Produkce medicínsky významných látek - isb

Zvyšování
konkurenceschopnosti
studentů oboru botanika
a učitelství biologie
CZ.1.07/2.2.00/15.0316
Houby v lékařské biotechnologii
Produkce antibiotik a dalších lékařsky užitečných produktů
 Patrně už i naši předkové používali různých plísní jako terapeutických
prostředků pro bakteriím
 Mnoho ANTIBIOTIK je běžně využíváno z bakterií, hlavně z aktinomycet.
Antibiotika houbového původu běžně využívané v medicíně jsou penicilin,
cephalosporin a fusidová kyselina (produkují ji rody Fusidium /Hypocreales/
nebo Mucor ), které jsou antibakteriální a látka griseofulvin, která je
antifungální.
 Největšího objemu výroby dosahují 2 skupiny těchto antibiotik: peniciliny a
cefalosporiny.
Čisté preparáty P. notatum penicilin produkujících kmenů začaly být široce
využívány až ve 40–tých letech k léčení infikovaných ran. V té době penicilin
byl vyčištěn, ale nebyl široce využitelný pro civilní využití.
 Než byl penicilin zaveden jako první skutečné antibiotikum, bylo zkoumáno
tisíce metabolitů, které byly produkovány hlavně houbami a aktinomycetami
pro antimikrobiální aktivitu.
Houby neprodukují jenom antibiotika, ale i další spektrum lékařsky
užitečných látek, jako NÁMELOVÉ ALKALOIDY, DERIVÁTY STEROIDŮ,
PROTINÁDOROVÉ LÁTKY A IMUNOREGULÁTORY.
HISTORIE
 Objev antibiotik spolu s aplikací hygienických praktik u lékařů (např. mytí
rukou a použití sterilizovaných nástrojů) je jeden z nejdůležitějších objevů v
současné medicíně. Dnes banální zranění, jako je škrábnutí, s sebou dříve
nesla riziko infekce a smrti.
 Již 2500 let př. n. l. používali v Číně k léčbě infekcí obklady z plesnivého
sojového mléka.
 První skutečně účinné objevené antibiotikum pocházelo z plísně.
Francouzský doktor Ernest Duchesne zaznamenal už v roce 1896 fakt, že
určité plísně rodu štětičkovec (Penicillium) ničí bakterie. Duchesne a jeho
výzkum však zůstal zapomenut po celou generaci.
 Alexander Fleming během svého výzkumu antibakteriálního působení
lysozymu kultivoval baktérie na agarových plotnách a jedna z nich byla
napadena plísní druhu Penicillium notatum. Fleming zaznamenal čistou zónu
kolem plísňového podhoubí a pochopil, že plíseň vylučuje něco, co růst
bakterií zastavilo. I když nebyl schopen sloučeninu izolovat, svůj objev v roce
1929 popsal ve vědecké literatuře. Protože plíseň byla rodu Penicillium, nazval
tuto sloučeninu penicilin.
POUŽITÍ
 Antibiotika se používají především k léčbě infekčních stavů, někdy však též
preventivně (tzv. antibiotická profylaxe).
 V současnosti je však velkým problémem CHYBNÉ POUŽITÍ ANTIBIOTIK zvláště pak použití nevhodného antibiotika (proti rezistetnímu původci) nebo
předepsání antibiotik při léčbě virových onemocnění, jako je rýma nebo chřipka.
Při nedodržení celé předepsané dávky antibiotik, obvykle pro pacientův
subjektivní pocit zlepšení, nejsou patogenní mikroorganismy zcela zničeny.
Kromě selhání léčby vede toto chování k rozvoji antibiotické rezistence u
neúplně zahubených populací bakterií.
 Antibiotika se uplatňují i v jiných oblastech, než je medicína. Podávání malých
množství ANTIBIOTIK HOSPODÁŘSKÝM ZVÍŘATŮM zvyšuje jejich přírůstky.
 Také při kultivacích MIKROORGANISMŮ V BIOTECHNOLOGICKÝCH
LABORATOŘÍCH se používají antibiotika, a to v tkáňových kulturách či
růstových mediích za účelem potlačení nežádoucí bakteriální kontaminace (v
selektivních médiích). Často se používá kombinace několika antibiotik a
antimykotik, aby došlo k pokrytí celého spektra mikroorganismů.
PENICILLIN
 V roce 1927 Sir A. Fleming
nechal růst na miskách čistou
kolonii Staphylococcus aureus,
když mu zkontaminovala. Na
misce se objevila jasná široká
zóna okolo houbové kolonie, což
Flemingovi ukázalo, že nějaká
látka pronikala do okolí a
dovedla zabíjet nebo inhibovat
růst bakterií.
 Fleming izoloval tuto plíseň a
určil ji jako Penicillium notatum
(nyní zařazeno do P.
chrysogenum) a zjistil, že působí
proti gram-pozitivním bakteriím.
 PRŮMYSLOVÁ VÝROBA s využitím povrchové kultivace však byla
zahájena AŽ V ROCE 1941 v USA. Jednalo se o první průmyslově vyráběné
antibiotikum. V tomto případě byl použit jako produkční mikroorganismus
Penicillium notatum, kmen izolovaný již Flemingem. Pro submersní
technologii, která následovala krátce poté byl použit nový producent –
Penicillium chrysogenum, od něhož jsou odvozeny kmeny, které se
používají pro výrobu penicilinových antibiotik i v současnosti.
Kolonie Penicillium
chrysogenum
Biosyntéza β-laktamových antibiotik vychází ze 3 aminokyselin – valinu,
leucinu a α-aminoadipové kyseliny. β-laktamová antibiotika působí převážně na
G+ bakterie; polosyntetické preparáty mají též účinnost proti některým Gbakteriím. Mechanismus účinku těchto látek spočívá v inhibici syntézy buněčné
stěny katalyzované transpeptidasami. Přírodní peniciliny jako např. penicillin G
a penicillin V byly brzy nahrazeny semisyntetickými peniciliny - methicillin,
ampicillin, carbenicillin, amoxicillin, etc.
Masová produkce penicilinu v 50.- tých letech 20. století
Biosyntéza penicilinu
VÝROBA PENICILINU
Produkční kmen se UCHOVÁVÁ ve formě LYOFILIZOVANÝCH SPOR, resp.
vegetativního mycelia v ochranném mediu (např. glycerol) v hluboko
mrazících boxech (- 70 °C). Příprava inokula má několik stupňů a provádí se v
nutričně bohatém mediu při teplotách okolo 25 °C. Doba zdvojení buněk se
pohybuje okolo 6 hodin.
 PRODUKČNÍ MEDIUM obsahuje pomalu utilizovatelné C-zdroje, např.
DEXTRINY, ŠKROBY, SACHAROSU; rostlinné i živočišné oleje, ethanol. Nzdroj může zajišťovat corn-steep (produkt z kukuřičných zrn), mouka z
bavlníkových semen ap. Tyto suroviny obsahují také dostatek síry.
Nezbytná je APLIKACE PREKURZORŮ, v závislosti na typu produkovaného
penicilinu. Penicilin G (benzylpenicilin) vyžaduje fenyloctovou kyselinu v
množství cca 0,47 g/g. Dávkování se provádí kontinuálně po celý produkční
interval (kyselina je toxická). Penicilin V (fenoxypenicilin) vyžaduje
fenoxyoctovou kyselinu v množství cca 0,50 g/g.
VÝROBA PENICILINU II.
Technologické zařízení - Průmyslově byly realizovány BATCH A FED-BATCH
PROCESY. Objem: 40 až 200 m3; v současnosti i více; fermentory typu air-lift,
resp. MÍCHANÝ TURBÍNOVÝ FERMENTOR (materiál antikoro – vyšší
koncentrace Fe má inhibiční vliv).
 Regulace procesu se provádí na základě měřených veličin:

Teplota (23 až 28 °C),

Tlak (nárůst parciálního tlaku CO2 na 0,08 atm. může snížit produkci
penicilinu až o 50% ),

pH (6,5 – 7,0),

Koncentrace kyslíku (0,4 až 1,0 mmol/l/min),

Koncentrace biomasy,

Základní složení media,

Koncentrace produktu.
DOSTATEČNÉHO NÁRŮSTU BIOMASY by mělo být dosaženo BĚHEM
PRVNÍCH 40 HODIN KULTIVACE. Rozhodující podíl penicilinu je produkován
ve fázi ZPOMALENÉHO RŮSTU A FÁZI STACIONÁRNÍ (sekundární metabolit).
V určitém rozmezí velmi nízké růstové rychlosti populace platí přímá závislost
mezi touto rychlostí a rychlostí produkce penicilinu. Konečná koncentrace
biomasy je limitována parametry zařízení (kapacita aeračního zařízení,
chlazení).
VSÁDKOVÁ (BATCH) KULTIVACE – buňky rostou z inokula do požadované
density a po té je kultivační médium odstředěno a produkt je izolován
PŘÍTOKOVÁ VSÁDKOVÁ (FED-BATCH) KULTIVACE - v určité fázi růstu je
přidáno médium nebo vhodná látka pro zvýšení buněčné denzity nebo
produkce
KONTINUÁLNÍ KULTIVACE – kultura je po celou dobu kultivace udržována v
exponenciální fázi růstu. Konstantní je koncentrace média a složení
produktů.
Typický míchaný bioreaktor
(fermentor)
Množství penicilinu vyprodukovaného na jednotku objemu závisí na:

a) koncentraci biomasy (počtu buněk) - dána typem zařízení

b) specifické rychlosti syntesy penicilinu

c) délce produkční fáze.
Fermentory
IZOLACE PENICILINU
 Jednotlivé izolační kroky vycházejí z vlastností media v němž je penicilin
obsažen a z fyzikálněchemických vlastností samotného produktu.
 Penicilin (G, V) je silná kyselina, vyrábí se ve formě různých solí.
Meziprodukty biosynthesy se snadno rozkládají v kyselém prostředí. Také
penicilin G má v kyselém prostředí nižší stabilitu ve srovnání s penicilinem V.
Molekula penicilinu může být snadno štěpena β-laktamasami.
 Vlastní izolační proces se obvykle skládá z následujících kroků:
 ochlazení kultivačního media na teplotu 0 až 4 °C (zamezení rozkladu βlaktamasami)
 oddělení biomasy (mycelia) ve vakuovém rotačním filtru
 snížení pH na hodnoty 3 až 4 (rozklad vedlejších produktů)
extrakce penicilinu do organického rozpouštědla (amylacetát, cyklické
ketony ap.)
 odstranění barviv a dalších nečistot na koloně s aktivním uhlím
 zvýšení pH na 5 až 7 a následná krystalizace v podobě sodné nebo
draselné soli
 izolace, promytí a sušení krystalů
Purifikační kroky zahrnují rekrystalizaci, sterilní filtraci a sterilní
vakuovou destilaci (injekční forma – PENICILIN G, tabletová forma –
PENICILIN V).
Technologický proces
Příprava kultivačních medií, inokula a vlastní kultivační proces mají
mnoho společných rysů pro výrobu většiny antibiotik, tedy nejen βlaktamových.
Rod Penicillium
 Rod Penicillium patří mezi vláknité houby, vlákna jsou septovaná.
 Rozmnožuje se asexuálně (je řazen do pomocné skupiny Deuteromycota,
pokud je nalezeno pohlavní stadium, tak do Ascomycetes).
 Jeho zástupci mohou být isolováni ve formě spor nebo vegetativně
rostoucího mycelia zejména z půdního prostředí, ze vzduchu a z nejrůznějších
potravin.
 Většina druhů tohoto rodu patří mezi půdní saprofyty a podílí se na
kolonizaci a mineralizaci rozmanitých organických materiálů.
Tyto druhy mají velký význam při
koloběhu prvků. Některé druhy patří
mezi parazity, napadají především
suché plody (obilí a další) a podílejí
se na biodeterioraci těchto potravin.
 Za podmínek parazitického růstu
produkují mykotoxiny.
 Některá penicilia napadají i měkké
ovoce (citrusy, jablka, hrušky,
meruňky a další) a svojí činností
způsobují velké ekonomické ztráty
 Penicilia se nevyznačují žádnými specifickými růstovými podmínkami,
využívají poměrně široké spektrum zdrojů uhlíku včetně řady pentóz, což
není u hub běžné. Ze zdrojů dusíku jsou utilizovány amonné ionty, dusitany,
dusičnany, močovina i aminokyseliny.
 Penicilia jsou známa produkcí dalších sekundárních metabolitů s
antimikrobními účinky (patřící mezi polyketidy, alkaloidy, terpeny, steroly, βlaktamy deriváty šikimové kyseliny a mastných kyselin). Tyto metabolity se
však z řady důvodů nevyrábějí.
 Některé metabolity mají význam jako mykotoxiny. Produkce mykotoxinů
byla popsána u 60 – 70 druhů. Penicilia napadají především obilí, sojové
boby, fazole, kávu, rýži a kukuřici. Většina mykotoxinů vykazuje
kancerogenní účinky pro různé druhy živočichů. Mezi nejznámější patří
citrinin (Penicillium sp.), patulin (P.expansum, P. patulinum), cyklopiazonová
kyselina (P. griseofulvum, P. patulum), penicilová kyselina (Penicillium sp.),
ochratoxiny (Penicillium sp.), rubratoxin (P. rubrum) a další.
Využití zástupců tohoto rodu v technologiích:
• PRODUKCE ANTIBIOTIK – penicilin (P. chrysogenum, P. notatum, βlaktamové antibiotikum) griseofulvin (P. griseofulvum – heptaketid)
• PRODUKCE ENZYMŮ - β-1,3-glukanasa (P. italicum, P. emersonii)
• VÝROBA SÝRŮ – P. roqueforti, P. camemberti
Přírodní penicilíny trpí několika nevýhodami:
1) Jsou rozkládány v žaludku a jako výsledek toho, nejsou tak efektivní,
když jsou přijímány ústně
2) Jsou citlivé na enzym penicilinázu, která je produkována penicilinrezistentními bakteriemi, což je fakt který kriticky redukuje jejich efektivitu
3) Jejich účinnost je omezena na gram-pozitivní bakterie
GRISEOFULVIN
 Griseofulvin je jediné
účinné antifungální antibiotikum produkované
houbami. Je produkováno houbou Penicillium griseofulvum (P. urticae). Je ve
své podstatě fungistatické více než fungicidní, a protože má malou toxicitu a
schopnost akumulovat se v kůži, vlasech a nehtech po ústním podání, je
používán ke kontrole povrchových dermatomykoz. Využívá se od 50.- tých let
jako systemický fungicid proti houbovým patogenům rostlin.
 Produkce griseofulvinu je dosahována použitím media obsahujícího laktózu,
výluh
z
máčených
kukuřičných
zrn,
uhličitan
vápenatý,
dihydrogenfosforečnanu draselného, přidání chloridu draselného.
 Izolace griseofulvinu z růstového
media je podobné jako u penicilinu a je
rozpuštěno v rozpouštědle, pak může
být snadno vyčištěno a krystalizováno.
Penicillium griseofulvum – a
Kolonie na agarové misce.
CEPHALOSPORINY
 Některé kmeny r. Cephalosporium (Acremonium) produkuje směs antibiotik ,
které přináležejí k cephalosporinům.
 Podobně jako penicilíny jsou cephalosporiny produkovány v dávkované
kultuře s glukózou jako zdrojem uhlíku.
 Cephalosporiny působí i proti některým Gram-negativním bakteriím.
Cephalosporium acremonium
FUSIDANY
 Fusidová kyselina, helvolová kyselina, cephalosporin P jsou antifungální
antibiotika, které jsou založeny na základě fusidanové kostry.
 Z těchto antibiotik, pouze fusidová kyselina je používaná terapeuticky a je
efektivní když je podávána orálně proti grampozitivním infekcím, hlavně
penicilin-resistentním staphylokokům.
 Fusidová kyselina byla poprvé izolována z houby Fusarium (Fusideum)
coccineum, ale i např. z druhu Mucor ramannianus (ramycin), z houby
Cephalosporium a nyní v současnosti z Isaria kogana (Ascomycotina)
 Helvolová kyselina je produkována více druhy hub, např. Aspergillus
fumigatus a Cephalosporium caerulens.
Umbellopsis (Mucor) ramanniana
Isaria sp.
OSTATNÍ ANTIBIOTIKA PRODUKOVANÁ HOUBAMI
 Houby produkují velké množství různých látek, které mají antifungální nebo
antibakteriální aktivitu, ale pouze několik z nich má použití v medicíně.
 Mnoho z těchto látek, např. oosporein (izolovaný z Verticillium psalliotae)
jsou také mykotoxiny a mají množství dalších užitečných vlastností, např.
mohou být herbicidní nebo antiprotozoálními vlastnostmi.
 Antibiotika produkovaná houbami, které našly pouze omezené lékařské
využití zahrnují Pecilocin (Variotin) - produkovaný houbou Paecilomyces
variotii, fumagilin – produkovaný houbou Aspergillus fumigatus a siccanin –
produkovaný houbou Helminthosporium spp.
Paecilomyces variotii
Aspergillus fumigatus
Oudemansiella
mucida
slizečka
porcelánová
produkuje
antibiotikum
MUCIDIN
(mucidermin)
Má také cytostatický
účinek
S úspěchem se
používá k léčení
lidských
dermatomykóz
ANTIVIROVÉ LÁTKY
 Gliotoxin (produkce některé druhy rodů Aspergillus, Penicillium,
Trichoderma) a chaetomin (produkce Chaetomium cochliodes), inhibují
multiplikaci RNA virů v kulturách a in vivo. Jsou účinné proti různým virůmpolioviry, a některé chřipkové viry.
 Funikulosin – izolovaný z Penicillium funiculosum, inhibuje oba DNA a RNA
viry
Penicillium funiculosum
PROTINÁDOROVÉ PŘÍPRAVKY Z HUB
 Okolo 300 protinádorových látek bylo izolováno z mikroorganismů, z nich ¾
jsou získány z aktinomycet, 11 % z bakterií a 13 % z hub.
 Ze 43 protinádorových látek izolovaných z hub, 23 pochází z nedokonalých
hub, 15 ze skupiny Basidiomycotina a 5 ze skupiny Ascomycotina. V
současnosti těchto látek bude patrně daleko více (okolo 200 protinádorových)
 Mykotoxiny jako např. aflatoxin B1, produkovaný houbou Aspergillus flavus,
ačkoliv jsou karcinogenní, tak mají paradoxně slabý protinádorový efekt.
 Sterigmatocystiny, produkované Aspergilus versicolor, jsou také účinné
proti indukované myší leukémii. Další protinádorové účinky mají látka
auguidin (Fusarium), glykoproteinový komplex (Candida), fumigalin
(Aspergillus fumigatus).
 Ze skupiny Basidiomycotina byly izolovány protinádorové látky z těchto
druhů: Coriolus consors, C. versicolor, Schizophyllum commune, Lentinus
edodes (lentinan), Ganoderma lucidum, Tremella fuciformus, Cordyceps
ophioglossoides, Pleurotus ostreaus, Sclerotinia glucanicum, Inonotus
obliquus (čága).
Housenice cizopasná (Cordyceps
ophioglossoides
Aspergilus versicolor
Coriolus consors syn. Irpex
consors – bránovitka
Schizophyllum commune
Klanolístka obecná
Coriolus versicolor
Outkovka pestrá
Tremela fuciformis rosolovka
řasotvará
Ganoderma lucidum
Lesklokorka lesklá
Pleurotus ostreatus Hlíva ústřičná
Lentinus edodes
Houževnatec jedlý
IMMUNOSUPRESIVA - CYKLOSPORIN
 Již 50 let se transplantují různé orgány. Pro
úspěšnou transplantaci je důležitá imunitní
odpověď a odmítnutí orgánu je nevítané.
 V minulosti byla používána různá imunosupresiva
– jako azathioprin a kortikosteroidy. Naneštěstí tyto
látky mají nepříjemné vedlejší účinky pokud jsou
používány příliš často a ve velké míře.
Tolypocladium inflatum (nyní nazývané
Tolypocladium niveum), produkuje látku
(cyklopeptid) se zajímavou antifungální aktivitou.
Další producenti Trichoderma polysporum a
Cylindrocarpon lucidum
 Cyklosporin dovede selektivně inhibovat dělení
lymfocytů (hlavně T-).
 Cyklosporiny jsou nepochybně nejlepší
imunosupresiva doposud objevené, které v
moderní transplantační medicíně značně snižují
riziko odmítnutí orgánu.
 Naštěstí, cyklosporin působí efektivně i proti
revmatické artritidě, jelikož chronický zánět v této
situaci je vlastně poruchou imunity.
Tolypocladium (inflatum)
niveum, houba
produkující Cyklosporin,
je anamorfou druhu
Cordyceps subsessilis
GLIOTOXIN
 Gliotoxin je sekundární metabolit produkovaný houbou Aspergillus
fumigatus
 Makrofágy (typ bílých krvinek) – jsou „požírači“ v imunitním systému
člověka, které pohlcují nepatřičné částice jako jsou bakterie. Kontaminace
touto houbou zabraňovalo připojení i fagocytózu.
 Izolovaná látka se nazývá gliotoxin, a tato látka zabraňuje jistým imunitním
buňkám množit se
 Gliotoxin je imunotoxin, látka která omezuje činnost imunitního systému.
 Gliotoxin podobně jako cyklosporin nachází využití v transplantačních
operacích nebo transplantacích kostní dřeně.
NÁMELOVÉ ALKALOIDY
 Námel neboli sušené sklerocium PALIČKOVICE NACHOVÉ (Claviceps
purpurea), napadající žito, znalo lidstvo již ve starověku. Nejprve spíše v
souvislosti s jeho toxickými účinky. Obilí obsahující námelová zrna, bylo
PŮVODCEM ROZSÁHLÝCH EPIDEMIÍ, které si vyžádali často desetitisíce
životů.
 Ve středověku byly extrakty z námele používány k VYVOLÁNÍ PORODŮ a k
regulaci poporodního krvácení.
 První chemicky čistá sloučenina byla z námele izolována v roce 1875
(ergotinin). V roce 1918 byl izolován klinicky využitelný ergotamin. V
polovině minulého století byly položeny základy průmyslové produkce
námelových alkaloidů.
ROD CLAVICEPS
 Rod Claviceps je známý především produkcí námelových alkaloidů.
Námelové alkaloidy jednoduššího strukturního provedení jsou produkovány i
dalšími houbami (r. Aspergillus, Penicillium) a rostlinami (Convolvulaceae).
Claviceps patří mezi askosporogenní houby, je homothalická. Tento rod je
representován přibližně 50 druhy, ovšem složitější námelové alkaloidy
(amidy lysergové kyseliny) jsou syntetizovány pouze druhy C. purpurea a C.
paspali. K produkci těchto látek dochází i v přírodě, a to za podmínek
parazitického růstu houby na hostitelské rostlině (obilniny, traviny, při cílené
polní produkci je využíváno žito).
Námel (sklerocium)
Claviceps purpurea Paličkovice
nachová
Stromata rostoucí ze sklerocia
Perithecia ve stromatu
ŽIVOTNÍ CYKLUS PALIČKOVICE NACHOVÉ
Asexuální fáze růstu této houby začíná PŘENESENÍM SPOR (konidie,
askospory) do KVĚTNÍCH ORGÁNŮ ROSTLINY. Spory klíčí nejprve v
promycelium, posléze se vytvoří SFACELIOVÉ MYCELIUM, které se intenzivně
větví a jeho vzdušné hyfy diferencují v konidiofory. Na konidioforech se
vytváří velké množství spor, konidií, které květ zcela vyplní.
V podmínkách parazitického růstu, v době, kdy SFACELIE vyčerpá květní
orgány hostitele, ODŠKRTÍ SEMENÍK OD CÉVNÍHO SVAZKU ústícího do
původního květu a umístí se místo něho na ústí floému.
Floémová šťáva měla sloužit k výživě diferencující obilky. Zatímco
doposud rostla houba na úkor vnitřních květních orgánů hostitele, stává se
od tohoto okamžiku novou ŽIVNOU PŮDOU TRVALÝ PŘÍTOK FLOÉMOVÉ
ŠŤÁVY.
Tato zásadní změna ve výživě je hlavní PŘÍČINOU VZNIKU SKLEROCIA.
Sklerocium se vytváří z konidií, které neklíčí ve sfaceliové mycelium, ale
zvětšují svůj objem. Sklerocium představuje z fyziologického hlediska
KLIDOVÉ STADIUM mezi dvěma obdobími aktivního růstu.
 Sklerocium (není-li sklizeno) se NA KONCI LÉTA UVOLNÍ, přečká zimu v půdě
a na jaře (nejdéle po pěti měsících) DIFERENCUJE VE STROMA. Stroma se
skládá ze stonku a z hlavy, v níž je ponořeno PERITHECIUM S ASKY
obsahujícími askospory. Vyvinuté askospory jsou z aska uvolňovány do
vzduchu právě v době, kdy začínají traviny kvést a životní cyklus se může
opakovat.
Životní cyklus
Paličkovice nachové
SYMPTOMY OTRAVY
1) GANGRENÓZNÍ ERGOTISMUS. Tento syndrom začíná pocitem
vyčerpanosti a chladnutím či ztrácením citu v končetinách, potom
následují pocity pálení v končetinách (svatý oheň). Postupně
NAPADENÉ ČÁSTI OCHRNUJÍ. Končetiny a chodidla zčernávají a
mumifikují. Tyto suché gangrény se šíří dále a prsty oběti a dokonce i
celé končetiny (podle literárních údajů) odpadávají.
2) KŘEČOVITÝ ERGOTISMUS. Zde je napadený hlavně centrální nervový
systém. Symptomy zahrnují pocity mravenčení, a i poškození mozku je
běžné. V nejzávažnějších případech má pacient epileptiformní křeče.
Úmrtnost je mezi 11-60%.
Může ležet jako mrtvý 6 - 8 hodin a
pak trpět kožní anestesií, paralysou
horních končetin, záškuby paží,
deliriem a ztrátou řeči. Zemřít může
třetí den po nástupu příznaků.
Zvířata postižená konvulsivním
ergotizmem se mohou stát divokými,
řvou, úzkostně rámusí, následně
pojdou.
Onemocnění bylo v minulosti často označováno jako oheň sv. Antonína (v
souvislosti s konvulsivní formou). Poslední popsaný případ ergotismu byl ve
Francii v roce 1950.
Příznaky jsou způsobovány 2 hlavními složkami (různými
chemikáliemi). (1) účinek na svaly: alkaloidy ovlivňující hladkou
svalovinu a způsobují vasokonstrikci. (2) účinek na CNS: aminy kys.
lysergové, hlavně derivát diethylamid kyseliny lysergové (LSD), má
velký potenciál jako halucinogen.
NÁMELOVÉ ALKALOIDY
 Hlavní efekt těchto látek je sympatetický efekt mající za následek inhibici
hormonu adrenalinu, noradrenalinu a sklerotinu, což způsobuje stažení cév, a
druhý účinek je na dělohu pomocí kontrakcí hladké svaloviny. Ale největší
farmakologický efekt pochází z přítomnosti diethyamidu kyseliny lysergové
(LSD), který má účinky na nervovou soustavu.
 Produkce ergotových alkaloidů. Původně byly ergotové
produkovány z námele, který přirozeně rostl na travách.
alkaloidy
 Nyní jsou ergotové alkaloidy produkované
v kulturách. Claviceps
fusiformis, Claviceps purpurea a Claviceps paspali jsou hlavními zdroji
námelových alkaloidů. Nyní je možné i mnoho námelových alkaloidů
syntetizovat, ale přirozená produkce houbami zůstává stále nejekonomičtější
způsob produkce.
 Produkce alkaloidů houbou Claviceps
sklerocií.
probíhá pouze během růstu
CHARAKTERISTIKA NÁMELOVÝCH ALKALOIDŮ
 Chemicky patří mezi alkaloidy tryptofanového typu. Základní část
molekuly je tvořena tetracyklickou strukturou zvanou ergolin. Existují 4
hlavní strukturální skupiny: klavinové alkaloidy, lysergové kyseliny,
jednoduché amidy lysergové kyseliny, peptidy lysergové kyseliny.
klaviny
D-lysergová kyselina
amidy lyserogové kyseliny
peptidy lysergové kyseliny
 Biologická aktivita námelových alkaloidů je SPOJENA S ČINNOSTÍ
NEURORECEPTORŮ A NEUROPŘENAŠEČŮ.
 Ergolinový skelet má řadu strukturních podobností právě s noradrenalinem,
dopaminem nebo serotoninem. Aktivita se projevuje jednak na úrovni
modulací psychického stavu, jednak na úrovni činnosti hladkého svalstva.
PRŮMYSLOVÁ PRODUKCE NÁMELOVÝCH ALKALOIDŮ
 Produkčními mikroorganismy jsou Claviceps purpurea tvořící při
patogenním růstu tmavě fialová sklerocia obsahující převážně peptidové
deriváty a Claviceps fusiformis – C. paspali tvořící šedá sférická sklerocia
obsahující převážně jednoduché amidy kyseliny lysergové a klaviny.
POLNÍ PRODUKCE
 INFEKCE obilí se PROVÁDÍ SUSPENZÍ SPOR. Rod Claviceps produkuje
jednak konidie (povrchová nebo submersní kultivace) jednak arthrospory
(submersní kultivace). Infekce probíhá v době uvolnění klasu z posledního
listu s využitím speciálních strojů. V rozmezí asi 4 TÝDNŮ PROBĚHNE
vegetativní část životního cyklu této fytopatogenní houby. Výsledkem jsou
námelová zrna, která se uvolňují z klasů. V tomto období se provádí tzv.
sklizeň, pro kterou byly opět vyvinuty speciální zemědělské stroje. Výtěžek
bývá asi 200 kg námele/ha.
 Tento typ produkce lze provádět bez hlubších znalostí regulace syntézy
alkaloidů, protože celý proces probíhá v PODMÍNKÁCH PŘIROZENÝCH PRO
PATOGENA. Nevýhodou je vliv podnebí a počasí na výrobní proces.
REAKTOROVÉ TECHNOLOGIE
 Vzhledem k tomu, že produkce alkaloidů probíhá v odlišném fyziologickém
stavu mikroorganismu, je nezbytné v průběhu kultivace takovou změnu
navodit. Kromě změny a optimalizace zastoupení jednotlivých nutrientů je
možné tohoto stavu dosáhnout výrazným zvýšením osmotického tlaku media.
 Kultivační proces trvá 2 až 3 týdny. Zařízení musí splňovat parametry pro
dlouhodobé udržení sterility. Produkční kmeny snadno ztrácí schopnost
hyperprodukce alkaloidů. Jsou citlivé k mechanickému stresu a celkovému
designu fermentorů.
 Claviceps můžeme kultivovat na minerálním médiu obsahujícím glukosu,
amonné ionty (nebo močovinu, glutamát, aspartát, dusičnany jsou
využívány zřídka) a anorganické sole.
 Dále je vyžadována přítomnost biotinu a zvýšená tenze oxidu uhličitého.
 Růst probíhá optimálně při teplotě blízké 30 °C, produkce alkaloidů v
rozmezí teplot 21 – 24 °C, hodnota pH 5 – 6.
IZOLACE
 Výchozí materiál (sklerocium, mycelium) se převede do alkalického
vodného roztoku a dále se provádí extrakce organickým rozpouštědlem.
 Extrakční operace a zahuštění ve vakuové odparce se používají pro další
přečištění alkaloidů. Krystalizaci je možné provádět z methanolového
roztoku.
 Paspalová kyselina se transformuje na lysergovou kyselinu v prostředí
hydroxidu amonného za zvýšené teploty.
TOXICKÉ HOUBY
 V současnosti již otravy námelovými alkaloidy nemají takovou váhu, ale
stále dochází k mnoha otravám, které si sami způsobují nezodpovědní
sběrači hub. K některým otravám dochází díky záměně jedlých hub za
jedovaté druhy, jiný druh otrav si lidé způsobují sami konzumací hub s
halucinogenními účinky.
CYKLOPEPTIDY HEPATONEFROTOXICKÝ SYNDROM
 Nejznámějšími cyklopeptidovými látkami jsou amatoxiny, α-amanitin a βamanitin. Oba jsou teplotně stabilní a zůstávají dokonce i po intenzivním
vaření.
 Symptomy se objevují 8-15 hodin po konzumaci a jsou spojeny s
gastoenterickými problémy, jako jsou bolesti břicha, zvracení, nevolnost,
akutní průjem a intenzivní žízeň. Toto stadium je následováno vymizením
příznaků, ale třetí den nastoupí obrovské poškození jater, koma,smrt.
 Tyto toxiny produkují např. Amanita phaloides, Amanita virosa. I další druhy
hub produkují tento druh toxinů –druhy r. Lepiota a Galerina unicolor.
Amanita virosa,
Muchomůrka jízlivá
Amanita phalloides,
Muchomůrka zelená
GYROMITRIN HEPATONEFROTOXICKÝ SYNDROM
 Monomethylhydrazin je produkován hydrolýzou gyromitrinu, který je
nacházen v houbách r. Gyromitra (ucháč).
 Přeměna je závislá na pH hodnotě a je určována kyselostí žaludku.
 Jed je nestabilní teplotně a jde ho odstranit vařením a následným vymytím
ve vodě.
 První symptomy jsou bolesti břicha a objevují se 6 hodin po požití, jsou
následovány napadením jater a ledvin.
 Monomethylhydrazin je také toxin centrální nervové soustavy a je to toxin
charakterizovaný vysokou horečkou.
 Tento toxin je obsažen v druhu
Gyromitra esculenta – ucháč obecný.
Gyromitra esculenta – ucháč
obecný
ORELANINY NEFROTOXICKÝ SYNDROM
 Orelaniny je název pro skupinu látek - orellaniny, grzymalin, kortinarin a
dva benzoniny.
 Všechny tyto látky jsou termostabilní a odolávají vysušení.
 Je zde charakteristické zpoždění v nástupu symptomů po požití hub. První
symptomy jsou bolení břicha, následováno bolestí svalů, bolestí zad a
bolestmi hlavy. K selhání ledvin dochází do 7-17 dnů od požití.
 Většina těchto otrav je způsobena požitím pavučinců – r. Cortinarius.
Cortinarius orellanoides
Pavučinec plyšový
HAEMOLYTICKÉ OTRAVY
 Haemolytické toxiny ničí červené krvinky a tak způsobují anémii.
Hemolytické toxiny jsou teplotně labilní a jsou ničeny vařením. Jsou
produkovány druhem Amanita rubescens a Amanita vaginata, Lepista nuda
Amanita vaginata – muchomůrka
pošvatá
Amanita rubescens muchomůrka růžovka
Čirůvka fialová – Lepista nuda
KOPRINOVÉ TOXINY
ANTABUSOVÝ SYNDROM
 Některé druhy r. Coprinus jsou jedlé a chutné a mohou způsobovat toxické
symptomy, pokud jsou konzumované s alkoholem.
 Symptomy zahrnují kovovou příchuť v ústech, zčervenání obličeje a krku,
pálení na hrudi, nevolnost, zvracení a průjmy. Tyto symptomy trvají asi 2 hod
ale mohou se vracet, pokud je alkohol konzumován v následujících 48
hodinách.
 Toxická látka se jmenuje koprin a je nacházena v druhu Coprinus
atramentarius a Pholiota squarrosa.
Coprinus atramentarius
Hnojník inkoustový
Pholiota squarrosa – šupinovka kostrbatá
PSYCHOTROPNÍ TOXINY HALUCINOGENNÍ SYNDROM
 Tyto toxiny napadají centrální nervový systém a způsobují halucinace a
delirium.
Muscimol, ibotenová kyselina a muscazon
 Muscimol je nejúčinnější z nich. Tyto toxiny jsou omezeny na druhy r.
Amanita (Amanita muscaria, Amanita pantherina). Příznaky zahrnují ospalost
a někdy i koma.
Amanita muscaria –
muchomůrka červená
Amanita pantherina – muchomůrka tygrovaná
INDOLOVÁ SKUPINA TOXINŮ PSILOCIN A PSILOCYBIN
 Tyto toxiny obsahují houby, označované jako rekreační drogy. - Psilocybe
semilanceata, Psilocybe cubensis a druhy r. Panaeolus.
Psilocybe semilanceata
Lysohlávka kopinatá
Tato houba se stala
velmi oblíbeným
druhem
psilocybinových hub
pro indoor pěstování.
Její kultivace je totiž
poměrně nenáročná,
snadnější i než
pěstování žampionů a
je možné ji pěstovat i
podomácku.
Psilocybe cubensis- Lysohlávka kubánská
Panaeolus subbalteatus Kropenatec lemovaný
HORDENIN, N-METHYLTYRAMIN A
TYRAMIN
 Některé houby skupiny polyporales obsahují tyto alkaloidy, které způsobují
nevolnost a symptomy spojené s účinkem na centrální nervový systém jako
závratě.
 Tyto toxiny se nacházejí např. v druhy Laetiporus sulphureus a Meripilus
giganteus.
Laetiporus sulphureus – sírovec
žlutooranžový
Vějířovec obrovský - Meripilus
giganteus
MUSKARINOVÉ TOXINY MUSKARINOVÝ SYNDROM
 Alkaloid muskarin způsobuje pocení asi do 2 hodin po požití, spolu s
nevolností a průjmy. Rozmazané vidění se také vyskytuje. Podává se
protilátka atropin.
 Tyto toxiny jsou nacházeny v druzích Amanita muscaria, Amanita
pantherina, Clitocybe dealbata a druzích r. Inocybe.
Clitocybe dealbata - strmělka odbarvená
Vláknice Patouillardova,
Inocybe patouillardii
AFLATOXINY
Aflatoxiny jsou mykotoxiny produkované toxigenními kmeny Aspergillus
flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř
100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G), A.
argeninicus a A. nomius
Aflatoxiny mohou být akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a
teratogenní
Při vysokých hladinách se toxicita projeví za 3-6 hodin jako nekróza
hepatocytů, poškození srážlivosti a kapilární fragilitou. To může vést k
širokým hemoragiím a případné smrti , zevně příznaky otravy
doprovázené poškozením jater a žloutenkou
Aspergillus flavus
FUMONISINY
 Skupina toxických metabolitů produkovaná primárně druhy Fusarium
verticilloides, F. proliferatum a dalšími příbuznými druhy, které napadají
kukuřici.
 Fumonisin B 1 – je primární hepatotoxin a karcinogen. Potvrzena role
fumonisinu FmB1 v etiologii rakoviny jícnu v oblastech jižní Afriky, Číny,
kde je častá kontaminace obilí.
 ZEARALENONY Důležitými mykotoxiny
druhů rodu Fusarium
 Způsobují syndromy
hyperestrogenismu u
vepřů, hovězího dobytka
a drůbeže.
Fusarium verticilloides
(syn. F. moniliforme)
TRICHOTECENY (TCTCs)
 Produkovány častými kontaminátory kukuřice, pšenice, ječmene rýžehlavně rod Fusarium, dále rody Myrothecium, Trichoderma,
Trichothecium, Cephalosporium, Stachybotrys.
 Jejich toxický účinek zahrnuje mnoho orgánů – trávicí, vylučovací,
nervovou, cévní soustavu, ovlivňuje imunitu
Trichotheceny jsou velmi odolné vůči inaktivaci, proces zpracování obilí je
neúčinný
 Nejznámějším TCTC je deoxynivalenol (DON) – produkován Fusarium
graminearum a F. culmorum. Způsobuje anorexii a zvracení.
Trichothecium
STERIGMATOCYSTIN
Hepatotoxický a karcinogenní mykotoxin produkovaný druhy Aspergillus
flavus, A. nidulans , A. nomius, A. parasiticus, A. versicolora, Penicillium
luteum. Nachází se v rýži, kukuřici, ječmenu, ale i kávových zrnech a
sýrech.
Rody Aspergillus a Penicillium produkují mnoho dalších toxinů – gliotoxin,
nitropropionová kyselina, patulin, ochratoxin, penicilinová kyselina,
citrinin, cyklopiazonová kyselina, rubratoxiny
DALŠÍ ZPŮSOBY VYUŽITÍ HUB V LÉKAŘSTVÍ
TRANSFORMACE STEROIDŮ HOUBAMI
 Ve 40-tých letech minulého století bylo zjištěno, že kortikosteroid kortizon
a adenokortikotrofní hormon (ACTH) mohou být využity pro svůj velký
účinek na ošetření některých lidských revmatických artritid.
 Z praktického hlediska nejdůležitější transformace steroidů je syntéza
ADRENOKORTIKOIDNÍCH HORMONŮ.
 Příklady hub, které jsou schopny transformace sterolů: Rhizopus arrhizus,
Fusarium solani, Curvularia lunata, Aspergillus flavus, Penicillium
lilacinum.
Curvularia lunata
BIOTRANSFORMACE DALŠÍCH FARMAKOLOGICKY AKTIVNÍCH
LÁTEK
 Nejen steroidy lze pomocí hub transformovat na jiné produkty, ale i další
látky
 Příklady takovýchto transformací: Protirakovinná látek jako např. akronin z
r. Vinca může být transformována za pomocí houby Aspergillus na mémě
toxické, ale stále aktivní deriváty.
 Použití hub k těmto účelům přináší ekonomicky významné látky, které by
bylo buď náročné nebo velmi nákladné produkovat chemicky
LÉKAŘSKÉ APLIKACE HOUBOVÝCH ENZYMŮ
 Příklady využití enzymů z hub v lékařství: Lipázy produkované druhem
Aspergillus oryzae a Candida lipolytica jsou používány ke kompenzacím
deficiencí lidských pankreatických lipáz
 Houbové laktázy se přidávají k mléku, aby tam proběhla reakce, která
snižuje intoleranci k mléku.
 Lidé, kterým chybí enzym β-galaktozidáza také potřebují tento enzym
(produkovaný houbami) dostávat.
 Urát-oxidáza, produkována houbou Aspergillus flavus je používá k léčení
dny.
ROZMANITÉ VYUŽITÍ HUB V LÉKAŘSTVÍ
 Hydrolyzované a očištěné levany produkované r. Aspergillus a kvasinkami
jsou používány jako náhrada krevní plasmy.
 Nejnovější patenty dokonce popisují použití mycelia hub jako záplaty na rány
(Mucor mucedo a Rhizomucor meihei)
 Kvasinky produkují malé množství selenomethioninu, který je používán pro
radioizotopové skenování pankreasu.
 Antibiotikum (toxin) patulin, které je produkováno Penicillium patulum má
antispasmotickou aktivitu, a může blokovat kontrakce kolonu.
 Griseofulvin izolovaný z P. griseofulvum může pomáhat pacientům s
anginou pektoris
Pythium oligandrum – léčení dermatomykoz
CHYTRÁ HOUBA
 Houbový organizmus Pythium oligandrum proniká svými vlákny do
buněk parazita (plísně nebo kvasinky) a čerpá z něho pro svoji výživu
potřebné látky. Na podkladě výživové a prostorové kompetice tak vytlačuje
z prostorů patogenní kožní houby. Podstatou účinnosti přípravku je
produkce enzymů a parazitování na plísňových chorobách.
 Po splnění tohoto úkolu ( vyčerpání
parazita) mizí z této lokality ( lidské tělo
není pro něho přirozené prostředí a není
schopen se v tomto prostředí
adaptovat) a uvolňuje prostor pro
znovuosídlení tzv. normální mikroflórou.
 Velmi dobře působí i na neduhy, které
nejsou vyvolány houbami jako
například lupenka, atopický ekzém,
nebo živé rány diabetiků, kde působí
převážně enzymatickou formou.
http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/namel.php