CMV-IgA-ELA Test PKS medac Český 0123

CMV-IgA-ELA Test PKS medac
Český

0123
112-PKS-VPCZ/010512
VÝROBCE:
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Fehlandtstraße 3
D-20354 Hamburg
MARKETING:
medac
Gesellschaft für klinische
Spezialpräparate mbH
Geschäftseinheit Diagnostika
Theaterstraße 6
D-22880 Wedel
Tel.:
Fax:
++49/ 4103/ 8006-351
++49/ 4103/ 8006-359
ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK:
Tel.:
Fax:
++49/ 4103/ 8006-111
++49/ 4103/ 8006-113
112-PKS-VPCZ/010512
CMV-IgA-ELA Test PKS medac
Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování
na průkaz protilátek IgA proti cytomegalovirus (CMV)
Katalogové číslo: 112-PKS
POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO
ÚVOD
Cytomegalovirus
(CMV)
patří
do
skupiny
lidských
patogenních
herpetických vírů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyhle
viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat
latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít
k reaktivaci viru.
Infekce cytomegalovirem probíhají u imunokompetentních osob obyčejně
nenápadně. U imunosupresivních osob (např. pacienti po transplantaci,
lidé infikovaní virem HIV, tumoroví pacienti nebo novorozenci) se však
pozorují závažně symptomy nejrůznějšího druhu.
Obyvlášť důležitý je CMV jako častý agens prenatálních infekcí. Tyto
infekce mohou způsobit závažné poškození dítěte, přičemž nelze
vyloučit pozdní poruchy také u dětí narozených bez symptomů.
Specifické protilátky IgA proti CMV byli detekovány v sérech pacientů
po transplantaci orgánů a korelovali s nálezem specifických protilátek
IgM proti CMV. Protilátky IgA proti CMV mohou být z toho důvodu
považovány za markry akutních infekcií. Kombinace detekce specifických
protilátek IgA proti CMV společně s průkazem antigenu a průkazem
specifických
protilátek
IgM
proti
CMV
vedla
u
pacientů
po
transplantaci orgánů ke zvýšení specifity diagnózy infekce CMV.
112-PKS-VPCZ/010512
1
PRINCIP TESTU
Mikrotitrační deštička je pokryta
protihumánním IgA.
Frakce IgA ze vzorek séra se váže
na mikrotitrační deštičku.
Protilátky proti anti-CMV-IgA se
vážou na peroxidázou konjugované
CMV-IgA-ELA (AG = antigen, P =
peroxidáza).
Inkubace se substrátem TMB (*).
Reakce
se
zastaví
přidáním
kyseliny
sírové.
Absorpce
se
odčítá foto-metricky.
Výhody testu

Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky
způsobené revmatoidními faktory.

Nedochází k blokování protilátek IgA vysokým titrem IgG.

Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat
krok pipetování, při kterém dochází ke změnám barev.

Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu.

Testy lze automatizovat pro otevřené zařízení ELISA.
112-PKS-VPCZ/010512
každý
2
OBSAH SOURAVY
Katalogové číslo: 112-PKS
1.
MTP
Mikrotitrační destička: 12 proužků po 8 jamkách (označená jako CMA,
s desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno
tvaru písmena U, pokrytá kozími protilátkami proti IgA, BSA a
indikátorem pH, připravená k použití.
2.
CONTROL Negativní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum,
připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClinTM 300 a gentamycin
sulfát.
3.
CONTROL +
Pozitivní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum,
připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClinTM 300 a gentamycin
sulfát.
4.
WB
Promývací roztok: 1 lahvička s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), pH
7,2 - 7,4, obsahuje ProClinTM 300.
5.
VIR-DIL
Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH
7,2 - 7,4, připravený k použití, obsahuje ProClinTM 300.
6.
ANTIGEN
CMV-IgA-ELA (enzymem označený antigen): 4 lahvičky každá s obsahem
po 5,0 ml, lyofilizovaný, zbarvený žlutě, obsahuje FKS, konjugovaný
HRP.
7.
TMB
Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravený k použití.
8.
STOP
Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem každá po 11 ml,
0,5 M kyselina sírová (H2SO4), připravený k použití.
112-PKS-VPCZ/010512
3
1.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
Materiál/Reagencie
Zkušební souprava
Stav
Skladování
neotevřená 2...8 °C
Mikrotitrační destička
otevřená
Kontroly
Promývací roztok
Roztok na ředění vzorků
CMV-IgA-ELA
Substrát TMB
Roztok na zastavení
reakce
2...8 °C
v sáčku
s desikantem
otevřené
2...8 °C
Zředěný
2...8 °C
otevřený
2...8 °C
rozpuštěný 2...8 °C
otevřený
2...8 °C
otevřený
2...8 °C
Stabilita
do uplynutí
použitelnosti
6 týdnů
6 týdnů
6 týdnů
6 týdnů
5 dní
6 týdnů
do uplynutí
použitelnosti
Nepoužívejte reagencie po uplynutí data jejich použitelnosti.
2.
DALŠÍ
POŽADOVANÉ REAGENCIE
A MATERIÁLY
2.1. Aqua ad iniectabilia (redestilovaná). Použití pouze deionizované
vody může negativně ovlivnit výsledek testu.
2.2. Mikropipety pro potřebné objemy.
2.3. Čisté skleněné nádoby
promývacího roztoku.
na
ředění
2.4. Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních destiček
multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISA).
(např.
2.5. Inkubátor pro 37
2.6. Fotometr na
620 - 650 nm.
3.
o
nebo
nádoby
z umělé
hmoty
C.
mikrotitrační
destičky
s filtry
na
450
nm
a
PŘÍPRAVA REAGENCIÍ
Před zahájením testu vytemperujte všechny
teplotu, aby nedocházelo ke kondenzaci.
komponenty
na
pokojovou
Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek.
112-PKS-VPCZ/010512
4
3.1. Mikrotitrační destička
Hliníkový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření
opět
pevně
uzavřít.
Skladování
a
životnost
nepoužitých
mikrotitračních jamek jsou uvedeny pod bodem 1.
Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín.
Rovněž se objevující zeleno-hnědé skvrny v jamkách jsou způsobené
zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a
výsledek testu.
3.2. Promývací roztok
Zmíchejte jednu objemovou
(10x) s devíti částmi
koncentrátu roztoku (10x)
jamek budete potřebovat
roztoku.
část koncentrátu promývacího roztoku
aqua ad iniectabilia (např. 50 ml
s 450 ml aqua ad iniectabilia). Na 8
10 ml zředěného roztoku promývacího
Krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit zahřáním
(max. na 37°C) nebo promícháním při pokojové teplotě.
3.3. CMV-IgA-ELA
Lyofilizát zřeďte s 5,0 ml roztoku na ředění vzorků. Uzavřená
lahvička se musí lehce potřást, aby se částice z uzávěru dostali
do roztoku.
Po rozpuštění je CMV-IgA-ELA zbarvený žlutě a hotový k použití.
Reagencie jednoho testu (mikrotitrační destička, kontroly, CMV-IgAELA) se nesmí zaměňovat s reagenciemi jiných šarží. Oproti tomu se
roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a roztok na
zastavení reakce u všech virologických testů firmy medac mohou
principiálně zaměňovat.
Reagencie jiných výrobců se obecně v tomto testu nesmí používat.
Pouze při přesném dodržení
reprodukovatelné výsledky.
4.
pracovních
předpisů
obdržíte
validní
a
VZORKY
4.1. Test je vhodný pro vzorky séra. Vzorky pacientů uchovávejte
maximálně 7 dní při teplotě 2–8 °C. Delší uchovávaní se musí
provádět při teplotě ≤ -20 °C. Vzorky se nesmí opakovaně
zamrazovat a odmrazovat.
4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu séra např.
deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminované
mikroorganismami ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty.
112-PKS-VPCZ/010512
5
4.3. Séra rozřeďte v poměru 1:100 roztokem na ředění
určení titru se vzorky mohou dále libovolně ředit.
vzorek.
Pro
5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU
5.1. Otevřete obal mikrotitrační deštičky a vyberte požadovaný počet
mikrotitračních proužků (viz 3.1.).
Mikrotitrační
promývat.
deštičky
jsou
připraveny
k
použití
a
nemusí
se
5.2. Jamku A1 nechte prázdnou (viz 6.A.) pro určení pozadí. Do jamek
na destičce napipetujte 50 µl zředěných vzorek, v duplikátech
negativní kontrolu a pozitivní kontrolu.
Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v
jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé jamce nezbarví,
znamená to, že do ni nebyl napipetován vzorek nebo kontroly.
V případě potřeby se může mikrotitrační deštička před zpracováním
ponechat ve vlhké komoře maximálně 30 minut při pokojové teplotě
nebo při 2 - 8 °C maximálně po dobu 60 minut.
5.3. Inkubujte deštičku 60 minut ( 5 minuty) při 37
komora nebo inkubační fólie).
o
C (± 1
o
C) (vlhká
5.4. Rozpusťte CMV-IgA-ELA (viz 3.3).
5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 μl
promývacího roztoku. Po dobu promývaní dbejte na to, aby se jamky
pořádně naplnily. Po promytí vyklepete mikrotitrační deštičku na
filtračním papíru.
Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě !
5.6. Do každé
žlutě).
jamky
napipetujte
(kromě
A1)
CMV-IgA-ELA
(zbarvený
Při manuálním zpracování testu napipetuje do každé jamky 50 μl
konjugátu.
Upozornění:
Při
práci
na automatizovaných
přístrojích
je
potřebné
naprogramovat 60 μl pro každou jamku, protože v inkubačních
komorách těchto zařízení dochází k intenzivnímu vypařování.
112-PKS-VPCZ/010512
6
V rámci validace testu pro automatické zpracování se ukázalo, že
tento test je v podstatě vhodný také pro automatické zpracování.
Nicméně doporučujeme verifikovat jeho kompatibilitu s přístrojem,
na kterém se bude pracovat.
5.7. Znovu inkubujte 60 minut ( 5 minuty) při 37
komora nebo inkubační fólie).
o
C (± 1
o
C) (vlhká
5.8. Po inkubaci promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5.).
5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 µl substrátu TMB a
inkubujte 30 minut ( 2 minuty) ve tmě při teplotě 37 °C (± 1 oC)
vlhká komora nebo inkubační fólie). Pozitivní vzorky se zbarví
modře.
5.10.Přidáním 100 µl roztoku na zastavení reakce do každé jamky
(včetně A1) se reakce zastaví. Modré zbarvení vzorek se změní na
žluté.
Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a
zkontrolujte, zda-li v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu.
Odečtení je nutno
zastavení reakce.
provádět
během
15
minut
112-PKS-VPCZ/010512
po
přidání
roztoku
na
7
5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU
Prázdná
jamka
(A1)
Negativní
kontrola
Pozitivní
kontrola
Vzorky
-
50 μl
-
50 μl
-
50 μl
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Vzorky
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 μl promývacího
roztoku
CMV-IgA-ELA
50/60 μl*)
-
50/60 μl*)
50/60 μl*)
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 μl promývacího
roztoku
50 μl
Substrát TMB
50 μl
50 μl
50 μl
Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 °C
Roztok na zastavení
reakce
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. délka
620 - 650 nm)
*) manuální/automatický postup (viz 5.6.)
6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA)

Fotometrické vyhodnocení se provází při
(referenční vlnová délka 620 - 650 nm).

Od všech hodnot OD

Kritéria validity
- Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,150.
- Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,600.
vlnové
délce
450
nm
odečtěte OD pozadí (A1 jamka).
Pokud kriteriá validity najsou splnena, musí se test opakovat.

Cut-off = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140

Šedá zóna = cut-off  10 %.
112-PKS-VPCZ/010512
8
6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Vzorky s hodnotami OD pod spodní hranicí šedé zóny se hodnotí
jako NEGATIVNÍ.

Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se hodnotí jako
HRANIČNÍ. Tyhle séra se musí opět zkontrolovat po 14 dnech
společně s nověodebraným vzorkem, aby se zjistil pohyb titru.

Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako
POZITIVNÍ.

Výsledky testu se musí interpretovat vždycky společně s klinickým
obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry.

Bylo sledovaných 59 potenciálně křížově reaktivních sér. Žádné
z nich nebylo reaktivní v testu IgA.

Velmi vysoké hodnoty lipidů
výsledky zkreslit.
Vysoké hodnoty hemoglobinu a
testu.
7.
mohou
v jednotlivých
bilirubinu
neovlivňují
případech
výsledky
CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU
Při diagnostické evaluaci jsme zjistili následující charakteristické
vlastnosti testu.
7.A. SPECIFITA
Z celkově 300 sér od dárců krve bylo testem CMV-IgA-ELA Test PKS medac
296 sér detekovaných jako negativní. Zbývající čtyři séra – tři z nich
hraniční a jedno slabě pozitivní v testu IgA – ukazovali všechny
vysoké titry CMV-IgG, jedno sérum dokonce pozitivní CMV-IgM.
V jiném porovnávacím referenčním testu bylo z těch samých 300 sér 284
negativních, 2 hraničních a 14 pozitivních.
112-PKS-VPCZ/010512
9
7.B. CITLIVOST
Z celkově 105 sér, které byli uvedeným referenčním testem určené jako
CMV-IgA pozitivní, detekoval test CMV-IgA-ELA PKS medac 101 sér jako
pozitivní, 2 jako hraniční a 2 jako negativní. To odpovědá relativní
citlivosti 96,2 %.
7.C. PŘESNOST
Vzorky
NK
SP
PK
Č. 1
Č. 2
Č. 3
Variace
(n
střední OD
0,047
0,341
1,601
0,047
0,223
2,473
intraassay
= 24)
SP
CV (%)
0,007
15
0,014
4
0,047
3
0,006
13
0,010
4
0,052
2
Vzorky
NK
SP
PK
Č. 1
Č. 2
Č. 3
Variace interassay
(n = 11)
střední OD
SP
CV (%)
0,044
0,005
11
0,276
0,034
12
1,391
0,119
8
0,052
0,008
15
0,201
0,020
10
2,184
0,187
9
NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnutá v soupravě);
PK = pozitivní kontrola
VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCI SE MANIPULACE

Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých
nezaměňujte lahvičky a jejich šroubové uzávěry.

Reagencie je potřebné ihned po použití uzavřít,
k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci.

Po skončení testu se musí reagencie uložit tak, jak je uvedené
v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost.

Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo
šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat
spolu v původním balení (viz také 3.).
112-PKS-VPCZ/010512
reagencií,
aby
nedošlo
10
INFORMACE TÝKAJÍCI SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ

Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti
práce.

Reagencie lidského původu byli testovány na HBsAg, na protilátky
proti HIV 1/2 a protilátky proti HCV a bylo zjištěno, že nejsou
reaktivní. Přesto se musí s těmito reagenciemi a také s těmi, které
obsahují součásti zvířecího původu, (viz obsah soupravy), pracovat
jako s potencielně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy.
RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACIE
Zbytky chemikálií a preparátů jsou všeobecně považovány za speciální
odpad. Likvidace tohoto druhu odpadu se řídí národními a regionálními
zákony a předpisy. Obraťte se na orgány místní správy nebo na
organizace zabývající se odpady, které vám podají informace, jak tyhle
nebezpečné odpady likvidovat.
Datum vydání: 01.05.2012
112-PKS-VPCZ/010512
11
LITERATURA
Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDS-Forschung (AIFO), Heft 11, 634-638 (1987).
Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A., Doerr, H. W.: Immunoglobulin A and M patterns to human cytomegalovirus during recurrent
infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J.
Virol. Methods 43, 65-76 (1993).
Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system,
compartment. Thesis European Medical Press (1985).
its
vascular
Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of
active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV)
diagnostic potential of IgA class and IgG subclass-specific antibodies. Infection 15, 93-98 (1987).
Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E.,
Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G and M to cytomegalovirus during recurrent infection in recipients of allogenic bone
marrow transplantation. J. Infect. Dis. 163, 628-630 (1991).
Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels,
R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg, H., Saah, A. J.: Cytomegalo-virus
IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV
related diseases in homosexual men. J. Med. Virol. 35, 174-179 (1991).
Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et al.: Virus-specific
antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G and A
in cytomegalovirus infections. Infect. Immun. 42, 237-244 (1983).
Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti,
M., Negro Ponzi, A.: CMV-specific polymeric and monomeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., Vol.
33, Nr. 4, 173-179 (1991).
Nielsen, L. N., Sorensen, I., Andersen, H. K.: Kinetics of specific
immunoglobulins M, E, A, and G in congenital primary, and secondary
cytomegalovirus infection studied by antibody-captured enzyme-linked
immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26, 654-661 (1988).
Porath, A., Hanuka, N., Keynan, A., Sarov, I.: Virus-specific IgG,
IgM, and IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as
determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol. 22, 223-230
(1987).
112-PKS-VPCZ/010512
12
Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a
novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of
cytomegalovirus infection in renal and heart transplant recipients.
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 653-659 (1997).
Sarov, I., Siqueira-Linhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard,
M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J. P.: Detection of specific
IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent
cyto-megalovirus infection. Intervirology 15, 228-234 (1981).
Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies
detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virol. Methods 6, 161-169 (1983).
Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytomegalovirus infections. Arch. Virol.
82, 173-180 (1984).
Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder,
U., Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate
between primary and recurrent or long-term human cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International
Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997).
Torfason, E. G., Källänder, C. and Halonen, P.: Solid-phase radioimmunoassay of serum IgG, IgM and IgA antibody to cytomegalovirus. J.
Med. Virol. 7, 85-96 (1981).
Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., Doerr,
H. W. : Comparison of shell viral culture and serology for the
diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects. Clin. Investig. 70, 503-507 (1992).
Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau, H., Doerr,
H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol. 40, 28-34 (1993).
112-PKS-VPCZ/010512
13