivit tak vzniklého derivátu a výchozí sloučeniny.
56
a) Interakce alkoholů a fenolů. Hydroxylová skupina je jedna z vůbec nejčastějších funkčních
skupin, které nalézáme v léčivech. Díky kyslíkovému atomu může sloužit jako akceptor dvou a
donor jedné vodíkové vazby. Vysoká elektronegativita dělá z hydroxylové skupiny relativně
dobrý donor vodíkové vazby, která je zřetelná v mnoha krystalových strukturách.
Zanamivir je příklad léčiva, které obsahuje hned několik hydroxylových skupin. V jeho
krystalové struktuře s mutantní neuraminidasou chřipkového viru rezistentního k oseltamiviru
můžeme pozorovat interakci dvou hydroxylových skupin s karboxylovou skupinou Glu 276.
Obě tyto vazby jsou stejně dlouhé (2,6 Å) a jsou zásadní pro afinitu zanamiviru k tomuto
enzymu, která je v porovnání s oseltamivirem asi 100 krát vyšší (Obr. 49).105
V úvodních SAR studiích můžeme ověřit význam hydroxylové skupin relativně snadno.
Můžeme využít převedení hydroxylu na metylether, který na rozdíl od hydroxylu není donorem
vodíkové vazby. Acetylací je možné dosáhnout snížení schopnosti akceptovat vodíkové vazby
(karbonyl acetátu sice může sloužit jako akceptor vodíkových vazeb, ale díky odlišné geometrii
již pravděpodobně nebude schopen poskytovat stejné vazby jako samotný hydroxyl).
Obr. 48. Alkoholy a fenoly mohou vystupovat jako donory i akceptory vodíkových vazeb.
Obr. 49. Krystalová struktura zanamiviru (žlutě) s mutantní N1 neuraminidazou chřipkového viru
(modře) (PDB id.: 3B7E )105 a porovnání struktury zanamiviru obsahujícího tři hydroxylové
skupiny a oseltamiviru, který má ve stejné oblasti alifatický řetězec. Karboxylátový anion
zanamiviru poskytuje řadu interakcí s okolními argininovými rezidui, jedná se ion iontový vztah a
silné vodíkové vazby. Můžeme zde také pozorovat interakce amidinové skupiny s jedním residuem
asparagové kyseliny a karbonylem polypeptidového řetězce. Další interakcí s cílovým proteinem je
vodíkový můstek mezi kyslíkem acetylu vázaného na ligandu a guanidinové skupiny argininu.
Ligand i protein jsou bohatě solvatovány molekulami vody, které mohou přinášet řadu dalších
vazeb ligand-protein „přes vodu“.
57
b) Interakce aminů. Aminy jsou také jak HBD tak HBA skupiny, ale donory jsou pouze primární
a sekundární aminy. Na druhé straně, aromatické a heteroaromatické aminy nemohou
vystupovat jako akceptory vodíkové vazby, díky konjugaci aminoskupiny s aromatickým
jádrem. V mnoha případech můžeme v krystalových strukturách pozorovat, že jsou alifatické
aminy protonovány a mají charakter a chování kvartérních amoniových soli. V takovém případě
nejsou schopny akceptovat vodíkovou vazbu, ale naopak fungují jako velmi silné HBD skupiny
a mohou poskytovat silnější iontové interakce. Analýza krystalových struktur ukázala, že
zatímco iontový vztah mezi karboxyláty a amoniovými skupinami má v průměru 2,79 Å,
interakce neutrálního aminu s karboxylátem má průměrnou délku 2,83 Å a s amidem je to 2,9
Å.93 Amidinová nebo guanidinová uspořádání vykazují vysokou afinitu ke karboxylovým
skupinám, se kterými tvoří iontové vztahy nebo silné vodíkové vazby, přičemž s guanidinovým
uspořádáním interagují jak „hlava-k-hlavě“ tak ze stran (Obr. 49).
V případě testování interakce v úvodní SAR studii je osvědčenou metodou převedení
primárních a sekundárních aminů na příslušné amidy například acetylací. V případě terciárních
aminů je situace značně obtížnější, a je nutné připravit analogický derivát synteticky složitější
cestou.
c) Interakce aromatických systémů. Tyto planární hydrofobní struktury se podílejí na řadě
interakcí mezi ligandy a proteiny. S dalšími plochými hydrofobními strukturami mohou
interagovat pomocí disperzních sil, -stackingu a hydrofobních interakcí. Zvýšená elektronová
hustota aromatického jádra umožňuje aromátům interagovat s kationty (např. amoniovými
ionty) pomocí ion-dipólových interakcí, a hrát roli akceptoru vodíkové vazby. Aromáty se
chovají také jako velmi slabé donory vodíkové vazby s průměrnou vzdáleností cca 3,4 Å.93
Nezbytnost aromatického kruhu může být otestována jeho hydrogenací, výsledný
cyklohexanový derivát má výrazně změněnou geometrii a nemůže poskytovat -stacking,
vodíkové a ion-dipólové vztahy. Také hydrofobní interakce cyklohexanu mají odlišný charakter
v porovnání s planárními aromáty.
d) Interakce alkenů a alkinů. Nenasycené uhlovodíkové deriváty, podobně jako aromatické
systémy, poskytují hydrofobní a disperzní interakce. Jsou také slabými akceptory vodíkové
vazby a terminální alkiny mohou být i slabými donory (průměrná vzdálenost je v krystalových
strukturách cca 3,2 Å)93.
Obr. 50. Krystalová struktura antivirotika efavirenz. Lineární struktura alkynové skupiny umožňuje
optimálně vyplnit hydrofobní kavitu.
58
Jedním z příkladů využití alkynu v návrhu léčiv je nenukleosidový inhibitor reverzní
transkriptasy HIV efavirenz. Z krystalové struktury tohoto inhibitoru je dobře vidět, že alkynová
skupina i koncový cyklopropyl jsou umístěny do zcela hydrofobní kavity tvořené několika
aromatickými ale i alifatickými rezidui (Obr. 50).
Hydrogenace těchto vazeb je většinou nejjednodušším způsobem prvotních SAR studií. Tato
transformace vede jak u alkenů, tak u alkynů ke změně orientace vazeb a zvýšení sterické
zábrany.
e) Interakce ketonů a aldehydů. Tyto funkční skupiny se ve struktuře léčiv nevyskytují příliš
často v důsledku své reaktivity (aldehydy jsou v léčivech velice vzácné, protože jsou
reaktivnější a lehce se oxidují na kyseliny). Mezi léčiva, která mají keto skupinu patří např.
dříve zmíněný tolkapon. Ketony mohou tvořit dvě vodíkové vazby díky volným elektronovým
párům, ale vystupují pouze jako akceptory těchto vazeb. Ketony mohou participovat také na
dipól-dipólových interakcích a ion-dipólových interakcích.
Celá skupina včetně elektronových párů je na základě sp2 hybridizace v rovině, a to umožňuje
testovat nezbytnost této vazby pomocí jednoduché redukce na alkoholy, které vykazují zcela
odlišnou geometrii.
f) Interakce amidů. Amidové skupiny jsou zásadními komponenty proteinů, tvoří peptidovou
vazbu a jsou součástí postranních řetězců některých aminokyselin. S tímto uskupením se
setkáváme velmi často u prvotních hitů, například v případě léčiv na bázi peptidů, ale můžeme
je nalézt také u řady klinicky používaných léčiv.
Amidy mohou poskytovat své volné elektronové páry pro vodíkovou vazbu, vystupují jako
HBA, a mohou tvořit až dvě vodíkové vazby s HBD. Dusík amidů má svůj volný elektronový
pár konjugován s karbonylovou skupinou a proto se nechová jako HDA. Primární a sekundární
amidy mohou poskytovat své vodíkové atomy pro další vodíkové vazby a vystupovat tak jako
HBD (Obr. 51). Amidy mají také dipólový moment, díky kterému figurují v dipól-dipólových a
ion-dipólových interakcích.
A
B
Obr. 51. A) Amidový dusík neposkytuje svůj elektronový pár pro vodíkové vazby, protože je
konjugován s karbonylovou skupinou. B) Příklady možných modifikaci, kterými můžeme testovat
vliv amidové skupiny na biologickou aktivitu.
V úvodním SAR můžeme uvažovat nad použitím mnoha náhrad amidové skupiny. HBD funkci
primárních a sekundárních amidů můžeme ověřit pomocí náhrad jednotlivých vodíků za metyly,
přestože takto vznikají i stericky náročnější sloučeniny. Dusík může být nahrazen kyslíkem
nebo uhlíkem za vzniku esterů a ketonů, které nejsou efektivními HBD. Keto skupina má ale v
porovnání se skupinou amidovou odlišnou geometrii a může dojít ke změně interakce i v
důsledku této geometrické změny. Interakce, které poskytují jak karbonyl, tak dusík amidové
skupiny, mohou být z tohoto pohledu nejlépe testovány náhradou za vinylovou skupinu, která
odpovídá amidům svou planární strukturou. Mezi další skupiny, které mohou být ve
specifických případech použity pro ověření interakcí amidů, patří aminy (zjištění interakce
karbonylu) a karboxylové skupiny.
59
Specifickým případem amidů jsou cyklické amidy nazývané laktamy. Pokud je kruh laktamu
dostatečně malý (většinou čtyřčlenný = -laktamy), může díky vysokému sterickému pnutí
docházet k otevření tohoto kruhu a vzniku kovalentní vazby s biologickým cílem. Tento efekt
využívají například -laktamová antibiotika jako jsou penicilíny, cefalosporiny, karbapenemy,
monobaktamy a penemy.
g) Interakce amoniových solí. K tvorbě amoniových solí dochází za fyziologických podmínek
protonací aminů. V průběhu interakce ligandů obsahujících takového protonované
aminoskupiny pozorujeme iontový vztah s karboxylovými zbytky kyseliny glutamové a
asparagové. Časté jsou také ion-dipólové interakce s karbonylovými skupinami, případně
s aromáty. Tyto protonované aminy jsou velmi dobrými donory vodíkové vazby.
Obr. 52. Krystalová struktura imatinibu, ze které je patrná silná vodíková vazba mezi amoniovou
solí a karbonylem polypeptidového řetězce. (PDB id: 1IEP)106
Jak interakci amidů, tak amoniových solí si můžeme názorně ukázat na imatinibu, inhibitoru
defektní Bcr-Abl kinasy, který se využívá k léčbě chronické myeloidní leukémie. Amidová
funkční skupina imatinibu poskytuje vodíkové vazby jak pomocí vodíku vázaného na
dusíkovém atomu, tak pomocí kyslíku karbonylu. Vzdálenost terciárního aminu od amidových
kyslíků polypeptidového řetězce je nápadně malá a dá se předpokládat, že je následkem velmi
silné vodíkové vazby, která vzniká v důsledku protonace této skupiny a ion-dipólové interakce
mezi kladně nabitým dusíkem imatinibu a druhým amidovým uskupením (Obr. 52).
Zajímavý příklad interakce kvartérních amoniových solí s aromatickými jádry můžeme
pozorovat také u inhibitoru trombinu a faktoru Xa, dvou enzymů hrajících významnou roli
v koagulační kaskádě. Afinity inhibitorů nesoucích trimetylamoniovou a t-butylovou funkční
skupinu vůči trombinu a faktoru Xa se výrazně liší a jejich selektivita je opačná. Přestože tyto
dva enzymy mají podobnou strukturu aktivního místa, kavita vážící amoniový kation je odlišná.
U faktoru Xa je tvořena 3 aromatickými rezidui, zatímco u trombinu pouze jedním. Tím, že se
kation váže silně na všechny tři rezidua u faktoru Xa, je překonána energie nutná pro
desolvataci tohoto iontu a tato kladně nabitá látka vykazuje vyšší afinitu než t-butyl derivát.
Naproti tomu trombin váže výrazně lépe t-butyl derivát pomocí hydrofobních interakcí a
disperzních sil, protože ion-dipólová interakce kationtu pouze s jedním aromatickým jádrem je
pro překonání solvatačního rozdílu nedostatečná (Obr. 53).
Tento příklad je názornou ukázkou toho, jak je možné v praxi používat ověřování skupin
v SAR. Právě t-butylovou skupinu lze využít jako stericky podobnou náhradu za
trimetylamoniovou sůl. Syntéza derivátů se sekundární amidovou skupinou, která nemůže být
protonována, je dalším možným způsobem, jak tuto interakci ověřit.
60
Inhibitor
(±)-A
(±)-B
Ki (M)
Trombin Faktor Xa
0.13
29
7.76
0,28
Obr. 53. Krystalová struktura látky B v komplexu s faktorem Xa (PDB id: 2BOK) a porovnání
modelů trombinu v komplexu s t-butyl derivátem A a analogem nesoucím kvarterní amoniovou
skupinu B.107
h) Interakce karboxylových kyselin. Karboxylové kyseliny se mohou v neionizované formě
chovat jako HBA i jako HBD. Jejich anionty, jsou schopny poskytovat iontové vztahy s kladně
nabitými rezidui argininu, histidinu a lysinu. Takto ionizované karboxylové kyseliny se mohou
účastnit také ion-dipólových interakcí. Často je můžeme nalézt v komplexu s kationty kovů
v metaloproteinech (např. komplexy se zinečnatými anionty u enalaprilátu viz. Kapitola 6.6.).
Karboxylátové anionty jsou velmi silné akceptory vodíkové vazby.
Pro ověření interakce s karboxylovými kyselinami můžeme využít neionizující deriváty
karboxylových kyselin, jako jsou amidy a estery, případně metylketony. Záměna za
hydroxylovou skupinu nám může ukázat, zda se karbonyl podílí na tvorbě vodíkových můstků.
i) Interakce esterů. Estery se na rozdíl od karboxylových kyselin chovají pouze jako akceptory
vodíkových vazeb. Ve specifických případech mohou poskytovat až čtyři tyto vazby. Estery se
v aktivních ligandech příliš často nevyskytují, protože dochází k jejich velmi rychlé metabolické
přeměně pomocí esteras a to jak ve tkáních, tak v krvi. Ne druhé straně této jejich vlastnosti je
možné využít pro usnadnění orální dostupnosti některých karboxylových kyselin (viz. Kapitola
12.3.). Metabolickým procesům odolávají pouze některé stericky silně bráněné estery.
j) Interakce nitrilů. Nitrily jsou velmi zajímavou skupinou, kterou nalezneme v mnoha léčivech.
Fungují jako velmi dobré akceptory vodíkové vazby a mohou poskytovat také dipól-dipólové
interakce a ion-dipólové interakce díky polarizaci C-N vazby.
k) Interakce alkylhalogenidů. Alkylhalogenidy obsahující chlor, brom a jód jsou většinou silná
alkylační činidla, které mohou alkylovat nukleofilní centra biomolekul a nejsou proto vhodnými
léčivy. Jedny z mála alkylhalogenidů obsahující tyto prvky, které se používají v klinické praxi,
jsou tzv. dusíkaté yperity. Jejich mechanismus účinku je založen právě na alkylaci převážně
guaninových nukleobází DNA a využívají se hlavně v terapii rezistentních druhů rakoviny.
61
Na druhé straně alkylfluoridy se jako alkylační činidla nechovají a jejich použití v medicinální
chemii je velmi časté a oblíbené. Vazba uhlíku a fluoru je velmi silná a nepodléhá
metabolickým změnám. Fluor se proto používá jako náhrada metabolicky nestálých vodíků. Za
tímto účelem se často využívá trifluormetylová skupina. Mezi léčiva nesoucích CF3 skupinu
patří například výše zmíněný efavirenz nebo antidiabetikum sitagliptin, inhibitor
dipeptidylpeptidasy IV, která hraje důležitou úlohu v degradaci inzulínu. Přestože se může fluor
chovat jako HBA, je považován spíše za slabý akceptor. Tento efekt můžeme pozorovat právě u
sitagliptinu (Obr. 54).
Obr. 54. Na struktuře sitagliptinu (PDB id.: 1X70)108 můžeme pozorovat jak vodíkovou vazbu,
kterou poskytují fluorové atomy vázané na alifatické, tak na aromatické části molekuly.
l) Interakce arylhalogenidů. U arylhalogenidů můžeme také pozorovat slabé vodíkové vazby, ve
kterých se halogen chová jako HBA. Právě na derivátech sitagliptinu bylo demonstrováno, že
aryl fluoridy mohou efektivně přispívat k vazbě pomocí vodíkových můstků.
Obr. 55. Ukázka krystalové struktury inhibitoru CLK1, kde můžeme pozorovat jak halogenovou
vazbu mezi chlorem a karbonylem polypeptidového řetězce, tak vodíkovou vazbu mezi nitrilem a
lyzinovým reziduem (PDB id.:2VAG) 109
U aromatických halogen derivátů lze pozorovat ortogonální dipolární interakci, kterou tvoří
s karbonylovými sloučeninami. Tato tendence je patrná především u arylfluoridů, u ostatních
halogenů již pozorujeme tendenci k paralelnímu postavení karbonylu a arylhalogenidu.93 Velmi
62
m)
n)
o)
p)
důležitou vazbou pro arylhalogenidy je pak vazba halogenová. Příkladem látky, u které
halogenová vazba sehrává důležitou roli je KH-CB19, nový inhibitor CLK1 kinasy, která je
potenciálním biologickým cílem pro Alzheimerovu chorobu110 a terapii chřipky (Obr. 55).111, 112
Interakce thiolů. Thioly poskytují velmi silné vazby s ionty kovů například ionty zinečnatými.
Tuto vazbu jsme si ukázali na příkladu kaptoprilu. Thioly jsou ale také slabé akceptory a donory
vodíkových vazeb. Význam vazby s thioly může být jednoduše ověřen náhradou za alkoholy.
Interakce etherů. Alifatické ethery jsou dobré akceptory vodíkové vazby, smíšené
arylalkylethery jsou slabé akceptory. Kyslíkové atomy aromatických etherů jsou takřka bez
HBA vlastností. Tuto vazbu můžeme ověřit náhradou za metylenovou skupinu, nebo
zvětšováním substituentů, které brání přístupu k etherovému kyslíku.
Interakce heterocyklů. Ve strukturách léčiv převažují zejména dusíkaté heterocykly. Velmi
záleží na jejich struktuře. Obecně je nutné si uvědomit, které skupiny fungují jako donory
elektronů, a které jako akceptory. U běžných aromatických heterocyklů mají dusíky vždy jen
jednu z těchto funkcí. Jednoduché heterocykly mohou poskytovat -stacking, disperzní a
hydrofobní interakce. Dipól-dipólová interakce byla nedávno pozorována také mezi amidy a
heterocykly, které vykazují dipólový moment.113
Jako příklad může sloužit adenin. Jeho purinový heterocyklus má
tři skupiny, které fungují jako akceptory vodíkových vazeb, a
jednu, která je donorem vodíkové vazby. Adenin může poskytovat
další dva vodíky aminoskupiny jako HBD, ale delokalizace
elektronového páru znemožňuje její zapojení do vazby jako HBA.
Stacking adeninu a dalších nukleobází je nezbytný pro správné
uspořádání v nukleových kyselinách (Obr. 56).
Ostatní funkční skupiny. V léčivech se můžeme setkat s mnoha
dalšími skupinami, jako jsou sulfonové, sulfonamidové,
fosfátové a fosfonátové. Chování těchto skupin je do značné míry
Obr. 56.
analogické karbonylovým a karboxylovým derivátům, jak uvidíme
v dalších kapitolách.
63
8. Strategie optimalizace hitu (leadu)
Prvním krokem k optimalizaci hitu bývá zvýšení jeho aktivity, selektivity účinku a případné
potlačení toxicity. Pro tento účel jsou prostředky medicinální chemie nezastupitelné, a sehrávají
v tomto procesu zásadní roli. Níže popsané postupy jsou využívány jak v úvodních fázích SAR
studií při výběru leadu, tak v průběhu jeho optimalizace.
Příprava nových analogů nám dává nezbytné informace o možných modifikacích výchozí struktury
a předpokládaném dalším postupu v jeho strategii. Můžeme rozlišit několik základních druhů
analogie a v této kapitole bychom se s nimi měli podrobněji seznámit.
8.1. Homologie
Jako homologa označujeme deriváty, které se liší v dané homologní řadě o určitou konstantní
jednotku (většinou - CH2 -). Prodlužování uhlovodíkového řetězce může vést k několika různým
fenoménům. Prodlužováním řetězce dochází k růstu hydrofobní části, který má vliv na základní
fyzikálně chemické parametry jako jsou log P (míra lipofilicity, viz níže), log S (míra rozpustnosti
ve vodě), Rf a kritická micelární koncentrace.
Můžeme rozlišovat:
a) Monoalkylované deriváty (R-X → R-CH2-X → R-CH2-CH2-X), jejichž struktura se liší
pouze v délce postranního řetězce, přičemž délka řetězce je buď omezena velikostí lipofilní
kavity, nebo se řídí zvonovitou křivkou (viz níže).
b) Cyklopolymetylenové deriváty, u kterých se jedná o prodlužování uhlovodíkového řetězce
v rámci cyklu, a dochází tak ke zvětšování nebo zmenšování cyklu (Obr. 57). Tato změna
může vést k výrazné změně geometrie celé molekuly. Jedním ze současných příkladů
využití této metodiky je SAR studie nových vinblastinových derivátů (Obr. 58).114
Obr. 57. Analogie pomocí zvětšování kruhů.
Obr. 58. Příklad využití expanze a kontrakce cyklů v SAR studiích derivátů vinblastinu.
c) Otevřené, difunkční, polymetylenové serie (X-(CH2)n-Y → X-(CH2)n+1-Y) mají dvě
různá funkční centra vázaná mezi sebou alifatickým řetězcem, který se může prodlužovat.
64
Na takovéto sérii můžeme sledovat vliv změny délky řetězce na biologickou aktivitu
připravených látek. Jednat se může jak o symetrické (X=Y), tak nesymetrické molekuly
(X≠Y).
Tato technika byla využita k optimalizaci vlastností nových inhibitorů fosfodiesterasy typu 4
(PDE4), které mají stejně jako další PDE4 inhibitory zmiňované výše, potenciálně
protizánětlivé účinky, a jejichž užití je zaměřeno zejména na léčbu psoriatické artritidy.115
Obr. 59.
Příklad aplikace všech tří výše zmíněných postupů je SAR studie aktivity a selektivity
jednoduchých benzotiazolonů na receptory. Tyto receptory byly původně mylně
považovány za opioidní receptory, ale dnes je zřejmé, že se jedná o samostatnou rodinu
receptorů, která váže celou řadu přírodních látek od steroidů až k alkaloidům.116 Možným
endogenním ligandem receptorů je halucinogenní látka N,N-dimetyltryptamin
(DMT).117 Jak látky vážící se na receptory tak ligandy receptorů mají potenciální
použití u neurodegenerativních onemocnění a rakoviny. Tato SAR studie jasně indikuje, že
prodlužování řetězce mezi benzotiazolonovou částí a cyklickým aminem vede
k markantnímu zvýšení afinity k receptorům, za současného snížení vazby na
receptory. Prodloužení postranního řetězce vede také ke zvýšení afinity vůči oběma
receptorům, zatímco zmenšení kruhu cyklického aminu vede k obecnému snížení aktivity
(Obr. 60).118
Obr. 60. SAR studie affinity benzothiazolonů k receptorům.
d) Substituované kationty, jsou specifickým příkladem homologie. V homologní řadě dochází
ke zvyšování objemu skupiny a vzestupu hydrofobního charakteru, které mohou vést ke
snižování efektivity vazby na cílový protein, například může klesat interakce s receptorem
ze sterických důvodů (Obr. 61).
65
Obr. 61.
Asi nejčastěji dochází se stoupajícím počtem uhlíkových atomů nejdříve k růstu aktivity (často od
metylu k pentylu až nonylu), který je následován přibližně stejně prudkým poklesem aktivity při
dalším prodlužování uhlíkatého řetězce. K tomuto charakteristickému průběhu tzv. zvonovité křivce
dochází z farmakodynamických nebo farmakokinetických důvodů.
Ke stoupaní afinity může docházet v důsledku vícenásobné interakce s proteinem na základě
hydrofobních interakcí a disperzních sil. Pokles účinnosti pak může být způsoben omezenou
velikostí lipofilní kapsy, která není schopna efektivně pojmout větší lipofilní řetězec. Tento důvod je
čistě farmakodynamický. Na druhé straně může mít křivka vrchol při optimálním poměru
rozdělovacího koeficientu logP, který zajišťuje správný poměr mezi účinností přechodu přes
membrány a rozpustností. Při úvodním prodlužování alifatického řetězce dochází ke zvyšování
prostupnosti přes biologické membrány a zvýšenému průniku do buněk. Následný pokles aktivity je
pak často způsoben snížením rozpustnosti ve vodě, nebo formováním micel, které znemožňují
přístup léčiva k biologickému cíli. U in vitro, tak in vivo testů mohou být tyto efekty kombinované,
a mohou se doplňovat.
Tento průběh aktivity pozorujeme na příkladu SAR studie nových inhibitorů chymotripsinu
podobné aktivity proteazomu (Obr. 62), která hraje klíčovou roli při degradaci apoptotických a
tumor supresivních proteinů. Její inhibitory mohou proto najít uplatnění v terapii nádorových
onemocnění.119
Derivát
R
IC50 (mM)
a
b
c
d
e
f
Me
Et
Pr
Bu
Pent
Hex
0,22
0,099
0,027
0,039
0,12
0,43
Obr. 62. Inhibitory chymotrypsinu podobné aktivity proteazomu vykazují tradiční průběh zvonovité
křivky.
Zvonovitá závislost aktivity na struktuře byla pozorována u zvyšování produkce interferonu alfa
(INF-v myších splenocytech (slezinné buňky) 2-substituovanými 6-aminopuriny(Obr. 63). Látky
tohoto typu jsou v současné době vyvíjeny jako potenciální léčiva proti virovým onemocněním. Zde
se čtyřčlenný řetězec vázaný na centrální purinový skelet přes etherový můstek zdá být nejlepší.
Tendenci růstu aktivity těchto látek je možné pozorovat také při porovnání substituentů vázaných
přímo na purin (H→n-Bu).
Prostorové omezení lipofilní kapsy je zřetelné na příkladu inhibitorů tyrosinkinasy EphB4, které
jsou vyvíjeny jako potenciální cytostatika. Metylová skupina (Obr. 64, červeně) zabírá optimální
66
prostor a jejím zvětšováním by docházelo k výraznému poklesu aktivity v důsledku repulze mezi
atomy proteinu a inhibitoru. U alkylového substituentu na heterocyklické části molekuly (Obr. 64,
modře) dochází k postupnému poklesu aktivity s prodlužujícím se řetězcem.
Derivát
R
MEC (M)
a
b
c
d
e
f
g
h
ch
H
CH2CH3
n-Bu
Ph
n-PrO
n-BuO
n-C5H11O
n-BuNH
n-BuS
10
1
0,03
10
0,01
0,0001
0,01
0,1
0,01
Obr. 63. Strukturně aktivitní závislost produkce INF- v myších splenocytech na délce
uhlovodíkového řetězce u 2-substituovaných 6-aminopurinů (MEC – minimální efektivní
koncentrace).120
A
Derivát
R
IC50 (nM)
a
b
c
n-Bu
n-C5H11
n-C6H13
56
177
1300
B
Obr. 64. Příklad prostorového omezení prodlužování postranního řetězce, kde metylová skupina
efektivně zapadá do kavity. Na druhé straně, substituent R, který směřuje ven z aktivního centra má
optimální velikost 4 uhlíky a s rostoucí velikostí dochází ke snížení aktivity (PDB id: 4GK3).121
V případě, že dochází s prodlužováním řetězce ke stálému vzrůstu aktivity, pak je možné
konstatovat, že vrcholu zvonovité křivky ještě nebylo dosaženo nebo že se jedná o nespecifický
účinek látky, limitujícím faktorem je pak rozpustnost látky ve vodném mediu. Křivka závislosti
aktivity na délce alifatického řetězce nemusí být vždy pravidelná a v mnoha případech je jedna
strana znatelně prudší než druhá. V určitých případech se projevuje také střídavé zvyšování a
snižování aktivity při přidávání jednotlivých homologních jednotek (tedy např. metylenové
jednotky).
67
Tento efekt je dán geometrickou orientací metylenových jednotek, zejména koncového metylu, a je
pozorován nejen u biologické aktivity látek, ale také u teploty tání a hustoty alkanů (Obr. 65).122
V případě takovéto fluktuace aktivity v in vivo experimentech může být tento trend způsoben také
rozdíly ve farmakokinetice (odlišnosti v metabolismu, vazbě na plazmatické proteiny a exkreci).
Obr. 65. Fluktuace teplot tání a hustot alkanů, způsobená rozdílnými rotacemi koncových
metylových skupin.122
Mezi specifické případy změny biologické aktivity v závislosti na prodlužování uhlovodíkového
řetězce můžeme počítat například agonisty acetylcholinových receptorů se dvěma trimetyl
amoniovými skupinami spojenými lineárním uhlovodíkovým řetězcem (Obr. 66). Deriváty
s řetězcem dlouhým 5-6 uhlíků vykazují agonismus vůči nikotinovým receptorům v synaptických
gangliích a dříve byly užívány v terapii hypertenze. Naproti tomu desetiuhlíkatý derivát vykazuje
antagonismus vůči muskulárním nikotinovým receptorům a používal se jako muskulární relaxancia
v anesteziologii, ale dnes je již také obsoletní. Tento efekt je způsoben odlišnou vzdáleností center
těchto receptorů vážících trimetylamoniovou skupinu. V tomto případě homologie dochází ke
změně vyvolaného účinku.
Obr. 66. Agonisté a antagonisté nikotinových receptorů.
Někdy může být pozorována až inverze aktivity. U N-alkylovaných derivátů noradrenalinu dochází
ke změně hypertenzního účinku analogů s kratšími alkylovými řetězci v účinek hypotenzní u
derivátů s řetězci delšími. Vysvětlení tohoto jevu je interakce noradrenalinu s a adrenergními
receptory. Deriváty s kratšími řetězci interagují s oběma typy receptorů, kdežto deriváty s delšími
pouze s -adrenergními receptory.
Kromě metylenové jednotky mohou být homologní jednotkou také další skupiny, např. vinylová
nebo acetylénová podjednotka123, benzenové jádro nebo etylenglykolový monomer (Obr. 67).
Vinyloga mají v medicinální chemii zanedbatelné využití zejména díky své nevyzpytatelné aktivitě
a metabolické nestálosti.
68
Obr. 67.
Obr. 68. Reverzibilní inhibitor EGFR kinasy - gefitinib a jeho ireverzibilní vinylog dacomitinib,
který je v současné době v pozdních stádiích klinických zkoušek na některá rakovinná onemocnění.
Konjugovaná vinylová skupiny je schopna napadat nukleofilní cysteinovou skupinu v blízkosti
aktivního centra enzymu, jak je patrné z krystalové strukury (PDB id.: 4I24).124
Často vede zavedení vinylové skupiny ke zvýšení toxicity v důsledku reaktivity dvojných vazeb,
zejména konjugovaných. Možnost vytvoření, kovalentní vazby s cílovým enzymem byla v poslední
době využita u některých inhibitorů proteinových kinas (Obr. 68).125
Anelace benzenového kruhu, nebo jeho zařazení do řetězce, vede ke vzniku benzolog. Jejich
příkladem je benzolog thiazolového antiparazitika nitatazoxanidu a tizoxanidu (Obr. 69).126
Derivát
NIT
TIZ
a
b
IC50 (M)
Giardia
intestinalis
1,214
0,716
0,297
0,590
Obr. 69. Srovnání aktivit thiazolových antiparazitik.
69
Trichomonas
vaginalis
0,068
0,211
0,842
2,147
Entamoeba
histolytica
0,504
1,229
3,515
8,021
Plasmodium
berghei
3,890
5,240
2,420
2,370
Analoga obsahující opakující se etylenglykolovou jednotku jsou používána zejména kvůli dobré
rozpustnosti ve vodném mediu, která omezuje v některých případech použití derivátů obsahujících
čistě uhlovodíkový řetězec. Příkladem použití této strategie je série muskarinových agonistů, které
byly připraveny jako potenciální léčiva pro schizofrenii (Obr. 70).127 Na této sérii je jasně vidět, že
každý z muskarinových receptorů má odlišné vazebné místo, a každý z nich má preferovanou délku
spojovacího řetězce.
Derivát
a
b
c
d
n
pKi (-logKi)
1
2
3
4
M1
M2
M3
M4
M5
6,1
6,5
7,3
6,4
7,4
7,4
8,1
8,6
7,3
6,6
7,6
5,8
7,2
7,1
8,6
7,9
6,6
6,2
6,4
7,0
Obr. 70. Agonisté muskarinových receptorů s opakujícími se etylenglykolovými jednotkami.127
8.2. Izosterie a bioizosterie
Koncept izosterie byl definován téměř před sto lety (v roce 1919) Irvingem Langmuirem a později
rozvinut Grimmem a Erlenmeyerem. Izostery jsou definovány jako atomy, skupiny atomů nebo
ionty, které mají stejné mocenství (valenční číslo, stejný počet elektronů ve valenční vrstvě).
Takovéto atomy nebo skupiny atomu tak sdílejí obdobné fyzikálně-chemické vlastnosti.
Hans Erlenmeyer také poprvé vyslovil myšlenku, že strukturně odlišné molekuly mohou být
obdobně rozeznávány biologickými systémy, i když pojem bioizoster byl zaveden až Harrisem
Friedmanem v padesátých letech minulého století.128 Podle Burgera definujeme bioizostery jako
látky nebo skupiny, které mají ekvivalentní tvar a objem, přibližně stejnou distribuci elektronů, a
které mají podobné fyzikálně-chemické vlastnosti jako např. hydrofobicitu. Bioizosterní sloučeniny
ovlivňují stejné biochemické systémy, a vyúsťují v biologické vlastnosti, které jsou navzájem
příbuzné. Dle Thornbera jsou bioizostery látky nebo jejich skupiny, které sdílejí fyzikální a
chemické podobnosti, a poskytují značně podobné biologické efekty.129
Bioizostery mohou ovlivňovat množství parametrů a při bioizosterní záměně bychom měli brát
v úvahu:
 velikost
 konformaci
 induktivní a mezomerní efekt
 polarizovatelnost
 formování vodíkových vazeb
 pKa
 logS
 logP
 reaktivitu a stabilitu
Koncept bioizosterů si vydobyl nezastupitelnou pozici v moderní medicinální chemii, stal se jednou
ze základních taktik ve vývoji nových léčiv od hitu přes leady až po finální klinické kandidáty.
Díky široké variabilitě výše zmíněných parametrů je tímto přístupem možné pozměnit řadu
vlastností léčiv od vlastních farmakodynamických parametrů (aktivita, selektivita) přes parametry
70
farmakokinetické (metabolismus, rychlost absorpce a exkrece, omezení toxikoforů) až po
patentovatelnost nově připravených látek.
8.2.1. Klasické bioizostery
Mezi klasické bioizostery řadíme takové atomy nebo skupiny, které do značné míry odpovídají i
principu izosterie. Jedná se o atomy nebo skupiny, které mají stejné valenční vlastnosti. Řadí se sem
také jednoduché ekvivalenty kruhů. Klasické bioizostery se proto většinou dělí na monovalentní,
divalentní, trivalentní atomy nebo skupiny, tetrasubstituované atomy a ekvivalenty kruhů.


Monovalentní atomy a skupiny:
OH
NH2 CH3 Cl
F
SH
PH2
Br
iPr
I
tBu
H
Bivalentní atomy nebo skupiny:
-CH2- -NH- -O-S-COCH2R
-CONHR
-COOR

Trivalentní atomy nebo skupiny:
-CH= -N=
-P=
-As=

Tetravalentní atomy:

Ekvivalenty kruhů:
-CH=CH-
-S-
-CH=
-N=
-O-
-S-
-CH2-
-COSR
-NH-
Mezi jednu z nejčastějších monovalentních obměn patří záměna vodíkového atomu za atom fluoru.
Tyto dva atomy se vyznačují podobnými Van der Wallsovskými poloměry (1.2 Å vodík a 1,35 Å
fluor). Jak jsme si řekli již dříve, tato obměna je významná zejména pro snížení metabolické
přístupnosti dané polohy (atom fluoru tvoří velmi pevnou vazbu s uhlíkem, a tato vazba nepodléhá
snadno metabolickým přeměnám).
Jako příklad bioizosterie v tomto případě můžeme použít 5-fluoruracil, který po in vivo konverzi na
5-fluor-2’-deoxyuridin slouží jako inhibitor thymidylátsyntasy (TS), enzymu klíčového pro de novo
syntézu dTMP a tím i dTTP z dUMP. TS umožňuje přenos metylenové jednotky z 5,1071
metylentetrahydrofolátu (5,10-CH2THF, Obr. 71) na uracilovou nukleobázi dUMP za vzniku báze
thyminové. Pokud je ale v poloze 5, kam se metylenová jednotka váže, atom fluoru, nemůže dojít
k odštěpení fluoru, a ke zpětné aromatizaci pyrimidinového kruhu. To ve svém důsledku vede
k depleci dTTP, celkové disbalanci nukleotidu v buňce, který má za následek kancerostatický
účinek těchto látek. Na stejném principu pracuje také proléčivo 6-fluoruracilu kapecitabin.129, 130
Obr. 71. Mechanismus inhibice thymidylátsyntasy (TS) pomocí 6-fluoruracilových derivátů.
Příkladem použití bivalentních bioizosteru mohou být antagonisté Smoothened (Smo) receptoru
účastnícího se „Hedgehog“ signalizační dráhy, důležité embryonální dráhy regulující diferenciaci
kmenových buněk (Obr. 72). Inhibitory přinášejí naději pro léčbu bazocelulárního karcinomu
(nejčastější nádor kůže).
Obr. 72. Antagonisté Smo receptoru jako ukázka bivalentních bioizosterů.
Na tomto příkladu můžeme jasně vidět zachování antagonistické aktivity všech bioizosterů.
Optimalizací struktury zavedením metylového zbytku (který v tomto případě vedl pravděpodobně
k uzavření v požadované konformaci, viz. Kapitola 9.) a přípravou benzologa byly získány deriváty
se zvýšeným antagonismem vůči Smo receptoru.131
72
8.2.2. Neklasické bioizostery
Neklasické bioizostery nemusejí mít stejný počet atomů a nesplňují sterické a elektronové
požadavky na klasické bioizostery. Většinou je dělíme na dvě skupiny:132


zaměnitelné funkční skupiny vykazující obdobné biologické efekty (vlastnosti)
záměna acyklických skupin za cyklické a naopak
8.2.3. Dělení bioizosterů podle funkčních skupin
Medicinální chemik musí mít představu, které skupiny může použít jako bioizostery strukturních
prvků výchozí molekuly a jakým způsobem tato záměna ovlivní chování a vlastnosti výsledných
analogů. Z tohoto pohledu je nejvhodnější rozdělení podle konkrétních funkčních skupin, které se
chystáme substituovat.
8.2.3.1. Bioizostery karboxylové skupiny
Záměna karboxylové skupiny bývá většinou vedena snahou ovlivnit acidobazické vlastnosti
bioizosteru nebo změnit (zvýšit) logP/logD molekuly. Mezi bioizostery karboxylových kyselin jsou
jak deriváty acyklické tak cyklické.
Řadíme sem přímé deriváty, které se vyznačují zachováním kyselého vodíku. Mezi bioizostery
karboxylových kyselin náleží celá řada skupin s podobnou kyselostí jako karboxylové kyseliny
(kyselina octová má pKa 4,76 a logD -1,65;133 kyselina benzoová pKa 4,2). Hydroxamové kyseliny
(pKa ~ 8-9) vykazují také vysoké chelatační schopnosti, které mohou být využity při syntéze
analogů karboxylových kyselin se známou interakcí s kationty kovů (například u metaloproteinů).
Karboxylovou skupinu můžeme nahradit také za některé další neplanární kyselé deriváty síry a
fosforu. Fosfonové kyseliny mohou sloužit jako výhodné bioizostery karboxylových kyselin,
přestože jsou bivalentní a mají nižší pKa (metylfosfonová kyselina pKa = 2,35 při logD = -2,13)133,
134
; a jsou také schopny komplexace s ionty kovů. Sulfonové kyseliny vykazují vyšší kyselost
(metansulfová kyselina pKa = -1,9 při logD = -2,66)133, 135 než jejich karboxylová analoga. Mezi
další hojně používané bioizostery karboxylové skupiny patří sulfonamidy, acylsulfonamidy a jejich
deriváty (Obr. 73).
Obr. 73. Příklady některých bioizosterů karboxylových kyselin.
Obr. 74. Kyselé heterocykly jako bioizostery karboxylových kyselin.132
73
Velmi důležitou skupinu bioizosterů karboxylových kyselin tvoří kyselé heterocykly (Obr. 74).
Tetrazoly si získaly značnou oblibu díky velmi podobnému pKa a podstatně více lipofilnímu
charakteru (cca 10× vyšší). Na rozdíl od karboxylových kyselin jsou prostorově objemnější.
Zdařilé porovnání některých acyklických i cyklických bioizosterů karboxylových skupin nabízí
SAR antagonistů receptorů pro angiotensin II typu 1 (AT1). Na základě obdobného mechanismu
účinku se tyto látky používají v podobných indikacích jako dříve zmíněné ACE inhibitory, tedy
především u hypertenze. Výsledkem této studie byl objev klinicky používaného léčiva losartan.133
Derivát
R
pKa (přibližná)
IC50 (M)
a
b
c
d
e
COOH
CONHOH
CONHOCH3
CONHSO2Ph
NHSO2CF3
5
10,5
10,9
8,4
4,5
0,23
4,1
2,9
0,14
0,083
5-6
0,019
f (losartan)
Obr. 75. Aktivita AT1 antagonistů v závislosti na použité bioizosterní skupině.
Také 3-hydroxyisoxazol a 3-hydroxyisothiazol jsou poměrně často používané bioizostery
karboxylových kyselin. Příkladem jejich využití v praxi je série agonistů a antagonistů
glutamátových NMDA a AMPA receptorů, které by mohly najít uplatnění zejména v terapii CNS
onemocnění (Obr. 76).133
Obr. 76. Příklady derivátů glutamové kyseliny, které se váží na glutamátové receptory a obsahují 3hydroxyisoxazol nebo 3-hydroxyisothiazol.
Obr. 77. Mezi bioizostery esterů patří amidy, sulfonamidy a jejich deriváty, halogenované alkeny a
alkyloximy. Vhodně substituované heterocykly, mohou díky své planaritě plně nahradit estery.
74
8.2.3.2. Bioizostery esterů
Náhrada esterové funkční skupiny může být v procesu hit-to-lead velmi významná, protože estery
jsou rychle degradovány esterasami jak v krevní plazmě, tak ve většině tkání. Záměna esterů za
vhodnější skupinu je proto provázena, prodlouženým biologickým poločasem a prodlouženým
účinkem (Obr. 77).Na příkladu nenukleosidových inhibitorů reverzní transkriptasy HIV pozorujeme
rychlou degradaci sloučenin obsahujících esterové funkční skupiny. Nahrazení esterů některými
výše zmíněnými bioizosterními skupinami došlo k dramatickému prodloužení plazmatického
poločasu těchto látek (Obr. 78).136
Derivát
IC50 (M)
HIV-1
EC50 (M)
MT-4
CC50 (M)
Poločas v plazmě
potkanů (min)
a
b
c
d
e
f
1.0
0.02
0.60
0.85
0.67
0.55
1.0
0.09
1.2
6.3
0.24
0.29
6.1
16.86
3.9
13.3
12.4
21.0
0.76 ±0.04
1.30 ± 0.09
4970 ± 795
156 ±21
3641 ±14.1
9.2 ± 1.5
Obr. 78. Vliv esterových skupin na metabolickou labilitu inhibitoru reverzní transkriptasy a její
efektivní snížení použitím bioizosterů.
8.2.3.3. Bioizostery amidů
Amidy jsou na rozdíl od esterů metabolizovány pomaleji a hlavní podíl jejich metabolismu probíhá
ve specifických orgánech, zejména játrech. Amidovou vazbu nacházíme v běžně používaných
léčivech mnohem častěji než vazbu esterovou. V některých případech je náhrada amidové skupiny
výhodná nebo dokonce nezbytná. Skupiny, které jsou často využívány jako bioizostery amidové
skupiny, jsou shrnuty na Obr. 79 a Obr. 80.
Obr. 79. Jednou z elegantních obměn amidové vazby je její prosté otočení, ale v praxi se uplatňuje
celá řada acyklických i cyklických modifikací amidové skupiny.
75
Bohužel léčiva na bázi peptidů, která jsou často získána z přírodních materiálů anebo na základě
racionálního designu založeného na proteinových sekvencí interagujících proteinů, podléhají této
metabolické degradaci velmi snadno, a peptidová léčiva mají proto velmi špatnou orální dostupnost.
Bioizostery amidové vazby umožňují přípravu derivátů těchto molekul se zvýšenou biologickou
stabilitou. Takto získané pozměněné látky imitující funkci peptidů označujeme jako
peptidomimetika.
Obr. 80. Časté obměny skeletu využívané u peptidomimetik.
Derivát
PalmCoA IC50 (M)
Lidské jaterní S9 %/ 30 min
a (CVT-4325)
0.38
74
b
3.63
72
c
4.80
49
d
11.0
43
e
1.30
40
f
1.50
40
Het
Obr. 81. Inhibitory oxidace palmitoyl-CoA. Porovnání biologické aktivity a metabolické stability v
supernatantu získaném centrifugací homogenátu lidských jaterních buněk (9000g/20 min).
76
Jednou z názorných ukázek uplatnění tohoto bioizosterního konceptu je příprava stabilních derivátů
inhibitorů oxidace palmitoyl-CoA. Deriváty snižující oxidaci mastných kyselin zvyšují oxidaci
glukózy, a proto mohou sloužit jako terapeutika pro ischemickou chorobu srdeční. Derivát CVT4325 byl testován in vivo na potkanech a psech, kde ukázal výborné farmakokinetické vlastnosti (u
psů orální dostupnost F = 93%, plazmatický poločas t1/2 = 13,6 h).137
8.2.3.4. Bioizostery – náhrada karbonylové skupiny
Karbonylové skupiny mohou vykazovat zvýšenou reaktivitu a tím indukovat toxicitu cílových
derivátů. Výčet záměn není omezen pouze na aldehydy a ketony, ale může být aplikován také na
výše zmíněné deriváty karboxylových kyselin. Jedním z těchto univerzálních příkladů je substituce
karbonylového uskupení oxetanovým kruhem, které lze snadno využít u ketonů, esterů i amidů
(Obr. 82).138
Obr. 82. Přehled bioizosterních skupin karbonylových sloučenin.
Obr. 83. Porovnání struktur výchozích derivátů a výsledného inhibitoru, který nese sulfonylovou
skupinu.
Obr. 84. Prolinový inhibitor (žlutý) je schopen integrovat jak s Gly449 tak s Tyr448 RNAdependentní RNA polymerasy hepatitidy typů C, kdežto výchozí benzodiazepinový derivát
obsahující karbonylovou skupinu (modrý) toho schopen není. Záměnou karbonylové skupiny za
sulfonylovou dochází k zachování interakce s Tyr448, ale vytváří se také nová interakce s Gly449.
77
Ukázkou použití sulfonylové skupiny na místo karbonylu byl racionální design nových
alosterických inhibitorů RNA-dependentní RNA polymerasy hepatitidy typů C, při které se
vycházelo ze znalosti krystalových struktur bezodiazepinového derivátu (Obr. 83a) a prolin
sulfonamidového inhibitoru (Obr. 83b). Překryv krystalových struktur (PBD id:2GC8, 3GNV,
3GNW) ukázal, že benzodiazepinový derivát není, na rozdíl od prolinového inhibitoru, schopen
poskytovat interakci jak s Gly449, tak s Tyr449. Izosterní náhrada karbonylu za sulfonyl tuto
interakci umožnila a vedla ke zvýšení aktivity v enzymových i buněčných testech.139, 140
8.2.3.5. Bioizostery – náhrada močoviny nebo thiomočoviny
Močovinový a thiomočovinový strukturní motiv je možné nahradit skupinami, které mimikují její
planární strukturu. V tomto případě byly použity acyklické skupiny jako je kyanguanidinová i
cyklické jako 3,4-diaminthiofen-1-oxid nebo 3,4-diamincyklobut-3-en-1,2-dion (Obr. 85).
Obr. 85. Příklady bioizosterů močovinové a thiomočovinové struktury použitelných v potenciálních
léčivech.
Obr. 86. Změna fyzikálně-chemických vlastností u bioizosterů močovinové skupiny.141
Vliv substituce močoviny a thiomočoviny ve struktuře léčiv lze demonstrovat na změně fyzikálněchemických vlastností u derivátů s diuretickými a antikompulzivními účinky (Obr. 86). Tato
technika byla využita také při návrhu antagonistů H2 histaminových receptorů (Obr. 87).132, 142
Obr. 87. Příklady antihistaminik obsahující skupiny bioizosterní k močovině a thiomočovině.
78
8.2.3.6. Bioizostery hydroxylů alkoholů a fenolů
Hydroxylová skupina u alkoholů může být důvodem rychlé metabolizace pomocí konjugace
s glukuronovou kyselinou nebo se sulfátovou skupinou. Vzniklé metabolity jsou následně rychle
vyloučeny z těla. Substituce hydroxylové skupiny (Obr. 88) může proto výrazně zlepšit
farmakokinetické vlastnosti cílových látek, především prodloužit jejich biologický poločas.
Obr. 88. Bioizostery hydroxylové skupiny.
Jedním ze zajímavých bioizosterních skupin, kterými můžeme nahradit hydroxyl je sulfoximinová
skupina, jejíž základní vlastnosti jsou shrnuty v Obr. 89A. Tato skupina byla například využita pro
derivatizaci HIV-1 proteasových inhibitorů (Obr. 89B).132
A
B
Obr. 89. Vlastnosti sulfoximinové skupiny (A) a využití některých bioizosterů hydroxylové skupiny
v SAR studii nových HIV-1 proteasových inhibitorů.
Léčiva obsahující fenolový nebo katecholový strukturní prvek mohou být také velmi rychle
metabolizována ve střevní sliznici a játrech. Katecholy jsou navíc specificky metabolizovány
katechol-O-metyltransferasami (COMT). U obou těchto skupin hydroxydrivátů jsou nejčastěji
využívány neklasické inhibitory, ve kterých je hydroxyl nahrazen heterocyklickým kruhem, který
mimikuje HBD a někdy také HBA roli této funkční skupiny (Obr. 90).
Obr. 90. Vybrané bioizostery katecholů.
Bioizostery fenolů byly podrobně studovány v souvislosti s výzkumem nových duálních
antagonistů D1/D5 dopaminergních receptorů. Přestože výchozí alkohol vykazoval excelentní in
vitro aktivitu, jeho orální dostupnost byla velmi malá díky first-pass efektu. Studium SAR
cyklických bioizosterů prokázalo, že aktivita je značně závislá na orientaci vodíkového atomu
vázaného na hydroxyl a tautomerii bioizosterních kruhů. Thiazolonový a imidazolonový derivát,
které měly in vitro aktivitu srovnatelnou s výchozím hydroxy derivátem, vykazovaly významně
lepší orální dostupnost.143
79
Obr. 91. Antagonisté dopaminergních receptorů jako příklad bioizosterní náhrady hydroxy skupiny
fenolů.
8.2.3.7. Bioizostery halogenových atomů
Halogenové atomy bývají nahrazovány skupinami, které odtahují elektrony (EWG). Mezi často
používané substituenty patří trifluormetyl a nitril (Obr. 92). Záměna halogenového atomu za nitril
vede k výraznému snížení lipofilního charakteru molekuly.
Obr. 92. Vybrané neklasické bioizostery halogenových atomů.
Případová studie optimalizace nenukleosidového inhibitoru reverzní transkriptasy HIV ukazuje, jak
je možné pomocí záměny atomů chlóru za kyano skupiny výrazně ovlivnit farmakokinetické
vlastnosti látky. Na základě této jednoduché obměny bylo dosaženo stejné inhibiční aktivity na RT
při výrazném snížení lipofilního charakteru a prodloužení biologického poločasu.132, 144
Obr. 93. Optimalizace NNRTI využívající bioizosterie halogenových atomů.
8.2.3.8. Bioizostery – náhrada thioeterů
Rychlá oxidace thioeterů v játrech na odpovídající sulfony je zodpovědná za jejich krátký
biologický poločas. Řešením může být náhrada za kyslíkatá analoga, nebo další substituenty
nesoucí HBA skupiny (Obr. 94).
80
Obr. 94. Bioizostery thioeterů.
8.2.3.9. Bioizostery – náhrada fosfátů
Náhrada fosfátů za jejich bioizostery zejména fosfonáty je jednou z nejúspěšnějších strategií
protivirových léčiv (Obr. 95). Tato metodika byla objevena a rozpracována na Ústavu organické
chemie a biochemie AV ČR profesorem Holým, a znamenala revoluci v moderní léčbě HIV a
hepatitidy B (HBV). Nukleosidová analoga jsou v buňkách několikanásobně fosforylována a
následně zabudována do struktury DNA nebo RNA. Nukleosidy jsou tedy jen proléčiva a aktivní
formou jsou jejich fosfáty. Ty jsou ale v roztoku poměrně nestálé. Metylenová skupina, která
nahrazuje kyslíkový atom spojující fosfát se zbytkem molekuly, výrazně zvyšuje stabilitu celého
uskupení. Ukázkou klinicky používaného léčiva využívajícího fosfonátovou skupinu je tenofovir,
který je součástí základní terapie HIV a HBV.
Obr. 95. Bioizostery fosfátové skupiny a jejich aplikace ve struktuře tenofoviru, jednoho
z nejdůležitějších preparátu používaných v terapii HIV.
8.2.3.10. Bioizostery – náhrada krystalové vody
Při interakci ligandu s proteinem nemusí docházet k interakcím přímo, ale mohou být
zprostředkovány molekulami vody. Tento fenomén můžeme velmi často pozorovat v krystalových
strukturách (např. Obr. 52 nebo Obr. 54). V některých případech je možné tuto molekulu
rozpouštědla vyměnit za skupinu, která je přímo vázaná na molekulu ligandu, a zvýšit tak afinitu
ligandu k danému proteinu. Velmi úspěšná byla v několika případech náhrada vody za kyano
skupinu, kterou si můžeme demonstrovat na příkladu optimalizace p38 MAP kinasových
inhibitorů, které jsou vyvíjeny jako potenciální protizánětlivé preparáty (Obr. 96).132, 145
Obr. 96. Ukázka náhrady molekuly vody za kyano skupinu u kinasových inhibitorů. Tato záměna
přinesla šedesátinásobné zvýšení aktivity.
81
8.2.3.11. Bioizostery aromatických kruhů
Mezi velmi významné bioizosterní náhrady patří substituce aromatických kruhů, zejména
benzenového jádra a jeho přímých homologů. Tyto aromatické části molekuly jsou nositelem
lipofilního charakteru molekuly a jejich záměnou můžeme regulovat, hydrofobní charakter
molekuly.
a) Náhrada benzenového jádra jinými aromáty
Tradiční náhradou benzenového jádra je jeho záměna za příbuzné heterocykly, jako jsou pyridin,
pyrimidin nebo thiofen. V případě pyridinu dochází nejen k přímému snížení log P/log D molekuly,
ale bazický charakter této skupiny můžeme využít pro další zvýšení hydrofilního charakteru celé
molekuly přípravou příslušných solí.
Obr. 97. Bioizostery benzenu a jeho homolog.
Přestože thiofen tuto výhodu neposkytuje, patří mezi nejčastěji požívané bioizostery benzenu díky
velmi podobnému elektronovému charakteru a ekvivalentní velikosti. Další možné bioizosterní
náhrady jsou shrnuty na Obr. 97. Příkladem uplatnění bioizosterie aromátů je studie nových
antagonistů prostaglandinových receptorů EP1 jako potenciálních analgetik pro léčbu chronické
bolesti. V této studii chemici z GlaxoSmithKline hledali nejvhodnější aromatický systém pro tento
typ EP1 antagonistů (Obr. 98) a sledovali nejen aktivitu daných derivátů, ale také jejich lipofilních
charakteru (log D).146
Obr. 98. SAR studie EP1 antagonistů.
b) Náhrada aromatických kruhů substituovanými aromáty
Některé vhodně substituované deriváty pyridinů a pyrimidinů mohou být využity jako náhrada
benzenového jádra s tím, že okupují obdobný prostor, ale mají výrazně hydrofilnější charakter.
Mezi takovéto skupiny patří např. 2-oxopyridin-1-ylová skupina a její deriváty. Tato záměna byla
použita pro přípravu nových inhibitorů protonové pumpy (Obr. 99)
V tomto případě bylo připraveno několik derivátů odvozených od výchozí látky nesoucí pyridin-2ylovou skupinu, která byla nahrazena několika oxo deriváty příbuzných heterocyklů. Ve všech
případech došlo ke znatelnému poklesu lipofilního charakteru molekuly, přičemž inhibiční aktivita
závisela na poloze heteroatomů v kruhu a substituentů.147
82
Obr. 99. Využití hydrofilních bioizosterů ve studii nových inhibitorů protonové pumpy.
c) Náhrada aromatické jádra acyklickými ekvivalenty kruhů
Aromatická a heteroaromatická jádra je možné nahradit také necyklickými skupinami, které tyto
cykly mimikují svou planární strukturou, která je stabilizována repulzí volných elektronových párů
nebo intramolekulární vodíkovou vazbou (Obr. 100). Takto můžeme nahradit aromatické jádro
např. oximovou skupinou.132
Obr. 100. Acyklické náhrady aromatických jader.
d) Náhrada aromátů alicyklickými systémy
Aromatické systémy mohou být substituovány alicyklickými kruhy, a to v případě, že aromatický
charakter této skupiny není zásadní pro biologickou aktivitu (např. lipofilní kavita, do které ligand
touto častí molekuly zapadá, není tvořena aromatickými rezidui). V takovém případě může aromát
představovat jen spojovací článek mezi jednotlivými funkčními skupinami molekuly, které
sehrávají zásadní roli pro afinitu ligandu k cílovému proteinu. Aromatickou část je pak možné
nahradit např. bicyklickým systémem, který lépe zaplní prostor v kavitě enzymu, a vytvoří potřebné
množství interakcí založených na disperzních silách a nepolárních interakcích. Jedním z vhodných
příkladů aplikace alicyklického systému jako bioizosteru benzenového jádra pro design nových
inhibitorů jsou inhibitory -sekretasy (Obr. 101), potenciální léčiva pro Alzheimerovu chorobu.148
Obr. 101. Využití bycyklického bioizosteru benzenového jádra u inhibitorů -sekretasy.
e) Náhrada aromatického jádra trojnou vazbou
Pokud aromatický kruh představuje pouze spoj mezi funkčními skupinami, případně výplň
lipofilního prostoru cílového proteinu, může být nahrazen trojnou vazbou, která svou velikostí a
83
orientací přibližně odpovídá šestičlennému aromatickému kruhu nesoucímu substituenty v poloze
para. Tato strategie byla využita pro přípravu inhibitorů 3C proteasy rhinovirů (Obr. 102).149
Obr. 102. Proteasové inhibitory využívající záměnu benzenového jádra za acetylénovou skupinu.
8.3. Záměna skeletu jako strategie přípravy nových funkčních derivátů
Vedle užití bioizosterů pro cílenou optimalizaci aktivních struktur, se v procesu hit to lead a při
optimalizaci leadu uplatňují další strategie umožňující racionální modifikaci výchozích derivátů.
S tématem bioizosterie kruhu úzce souvisí jedna z nich - záměna skeletu neboli „scaffold
hopping“. Scaffold hopping se uplatňuje při hledání nového chemického prostoru, a to jak z důvodu
optimalizace interakce s cílovou strukturou, tak z důvodů čistě pragmatických jako jsou
patentovatelnost produktu a příprava me too derivátů.
Pojem scaffold hopping se užívá v několika situacích spojených s obměnou centrálního skeletu, od
prosté změny jádra molekuly, až po komplexní transformaci struktury, při kterých zůstává
zachována nebo roste sledovaná biologická aktivita. Tradičním příkladem scaffold hoppingu jsou
ligandy GABAA receptoru, které přes svou značnou strukturní variabilitu vykazují obdobné
sedativní účinky (Obr. 103).
Obr. 103. Ligandy GABAA receptoru s významně odlišnými topologiemi.
Scaffold hopping můžeme klasifikovat do několika tříd podle složitosti dané obměny:150
a) Záměna heterocyklů
Jednou z nejjednodušších možných obměn je prostá záměna centrálního heterocyklického jádra
molekuly za jiný heterocyklus. Přestože se tato transformace může zdát triviální, může vyústit i ve
zcela nové léčivo jako tomu bylo v případě modifikace komerčně velmi úspěšného inhibitoru
fosfodiesterasy typu 5 sildenafilu (Obr. 104). Tato látka, uvedena na trh společností Pfizer, známá
pod komerčním názvem Viagra® samozřejmě přilákala pozornost konkurenčních farmaceutických
firem.
84
Obr. 104. Jeden z triviálních příkladů záměny skeletu, která vedla k uvedení nového léčiva na trh.
Společnosti Bayer AG, GlaxoSmithKnite a Schering-Plough společně vyvinuly látku vardenafil,
která je strukturně velmi podobná sildenafilu a liší se pouze pozicí jednoho atomu dusíku na
centrálním jádře a zanedbatelnou změnou postranního řetězce. Modifikace tohoto typu jsou
ekvivalentní bioizosterní náhradě aromatických jader.
b) Transformace kruhů
U transformací kruhů rozlišujeme tři možné přístupy:
Přístup analogický
 Analogie otevřením kruhu. V některých případech můžeme kruh nahradit acyklickou strukturou,
která má obdobné vlastnosti jako struktura cyklická. Tuto změnu můžeme provést např.
zavedením skupin, které mezi sebou vytvářejí vodíkovou vazbu, a udržují tak planární strukturu
obdobnou aromatickému prekurzoru.
Analogie otevřením kruhu byla využita také pro přípravu alicyklických derivátů. Mezi
reprezentativní příklady můžeme zařadit dietylstilbestrol, který byl připraven jako analog
estradiolu a představuje potenciální nesteroidní kontraceptivum (Obr. 105).
Obr. 105. Analogie otevřením kruhu u estradiolových derivátů.

Analogie uzavřením kruhu. Uzavření kruhu vede ke zvýšení konformační rigidity skeletu a
vhodné uzavření může znatelně zvýšit aktivitu díky „uzamčení“ v aktivní konformaci (viz.
dále). Zavedení dodatečného kruhu však může vyústit ve snížení rozpustnosti ve vodě, a vede
ke zvýšenému riziku vzniku rezistence (antimikrobiální látky, cytostatika).
Obr. 106. Analoga ketoprofenu se sníženou iritací žaludeční sliznice získaná analogií založenou na
uzavření kruhu.
85


V případě uzavírání kruhů můžeme zvolit přesně opačný postup k postupu popsanému výše pro
analogii otevírání kruhů. V případě, že molekula obsahuje intramolekulární vodíkovou vazbu, je
možné ji nahradit kovalentní vazbou. Tento přístup byl zvolen pro optimalizaci vlastností
derivátu ketoprofenu (Obr. 106).
Zvětšování nebo zmenšování kruhu. Dříve zmíněné zmenšování nebo zvětšování kruhu může
být počítáno také mezi možné záměny kruhů, ale v tomto textu bylo diskutováno už dříve
v kapitole o homologii (Kapitola 8.1.).
Reorganizace kruhů. Posledním typem analogické obměny ve scaffold hoppingu je reorganizace
kruhů (Obr. 107). Pomocí přeskupení kruhů můžeme získat deriváty s podobnou biologickou
aktivitou, jako je tomu například u anthelmintik thiabendazolu a tetramizolu (Obr. 108).
Anthelmintika jsou látky používané proti parazitickým červům.
Obr. 107. Reorganizace kruhů.
Obr. 108. Scaffod hopping pomocí reorganizace kruhů u anthelmintik.
Přístup zjednodušující a spojovací
Některé výchozí struktury hitu nebo leadu mohou být výrazným způsobem zjednodušeny bez ztráty
biologické účinnosti. Zjednodušení mnoha přírodních látek vedlo k syntetickým nebo
semisyntetickým analogům, které se používají v klinické praxi.
Obr. 109. Analoga morfinů získaná spojovacím zjednodušujícím přístupem.
Opakem tohoto zjednodušování molekul, který nazýváme také „disjunctive approach“, je přístup
spojovací „conjunctive approach“. Řada moderních analgetik je založena na fenylpiperidinové
podjednotce, která je součástí struktury přírodních alkaloidu půdně získaných z opia.151
Semisyntetickou úpravou byl připraven také komplexnější derivát morfinu - etorfin, který má o
několik řádů vyšší analgetický účinek (Obr. 109).152
86
c) Topologická a tvarová změna skeletu (topology/shape-based scaffold hopping)
V některých literárních zdrojích je pouze tato kategorie záměn skeletu označována jako scaffold
hopping. Jedná se o celkovou přestavbu skeletu tak, že získané deriváty mají pouze funkční
podobnost, ale jejích struktura je zcela odlišná. Příkladem jsou výše zmínění antagonisté GABAA
receptoru (Obr. 103).
Hledání nových strukturních typů se provádí pomocí virtuálního screeningu a to založeného jak na
ligandech, tak na struktuře biologického cíle (viz. Kapitola 6.6.). Tato strategie nachází své
uplatnění zejména při hledání látek, které mají výrazně změněné ADME vlastnosti a při hledání
nového chemického prostoru u významných indikačních skupin onemocnění a biologických cílů.
Pomocí této technologie byly nalezeny inhibitory ZIPA-FtsZ protein proteinové interakce, která
hraje důležitou roli při dělení bakterií. Látky vycházející z původního HTS hitu by neměly
optimální toxikologický profil, a navíc by měly omezenou patentovatelnost. K virtuálnímu
screeningu byl použit program ROCS, a přestože získané virtuální hity vykázaly nižší aktivitu
v porovnání s výchozí látkou, nebyly toxické a byly zajímavé z pohledu patentového prostoru (Obr.
110).150
Obr. 110. Hit z HTS a virtuálního screeningu.
87
9. Rigidizace struktury v SAR
V průběhu interakce proteinu s ligandem vzniká nekovalentní interakce mezi těmito dvěma
molekulami. Při této interakci dochází k několika dějům, mezi které patří desolvatace spojená
s přiblížením povrchů jednotlivých interagujících partnerů, ionizace funkčních skupin a samotný
vznik nekovalentních interakcí. Při vzniku této interakce může docházet také ke změně konformace
molekuly ligandu (a v principu i proteinu). Zatímco v roztoku může mít molekula ligandu poměrně
značnou konformační flexibilitu, vazbou na protein dochází ke značnému omezení této flexibility
(Obr. 111).
Obr. 111.
Z pohledu reakční kinetiky a vazebné energie je možné pohlížet na vytvořené nevazebné interakce
mezi proteinem a ligandem jako na složku působící ve prospěch negativní entalpie (0 < H), která
koresponduje s negativní Gibbsovou energií systému (0 < G). Při desolvataci je energie
spotřebovávaná zatímco díky uvolnění molekul vody dochází ke zvýšení entropie – dříve zmíněný
desolvatační efekt u polárních molekul versus hydrofobní interakce a příspěvek neuspořádanosti
molekul ve vodě. Z pohledu konformačního dochází ke snížení mobility ligandu (případně změně
konformace proteinu), čímž dochází ke snížení entropie (klesá hodnota S - negativní dopad na G,
hodnota roste – uvolňuje se méně energie).
Obr. 112.
Flexibilní molekula musí zaujmout aktivní konformaci (musí být „více uspořádaná“) a dochází ke
snížení S. Pokud zafixujeme molekulu v aktivní konformaci, k této ztrátě entropie při interakci
s proteinem nedochází, protože molekula již má potřebnou konformaci. Jestliže pak srovnáme dvě
molekuly, které mají stejné interakce s daným proteinem vyjádřené stejnou změnou entalpie H, ale
jedna z nich je flexibilní a druhá rigidní fixovaná v aktivní konformaci – bude rigidní molekula
účinnější než molekula flexibilní, protože u rigidní molekuly nedojde při interakci ke snížení změny
88
entropie v důsledku konformační změny. G je proto u rigidní molekuly zápornější (při interakci se
uvolňuje energie - interakce je silnější).
Rovnice 4
Flexibilita molekuly může být omezena několika způsoby a to pomocí:
a) Sterické zábrany rotace
Vhodným zavedením substituentu je možné docílit zamezení rotace určitých substituentů a
stabilizaci molekuly v požadované konformaci. V některých případech na to stačí poměrně malé
substituenty. Příkladem omezení flexibility pomocí sterické zábrany malým substituentem je
metylová skupina imatinibu (Obr. 113).
Obr. 113. Výrazné zvýšení inhibice Brc-Abl kinasy v důsledku stabilizace aktivní konformace po
zavedení metylového substituentu.
b) Zábrany rotace řetězce pomocí rigidní vazby
Volně otáčivou jednoduchou vazbu je možné zaměnit za dvojnou vazbu, která stabilizuje
molekulu v potřebné konformaci. Příkladem zvýšení aktivity tímto způsobem jsou duální
inhibitory Src/Alb kinas (Obr. 114).153
Obr. 114.
89
c) Konformační uzamčení pomocí kruhů
Tento způsob zábrany rotace patří k často používaným metodikám užívaným v medicinální
chemii. Využívány jsou anelace nasycených i aromatických kruhů. Jedním z nejlepších příkladů
jsou nová terapeutika proti hepatitidě typu C cílící na virovou RNA dependentní RNA
polymerasu (Obr. 115). Původní hit byl objeven firmou Japan Tobacco a postupně upravován
několika dalšími výzkumnými skupinami. Uzamčení obou aromatických částí molekuly vedlo
ke zvýšení inhibiční aktivity derivátů.154 Dalším příkladem využití tohoto přístupu je syntéza
nových derivátů rivastigminu (Obr. 116), inhibitoru acetylcholinesterasy, u kterých se podařilo
výrazně zvýšit inhibiční aktivitu pomocí uzamčení aktivní konformace postranního řetězce
pomocí dvou kruhů.155 Tyto látky mohou být potenciálně použity v léčbě Alzheimerovy
choroby.
Obr. 115. Inhibitory HCV RNA dependentní RNA polymerasy.
Obr. 116. Nová analoga rivastigminu jako potenciálních léčiv pro Alzheimerovu chorobu.
10. Chiralita a její vliv na aktivitu léčiv
Makromolekuly obsažené v buňkách jsou tvořeny převážně chirálními podjednotkami
(aminokyseliny tvořící proteiny, nukleotidy tvořící nukleové kyseliny). Tato explicitní chiralita
molekulových cílů většiny léčiv je příčinou jejich odlišné interakce s jednotlivými enantiomery
chirálních léčiv.
V roce 2006 bylo zhruba 56 % látek používaných jako léčiva chirální, ale 88% jich bylo stále
podáváno jako racemické směsi enantiomerů.156 V současné době se snaží příslušné autority tento
trend změnit, a většina chirálních léčiv je schválená pouze ve své aktivní enantiomerní formě.
Aktivita jednotlivých enantiomerů chirální látky může být značně odlišná. Může se přitom jednat
nejen o kvantitativní odlišnost, kdy jeden enantiomer vykazuje vyšší aktivitu než enantiomer druhý,
ale účinek enantiomerů se může lišit také po stránce kvalitativní – jeden enantiomer může být
nositelem nežádoucích účinků, nebo může mít i úplně opačný účinek. Enantiomery mohou mít
odlišný efekt také na farmakokinetiku látek a vykazovat odlišný metabolismus a distribuci
v organismu.
Rozdíl u aktivity jednotlivých enantiomerů je dán odlišným postavením substituentu v prostoru.
Easson a Stedman tuto odlišnost vysvětlili tříbodovou interakcí chirální molekuly s molekulárním
cílem (Obr. 117).157 Aktivní enantiomer interaguje s biologickým cílem všemi třemi možnými
90
skupinami, které jsou vázány na chirální centrum, zatímco jeho optický antipod takto efektivní
interakci s vazebným místem poskytovat nemůže a může interagovat jen se dvěma částmi
vazebného místa. Tato ztráta interakce s vazebným centrem se projeví citelným snížením aktivity
tohoto enantiomeru. Tento vliv si můžeme názorně ukázat na interakci isoprenalinu s 1
adrenergním receptorem. Zatímco isoprenalin může poskytovat velmi silnou interakci
s asparagovou kyselinou Asp121, jeho optický antipod o tuto vazbu přichází, čímž dochází
k podstatné ztrátě vazebné energie a aktivity (Obr. 118).
Obr. 117. Easson a Stedman vysvětlili snížení aktivity jednoho z enantiomerů ztrátou jedné ze tří
interakcí v tříbodovém modelu.
Enantiomer s vyšší účinností se označuje jako eutomer a ten s nižší jako distomer. Poměr aktivity
eutomeru a distomeru je označován jako eudismický poměr (EP). Zvýšení aktivity eutomeru je
provázeno zvýšením eudismického poměru. Tento vztah je známý jako Pfifferovo pravidlo. Pokud
je stereogenní centrum součástí farmakoforu (části nepostradatelné pro účinek), eudismický poměr
roste, protože molekulární komplementarita distomeru není zachována do takové míry, aby byla
zachována i aktivita analogická k eutomeru.
Obr. 118. Rozdíl mezi vazbou dvou enantiomeru isoprenalinu s 1 adrenergnimi receptory.
Enantiomery se mohou od sebe lišit těmito způsoby:
1. Jeden enantiomer je nositel aktivity a druhý nemá aktivitu, nebo má aktivitu sníženou
V některých případech je rozdíl mezi aktivitou obou enantiomerů velmi vysoký a jeden je
mnohem účinnější než druhý. Na druhé straně, může mít distomer aktivitu sníženou, ale
91
s biologickým cílem stále interaguje. Příkladem léčiva s vysokým eudismickým poměrem je
dexetimid (Obr. 119). Oproti svému optickému antipodu nazývanému levetimid vykazuje
eudismický poměr EP = 10000.158 Příkladem léčiva s nižším eudismickým poměrem je
ibuprofen. S/R izomery mají eudismický poměr EP = 160. Navíc u ibuprofenu dochází ke
konverzi distomeru (R-(-)) na eutomer (S-(+)) in vivo.159, 160
Obr. 119.
2. Jeden enantiomer je zodpovědný za aktivitu a druhý za toxicitu
Nejznámějším případem toxicity způsobené jedním z enantiomerů je bezesporu případ
thalidomidu. Toto sedativum bylo uvedeno na trh v roce 1957 a bylo předepisováno
těhotným ženám. Přestože bylo léčivo testováno na teratogenní účinek u březích krys a
žádné takové účinky nevykazoval, u nově narozených dětí matek, které v průběhu
těhotenství tento přípravek používaly, se vyskytovaly časté charakteristické malformace
končetin. Tento lék byl proto v roce 1961 stažen. R-(+)-thalidomid vykazuje sedativní
účinek, zatímco S-(-) je pravděpodobně nositelem teratogenního účinku.161 Thalidomid byl
v roce 1998 znovu schválen pro léčbu erythema nodosum leprosum, která je kožní
zánětlivou komplikací infekce Mycobatecterium leprae. V roce 2006 byla tato látka
schválená také pro terapii mnohočetného myelomu.
Obr. 120. Struktura thalidomidu.
3. Oba enantiomery jsou aktivní, ale jeden je toxický
Příkladem takovýchto léčiv je prilokain. Oba enantiomery vykazují lokálně anestetický
účinek. Jeho S enantiomer ale způsobuje methemoglobinémii, tedy zvýšené množství
oxidované formy hemoglobinu v krvi, která má značně nižší afinitu ke kyslíku.
4. Optické izomery mají odlišné aktivity
V některých případech mohou být dva izomery téže látky používány pro odlišné aplikace.
Takovýmto příkladem jsou dextro- a levo- propoxyfen. Pouze dextropropoxyfen (Darvon®)
vykazuje analgetický účinek, jeho diastereomer (Novrad®) má účinek antitusický (Obr.
121). Obě tyto látky se v dnešní době již nepoužívají. Podobně chinin se používá jako
základní antimalarikum, tato látka byla pro tento účinek používána již od poloviny 17.
století. Chinidin, stereoizomer chininu, je používán jako antiarytmikum.
92
Obr. 121.
5. Enantiomery mají opačné účinky
Pokud mají enatiomery opačné účinky, může to vést k výraznému potlačení účinků u
racemátu. Takovýto trend byl pozorován např. u analog nifedipinu, blokátorů kalciových
kanálů, které byly vyvíjeny jako potenciální vazodilatátory a antihypertenzivní léčiva. Látka
Bay K 8644162 (Obr. 122) byla původně připravena jako racemát, který vykazoval
překvapivě spíše posílení influxu kalciových iontů než předpokládanou inhibici in vitro.
Později se však ukázalo, že S-(-) enantiomer se chová jako agonista kalciových kanálů
zatímco R-(+) izomer působí jako slabý antagonista těchto kanálů.163
Obr. 122.
6. Enantiomery se stejnou aktivitou ale odlišným eudismickým poměrem pro různé
receptory
Látky, které působí na více receptorů, mohou vykazovat odlišné eudismické poměry pro
jednotlivé receptory. Tato vlastnost je do značné míry závislá na geometrii vazebného místa,
které se u jednotlivých receptorů liší. Z pohledu chemické biologie mohou být tyto rozdíly
využity ke sledování subtypů receptorů.
Butaklamol je neuroleptikum, které vykazuje účinky na několik různých receptorů, mezi
které patří D2-dopaminové, -adrenergní, 5HT2 a 5HT1 serotoninové a opioidní receptory.
Zatímco u D2 receptorů je eudismický poměr (+)/(-) pro jednotlivé enantiomery 1250, u
serotoninových receptorů je to jen 143 a u opioidních receptorů jsou ekvipotentní.
7. Pozitivní příspěvek obou enantiomerů (diastereomerů)
V některých případech mohou oba enantiomery (nebo diastereomery) vykazovat synergický
efekt. Příkladem takovéhoto léčiva je nebivolol (Obr. 123), který se používá jako
antihypertenzivum. Jedná se o racemickou směs, přičemž D-enantiomer je zodpovědný za adrenolytickou aktivitu, zatímco L-enantiomer stimuluje produkci oxidu dusnatého (NO) a
působí vasodilatačně. Souhra těchto dvou látek vyvolává znatelně odlišný profil tohoto
léčiva v porovnání s ostatními -blokátory.164
93
Obr. 123.
8. Enantiomery s rychlou interkonverzí in vivo
Některá léčiva vykazují rychlou konverzi mezi jednotlivými enantiomery in vivo, a proto
příprava jejich čistých forem postrádá původní smysl. Antidiabetikum rosiglitazon může
rychle racemizovat v roztoku díky keto-enol tautomerii a používá se proto jako racemát
(Obr. 124). Tato látka se váže na jaderné receptory PPAR a způsobuje expresi genů
zodpovědných za hypolipidemický účinek a zvýšení senzitivity vůči inzulínu.
Obr. 124.
10.1. Chirální záměna („chiral switch“)
Za posledních zhruba dvacet let se citelně změnil pohled na používání racemických směsí látek ve
farmacii díky výše zmíněným příkladům látek, jejichž optické antipody mají odlišné vlastnosti a
jeden z enantiomerů vykazuje buď znatelně vyšší aktivitu, nebo naopak zvýšenou toxicitu. Tato
zjištění, společně s pokrokem v separaci enantiomerů a s enantioselektivní syntézou, přinesla jak
potřebu, tak i možnost přípravy čistých enantiomerů léčiv, které byly dříve používány jako
racemické směsi. Jako chirální záměnu (častěji „chiral switch“) označujeme vývoj léčiv na bázi
čistých enantiomerů z původních klinicky používaných racemátů. Přestože hlavní hnací silou tohoto
procesu byla snaha o zavedení léčiv s vyšší účinností a sníženým rizikem toxicity, vhodné
načasování takovéto záměny umožnilo některým farmaceutickým společnostem prodloužení
exkluzivity jejich produktů, u kterých bylo racemické léčivo s procházející patentovou ochranou
nahrazeno svým eutomerem. Mezi léčiva, která prošla úspěšnou záměnou, patří levofloxacin,
dexibuprofen a esomeprazol (Obr. 125).165, 166
Obr. 125.
94
11. Optimalizace leadu
Pojem „lead“ je v odborné literatuře často používán chybně. Tato nejednoznačnost vychází jak
z omezené znalosti v případě zaměňování hitu za lead, tak z faktu, že proces generování leadu z hitu
a proces další optimalizace leadu se v dnešní době do určité míry překrývají. Tento trend vychází
zejména z ekonomických faktorů. Farmaceutické společnosti dnes obecně vyznávají strategii „Fail
fast and cheap“, která říká, že látky, které nemají vhodné vlastnosti, by měly být vyřazeny
z potenciálního vývoje co nejdříve, protože náklady na jejich pozdní selhání až v klinických
zkouškách jsou neúnosně vysoké. V současné době je proto jedním z hlavních trendů ve výzkumu
léčiv snaha o charakterizaci základních farmakokinetických vlastností již od raných stádií celého
procesu. Hlavní důraz tedy není kladen jen na aktivitu léčiva, ale také na jeho osud v organismu.
Sebeaktivnější látku nemůžeme využít jako léčivo pokud se nedostane ke svému biologickému cíli.
Část výzkumu nových léčiv, kterou nazýváme optimalizací leadu, je proto převážně zaměřena na
optimalizaci farmakokinetických vlastností. Výsledkem této části je identifikace tzv. preklinického
kandidáta - látky, která má optimalizované fyzikálně-chemické vlastnosti, vykazuje žádoucí
farmakodynamické i farmakokinetické vlastnosti a vykazuje tedy parametry pro přechod do
preklinického testování léčiva (Obr. 126).
Obr. 126. Obecné schéma optimalizace leadu.
Farmakodynamika je obor farmakologie, která sleduje interakci léčiva s biologickým cílem a
mechanismus účinku této látky. Studuje, kde a jak léčivo působí. Naproti tomu farmakokinetika
sleduje jaký je osud léčiva v organismu, a zabývá se čtyřmi hlavními tématy: absorpcí látky, její
distribucí, metabolismem a exkrecí (vylučováním). Zkratka pro tyto čtyři pojmy tvořená prvními
písmeny - ADME je často užívaná v odborných textech věnovaných medicinální chemii,
farmakologii a příbuzným oborům spojeným s objevem léčiv a bývá někdy také doplněna o
písmeno T (ADMET), které zastupuje pojem toxicita, další parametr neodmyslitelně spojený
s výzkumem léčiv.
Stejně jako všechna ostatní stadia procesu objevování léků je i stádium optimalizace leadu a jeho
průběh do značné míry závislý na subjektu, který jej provádí tedy výzkumné instituci nebo
farmaceutické společnosti. Proces zahrnuje řadu in vitro zkoušek a vybrané in vivo testy, které
vedou k objasnění metabolismu, farmakokinetiky a toxicity sledovaných látek. Celá procedura je
repetitivní a probíhá v relativně velkém měřítku („high throughput“ módu).167
Mezi základní předpoklady pro další možný vývoj léčiva patří:
 Účinnost látky – schopnost látky dosahovat dostatečný farmakologický efekt.
 Orální dostupnost látky – schopnost látky prostupovat biologickými barierami.
 Metabolická stabilita a doba účinku – schopnost látky zůstat v organismu po dobu
nezbytnou pro daný farmakologický účinek; sleduje se stabilita v biologickém prostředí,
identifikují se metabolity, stanovuje se aktivita a toxicita případných metabolitů .
 Bezpečnost látky – látka musí mít dostatečný index selektivity, tzn. poměr mezi kýženým
účinkem a projevy toxicity, toxicita a mutagenita musí být co nejnižší .
95

Přijatelné farmaceutické vlastnosti – látky by měly být synteticky dostupné, měly by mít
dostatečnou rozpustnost ve vodě a dostatečnou chemickou stabilitu.
Výsledný preklinický kandidát by měl splňovat většinu těchto předpokladů. Konkrétní algoritmus,
podle kterého je látce přisouzena možnost dalšího preklinického a klinického vývoje je rovněž
značně specifický pro jednotlivé farmaceutické společnosti. Většina těchto algoritmů se ale snaží
pokrýt osud léčiva (ADMET) v organismu a vyvodit tak příslušné závěry již v této rané fázi celého
procesu výzkumu a vývoje nových léčiv. Příklad takovéhoto algoritmu je nastíněn na Obr. 127.168
Obr. 127. Příklad algoritmu využívaného pro optimalizaci leadu.168
11.1. Absorpce látky
Absorpce látky je chápána jako její průnik z místa podání do systémové cirkulace. Tento krok se
tedy nevztahuje na podání látky přímo do krevního oběhu.
Způsoby podání látky můžeme rozdělit na lokální a systémové. Při lokálním podání se snažíme
cílit pouze na konkrétní místo organismu resp. tkáň, zatímco při systémovém podání se látka
dostává do celého těla, přestože její distribuce nemusí být uniformní (např. neproniká
hematoencefalickou bariérou atd.). Systémové podání můžeme podle způsobu aplikace rozdělit na
enterální (podávaná do trávicího ústrojí) a parenterální (podávaná jinou cestou). Enterální podání
96
se nemusí omezovat na podání perorální (ústy), ale může se jednat také o podání rektální (např.
čípky) a další (např. nasogastrickou sondou). Z pohledu medicinálně chemického je perorální
podání zcela klíčové a značná část úsilí je věnována přípravě látek, které budou absorbovány
z trávicího traktu. Perorální podání je samozřejmě vůbec nejčastější způsobem aplikace léčiv.
Ke vstřebání látky může docházet v různých částech trávicího traktu. Již v ústech může být látka
vstřebávána, pokud je v kontaktu se sliznicí dostatečně dlouhou dobu a má vhodné vlastnosti (např.
pKa). Toto podání (bukální – sliznici dutiny ústní nebo sublingvální – podání pod jazyk) se
vyznačuje rychlým nástupem účinku. Látka také obchází tzv. first-pass effect (efekt prvního
průchodu játry, kde je metabolizována). pH v ústech se většinou pohybuje mezi 6-7. Některé látky,
zejména slabě kyselé sloučeniny se mohou vstřebávat také v žaludku, kde pH kolísá mezi 1-3
(zejména v závislosti na jídle). Látka, která se nevstřebává v ústech, musí vykazovat dostatečnou
stabilitu v kyselém prostředí, aby mohla v nezměněné formě projít žaludkem a být vstřebána až ve
střevě. Nedostatečná stabilita některých látek, může být kompenzována lékovou formou (tzv.
enterosolventní (gastrorezistentní) tablety – jedná se o potahované tablety, které jsou stabilní při
nízkém pH, ale rozpadají se v tenkém střevě). Povrch ústní i žaludeční sliznice je zanedbatelný
v porovnání s plochou sliznice tenkého střeva, který u tenkého střeva činí až 300 m2. Většina látek
je proto absorbována do systémové cirkulace právě zde. Stěna tenkého střeva má bohatý reliéf
tvořený prstovitými výběžky označovanými jako střevní klky a příčnými střevními řasami. Povrch
klků je tvořen cylindrickým epitelem a látky, které procházejí přes jeho buňky, musí překonat obě
membrány těchto buněk. Penetrace látek mezi buňkami epitelu je omezena jejich těsnými spojeními
tzv. tight junctions.
Aby látky mohly pasivně procházet těmito membránami, musí mít hydrofilně-hydrofobní charakter,
musí být rozpustné ve vodě, ale zároveň musí projít lipofilní dvojvrstvou plazmatické membrány.
V optimálním případě jsou tyto vlastnosti v rovnováze. Mnoho léčivých látek je na bázi aminů a
jejich pKa se pohybuje mezi 6-8. V prostředí tenkého střeva (pH = 7,5-8,5) jsou proto zhruba z 50%
ionizované a z 50% neionizované formě, což vychází z Henderson-Hasselbalchova vztahu:
Rovnice 5
Kromě pasivní difuze přes membrány střevní stěny mohou být vybrané látky transportovány taky
pomocí alternativních cest:
1) Transportními proteiny – pomocí těchto proteinu jsou transportovány specifické molekuly,
jako jsou aminokyseliny, nukleobáze, glukóza, atd. Tyto přenašeče se zapojují do absorpce
omezeného množství látek jako jsou levodopa (využívající protein pro transport
fenylalaninu), flurouracil (využívající transportér thyminu a uracilu) a lisinopril (používající
protein pro dipeptidy).
2) Prostup mezi buňkami – mohou využívat pouze velmi malé molekuly (MW < 200). Tento
typ absorpce je však málo účinný díky omezenému povrchu.
3) Pinocytóza – uplatňuje se pro transport větších molekul např. tuků a bílkovin.
Po překonání barier střevní stěny může látka snadno procházet do bohaté krevní sítě uvnitř klků
díky pórům mezi jednotlivými buňkami krevních kapilár. Všechny látky pak putují do jater Venou
portae, kde podstupují metabolismus, již zmíněný first-pass effect. Výjimku tvoří látky podávané
anorektálně, které pronikají do hemoroidálních cévních pletení. Takto vstřebané látky obcházejí
játra a dostávají se přímo do systémového oběhu.
V některých případech můžeme záměrně designovat látky tak, aby neprocházely střevní sliznicí a
působily pouze ve střevě. Mezi takovéto látky patří například střevní dezinficiencia.
97
11.1.1. Orální dostupnost a její predikce
Orání dostupnost představuje jednu z hlavních farmakokinetických vlastností léčivých látek a
vyjadřuje frakci léčiva, které se po perorálním podání dostane do systémové cirkulace a může být
distribuováno ke svému biologickému cíli. V úvodních stádiích vývoje je ale nemožné zkoušet
orální biologickou dostupnost všech připravených látek in vivo.
Predikce orální dostupnosti na základě výpočetních modelů je proto jedním z možných milníků při
rozhodování, které látky budou syntetizovány a dále vyvíjeny už v raných etapách výzkumu nových
léčiv. Všechny tyto modely byly vyvíjeny na základě statistických porovnávání fyzikálněchemických vlastností klinicky užívaných léčiv, kandidátů v klinickém vývoji nebo látek se známou
farmakokinetikou. Proto jsou tyto modely spíše orientačními body, které mohou medicinálním
chemikům umožnit pohybovat se v chemickém prostoru se zvýšenou pravděpodobností orálně
dostupných látek. Jedním z nejčastěji používaných pravidel, které na základě velmi jednoduchých
prediktorů pomáhá předpovědět orální dostupnost látek je Lipinského pravidlo pěti (Lipinski’s rule
of five)169, které říká, že látka je orálně dostupná pokud:
a)
b)
c)
d)
Molekulární hmotnost sloučeniny není vyšší než 500.
Látka nemá více než 5 skupin, které patří mezi donory vodíkových vazeb (HBD).
Látka nemá více než 10 skupin sloužících jako akceptory vodíkových vazeb (HBA).
clogP látky není větší než +5. clogP je in silico predikovaná hodnota rozdělovacího
koeficientu P resp. logP, tedy míra lipofilního charakteru látky.
Přestože se toto pravidlo značně zažilo v komunitě medicinálních chemiků, určitá část orálně
dostupných léčiv toto pravidlo nesplňuje. Novější studie ukazují, že zejména molekulová hmotnost
není deskriptor vhodný a může být nahrazen počtem otáčivých vazeb (RB, „rotatable bond“) a
velikostí polárního povrchu (PSA, „polar surface area“), který může být substituován sumou donorů
a akceptorů vodíkových vazeb. Rozšířená pravidla říkají, že láky jsou orálně dostupné pokud:
a) Velikost polárního povrchu PSA je menší nebo rovno 140 Å a počet otáčivých vazeb RB je
menší nebo rovno 10.
b) Součet HBD a HBA je menší nebo roven 12 a počet otáčivých vazeb RB je menší nebo
roven 10.
Velikost polárního povrchu PSA je definován jako součet povrchů polárních atomů v molekule
molekuly. V současné době je možné ji velmi snadno vypočítat pomocí volně šiřitelných
softwarových balíků jako je ACD/ChemSketch170.
Tato pravidla jsou omezena pro případy, kdy:
a) Předpokládáme orální podání.
b) Předpokládáme pasivní průchod léčiva přes střevní stěnu.
c) Známe řadu příkladů, kdy tato pravidla neplatí.171
Mezi in vitro metody, které se často používají pro predikci prostupnosti přes biologické membrány
a orální dostupnost patří test na permeabilitu u Caco-2 buněk. Základním principem tohoto testu je
sledování prostupnosti látek přes monovrstvu lidských intestinálních buněk. Tímto je simulován
proces průchodu látky přes buňky střevní sliznice, přičemž může být sledován jak průchod pasivní
tak aktivní. Alternativou tohoto testu je model využívající MDCK buňky (Madin-Darby canine
kidney).
98
Obr. 128. Schématické znázornění systému pro in vitro predikci prostupnosti látek přes biologické
membrány.
11.2. Distribuce látek v organismu
Po vstřebání jsou látky odváděny Venou portae do jater kde dochází k jejich první metabolizaci.
Dále jsou distribuovány krví do celého organismu, přičemž distribuce není uniformní. Přechod látek
do tkání umožňují sítě kapilár. Žádná buňka v našem těle by neměla být vzdálena od kapiláry víc
než 20-30 m. Odhaduje se, že kapilární síť má povrch až 200 m2 a v našem těle je až 10 miliard
kapilár. Kapiláry mají póry o velikosti 90-150 Å, které jsou dostatečné pro léčiva, ale ne pro
proteiny krevní plazmy a velké molekuly. Díky tomu vede vazba na proteiny krevní plazmy k
nedostupnosti léčiva navázaného na tyto proteiny.
Vazba na plazmatické proteiny (udává se v procentech) je jeden z důležitých farmakokinetických
parametrů - do značné míry ovlivňuje míru účinku látky ve tkáních, ale také míru metabolické
přeměny a exkrece látky z organizmu, a tím i délku účinku léčiva. Pokud se látka neváže na
plazmatické proteiny, může volně prostupovat do tkání, kde vyvolává požadovaný účinek, je ale
zároveň dostupná pro metabolizaci v játrech, a může být bez ohledu na plazmatické proteiny
vylučovaná z organismu. U látek, které se váží na proteiny krevní plazmy, může prostupovat do
tkání pouze frakce látky, která není na těchto proteinech navázaná, čímž může být účinek výrazně
snížen. Vazba na plazmatické proteiny vede k prodloužení plazmatického poločasu tím, že látka
nemůže být efektivně metabolizována a vylučována z organismu. Vazba na proteiny je významná,
pokud se látka váže z více než 50% a silněji se vážou kyselé molekuly. Vazba látek na proteiny
krevní plazmy může mít závažné konsekvence, a může být příčinou lékových interakcí. Látky
navázané na proteiny krevní plazmy mohou být z této vazby kompetitivně vyvázány jinými látkami,
a to může vést k výraznému zvýšení jejich farmakologického účinku a k nebezpečí toxického
efektu. Například antikoagulační účinek warfarinu může být zvýšen působením cytostatika
metotrexátu.
Jakmile prostoupí látka do tkání přes stěnu kapilár, může okamžitě působit na receptory na povrchu
buněk. Některé látky, jako jsou enzymové inhibitory, ligandy intramolekulárních receptorů a látky
působící na nukleové kyseliny, musí překonat další buněčné membrány, aby se dostaly ke svým
biologickým cílům. To musíme mít na paměti především u látek podávaných intravenózně.
Distribuce látek do jednotlivých orgánů se může značně lišit. Např. silně lipofilní látky mohou být
„vychytávány“ do tukové tkáně, kde se kumulují, čímž se snižuje jejich množství v krvi a jejich
účinek. Na straně druhé to může vést k prodloužení jejich účinku. Distribuce se může díky tomu
značně lišit u obézních pacientů.
Svá specifika má také přechod látek přes hematoencefalickou barieru (BBB, z anglického bloodbrain barrier) do centrální nervové soustavy (Obr. 129). Kapiláry zásobující mozek nemají póry,
jsou spojeny pomocí těsných spojení „tight junctions“ a proto látka musí překonat plazmatické
membrány těchto endoteliálních buněk. Další důležitou součástí BBB je tzv. bazální membrána.
Jedná se o silnou extracelulární matrix, která je tvořená lamininovou a kolagenovou vrstvou
spojenou entaktinem. Na ní nasedají astrocyty, hvězdicové buňky, které zásobují neurony výživou.
99
Látky musí překonat několik plazmatických membrán. Díky tomu mohou do mozku pronikat pouze
lipofilní látky, malé molekuly jako jsou plyny, voda a např. etanol. Pro průchod BBB musí být látky
co možná nejméně polární nebo musí být polární skupiny maskovány pomocí lipofilních skupin, a
léčivo aplikováno jako proléčiva.
Některé hydrofilní molekuly se dostávají přes hematoencefalickou bariéru díky specifickým
přenašečům – aktivním transportem. Jedná se zejména o glukózu a aminokyseliny. Zvýšenou
polaritou látek můžeme naopak omezit přístup látek do CNS, pokud je žádoucí jejich účinek pouze
na periferii.
Obr. 129. Schematické znázornění hematoencefalické bariéry.
Placentární bariéra mezi matkou a plodem, která slouží k výměně živin a odpadních látek, je
rovněž prostupná pro lipofilní molekuly jako jsou barbituráty, nikotin nebo alkohol. Díky nižší
detoxikační schopnosti organismu novorozence může docházet k prodloužení účinku a zvýšené
toxicitě těchto látek.
11.3. Metabolismus léčiv a dalších látek
Léčivé látky jsou pro tělo cizorodé sloučeniny, které se tělo snaží degradovat a modifikovat tak, aby
je mohlo lehce vyloučit. Produktem těchto metabolických reakcí jsou metabolity, které většinou
mají sníženou nebo zcela potlačenou aktivitu. Metabolismus může ale vést také k aktivaci látek a
může být využit při návrhu nových léčiv (viz. Kapitola 12.3.). V určitých případech může být
metabolizace zodpovědná za modifikaci účinků látek, vznik vedlejších účinků a vznik toxických
metabolitů. V současné době je identifikace metabolických produktů jedním z nezbytných
předpokladů pro schválení léčiva pro klinické použití. Identifikace metabolických produktů může
být také důležitá pro vyčerpávající pokrytí účinných látek z pohledu patentového práva, v případě,
že jsou metabolity zodpovědné za pozorovanou aktivitu léčivých látek.
Většina metabolických reakcí směřuje ke zvýšení polarity látek, aby mohly být jednoduše
vyloučeny exkrečními orgány, zejména ledvinami. V závislosti na charakteru metabolických reakcí
rozdělujeme metabolismus na dvě fáze. Metabolismus fáze I, který se vyznačuje zavedením nových
hydrofilních funkčních skupin do struktury metabolizované látky nebo jejich „odmaskování“ (např.
štěpení esterových nebo etherových vazeb). Tato fáze metabolismu se odehrává zejména v játrech,
částečně k ní ale dochází také ve střevní stěně, krevní plazmě a dalších orgánech. Reakce této fáze
metabolismu jsou katalyzovány nespecifickými enzymy, jako jsou například enzymy ze skupiny
cytochromů P450. Metabolismus fáze II je charakterizován připojením endogenního ligandu,
pomocí konjugační reakce, k metabolizované molekule na vhodném místě, často hydrofilní polární
skupině, která byla zavedena ve fázi I metabolických transformací. I tato fáze nejčastěji probíhá
v játrech, a výsledná molekula je vyloučena játry nebo ledvinami. Většina těchto reakcí je
regiospecifická a stereospecifická. Vykazuje mezidruhovou specificitu ale také závislost na pohlaví,
věku, hormonální hladině (např. v graviditě), a může být ovlivněná řadou onemocnění (jak
vrozených, tak získaných např. hepatitidou). Druhová specificita musí být zohledněna při výběru
vhodného in vivo (zvířecího) modelu pro identifikaci a studium metabolických produktů.
100
11.3.1. Metabolismus fáze I
1) Oxidativní reakce
Nejdůležitější rodina metabolických enzymů katalyzujících oxidativní metabolizaci jsou enzymy
patřící do rodiny cytochromů P450 (CYP).
Cytochromy P450 se řadí do skupiny
hemových proteinů obsahujících hem jako
kofaktor, který je nekovalentně vázán
k CYP. Železité kationty obsažené v
hemu jsou nezbytné pro oxidativní reakce
katalyzované těmito enzymy. Tyto
enzymy se řadí mezi monooxygenasy,
enzymy ze skupiny oxidoreduktas
katalyzující vstup jednoho atomu
molekulárního kyslíku do substrátu
(Rovnice 6). V současné době je známo
asi 53 různých lidských cytochromů
P450. Pro jejich současnou klasifikaci se
používá systém založený na sekvenční
identitě jednotlivých proteinů. Jednotlivé
cytochromy jsou řazeny do rodin
označovaných číslem, podrodin,
označovaných velkým písmenem, ve
kterých jsou číselně řazeni jednotliví
zástupci (CYP3A4 – hlavní rodina –
podrodina – konkrétní enzym) (Obr.
130).172 Metabolismu léčiv se účastní
Obr. 130. Krystalová struktura cytochromu P450
zejména 5 lidských cytochromů P450
3A4 v komplexu s erytromycinem (protein – fialová,
(CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2,
hem – žlutá, erytromycin – oranžová).
CYP2E1).
Cytochromy P450 zprostředkovávají oxidaci jak na atomech uhlíků tak dalších heteroatomech (N,
P, S a dalších).
Rovnice 6
Přehled reakcí katalyzovaných cytochromy P450 je nastíněn na Obr. 131. Tyto enzymy katalyzují
hydroxylační a epoxidační reakce.173 Atomy uhlíku v organických sloučeninách jsou cytochromem
P450 oxidovány nejvíce na exponovaných nebo aktivovaných místech. U jednoduchých molekul se
často jedná o oxidaci terminálních metylových skupin. Metyl může být postupně oxidován přes
alkohol až na derivát karboxylové kyseliny. Primárně jsou oxidovány zejména benzylové a další
aktivované polohy (Obr. 131b a c). U dlouhých řetězců je pozorována oxidace na předposledním
uhlíku řetězce a u alicyklických derivátů jsou to většinou nejexponovanější uhlíkové atomy kruhu.
Cytochrom P450 může také katalyzovat epoxidace alkenů a aromátů. Vzniklé epoxidy jsou
následně deaktivovány epoxihydrolasou, nebo dochází k jejich samovolnému rozpadu. Epoxidy paří
mezi jedny z potenciálně toxických metabolitů, protože mohou poskytovat alkylační reakce. Tato
epoxidační reakce je například zodpovědná za toxicitu aflatoxinu 1 (Obr. 132).173
101
Obr. 131. Reakce katalyzované cytochromy P450.
Obr. 132. Metabolismem indukovaná toxicita aflatoxinu B. Oxidace pomocí cytochromu P450 vede
ke vzniku reaktivního epoxidového meziproduktu, který má schopnost alkylovat buněčnou DNA.
Může být odbourán pomocí glutathion-S-transferasy (GST, viz. dále) nebo hydrolyzován reakcí
s vodou. Produkt této hydrolýzy je ale značně nestabilní a může vytvářet další reaktivní
intermediáty, které mohou poskytovat nežádoucí reakce např. s aminokyselinami.
Těmto nechtěným reakcí se buňky snaží předcházet konjugací reaktivních intermediátu
s glutathionem za katalýzy glutathion-S-transferasou (viz. transformace fáze II), tímto enzymem
bývají deaktivovány také aromatické dioly. Cytochrom P450 oxiduje také atomy v  pozici vůči
102
heteroatomu (Obr. 131g). Vzniklé nestabilní intermediáty jsou následně hydrolyzovány. Tento
proces vede k dealkylaci aminů, etherů a thioetherů. Obdobný proces u halogenidů poskytuje
karbonylové deriváty. U primárních aminů takto dochází uvolnění amoniaku (resp. jeho
protonované formy), terciární aminy jsou reaktivnější než aminy sekundární. V závislosti na
substrátu může ale cytochrom P450 katalyzovat také oxidaci přímo na heteroatomu. Aminy tak
mohou být oxidovány na N-oxidy, které podléhají rychle konverzi na hydroxylaminy. U primárních
aromatických aminů může vést tato transformace ke vzniku vysoce reaktivních intermediátů, které
jsou zodpovědné za toxicitu a kancerogenitu těchto derivátů. Thioly mohou být oxidovány na
disulfidy, nebo převedeny na thioestery a dále oxidovány na sulfoxidy nebo sulfony. Thioketony a
jejich analoga mohou být transformovány na ketony desulfurací.
Mezi další frekventované oxidativní enzymy patří monoaminooxidasy (MAO),
alkoholdehydrogenasa a aldehyddehydrogenasa. Flavin obsahující monoaminooxidasy (FMO) jsou
primárně mitochondriálními enzymy, které se vyskytují ve všech tkáních (v největší míře však
v játrech) a zprostředkovávají oxidaci na heteroatomech dusíku, síry a fosforu, respektive na 
uhlících vzhledem k těmto heteroatomům obdobně jako cytochromy P450 (Obr. 131g a h). Na
rozdíl od cytochromů P450 tyto enzymy ve významné míře neoxidují izolované atomy uhlíku. Do
této skupiny patří enzymy podílející se degradaci některých důležitých neurotransmiterů, jako je
např. dopamin.V menší míře se na oxidaci xenobiotik (mezi které můžeme počítat i potenciální
léčivé látky) podílejí monoaminooxidasy, které neobsahují flavin, jako jsou plazmatické nebo
tkáňové monoaminooxidasy.174 Oxidace alkoholů a aldehydů na příslušné karboxylové kyseliny
jsou katalyzovány alkoholdehydrogenasami a aldehyddehydrogenasami (Obr. 133). Jedná se také o
enzymy zastoupené ve všech tkáních, jejich výskyt v játrech je však nejmarkantnější.
Obr. 133. Reakce katalyzované alkoholdehydrogenasou a aldehyddehydrogenasou
Obr. 134. Příklady reduktivních metabolických reakcí.
2) Reduktivní reakce
Reduktivní reakce se na metabolismu podílejí v mnohem menší míře než oxidace, ale mohou
sehrávat důležitou roli v deaktivaci některých důležitých funkčních skupin, jako jsou aldehydy a
ketony, některé dusíkaté funkční skupiny ve vyšším oxidačním stupni nebo halogenované deriváty.
Některé tyto transformace jsou zprostředkovány specifickými enzymy jako aldo-keto reduktasami,
103
které redukují aldehydy a ketony na alkoholy (redukce aldehydu je méně častá). Značná část těchto
reakcí je katalyzována také alkoholdehydrogenasou nebo cytochromy P450, které jsou schopny
katalyzovat jak oxidace, tak redukce, a tyto reakce jsou vratné. Nejdůležitější reduktivní
transformace jsou shrnuty na Obr. 134.
3) Hydrolytické reakce esterů a amidů
Z hlediska medicinální chemie jsou důležitými metabolickými enzymy také enzymy katalyzující
hydrolýzu esterů a amidů na příslušné karboxylové kyseliny a alkoholy nebo amidy. Tyto procesy
jsou katalyzovány esterasami a peptidasami (amidasami). Obě skupiny těchto nespecifických
enzymů se nacházejí ve všech tkáních našeho těla, ale místy s nejvyšší enzymatickou hladinou jsou
krevní plazma, játra, ledviny a střevní stěna. Obecně se estery štěpí lépe než amidy, ale labilita obou
skupin značně závislá na substituentech (EWG substituenty zvyšují labilitu vazby). Zvýšená
náchylnost esterů k hydrolýze se často využívá při přípravě proléčiv látek se špatnou biologickou
dostupností.
Obr. 135. Reakce katalyzované hydrolytickými enzymy.
11.3.2. Metabolismus fáze II
Fáze II metabolismu tzv. fáze konjugační je charakterizována konjugací molekuly xenobiotika
s endogenní látkou, která je často navázaná na funkční skupinu zavedenou ve fázi I. V této fázi jsou
látky většinou dále modifikovány tak, aby se zvýšil jejich hydrofilní charakter, a mohly být
vyloučeny močí nebo žlučí.
1) Konjugace s glukuronovou kyselinou
Nejčastější konjugační reakcí je konjugace s glukuronovou kyselinou. Tato silně hydrofilní skupina
je přenášena pomocí UDP-glukuronyltransferasy (UGT) z uridindifosfátglukuronátu na alkoholy,
fenoly, karboxalové, hydroxylaminy, kyseliny, sulfonamidy, amidy, aminy a thioly. V závislosti na
heteroatomu, na který je glukuronová skupina navázána, rozlišujeme O-, N-, S-glukuronidy.
Výjimečně mohou vznikat i C-glukuronidy, většinou vedle karbonylové funkce.
Obr. 136. Konjugace s glukuronovou kyselinou.
2) Konjugace se sulfátem
Méně častou konjugační reakcí než glukuronidace je sulfatace. Sulfát je přenášen z 3’fosfoadenosin-5’-fosfosulfátu pomocí sulfotransferasy (Obr. 137). Stabilní konjugáty jsou tvořeny
s primárními a sekundárními aminy, sekundárními alkoholy a fenoly. Na druhé straně, primární
104
alkoholy, hydroxylaminy a hydroxylamidy poskytují nestabilní deriváty, které mohou vést ke
zvýšení toxicity metabolitů v důsledku alkylačních vlastností těchto látek.
Obr. 137.
3) Konjugace s aminokyselinami
Karboxylové kyseliny mohou být konjugovány také s aminokyselinami pomocí peptidové vazby. U
člověka jsou karboxylové kyseliny konjugovány nejčastěji s glycinem, taurinem a glutamanem, ale
u dalších živočišných druhu mohou být aminokyseliny značně variabilní. Látka je nejdříve
aktivována konjugací s koenzymem A. Takto vzniklý thioester následně reaguje s aminokyselinou
za katalýzy specifickou N-acyltransferasou (Obr. 138).
Obr. 138.
4) Konjugace s glutathionem
Konjugace s glutathionem (GSH) je velmi důležitá pro detoxikaci buněk a ochranu buněčného
prostředí od alkylačních látek a volných radikálů. U jaterních buněk je koncentrace GSH až 10
mM.175
Obr. 139.
Transfer GSH na metabolizované látky je katalyzován glutathion-S-transferasami, které mají řadu
izoforem. Uvádí se, že až 10% všech proteinů v jaterních buňkách jsou glutathion-S-transferasy
105
(GST).176 K reakci s glutathionem dochází na elektrofilním centru molekuly. Konjugáty
s glutathionem následně podléhají dalším modifikacím, konkrétně transformaci na cysteinový a
acetylcysteinový derivát (Obr. 139). Zatímco glutathionové konjugáty jsou vylučovány většinou
přímo žlučí, cysteinové deriváty se vylučují močí.
5) Metylace
Na rozdíl od předchozích transformací metylace a acetylace vedou většinou ke snížení polarity
vzniklých metabolitů. Tato reakce je zprostředkována metyltransferasami, kterých se v našich
buňkách nalézá celá řada. Podle typu heteroatomu, na který je metylová skupina přenášena,
rozlišujeme O-metyltransferasy (např. katechol-O-metyltransferasa (COMT), metylující
katecholové deriváty v poloze meta), N-metyltransferasy (např. histamin N-metyltransferasa) a Smetyltransferasy. Existují ale i další druhy metyltransferas, které nesehrávají tak důležitou úlohu
v metabolismu léčiv a obecně xenobiotik. Zdrojem metylové skupiny pro tyto reakce je Sadenosylmethionin, který se v průběhu reakce mění na S-adenosylhomocystein (Obr. 140).
Obr. 140.
6) Acetylace
Sloučeniny obsahující aminoskupinu, hydroxyl nebo thiol mohou být také acetylovány (Obr. 141).
Tato reakce je katalyzována acetyltransferasami a jako zdroj acetylové skupiny slouží
acetylkoenzym A. V lidském těle se nacházejí dva druhy acetyltransferas (NAT1 a NAT2).
Označují se sice obě jako N-acetyltransferasy (NAT), protože byly původně objeveny jako enzymy
acetylující amino skupiny, ale mohou také acetylovat alkoholy a thioly. Tyto enzymy mají menší
význam v metabolismu a nižší spektrum substrátů, ale metabolizují některé významné látky a léčiva
jako např. kofein nebo sulfonamidová antibiotika.
Obr. 141.
7) Další metabolické transformace
Mezi minoritní reakce podílející se na metabolické transformaci léčiv patří také konjugace
s cholesterolem, která se uplatňuje u některých karboxylových kyselin, a konjugace s mastnými
kyselinami, pozorována u alkoholů. Obě tyto transformace vedou ke zvýšení lipofilního charakteru
látek a k jejich vyloučení převážně žlučí.
106
Aktivita těchto enzymů je značně variabilní i u jednotlivců. Např. 8% Američanů nemá CYP2D6,
který se podílí na metabolismu tramadolu, haloperidolu a aktivaci kodeinu. Aktivita cytochromu
P450 může být ovlivněna také jídlem a dalšími látkami. Např. růžičková kapusta a kouření zvyšují
aktivitu CYP, zatímco šťáva z grapefruitu CYP inhibuje. Šťáva z grapefruitu tak může zvyšovat
účinek některých léčiv jako je např. antihistaminikum terfenadin, u kterého se při podávání
s grapefruitovou šťávou může objevovat kardiotoxický účinek, protože není v dostatečné míře
metabolizován na fexofenadin (Obr. 142).
Obr. 142.
Cytochrom P450 hraje důležitou roli také v lékových interakcích. Vliv látek na cytochrom P450 je
proto studován již v raných stádiích výzkumu léčiv. Mezi známé lékové interakce způsobené
vlivem na tyto enzymy patří např. stimulace aktivity CYP fenobarbitalem (sedativum) způsobující
zvýšené odbourávání warfarinu (antikoagulační látka).
V ideálním případě by se měly látky metabolizovat co možná nejméně, protože každá metabolizace
sebou přináší riziko vzniku toxických produktů. Ve většině případů však k určité metabolizaci
dochází, a zapojuje se i několik metabolických cest najednou. Např. antidepresivum fluvoxamin,
které působí jako selektivní inhibitor zpětného vychytávání serotoninu podléhá metabolismu jak
první tak druhé fáze (Obr. 143).
Obr. 143.
11.3.3. In vitro testy pro predikci metabolické stability
Pro predikci metabolické stability látek se používají 4 typy in vitro modelů:177
107
a) Rekombinantní enzymy – rutinně používané pro predikci clearance (viz dále) a lékových
interakcí. Časté jsou studie metabolizace látek pomocí rekombinantních cytochromů.
b) Jaterní mikrozomy – jaterní (ale i jiné) mikrozomy mohou být získány pomocí
ultracentrifugace z homogenizovaných lidských nebo zvířecích tkání. Jedná se o velmi často
používaný model, díky možnosti skladovat mikrozomy po dlouhou dobu. Pokud jsou
nastaveny vhodné podmínky, je možné odlišit metabolizaci pomocí různých enzymů (CYP,
FMO, UGT). Tento model je také vhodný pro HTS. V literatuře se velmi často označují
zkratkou HLM (human liver microsomes).
c) Hepatocyty-získané od lidských dárců (nedostupnost je hlavní překážka použití). Mají
všechny potřebné enzymy a kofaktory pro obě fáze metabolizmu.
d) Plátky jaterní tkáně-nejvěrnější model pro predikci metabolismu látek, ale není příliš běžný.
11.4. Vylučování (exkrece) potenciálních léčiv
Vylučování látek přímo navazuje na jejich metabolizaci. Nejdůležitějšími exkrečními orgány jsou
ledviny a játra (resp. žlučové cesty). Jen minimum léčiv je vylučována plícemi (např. plynné látky
jako celková anestetika), potem, slinami, slzami nebo mateřským mlékem. Některé druhy léčiv jsou
částečně vylučovány také v kožních derivátech, jako jsou vlasy.178
Žlučí jsou vylučovány látky o vyšší molekulové váze (většinou nad 300) a jedná se o aktivní proces.
Mnoho látek, které jsou metabolizovány v játrech, je následně vyloučeno zpět do střev pomocí
žlučových cest, ale mohou takto být vyloučeny i látky v nezměněné formě. Látky vyloučené do
střeva mohou být opětovně vstřebány. Jak nezměněné látky, tak některé konjugáty (např.
glukuronidy), mohou být po rozštěpení ve střevě znovu absorbovány. Může tak docházet k cirkulaci
látky mezi játry a střevy. Tento proces je označován jako enterohepatální cirkulace. Pokud ke
zpětné resorpci nedochází, jsou láky vyloučeny stolicí.
Nejdůležitějším vylučovacím orgánem lidského těla jsou ledviny. Dochází zde ke třem důležitým
dějům, jsou to:178
a) Glomerulární filtrace – menší látky prostupují přes stěnu Bowmanových váčků společně
s vodou do proximálních tubulů.
b) Tubulární sekrece - některé látky jsou aktivně transportovány do lumen tubulů, jedná se o
aktivní proces využívající přenašeče. Tento proces není ovlivněn vazbou na plazmatické
bílkoviny. Pomocí přenašečů pro bazické látky se takto přenášejí např. amilorid nebo
dopamin, zatímco přenašeče pro kyselé látky transportují např. penicilín nebo furosemid.
c) Tubulární resorpce – je obvykle pasivní proces zprostředkovaný prostou difuzí. Látky musí
prostupovat přes plazmatické membrány buněk tubulárního epitelu, a proto se dobře
vstřebávají spíše lipofilní látky, zatímco polární látky zůstávají v moči. Resorpce je také
značně ovlivněna mírou disociace látek, která může být výrazně ovlivněna pH. Kyselost
moče může být do značné míry závislá na dietě, dalších léčivech a onemocněních ledvin. Ve
specifických případech mohou být látky vstřebávány aktivně (např. levodopa).
11.4. Důležité fyzikálně-chemické a ADME parametry užívané v raných fázích výzkumu a vývoje
léčiv
S farmakokinetikou potenciálních léčiv souvisí některé fyzikálně-chemické a ADME parametry,
které jsou často používány v raných stádiích výzkumu léčiv, pro identifikaci nejvhodnějších
kandidátů pro další optimalizaci a případný vývoj.
Rozdělovací koeficient (logP)
Tento parametr vyjadřuje lipofilně-hydrofilní charakter látky a je definován jako poměr
rovnovážných koncentrací látky v neionizovaném stavu ve dvoufázovém systému omezeně
mísitelných rozpouštědel (nejčastěji oktanol-voda):
108
Rovnice 7
Distribuční koeficient (logD)
Blízce spjat s rozdělovacím koeficientem logP, vyjadřuje lipofilně-hydrofilní charakter látky
s ohledem na ionizovanou část léčiva a pH. Je definován jako poměr rovnovážných koncentrací
látky v neionizovaném i ionizovaném stavu ve dvoufázovém systému omezeně mísitelných
rozpouštědel (nejčastěji oktanol-voda) a je uváděn v logaritmickém tvaru při určitém pH (např.
logD7,4 při pH =7,4 tedy pH krevního séra):
Rovnice 8
Orální dostupnost (F)
Orální dostupnost (obecně biologická dostupnost) je množství látky, které se dostane do systémové
cirkulace po perorálním podání (resp. jiném než intravenózním podání). Je vyjádřeno jako poměr
ploch pod křivkami (AUC, koncentrace za časový úsek) při perorálním (příp. jiném podání) a
intravenózním podání. Udává se v procentech.
Rovnice 9
Orální dostupnost je dána jak schopností látky procházet přes membrány v gastrointestinálním
traktu, tak odolávat first-pass metabolismu.
Distribuční objem (Vd)
Distribuční objem je dán podílem množství látky v organismu a její plazmatickou koncentrací, a
vyjadřuje hypotetický objem, ve kterém by musela být látka rozpuštěna, aby bylo dosaženo
plazmatické koncentrace. Distribuční objem se udává buď v litrech, nebo v litrech na kilogram
(pokud je podaná dávka vyjádřena na kilogram).
Rovnice 10
Distribuční poměr látky je značně závislý na pKa, logP a vazbě látky na plazmatické proteiny a
tkáně, ale také na věku, pohlaví a na některých onemocněních daného jedince. Malý distribuční
objem je charakteristický pro hydrofilní, negativně nabité látky nebo látky silně vázané na
plasmatické proteiny, které nedifundují do tkání. Naproti tomu velký distribuční objem mají
hydrofobní látky, které se rychle distribuují do tukové tkáně, nebo kladně nabité molekuly, které se
váží na buněčné povrchy (fosfolipidy). Vazbou ve tkáních dochází ke snížení plazmatické
koncentrace. U některých látek je distribuční objem mnohem vyšší než celkový tělesný objem,
jedná se většinou o silně hydrofobní látky (např. antimalarikum chlorochin má distribuční objem u
myší 667 l.kg-1) 179. Optimální distribuční objem látky je závislý na konkrétních požadavcích na
léčivo. Do značné míry záleží na požadované době účinku léčiva (plazmatickém poločasu viz dále)
109
a farmakologickém účinku léčiva (větší u antibiotik nebo antivirotik – prodloužení účinku a
dostatečná celulární koncentrace, vs. nízký Vd u anestetik – zlepšení kontroly, zkrácení účinku).
Clearance (CL)
Clearance je poměr rychlosti eliminace léčiva k jeho koncentraci v tělní tekutině (např. plazmě)
resp. objem krevní plazmy, který se za jednotku času formálně očistí od sledované látky. Uvádí se
většinou v litrech za hodinu (l.h-1) nebo v mililitrech za minutu na kilogram (ml.min-1.kg-1).
Clearance je závislá na vyloučení léčivá z organismu (ledvinami, játry atd.) a na metabolických
přeměnách léčiva. V některý případech se sleduje clearence závislá na jednotlivých orgánech –
renální clearance, jaterní clearance. Suma clearance všemi exkrečními kanály je označována jako
celková clearance.
Plazmatický poločas (t1/2)
Jako plazmatický poločas označujeme dobu, za kterou klesne koncentrace léčiva v krevní plazmě na
polovinu (Rovnice 11). Tento parametr je závislý na schopnosti látky distribuovat se v organismu a
na její eliminaci z organismu, proto je plazmatický poločas závislý na distribučním objemu látky a
clearance. Poločas je tím kratší, čím menší je distribuční objem a čím vyšší je clearance.
Rovnice 11
110
12.
Medicinálně chemické přístupy k optimalizaci ADME vlastností látek
Pomocí vybraných metodik obměny struktury leadů můžeme dosáhnout zlepšení absorpce látek do
těla, zabránit nebo usnadnit jejich metabolizaci, případně ovlivnit jejich distribuci do konkrétních
tkání a exkreci látky z těla. Díky optimalizaci těchto farmakokinetických parametrů můžeme
dosáhnout také výrazného snížení toxicity látek.
12.1. Optimalizace absorpce
Absorpce látek je daná některými fyzikálně-chemickými parametry jako jsou lipofilicita/
hydrofilicita (vyjádřena logP nebo logD), rozpustnost ve vodě (vyjádřený logS), a s nimi související
pKa dané látky. Orální dostupnost látek může být proto zvýšena chemickými modifikacemi
vedoucími ke změně těchto parametrů při zachování požadované biologické aktivity.
Lipofilní charakter látek sice zvyšuje jejich prostupnost do tkání, ale zvyšuje také jejich afinitu
k metabolickým enzymům a to má za následek výrazný first-pass efekt.
Lipinského pravidlo pěti je jedním z vhodných vodítek pro prvotní optimalizaci orální dostupnosti.
Existuje několik vhodných přístupů k optimalizaci:
1. Změna polarity pomocí změny polárních funkčních skupin. Optimální poměr rozpustnosti a
hydrofobního charakteru látek je základním předpokladem pro jejich absorpci po perorálním
podání. U velmi lipofilních sloučenin může být problémem jejich nízká rozpustnost ve vodě.
Látka se nemůže vstřebat, protože není vůbec přítomna v roztoku. Na druhé straně silně polární
a ionizované látky nemohou procházet lipofilní membránou. Existuje celá řada technik, které
můžeme použít pro zvýšení rozpustnosti špatně rozpustných látek, jako jsou tvorba solí,
příprava správných krystalových polymorfů, využití přídavných rozpouštědel a pomocných
látek usnadňující rozpouštění.180 Tyto techniky jsou ale spíše doménou farmaceutických
technologů. Zde se zaměříme pouze na metodiky využívající transformace skeletu aktivní látky.
Přidáním polárních skupin na vhodná místa molekuly můžeme dosáhnout znatelného zvýšení
jejich rozpustnosti ve vodě. Optimální je umístění směřující ven z aktivního místa cílového
proteinu, které nezpůsobí energetické znevýhodnění v důsledku desolvatační bariéry. Tyto
skupiny mohou být neutrální (např. hydroxyl), kyselé (karboxylová, sulfonová skupina) nebo
zásadité (terciární aminy). Zavedení nasycených dusíkatých heterocyklů (např. pyrrolu nebo
morfolinu) můžeme také umožnit tvorbu solí, které vykazují podstatně vyšší rozpustnost ve
vodě než výchozí báze. Jedním z příkladů je užití hydrofilní skupiny u nových léčiv proti
respiračnímu syncyciálnímu viru (RSV), velmi častému patogenu u dětí, která vedla nejen ke
zvýšení už tak excelentní protivirové aktivity, ale také k výraznému snížení logD a zvýšení
biologické dostupnosti (Obr. 144. Optimalizace inhibitorů RSV replikace.).181
Obr. 144. Optimalizace inhibitorů RSV replikace.
111
U některých vysoce polárních molekul, například přírodních produktů, je žádoucí naopak
odebrat některé polární funkční skupiny, které nejsou nezbytné pro biologický účinek. Tato
modifikace vede ke zvýšení lipofilního charakteru a usnadnění průchodu přes biologické
membrány. Náhrada hydroxylové skupiny ve struktuře linkomicinu za lipofilnější atom chlóru
vedla k přípravě klindamycinu, který je lépe absorbován (Obr. 145).
Obr. 145. Zvyšování lipofilního charakteru, které vede ke zvýšení orální dostupnosti.
2. Změna polarity pomocí změny alkylových nebo acylových substituentů. Pomocí těchto
substituentů můžeme jednoduše snížit polaritu například u alkoholů a fenolů, jejich převedením
na étery a estery a u primárních a sekundárních aminů jejich transformací na amidy nebo
terciární aminy. Skupina, kterou takto maskujeme, by neměla hrát zásadní roli v interakci
s molekulovým cílem. Pro zvýšení polarity můžeme zvolit opačný postup.
3. Změna pKa. Léčiva, která mají hodnotu pKa mimo 6-9, mohou být ve vodných roztocích silně
ionizována, a to může způsobovat jejich špatný průnik přes biologické membrány. Proto může
být absorpce v gastrointestinálním traktu výrazně ovlivněna pomocí změny pKa, a to hned
několika způsoby. Jednou z možností je použití bioizosterních skupin, které mohou upravovat
jak pKa tak lipofilní charakter modifikované skupiny. Příkladem může být již dříve zmíněná
náhrada karboxylové skupiny za tetrazol, nebo záměna fenyl amidinového uskupení u inhibitorů
faktoru Xa, kterým bylo možné výrazně ovlivnit jak pKa tak i lipofilní charakter (Obr. 146).182
Obr. 146. Příklady bioizosterů amidinové skupiny, které umožňují zvýšení biologické dostupnosti
ovlivněním pKa.
Obr. 147.
112
U aminů a karboxylových kyselin můžeme jejich pKa výrazně ovlivnit pomocí EWG a EDG
skupin. U oxamnichinu, anthelmintika proti schistosomóze, parazitárního onemocnění
způsobeného motolicemi, můžeme pozorovat výrazný posun rovnováhy k neionizované formě
v důsledku mezomerního efektu nitro skupiny (Obr. 147).
12.2. Optimalizace metabolismu
U většiny potenciálních léčiv se snažíme prodloužit jejich dobu působení v organismu (prodloužit
plazmatický poločas a snížit clearance). Existují však i případy, kdy se snažíme omezit působení
léčiva pouze na určitou dobu, a našim cílem mohou být deriváty, které budou metabolizovány
rychleji. Optimalizace metabolické stability může kolidovat se snahou získat nejúčinnější deriváty,
a proto by v procesu optimalizace leadu měly jít tyto dvě snahy ruku v ruce.
Zvyšování rezistence vůči chemické a metabolické degradaci
1) Snižování lipofilního charakteru
Cytochrom P450 interaguje se substráty především na základě hydrofobních interakcí, a proto
může snížení lipofilního charakteru molekuly vést ke zvýšené metabolické stabilitě molekuly a
prodloužení plazmatického poločasu. Příkladem zvýšení mikrozomální stability založené na
snížení hydrofobicity je SAR studie inhibitorů aldosteronsyntasy (AldSyn), potenciálního
biologického cíle u onemocnění krevního oběhu zejména hypertenze a selhání srdce (Obr.
148).183
Obr. 148.
2) Použití sterického štítu
Rychlost hydrolýzy některých skupin (např. aminů, amidů a esterů) může být výrazně ovlivněna
sterickými vlastnostmi okolních skupin a objemné substituenty mohou značně zpomalit tento
proces. Například amfetamin184 a methamfetamin jsou podstatně odolnější než fenyletylamin185
a přirozené neurotransmitery (dopamin, serotonin) proti oxidativnímu odbourávání pomocí
monoaminooxidas. Tato stabilita je dána sousedící metylovou skupinou, která znesnadňuje
interakci s tímto enzymem (Obr. 149).186
Obr. 149. Efekt sterického štítu u fenyletylaminových derivátů.
113
3) Blokování metabolicky labilních skupin
Velmi účinnou strategií zvyšování biologické dostupnosti je příprava derivátů, u kterých je
místo metabolismu blokováno stabilní skupinou. Mezi takováto labilní místa, označovaná také
jako „soft spots“, patří benzylové a allylové skupiny, které mohou být snadno oxidovány.
V tomto případě se velmi často využívá náhrady benzylových vodíků za fluory. Záměna metylu
za trifluormetylovou skupinu byla využita k výraznému prodloužení stability látek s antivirovou
aktivitou proti pikornavirům v opičích mikrozomech (Obr. 150).187
Obr. 150. Významné prodloužení stability v mikrozomech zablokováním místa metabolizace.
Stejná metabolicky stabilní skupina byla využita při přípravě nových antagonistů TRPV1
kapsaicinových receptorů, potenciálních analgetik (Obr. 151).188
Fluorové atomy jsou často používaný také k zábraně metabolizace aromatických kruhů. U
antagonistů adeninových receptorů A2A, vyvíjených jako nová léčiva proti Parkinsonově nemoci,
bylo dosaženo výrazného zvýšení stability v lidských mikrozomech zavedením fluorového
atomu na nejexponovanější místo aromatického kruhu (Obr. 152).183
Obr. 151. Využití trifluormetylové skupiny pro stabilizaci TRPV1 antagonistů.
Obr. 152. Blokování místa metabolismu antagonistů adeninových receptorů A2A.
Fluor je bezesporu jednou z nejpoužívanějších blokujících skupin, ale není zdaleka jedinou.
V některých případech může být místo metabolizmu zablokováno pomocí metylové nebo kyano
skupiny. Kyano skupina byla využita nejen ke zvýšení afinity agonistů FFA1 receptorů, ale také
jejich stability. FFA1 receptory jsou jedním z nových biologických cílů pro léčbu diabetu typu 2
(Obr. 153).189
114
Obr. 153. Zvýšení metabolické stability FFA1 agonistů zavedením kyano skupiny.
4) Odstranění nebo náhrada metabolicky nestálé skupiny
V některých případech je možné metabolicky nestálou skupinu zcela odstranit případně nahradit
skupinou stabilnější. Na derivátech celekoxibu, COX-2 selektivního nesteroidního analgetika,
můžeme pozorovat nárůst stability v potkaní krevní plazmě po záměně metabolicky nestabilní
metylové skupiny za atom chlorů (Obr. 154).190, 191
Obr. 154. Zvýšení plazmatické stability u derivátu celekoxibu.
Labilní esterové a amidové vazby je možné nahradit vybranými bioizostery, které mohou
významným způsobem zvýšit jejich stabilitu v krevní plazmě (viz Kapitola 8.2.3.).
5) Deaktivace reaktivní skupiny
Pomocí skupin odtahujících (EWG) nebo naopak dodávajících (EDG) elektrony můžeme
výrazně ovlivňovat reaktivitu některých skupin, stejně jako pozic na aromatických jádrech, a
tím změnit i jejich přístupnost metabolickým procesům. Metabolismus některých léčivých látek
může být tímto způsobem výrazně zpomalen. To je zřejmé z příkladu nových antimalarik (Obr.
155.) u nichž EDG skupina významně zvyšuje přístupnost k metabolizaci aromatického kruhu
zatímco deriváty s EWG skupinami jsou metabolizovany výrazně pomaleji.192 Na druhé straně,
zvýšení elektronové hustoty na karbonylové skupině může vést ke snížení její přístupnosti
k nukleofilnímu ataku. Toho lze využít k desenzibilizaci esterů vůči rychlému štěpení
esterasami. Například karbachol je v porovnání s acetylcholinem metabolizován zanedbatelně
(Obr. 156).
Obr. 155. Efekt EDG a EWG skupin na metabolizaci antimalarik v lidských mikrozomech.
115
Obr. 156.
Existuje mnoho dalších metodik, kterými je možné zvyšovat metabolickou stabilitu látek. Většina
těchto postupů vyžaduje identifikaci slabých míst molekuly na základě studia jejich
metabolismu.183, 193
Snížení odolnosti proti metabolizaci
Ve většině případů se snažíme prodloužit biologický poločas látek a snížit jejich clearance. Mohou
ale nastat i případy, kde zbytečně pomalé odbourávání látek brání jejich užití například kvůli
bezpečnostním rizikům spojeným s jejich účinky. V těchto případech se snažíme využít derivátů,
které mají optimalizovaný biologický poločas zavedením skupiny, která usnadňuje metabolizaci
dané látky. Může se jednat o dříve zmíněné benzylové CH3 skupiny, které jsou rychle oxidovány
pomocí cytochromu P450. Příkladem využití této metodiky je příprava labilních antiarytmik (Obr.
157).
Pro zvýšení metabolického rozkladu se nabízí také esterové skupiny případně fenolické deriváty,
které jsou rychle konjugovány v metabolismu fáze 2.
Obr. 157. Antiarytmika se zvýšeným metabolickým rozkladem.
12.3. Proléčiva
Jako proléčiva (profarmaka, prodrugs) označujeme látky, které jsou samy o sobě neaktivní, ale
v organizmu jsou přeměněny na vlastní léčivo, které může následně působit na zvolený biologický
cíl. Proléčiva používáme zejména ke zvýšení biologické dostupnosti látek anebo ke zlepšení
rozpustnosti látek ve vodném médiu. Některá proléčiva mohou sloužit také k prodloužení účinků
léčiva, omezení nepříjemné chuti, nebo směrování léčiva do konkrétních tkání.
1) Proléčiva zlepšující prostup membránami
Jako proléčiva látek, které nesou kyselý vodík (jako jsou karboxylové nebo fosfonové
kyseliny) jsou často využívány jejich estery (Obr. 158). Tento princip zlepšení biologické
dostupnosti využívají například důležitá antivirotika jako jsou oseltamivir, jehož aktivní
složkou je karboxylová kyselina, která se uvolní po rozštěpení etylesteru, nebo tenofovir
disoproxil, který po absorpci uvolňuje aktivní fosfonovou kyselinu tenofovir a umožňuje
zvýšit biologickou dostupnost této látky až na 45%.194
Esterová proléčiva mohou být využita také pro zvýšení dostupnosti při topickém podání
jako je tomu u tafluprostu, prostaglandinového analoga, které se používá ve formě očních
kapek při glaukomu. Esterová skupina umožňuje snadný průnik léčiva do očních tkání, kde
se velmi rychle rozpadá na aktivní karboxylovou kyselinu.195
116
Obr. 158. Struktura proléčiv a aktivních forem vybraných léčiv.
Přestože různé estery jsou nejčastějšími proléčivy, pro zvýšení prostupnosti léčiv přes
biologické membrány je možné využít také látek, které jsou aktivovány jinými
enzymatickými procesy. Látku, která je kombinovaným proléčivem využívajícím jak
aktivaci esterasami, tak dalším enzymem, aldehydoxidasou, představuje famciklovir (Obr.
159).196
Obr. 159. Aktivace famcikloviru na penciklovir.
2) Proléčiva umožňující absorpci pomocí membránových přenašečů
Některá proléčiva jsou schopna využívat membránových přenašečů pro di- a tripeptidy
v tenkém střevě. Valacyklovir a valganciklovir jsou proléčiva antivirotik acykloviru a
gancikloviru, která využívají právě tyto membránové přenašeče (Obr. 160). Díky této
technologii bylo možné zvýšit orální dostupnost acykloviru z 12-20% na 50% a
gancikloviru z 6 na 61%.194
117
Obr. 160. Proléčiva umožňující průchod přes membrány využívající přenašeče.
3) Proléčiva zvyšující rozpustnost ve vodě
Zvýšení rozpustnosti ve vodě může umožnit jak vyšší biologickou dostupnost po perorálním
podání, tak možnost parenterálního podání v menším množství tekutiny. Pro zvyšování
rozpustnosti v obou těchto případech se nejčastěji používají monoestery fosforečné kyseliny
(Obr. 161).
Tato strategie zvyšování biologické dostupnosti byla využita u například u miproxifen
fosfátu, cytostatika používaného u nádorů prsu. Zavedením fosfátové skupiny se zvýšila
jeho rozpustnost asi o tři řády a biologická dostupnost vzrostla na necelých 30 %. Na druhé
straně, fosflukonazol, proléčivo antifungálního léčiva flukonazolu, je možné podávat
intravenózně v malém množství roztoku ve velmi vysoké dávce (Obr. 162). Tyto estery
fosforečné kyseliny jsou v těle rozštěpeny pomocí fosfatas, čímž dojde k uvolnění aktivní
složky.194
Obr. 161. Miproxifen fosfát umožňující vyšší biologickou dostupnost a jeho aktivní metabolit.
Obr. 162. Fosflukonazol umožňuje zvýšení intravenózní dávky flukonazolu.
118
4) Proléčiva prodlužující účinek léčiva
Pokud jsou metabolicky labilní skupiny nezbytné pro interakci léčiva s molekulárním cílem,
je možné zamezit jejich metabolizaci a prodloužit tak účinek léčiva jejich vhodnými
„chránícími skupinami“. Tento postup byl použit u bronchodilatátoru terbutalinu (Obr. 163).
Bambuterol, který je proléčivem terbutalinu se pomalu rozkládá nespecifickou
bytyrylcholinesterasou, a umožňuje tak podání tohoto léčiva pouze jedenkrát denně.197
Obr. 163.
5) Proléčiva maskující hořkou chuť
Proléčiva jsou někdy používána také k potlačení některých negativních chuťových
vlastností. Tento přístup většinou zahrnuje snížení rozpustnosti ve vodě, čímž nedochází ke
kontaktu léčiva s chuťovými pohárky. Hořká chuť byla tímto způsobem potlačena u
některých antibiotik například chloramfenikolu nebo klindamycinu.198
6) Proléčiva snižující toxicitu
Vhodná aplikace konceptu proléčiv může vést ke snížení toxicity léčiv. Klasickým
příkladem je využití kyseliny aspirinu místo kyseliny salicylové. Novějším příkladem je
využití nového proléčiva tenofoviru pro zmírnění negativních účinku pozorovaných u
některých pacientů užívajících tenofovir disoproxil. Tenofovir alafenamid (Obr. 164)
umožňuje snížit množství použitého tenofoviru na desetinu a tím potlačit nefrotoxicitu a
vedlejší účinky pozorované na kostní dřeni.199
Obr. 164. Nové profarmakum tenofoviru umožňuje snížení dávek tohoto léčiva a vede k potlačení
některých negativních účinků.
7) Proléčiva umožňující směrování léčiv do konkrétních tkání
Proléčiva byla úspěšně použita pro selektivní směrování léčiv do vybraných tkání například
do mozku, jater nebo nádorové tkáně. Tyto technologie většinou využívají zvýšenou expresi
některých enzymů v cílové tkáni a umožnují tak selektivní konverzi léčiva na místě
žádaného účinku. Příkladem směrování léčiv pomocí proléčiv je využití zvýšené hladiny
histondeacetylasy a proteasy katepsinu L pro selektivní odmaskování puromycinu, silného
cytostatika, v nádorech.200
119
Obr. 165. Proléčivo puromycinu směrované do nádorů.
120
Použitá literatura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
M. Herper, The Cost Of Creating A New Drug Now $5 Billion, Pushing Big Pharma To
Change, http://www.forbes.com/sites/matthewherper/2013/08/11/how-the-staggering-costof-inventing-new-drugs-is-shaping-the-future-of-medicine/, Accessed 10. 1. 2015, 2015.
A. Schieppati, J.-I. Henter, E. Daina and A. Aperia, Lancet, 2008, 371, 2039-2041.
National Ambulatory Medical Care Survey: 2010 Summary Tables,
http://www.cdc.gov/nchs/data/ahcd/namcs_summary/2009_namcs_web_tables.pdf,
Accessed 11.1.2015.
M. Heron, National vital statistics reports : from the Centers for Disease Control and
Prevention, National Center for Health Statistics, National Vital Statistics System, 2013, 62,
1-96.
C. W. Lindsley, Acs Chemical Neuroscience, 2013, 4, 1133-1135.
A. L. Hopkins and C. R. Groom, Nature Reviews Drug Discovery, 2002, 1, 727-730.
P. Ascenzi, M. G. Ascenzi and G. Amiconi, Biochemical Education, 1987, 15, 134-135.
D. Sviridov, P. Nestel and G. Watts, Cardiovascular & Hematological Agents in Medicinal
Chemistry, 2007, 5, 215-221.
A. P. Lea and D. McTavish, Drugs, 1997, 53, 828-847.
A. F. Marques, D. Esser, P. J. Rosenthal, M. U. Kassack and L. M. T. R. Lima, Bioorganic
& Medicinal Chemistry, 2013, 21, 3667-3673.
V. L. Schramm, Acs Chemical Biology, 2013, 8, 71-81.
J. A. Gutierrez, M. Luo, V. Singh, L. Li, R. L. Brown, G. E. Norris, G. B. Evans, R. H.
Furneaux, P. C. Tyler, G. F. Painter, D. H. Lenz and V. L. Schramm, Acs Chemical Biology,
2007, 2, 725-734.
J. Magano, Chemical Reviews, 2009, 109, 4398-4438.
G. Thomas, Fundamentals of Medicinal Chemistry, John Wiley & Sons Ltd., Chichester,
2003.
L. Daeffler and Y. Landry, Fundamental & Clinical Pharmacology, 2000, 14, 73-87.
A. K. Evans and C. A. Lowry, Cns Drug Reviews, 2007, 13, 475-501.
L. Nagy and J. W. R. Schwabe, Trends in Biochemical Sciences, 2004, 29, 317-324.
H. Gronemeyer, J. A. Gustafsson and V. Laudet, Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3,
950-964.
C. Yang, Q. Li and Y. Li, Marine Drugs, 2014, 12, 601-635.
B. S. Komm and S. Mirkin, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2014,
143, 207-222.
L. Iversen, British Journal of Pharmacology, 2006, 147, S82-S88.
Y. Liu, Y. Cao, W. Zhang, S. Bergmeier, Y. Qian, H. Akbar, R. Colvin, J. Ding, L. Tong, S.
Wu, J. Hines and X. Chen, Molecular Cancer Therapeutics, 2012, 11, 1672-1682.
M. M. Gottesman, T. Fojo and S. E. Bates, Nature Reviews Cancer, 2002, 2, 48-58.
S. Bagal, A. D. Brown, P. J. Cox, K. Omoto, R. M. Owen, D. C. Pryde, B. Sidders, S. E.
Skerratt, E. B. Stevens, R. I. Storer and N. A. Swain, Journal of Medicinal Chemistry, 2013,
56, 593-624.
W. Dalemans, P. Barbry, G. Champigny, S. Jallat, K. Dott, D. Dreyer, R. G. Crystal, A.
Pavirani, J. P. Lecocq and M. Lazdunski, Nature, 1991, 354, 526-528.
F. Lehmann-Horn and K. Jurkat-Rott, Physiological Reviews, 1999, 79, 1317-1372.
A. S. Verkman and L. J. V. Galietta, Nature Reviews Drug Discovery, 2009, 8, 153-171.
D. C. Swinney and J. Anthony, Nature Reviews Drug Discovery, 2011, 10, 507-519.
T. D. Cushing, D. P. Metz, D. A. Whittington and L. R. McGee, Journal of Medicinal
Chemistry, 2012, 55, 8559-8581.
S. J. Lee and J. Y. J. Wang, Journal of Biology (London), 2009, 8, 30-Article No.: 30.
121
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
International Human Genome Sequencing Consortium, Nature, 2001, 409, 860-921.
I. Ezkurdia, D. Juan, J. Manuel Rodriguez, A. Frankish, M. Diekhans, J. Harrow, J.
Vazquez, A. Valencia and M. L. Tress, Human Molecular Genetics, 2014, 23, 5866-5878.
M. G. Katz-Jaffe, S. McReynolds, D. K. Gardner and W. B. Schoolcraft, Molecular Human
Reproduction, 2009, 15, 271-277.
S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. J. Lipman, Journal of Molecular
Biology, 1990, 215, 403-410.
W. R. Pearson, Multiple Sequence Alignment Methods, 2014, 1079, 75-101.
Y.-M. Wu, F. Su, S. Kalyana-Sundaram, N. Khazanov, B. Ateeq, X. Cao, R. J. Lonigro, P.
Vats, R. Wang, S.-F. Lin, A.-J. Cheng, L. P. Kunju, J. Siddiqui, S. A. Tomlins, P.
Wyngaard, S. Sadis, S. Roychowdhury, M. H. Hussain, F. Y. Feng, M. M. Zalupski, M.
Talpaz, K. J. Pienta, D. R. Rhodes, D. R. Robinson and A. M. Chinnaiyan, Cancer
Discovery, 2013, 3, 636-647.
Q. C. Ma, C. A. Ennis and S. Aparicio, Current Opinion in Genetics & Development, 2012,
22, 3-9.
M. A. Quail, M. Smith, P. Coupland, T. D. Otto, S. R. Harris, T. R. Connor, A. Bertoni, H.
P. Swerdlow and Y. Gu, Bmc Genomics, 2012, 13.
M. C. Pirrung, Angewandte Chemie (International ed. in English), 2002, 41, 1276-1289.
S. Fontana, G. De Leo, M. Sedic, S. Kraljevic Pavelic and R. Alessandro, Drug Discovery
Today: Technologies, 2006, 3, 441-449.
E. Fic, S. Kedracka-Krok, U. Jankowska, A. Pirog and M. Dziedzicka-Wasylewska,
Electrophoresis, 2010, 31, 3573-3579.
B. Canas, C. Pineiro, E. Calvo, D. Lopez-Ferrer and J. M. Gallardo, Journal of
Chromatography A, 2007, 1153, 235-258.
S. H. Chiou and S. H. Wu, Analytica Chimica Acta, 1999, 383, 47-60.
J. Burbaum and G. M. Tobal, Current Opinion in Chemical Biology, 2002, 6, 427-433.
M. F. Templin, D. Stoll, M. Schrenk, P. C. Traub, C. F. Vohringer and T. O. Joos, Drug
Discovery Today, 2002, 7, 815-822.
J. Lee and M. Bogyo, Current Opinion in Chemical Biology, 2013, 17, 118-126.
M. Wildova and M. Rumlova, Chemicke Listy, 2008, 102, 28-34.
J. L. Vaerman, P. Moureau, F. Deldime, P. Lewalle, C. Lammineur, F. Morschhauser and P.
Martiat, Blood, 1997, 90, 331-339.
N. Dias and C. A. Stein, Molecular Cancer Therapeutics, 2002, 1, 347-355.
C. Guan, C. Ye, X. Yang and J. Gao, Genesis, 2010, 48, 73-85.
C. Smith, Nature, 2003, 422, 341-+.
O. Vidalin, M. Muslmani, C. Estienne, H. Echchakir and A. M. Abina, Current Opinion in
Pharmacology, 2009, 9, 669-676.
J. P. Hughes, S. Rees, S. B. Kalindjian and K. L. Philpott, British Journal of Pharmacology,
2011, 162, 1239-1249.
S. M. Schmitt, M. Gull and A. W. Braendli, Advanced Drug Delivery Reviews, 2014, 69,
225-246.
J. Tat, M. Liu and X.-Y. Wen, Drug Discovery Today: Technologies, 2013, 10, e83-e89.
C. A. d'Alencon, O. A. Pena, C. Wittmann, V. E. Gallardo, R. A. Jones, F. Loosli, U. Liebel,
C. Grabher and M. L. Allende, Bmc Biology, 2010, 8.
C. J. Veinotte, G. Dellaire and J. N. Berman, Disease Models & Mechanisms, 2014, 7, 745754.
C. G. Wermuth, Drug Discovery Today, 2006, 11, 160-164.
C. G. Wermuth, Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47, 1303-1314.
S. Ehrhardt and C. G. Meyer, Therapeutics and clinical risk management, 2009, 5, 805-815.
D. Wardrop and D. Keeling, British Journal of Haematology, 2008, 141, 757-763.
122
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
R. W. Carlson, Clinical breast cancer, 2005, 6 Suppl 1, S5-8.
R. Bucourt, M. Vignau, V. Torelli, H. Richardfoy, C. Geynet, C. Seccomillet, G. Redeuilh
and E. E. Baulieu, Journal of Biological Chemistry, 1978, 253, 8221-8228.
L. Bertram and R. E. Tanzi, Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 1449-1457.
E. Ravina, The Evolution of Drug Discovery, WILEY-VCH Verlag & Co KGaA.,
Weinheim, 2011.
D. B. Kitchen, H. Decornez, J. R. Furr and J. Bajorath, Nature Reviews Drug Discovery,
2004, 3, 935-949.
R. A. Laskowski, Molecular Biotechnology, 2011, 48, 183-198.
T. Schmidt, A. Bergner and T. Schwede, Drug Discovery Today, 2014, 19, 890-897.
A. Liantonio, A. Picollo, G. Carbonara, G. Fracchiolla, P. Tortorella, F. Loiodice, A.
Laghezza, E. Babini, G. Zifarelli, M. Pusch and D. C. Camerino, Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105, 1369-1373.
P. C. D. Hawkins, A. G. Skillman and A. Nicholls, Journal of Medicinal Chemistry, 2007,
50, 74-82.
A. Roy and J. Skolnick, Bioinformatics, 2014.
I. S. Haque and V. S. Pande, Journal of Computational Chemistry, 2010, 31, 117-132.
P. J. Ballester and W. G. Richards, Journal of Computational Chemistry, 2007, 28, 17111723.
G. Schneider and U. Fechner, Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4, 649-663.
Y. Nishibata and A. Itai, Tetrahedron, 1991, 47, 8985-8990.
H. J. Bohm, Journal of Computer-Aided Molecular Design, 1992, 6, 593-606.
Y. Yuan, J. Pei and L. Lai, Journal of Chemical Information and Modeling, 2011, 51, 10831091.
F. Dey and A. Caflisch, Journal of Chemical Information and Modeling, 2008, 48, 679-690.
D. Douguet, Nucleic Acids Research, 2010, 38, W615-W621.
D. C. Rees, M. Congreve, C. W. Murray and R. Carr, Nature Reviews Drug Discovery,
2004, 3, 660-672.
M. J. Harner, A. O. Frank and S. W. Fesik, Journal of Biomolecular Nmr, 2013, 56, 65-75.
J. D. Oslob and D. A. Erlanson, Drug Discovery Today: TARGETS, 2004, 3, 143-150.
D. A. Erlanson, A. C. Braisted, D. R. Raphael, M. Randal, R. M. Stroud, E. M. Gordon and
J. A. Wells, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 2000, 97, 9367-9372.
G. L. Card, L. Blasdel, B. P. England, C. Zhang, Y. Suzuki, S. Gillette, D. Fong, P. N.
Ibrahim, D. R. Artis, G. Bollag, M. V. Milburn, S. H. Kim, J. Schlessinger and K. Y. J.
Zhang, Nature Biotechnology, 2005, 23, 201-207.
M. Congreve, G. Chessari, D. Tisi and A. J. Woodhead, Journal of Medicinal Chemistry,
2008, 51, 3661-3680.
S. K. Mamidyala and M. G. Finn, Chemical Society Reviews, 2010, 39, 1252-1261.
M. Whiting, J. Muldoon, Y. C. Lin, S. M. Silverman, W. Lindstrom, A. J. Olson, H. C.
Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, J. H. Elder and V. V. Fokin, Angewandte ChemieInternational Edition, 2006, 45, 1435-1439.
A. Steinmeyer, Chemmedchem, 2006, 1, 31-36.
A. K. Bronowska, Thermodynamics-interaction studies-solids, liquids and gases, 2011.
S. Kumar and R. Nussinov, Biophysical Journal, 2002, 83, 1595-1612.
E. Arunan, G. R. Desiraju, R. A. Klein, J. Sadlej, S. Scheiner, I. Alkorta, D. C. Clary, R. H.
Crabtree, J. J. Dannenberg, P. Hobza, H. G. Kjaergaard, A. C. Legon, B. Mennucci and D. J.
Nesbitt, Pure and Applied Chemistry, 2011, 83, 1637-1641.
P. Gilli, L. Pretto, V. Bertolasi and G. Gilli, Accounts of Chemical Research, 2009, 42, 3344.
123
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
C. Bissantz, B. Kuhn and M. Stahl, Journal of Medicinal Chemistry, 2010, 53, 5061-5084.
T. K. Harris and A. S. Mildvan, Proteins-Structure Function and Genetics, 1999, 35, 275282.
J. A. K. Howard, V. J. Hoy, D. Ohagan and G. T. Smith, Tetrahedron, 1996, 52, 1261312622.
H. J. Bohm, D. Banner, S. Bendels, M. Kansy, B. Kuhn, K. Muller, U. Obst-Sander and M.
Stahl, Chembiochem, 2004, 5, 637-643.
C. Dalvit, C. Invernizzi and A. Vulpetti, Chemistry-a European Journal, 2014, 20, 1105811068.
C. M. Deane, F. H. Allen, R. Taylor and T. L. Blundell, Protein Engineering, 1999, 12,
1025-1028.
A. Choudhary, D. Gandla, G. R. Krow and R. T. Raines, Journal of the American Chemical
Society, 2009, 131, 7244-+.
F. R. Fischer, W. B. Schweizer and F. Diederich, Angewandte Chemie-International
Edition, 2007, 46, 8270-8273.
F. R. Fischer, P. A. Wood, F. H. Allen and F. Diederich, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105, 17290-17294.
C. Faeh, L. A. Hardegger, M.-O. Ebert, W. B. Schweizer and F. Diederich, Chemical
Communications, 2010, 46, 67-69.
R. Paulini, K. Muller and F. Diederich, Angewandte Chemie-International Edition, 2005,
44, 1788-1805.
K. E. Riley and P. Hobza, Accounts of Chemical Research, 2013, 46, 927-936.
P. J. Collins, L. F. Haire, Y. P. Lin, J. Liu, R. J. Russell, P. A. Walker, J. J. Skehel, S. R.
Martin, A. J. Hay and S. J. Gamblin, Nature, 2008, 453, 1258-U1261.
B. Nagar, W. G. Bornmann, P. Pellicena, T. Schindler, D. R. Veach, W. T. Miller, B.
Clarkson and J. Kuriyan, Cancer Research, 2002, 62, 4236-4243.
K. Scharer, M. Morgenthaler, R. Paulini, U. Obst-Sander, D. W. Banner, D. Schlatter, J.
Benz, M. Stihle and F. Diederich, Angewandte Chemie-International Edition, 2005, 44,
4400-4404.
D. Kim, L. P. Wang, M. Beconi, G. J. Eiermann, M. H. Fisher, H. B. He, G. J. Hickey, J. E.
Kowalchick, B. Leiting, K. Lyons, F. Marsilio, M. E. McCann, R. A. Patel, A. Petrov, G.
Scapin, S. B. Patel, R. S. Roy, J. K. Wu, M. J. Wyvratt, B. B. Zhang, L. Zhu, N. A.
Thornberry and A. E. Weber, Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48, 141-151.
O. Fedorov, K. Huber, A. Eisenreich, P. Filippakopoulos, O. King, A. N. Bullock, D.
Szklarczyk, L. J. Jensen, D. Fabbro, J. Trappe, U. Rauch, F. Bracher and S. Knapp,
Chemistry & Biology, 2011, 18, 67-76.
P. Jain, C. Karthikeyan, N. S. Hari Narayana Moorthy, D. K. Waiker, A. K. Jain and P.
Trivedi, Current Drug Targets, 2014, 15, 539-550.
A. Karlas, N. Machuy, Y. Shin, K.-P. Pleissner, A. Artarini, D. Heuer, D. Becker, H. Khalil,
L. A. Ogilvie, S. Hess, A. P. Maeurer, E. Mueller, T. Wolff, T. Rudel and T. F. Meyer,
Nature, 2010, 463, 818-U132.
A.-l. Liu, M. Zu, J.-s. Fang and G.-h. Du, Acta Pharmacologica Sinica, 2013, 34, 45-45.
M. Harder, B. Kuhn and F. Diederich, Chemmedchem, 2013, 8, 397-404.
K. D. Schleicher, Y. Sasaki, A. Tam, D. Kato, K. K. Duncan and D. L. Boger, Journal of
Medicinal Chemistry, 2013, 56, 483-495.
M. Krier, J. X. de Araujo-Junior, M. Schmitt, J. Duranton, H. Justiano-Basaran, C. Lugnier,
J. J. Bourguignon and D. Rognan, Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48, 3816-3822.
D. Crottes, H. Guizouarn, P. Martin, F. Borgese and O. Soriani, Frontiers in Physiology,
2013, 4.
124
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
D. Fontanilla, M. Johannessen, A. R. Hajipour, N. V. Cozzi, M. B. Jackson and A. E.
Ruoho, Science, 2009, 323, 934-937.
R. Bhat, J. A. Fishback, R. R. Matsumoto, J. H. Poupaert and C. R. McCurdy, Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23, 5011-5013.
S. Ozcan, A. Kazi, F. Marsilio, B. Fang, W. C. Guida, J. Koomen, H. R. Lawrence and S.
M. Sebti, Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 56, 3783-3805.
R. L. Halcomb, in Successful Strategies for the Discovery of Antiviral Drugs eds. M. C.
Desai and N. A. Meanwell, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2013, ch. TLR-7
agonists for treatment of viral hepatitis, pp. 365-383.
K. Lafleur, J. Dong, D. Z. Huang, A. Caflisch and C. Nevado, Journal of Medicinal
Chemistry, 2013, 56, 84-96.
R. Boese, H. C. Weiss and D. Blaser, Angewandte Chemie-International Edition, 1999, 38,
988-992.
A. Nudelman, Y. Binnes, N. ShmueliBroide, Y. Odessa, J. P. Hieble and A. C. Sulpizio,
Archiv Der Pharmazie, 1996, 329, 125-132.
K. S. Gajiwala, J. Feng, R. Ferre, K. Ryan, O. Brodsky, S. Weinrich, J. C. Kath and A.
Stewart, Structure, 2013, 21, 209-219.
T. Barf and A. Kaptein, Journal of Medicinal Chemistry, 2012, 55, 6243-6262.
G. Navarrete-Vazquez, F. Chavez-Silva, R. Argotte-Ramos, M. D. Rodriguez-Gutierrez, M.
J. Chan-Bacab, R. Cedillo-Rivera, R. Moo-Puc and E. Hernandez-Nunez, Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters, 2011, 21, 3168-3171.
F. R. Tejada, P. I. Nagy, M. Xu, C. Wu, T. Katz, J. Dorsey, M. Rieman, E. Lawlor, M.
Warrier and W. S. Messer, Journal of Medicinal Chemistry, 2006, 49, 7518-7531.
L. M. A. Lima and E. J. Barreiro, Current Medicinal Chemistry, 2005, 12, 23-49.
G. A. Patani and E. J. LaVoie, Chemical Reviews, 1996, 96, 3147-3176.
D. B. Longley, D. P. Harkin and P. G. Johnston, Nature Reviews Cancer, 2003, 3, 330-338.
A. Solinas, H. Faure, H. Roudaut, E. Traiffort, A. Schoenfede, A. Mann, F. Manetti, M.
Taddei and M. Ruat, Journal of Medicinal Chemistry, 2012, 55, 1559-1571.
N. A. Meanwell, Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 54, 2529-2591.
C. Ballatore, D. M. Huryn and A. B. Smith, III, Chemmedchem, 2013, 8, 385-395.
L. D. Freedman and G. O. Doak, Chemical Reviews, 1957, 57, 479-523.
J. P. Guthrie, Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne De Chimie, 1978, 56,
2342-2354.
T. Sakamoto, M. D. Cullen, T. L. Hartman, K. M. Watson, R. W. Buckheit, C.
Pannecouque, E. De Clercq and M. Cushman, Journal of Medicinal Chemistry, 2007, 50,
3314-3321.
E. Elzein, P. Ibrahim, D. O. Koltun, K. Rehder, K. D. Shenk, T. A. Marquart, B. Jiang, X. F.
Li, R. Natero, Y. Li, M. Nguyen, S. Kerwar, N. Chu, D. Soohoo, J. Hao, V. Y. Maydanik,
D. A. Lustig, D. W. Zeng, K. Leung and J. A. Zablocki, Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters, 2004, 14, 6017-6021.
G. Wuitschik, E. M. Carreira, B. Wagner, H. Fischer, I. Parrilla, F. Schuler, M. RogersEvans and K. Mueller, Journal of Medicinal Chemistry, 2010, 53, 3227-3246.
K. Vandyck, M. D. Cummings, O. Nyanguile, C. W. Boutton, S. Vendeville, D. McGowan,
B. Devogelaere, K. Amssoms, S. Last, K. Rombauts, A. Tahri, P. Lory, L. Hu, D. A.
Beauchamp, K. Simmen and P. Raboisson, Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 52, 40994102.
A. Gopalsamy, R. Chopra, K. Lim, G. Ciszewski, M. Shi, K. J. Curran, S. F. Sukits, K.
Svenson, J. Bard, J. W. Ellingboe, A. Agarwal, G. Krishnamurthy, A. Y. M. Howe, M.
Orlowski, B. Feld, J. O'Connell and T. S. Mansour, Journal of Medicinal Chemistry, 2006,
49, 3052-3055.
125
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
J. Wouters, C. Michaux, F. Durant, J. M. Dogne, J. Delarge and B. Masereel, European
Journal of Medicinal Chemistry, 2000, 35, 923-929.
R. I. Storer, C. Aciro and L. H. Jones, Chemical Society Reviews, 2011, 40, 2330-2346.
W. L. Wu, D. A. Burnett, R. Spring, W. J. Greenlee, M. Smith, L. Favreau, A. Fawzi, H. T.
Zhang and J. E. Lachowicz, Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48, 680-693.
C. E. Mowbray, C. Burt, R. Corbau, S. Gayton, M. Hawes, M. Perros, I. Tran, D. A. Price,
F. J. Quinton, M. D. Selby, P. A. Stupple, R. Webster and A. Wood, Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19, 5857-5860.
C. J. Liu, S. T. Wrobleski, J. Lin, G. Ahmed, A. Metzger, J. Wityak, K. M. Gillooly, D. J.
Shuster, K. W. McIntyre, S. Pitt, D. R. Shen, R. F. Zhang, H. J. Zhang, A. M. Doweyko, D.
Diller, I. Henderson, J. C. Barrish, J. H. Dodd, G. L. Schieven and K. Leftheris, Journal of
Medicinal Chemistry, 2005, 48, 6261-6270.
A. Hall, R. A. Bit, S. H. Brown, A. Chowdhury, G. M. P. Giblin, D. N. Hurst, I. R. Kilford,
X. Lewell, A. Naylor and T. Scoccitti, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, 18,
1592-1597.
D. J. St Jean, Jr. and C. Fotsch, Journal of Medicinal Chemistry, 2012, 55, 6002-6020.
A. F. Stepan, C. Subramanyam, I. V. Efremov, J. K. Dutra, T. J. O'Sullivan, K. J. DiRico,
W. S. McDonald, A. Won, P. H. Dorff, C. E. Nolan, S. L. Becker, L. R. Pustilnik, D. R.
Riddell, G. W. Kauffman, B. L. Kormos, L. Zhang, Y. Lu, S. H. Capetta, M. E. Green, K.
Karki, E. Sibley, K. P. Atchison, A. J. Hallgren, C. E. Oborski, A. E. Robshaw, B. Sneed
and C. J. O'Donnell, Journal of Medicinal Chemistry, 2012, 55, 3414-3424.
P. S. Dragovich, T. J. Prins, R. Zhou, T. O. Johnson, Y. Hua, H. T. Luu, S. K. Sakata, E. L.
Brown, F. C. Maldonado, T. Tuntland, C. A. Lee, S. A. Fuhrman, L. S. Zalman, A. K.
Patick, D. A. Matthews, E. Y. Wu, M. Guo, B. C. Borer, N. K. Nayyar, T. Moran, L. J.
Chen, P. A. Rejto, P. W. Rose, M. C. Guzman, E. Z. Dovalsantos, S. Lee, K. McGee, M.
Mohajeri, A. Liese, J. H. Tao, M. B. Kosa, B. Liu, M. R. Batugo, J. P. R. Gleeson, Z. P. Wu,
J. Liu, J. W. Meador and R. A. Ferre, Journal of Medicinal Chemistry, 2003, 46, 4572-4585.
H. Sun, G. Tawa and A. Wallqvist, Drug Discovery Today, 2012, 17, 310-324.
H. Lachance, S. Wetzel, K. Kumar and H. Waldmann, Journal of Medicinal Chemistry,
2012, 55, 5989-6001.
K. W. Bentley and D. G. Hardy, Journal of the American Chemical Society, 1967, 89, 3281&.
W. S. Huang, X. T. Zhu, Y. H. Wang, M. Azam, D. Wen, R. Sundaramoorthi, R. M.
Thomas, S. Liu, G. Banda, S. P. Lentini, S. Das, Q. H. Xu, J. Keats, F. Wang, S. Wardwell,
Y. Y. Ning, J. T. Snodgrass, M. I. Broudy, K. Russian, G. Q. Daley, J. Iuliucci, D. C.
Dalgarno, T. Clackson, T. K. Sawyer and W. C. Shakespeare, Journal of Medicinal
Chemistry, 2009, 52, 4743-4756.
M. J. Sofia, W. S. Chang, P. A. Furman, R. T. Mosley and B. S. Ross, Journal of Medicinal
Chemistry, 2012, 55, 2481-2531.
M. L. Bolognesi, M. Bartolini, A. Cavalli, V. Andrisano, M. Rosini, A. Minarini and C.
Melchiorre, Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47, 5945-5952.
L. A. Nguyen, H. He and C. Pham-Huy, International journal of biomedical science : IJBS,
2006, 2, 85-100.
L. H. Easson and E. Stedman, The Biochemical journal, 1933, 27, 1257-1266.
P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors and U. Madsen, Textbook of Drug Design and Discovery
Taylor & Francis, London, New York, 2002.
J. Caldwell, A. J. Hutt and S. Fournelgigleux, Biochemical Pharmacology, 1988, 37, 105114.
R. D. Knihinicki, K. M. Williams and R. O. Day, Biochemical Pharmacology, 1989, 38,
4389-4395.
126
161.
162.
163.
164.
165.
166.
167.
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179.
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
J. B. Bartlett, K. Dredge and A. G. Dalgleish, Nature Reviews Cancer, 2004, 4, 314-322.
M. Schramm, G. Thomas, R. Towart and G. Franckowiak, Nature, 1983, 303, 535-537.
F. T. M. Vanamsterdam, N. C. Punt, M. Haas, M. S. Vanamsterdammagnoni and J.
Zaagsma, Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology, 1989, 339, 647-652.
L. J. Ignarro, Cardiovascular Therapeutics, 2008, 26, 115-134.
I. Agranat, H. Caner and A. Caldwell, Nature Reviews Drug Discovery, 2002, 1, 753-768.
J. Valentova and A. J. Hutt, Ceska a Slovenska farmacie : casopis Ceske farmaceuticke
spolecnosti a Slovenske farmaceuticke spolecnosti, 2004, 53, 285-293.
K. C. Cheng, W. A. Korfmacher, R. E. White and F. G. Njoroge, Perspectives in medicinal
chemistry, 2008, 1, 1-9.
J. F. Pritchard, M. Jurima-Romet, M. L. J. Reimer, E. Mortimer, B. Rolfe and M. N. Cayen,
Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 542-553.
C. A. Lipinski, F. Lombardo, B. W. Dominy and P. J. Feeney, Advanced Drug Delivery
Reviews, 2001, 46, 3-26.
ACD/ChemSketch, 12.01, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, On, Canada,
www.acdlabs.com, 2014.
T. H. Keller, A. Pichota and Z. Yin, Current Opinion in Chemical Biology, 2006, 10, 357361.
M. Ekroos and T. Sjogren, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 2006, 103, 13682-13687.
F. P. Guengerich, Aaps Journal, 2006, 8, E101-E111.
M. S. Benedetti, Fundamental & Clinical Pharmacology, 2001, 15, 75-84.
A. Meister, Journal of Biological Chemistry, 1988, 263, 17205-17208.
N. Kaplowitz, The American journal of physiology, 1980, 239, G439-444.
P. Baranczewski, A. Stanczak, K. Sundberg, R. Svensson, A. Wallin, J. Jansson, P. Garberg
and H. Postlind, Pharmacological Reports, 2006, 58, 453-472.
S. Chillistone and J. G. Hardman, Anaesthesia & Intensive Care Medicine, 2014, 15, 388391.
B. R. Moore, M. Page-Sharp, J. R. Stoney, K. F. Ilett, J. D. Jago and K. T. Batty,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2011, 55, 3899-3907.
H. D. Williams, N. L. Trevaskis, S. A. Charman, R. M. Shanker, W. N. Charman, C. W.
Pouton and C. J. H. Porter, Pharmacological Reviews, 2013, 65, 315-499.
R. L. Mackman, M. Sangi, D. Sperandio, J. P. Parrish, E. Eisenberg, M. Perron, H. Hui, L.
Zhang, D. Siegel, H. Yang, O. Saunders, C. Boojamra, G. Lee, D. Samuel, K. Babaoglu, A.
Carey, B. E. Gilbert, P. A. Piedra, R. Strickley, Q. Iwata, J. Hayes, K. Stray, A. Kinkade, D.
Theodore, R. Jordan, M. Desai and T. Cihlar, Journal of Medicinal Chemistry, 2015.
P. Y. S. Lam, C. G. Clark, R. H. Li, D. J. P. Pinto, M. J. Orwat, R. A. Galemmo, J. M.
Fevig, C. A. Teleha, R. S. Alexander, A. M. Smallwood, K. A. Rossi, M. R. Wright, S. A.
Bai, K. He, J. M. Luettgen, P. C. Wong, R. M. Knabb and R. R. Wexler, Journal of
Medicinal Chemistry, 2003, 46, 4405-4418.
A. F. Stepan, V. Mascitti, K. Beaumont and A. S. Kalgutkar, Medchemcomm, 2013, 4, 631652.
J. D. Baggot and L. E. Davis, Biochemical Pharmacology, 1972, 21, 1967-&.
H. E. Shannon, E. J. Cone and D. Yousefnejad, Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics, 1982, 223, 190-196.
C. Steinberg and D. A. Notterman, Clinical Pharmacokinetics, 1994, 27, 345-367.
G. D. Diana, P. Rudewicz, D. C. Pevear, T. J. Nitz, S. C. Aldous, D. J. Aldous, D. T.
Robinson, T. Draper, F. J. Dutko, C. Aldi, G. Gendron, R. C. Oglesby, D. L. Volkots, M.
Reuman, T. R. Bailey, R. Czerniak, T. Block, R. Roland and J. Oppermann, Journal of
Medicinal Chemistry, 1995, 38, 1355-1371.
127
188.
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
M. Z. Hernandes, S. M. T. Cavalcanti, D. R. M. Moreira, W. F. de Azevedo, Jr. and A. C.
Lima Leite, Current Drug Targets, 2010, 11, 303-314.
E. Christiansen, M. E. Due-Hansen, C. Urban, M. Grundmann, J. Schmidt, S. V. F. Hansen,
B. D. Hudson, M. Zaibi, S. B. Markussen, E. Hagesaether, G. Milligan, M. A. Cawthorne,
E. Kostenis, M. U. Kassack and T. Ulven, Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 56, 982992.
T. D. Penning, J. J. Talley, S. R. Bertenshaw, J. S. Carter, P. W. Collins, S. Docter, M. J.
Graneto, L. F. Lee, J. W. Malecha, J. M. Miyashiro, R. S. Rogers, D. J. Rogier, S. S. Yu, G.
D. Anderson, E. G. Burton, J. N. Cogburn, S. A. Gregory, C. M. Koboldt, W. E. Perkins, K.
Seibert, A. W. Veenhuizen, Y. Y. Zhang and P. C. Isakson, Journal of Medicinal Chemistry,
1997, 40, 1347-1365.
W. K. Hagmann, Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 51, 4359-4369.
D. G. Cabrera, C. Le Manach, F. Douelle, Y. Younis, T.-S. Feng, T. Paquet, A. T. Nchinda,
L. J. Street, D. Taylor, C. de Kock, L. Wiesner, S. Duffy, K. L. White, K. M. Zabiulla, Y.
Sambandan, S. Bashyam, D. Waterson, M. J. Witty, S. A. Charman, V. M. Avery, S. Wittlin
and K. Chibale, Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, 1014-1022.
A. E. F. Nassar, A. M. Kamel and C. Clarimont, Drug Discovery Today, 2004, 9, 10201028.
J. Rautio, H. Kumpulainen, T. Heimbach, R. Oliyai, D. Oh, T. Jarvinen and J. Savolainen,
Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7, 255-270.
Y. Fukano and K. Kawazu, Drug Metabolism and Disposition, 2009, 37, 1622-1634.
M. R. Rashidi, J. A. Smith, S. E. Clarke and C. Beedham, Drug Metabolism and
Disposition, 1997, 25, 805-813.
K. M. Huttunen, H. Raunio and J. Rautio, Pharmacological Reviews, 2011, 63, 750-771.
R. Karaman, in Application of Nanotechnology in Drug Delivery, ed. A. D. Sezer, InTech,
2014.
W. A. Lee, G. X. He, E. Eisenberg, T. Cihlar, S. Swaminathan, A. Mulato and K. C. Cundy,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49, 1898-1906.
N. Ueki, S. Lee, N. S. Sampson and M. J. Hayman, Nature Communications, 2013, 4.
128
Mgr. Radim Nencka, Ph.D.
Základní principy výzkumu nových léčiv
Výkonná redaktorka prof. PaedDr. Libuše Ludíková, CSc.
Odpovědná redaktorka Vendula Drozdová
Technická redakce autor
Grafické zpracování obálky Jiří Jurečka
Publikace ve vydavatelství neprošla technickou ani jazykovou redakční úpravou.
Vydala a vytiskla Univerzita Palackého v Olomouci
Křížkovského 8, 771 47 Olomouc
www.vydavatelstvi.upol.cz
www.e-shop.upol.cz
[email protected]
1. vydání
Olomouc 2015
Ediční řada – Skripta
ISBN 978-80-244-4538-0
Neprodejná publikace
vup 2015/0162