docVI. Transgenoze a klonování živočichů
download 
Stížnost Transkript
VI. Transgenoze a klonování živočichů
15/03/2010 transgenoze a klonování živočichů základní metody transformace živočišných buněk • Mikroinjekce Mikroinjekce – cizorodá DNA se přenáší do oplodněného vajíčka pomocí tenké skleněné kapiláry pod mikroskopem – mikroinjekce spermioidů • Injekce rekombinantními kmenovými buňkami • Lipofekce • Elektroporace • Retrovirální infekce – viz přednáška genové terapie 1 15/03/2010 lipofekce • DNA se zabalí umělými lipidovými vezikuly (lipozomy) a přirozenou cestou je dopravená až do jádra • DNA je záporně nabitá • lipidové li id monomery jjsou nabité bi kl kladně d 3-dimethylamino-1,2-propanediol oleyl-toluensulfonát dioleyloxy(propyl)-N,N,N- trimetylamonium chlorid lipofekce 2 15/03/2010 lipofekce DNA (snímky z elektronového mikroskopu) liposom komplex liposomy mohou sloužit jako tkáňově (tumor) specifické transportery DNA nové přístupy: zacílení na specifické buňky, do struktury liposomů se zabudují protilátky specifické na dané buňky 3 15/03/2010 mikroinjekce mikroinjekce • transgen je vložen do vhodného vektoru a) rekombinační vektor (virový vektor) b)) transgen g jje vyštěpen y p • oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části a samičí pronucleus je lépe viditelný) viditelný).. • mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka pod mikroskopem • implantace vajíčka do náhradní matky matky.. • embryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porod. porod. • detekce potomka vykazující fenotyp transgenu • stále nejpoužívanější metoda, účinnost 1 1-5% elektroporace – vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s DNA elektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidů 4 15/03/2010 mikroinjekce aaa aaa PG5 modelový organismus – Xenopus laevis (drápatka vodní) • obrovská vajíčka umožňují velice snadnou mikroinjekci • zárodky (pulci) se vyvíjejí mimo tělo matky – velice snadné pozorování a manipulace i l • studium vývoje zárodku a zakládání orgánů (embryogeneze) • nevýhody: pomalý životní cyklus, tetraploidní genom druh X. laevis ploidie allotetraploidní diploidní N 18 chromozomů 10 chromozomů X. tropicalis velikost genomu 3.1 x 10 9 bp 1.7 x 10 9 bp teplotní optimum 16-22o C 25-30o C velikost dospělce 10 cm 4-5 cm velikost vajíčka 1-1.3 mm 0.7-0.8 mm počet vajíček 300-1000 1000-3000 životní cyklus 1-2 roky 4 měsíce 5 Snímek 10 PG5 allotetraploidní - dva genomy, každý z jiného druhu galuszka; 10/04/2007 15/03/2010 metallothionein promoter regulovaný těžkými kovy PG6 příklad mikroinjekce • krysí gen pro růstový hormon byl mikroinjekcí vpraven do myši • pod myším promotorem metallothionein, který aktivován těžkými kovy • homozygotní linie byla vyselektována na potravě bohaté na těžké kovy • 10 týdnů staří sourozenci laboratorní myši (49 versus 29 gramů živé váhy) pro je PG1 PG7 příklad mikroinjekce transgenní losos • gen pro růstový hormon z většího lososa mořského byl pod specifickým antifreeze promotorem vložen do menšího říčního lososa • fenotyp – ryba roste daleko rychleji a dosahuje dospělosti za polovinu doby než wild-typová ryba. pstruh • nebezpečí: transgenní ryba unikne ze sádek do volné přírody? • transgenní ryby mají výhodu při páření ale jsou méně zdatnější – evolučně velice nebezpečné – může zdecimovat veškerou populaci • řešení: sterilní ryby, nebo pěstování ve vnitrozemských sádkách 6 Snímek 11 PG6 metalothionein - protein podilejici se na transportu zinku, jeho druhou funkci je detoxifikace jedovatých těžkých kovů Cd, Hg.., ktere pak uklada ve formě inkluzi např v kostech. Je to maly protein majici až 30% cysteinu. galuszka; 10/04/2007 Snímek 12 PG1 V celosvětovém měřítku se vyvíjí nejméně 35 druhů transgenních ryb. Kvalitním biotechnologickým výzkumem se kupodivu může chlubit Kuba. Zelenou tu dostala konzumace geneticky upravených tilapií nilských. Tato sladkovodní ryba z čeledi cichlid měla tu čest být prvním modifikovaným živočichem na světě, o němž úřady prohlásily: můžete jej chovat a jíst. Útěky obyčejných, nemodifikovaných tilapií z uzavřených chovných prostor přitom způsobily v Latinské Americe nejednu katastrofu. Tato mimořádně přizpůsobivá ryba snadno vytlačí původní druhy. V Číně zase údajně plují zatopenými rýžovými poli transgenní kapři. Úřady prý zastávají pragmatické stanovisko: zakazujte si na Západě genetické modifikace, jak chcete, my musíme nakrmit více než miliardu lidí. Nemáme čas na rozmýšlení. Mohou tedy modifikované ryby ohrozit přírodu? ˝Riziko tu určitě je,˝ říká ing. Jaroslav Petr z Výzkumného ústavu živočišné výroby. Mnohem horší jsou ale podle něj zločiny, které s genetikou vůbec nesouvisejí: například znečištěné řeky v Kanadě, v nichž lososi samovolně mění pohlaví, či vypouštění nepůvodních druhů do moří, jezer a vodních toků. galuszka; 10/04/2007 PG7 u dobytka tento přístup selhává galuszka; 08/04/2008 15/03/2010 injekce kmenových buněk kmenové buňky – nediferenciované buňky, které se mohou diferenciovat v jakoukoliv jinou buňku (totipotentní totipotentní) - mohou h se k kultivovat li i vitro in i v nediferenciovaném dif i stavu a snadno geneticky manipulovat, jsou nesmrtelné EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY odvozeny z vnitřních buněk embrya ve stavu blastocysty - jsou pluripotentní multipotentní PG2 injekce kmenových buněk 1998 – zjištěno, jak se dají nekonečně dlouho množit in vitro a získat z abortovaných lidských embryí při umělém oplodnění (aktivní telomerasy) velice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají diferenciovat in vitro již byly připravena většina ze zhruba 250 typů savčích buněk (neurony, ganglia etc.) etc ) pro speciální účely mohou být kmenové buňky odvozeny i z dospělého jedince např.. kmenové buňky z lidské kostní dřeně lze např diferenciovat in vitro na prekurzorové buňky mozkové, jaterní či svalové), lze je však velmi těžce vyselektovat (u 4040-letého jedince je to jedna buňka z 10 miliard) 2002 – kmenové buňky byly získány z odsátého tuku po liposukci, za 1500 dolarů navíc, je lze najít a uchovat do budoucna budoucna.. signál 2004 – byly připraveny pluripotentní buňky ze zubní dřeně mléčných zubů 2005 – in vitro množené buňky obsahují množství letálních mutací 7 Snímek 14 PG2 2005 - při množení kmenových buňěk vzniká velké množství mutací SELEKCE KMENOVÝCH BUNěK SE PROVÁDÍ POMOCÍ MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK ekb mají aktivní enzym telomerasu, která prodlužuje telomery při dělení galuszka; 02/04/2006 15/03/2010 za prsní implantáty a Viagru se utrácí podstatně více peněz, než za výzkum Alzheimera. To znamená, že kolem roku 2030 zde bude široká důchodcovská populace s krásnými ňadry a obrovskými erekcemi, která si ale ani za boha nevzpomene, co s tím má dělat… transformace selekce injekce kmenových ý buněk -vznik chimerické myši 8 15/03/2010 injekce kmenových buněk -vznik chimerické myši normální blastocysta ICM (inner cell mass) injekce embryonální kmenové buňky vzniká chimerická myš tzn. že má část těla z buněk svých a část těla z buněk kmenových PG3 mikrochimerismus u člověka 9 Snímek 18 PG3 Byla jednou jedna maminka a ta otěhotněla. Malá náhodička způsobila, že čekala dvojvaječná dvojčátka, chlapečka a holčičku. Jenže plod, ze kterého mohl být chlapeček z nějakého důvodu odumřel, nebyl schopný života. A organismus vedle něho - jeho vlastní sesterský plod - ho časem pohltil. Ale plod, ze kterého by byl chlapeček nezmizel úplně beze stopy. Jeho sestra po něm "podědila" krevní oběh. No a když se narodila, vyrostla, otěhotněla a rozváděla se...přišla na to, že její krev není její. A že mohla mít dvojče :-( Petr Galuszka; 08/04/2009 15/03/2010 transformace kmenových buněk substituční vektor inserční vektor pozitivní selekce na neomycin (gen M) Křížení – selekce transgenní myši tm = mutace (nebo nový gen) X A – dominantní pro agouti srst chimerický myšák ES blast barva srsti: agouti genotyp: AABB tm/+ES gamety: tm a +ES AB black aaBB normální myška black aaBB +B6 /+B6 +B6 /+B6 +B6 aB +B6 aB potomstvo F1: pokud je recesivní – bez projevu pokud je dominantní – část potomstva s projevem agouti AaBB black aaBB agouti AaBB +ES/+B6 +B6/+B6 tm/+B6 10 15/03/2010 Křížení – selekce transgenní myši tm = mutace (nebo nový gen) potomstvo F2: p X tm/+B6 tm/+B6 t /t tm/tm t /+B6 tm/+ +B6/+B6 25% 50% 25% transgenní homozygot knockoutovaná myš • • • • • gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu) do jeho ORF transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu) inzerční vektor gen v genomu EKB homologní rekombinace a přerušení genu 11 15/03/2010 knockoutovaná myš • PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ REKOMBINACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen) • možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci • do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB také ké tento gen • selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk • náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají homologní rekombinace linearizovaný substituční vektor N R Neo náhodná integrace HSVtk NeoR NeoR+/ HSVtk+ NeoR+/ HSVtk- knockoutovaná myš -důležitý ůležitý model pro testování funkce jednotlivých genů u obratlovců PROBLÉMY: 1) knockout zabíjí časné fáze embrya i když by neměl letální vliv na dospělého jedince. 2) nedostatečnost transgenní placenty – přenesení embrya do netransformované matky y (část ( placenty p y vzniká z embrya) y ) ŘEŠENÍ: PODMÍNĚNÝ KNOCKOUT Nobelova cena za medicínu 2007 12 15/03/2010 podmíněný knockout • využívá rekombinasový systém P1 fága Cre –lox, • Cre-rekombinasa je specificky fungující enzym pro lox sekvence (34bp, sekvence mezi je tzv. floxovaná) • standardně jsou připraveny dvě linie transgenní myši pomocí kmenových buněk • první) je připravená homologní rekombinaci tak že má do sebe vložený požadovaný ž d ý transgen (j (je stále ál ffunkční) kč í) fl floxovaný ý llox místy í a geny pro selekci l k i • druhá) je připravená náhodnou rekombinací a je do ní vložen gen pro Cre rekombinasu pod specifickým promotorem a) tkáňově specifický b) indukovatelný tetracyklinem • z obou linií se vyselektují homozygoti • ti se zkříží • gen je knockoutován pouze ve specifické tkáni (místně) • nebo časově po indukci tetracyklinem problémy práce s embryonálními kmenovými buňkami • etické – v některých zemích je zákaz odvozovat a pracovat s EKB úplný zákaz: Německo, Rakousko, Francie, Švýcarsko, Norsko, Irsko, Polsko, Brazílie částečný: USA pouze linie odvozené do roku 2001, nesmí se derivovat nové volná manipulace: Japonsko, Kanada, Španělsko, Itálie, Finsko, Švédsko, Izrael, Singapur, Austrálie, ČR • imunologická inkompaktibilita vytvořené linie nejsou imunologicky kompatibilní s většinou pacientů kteří potřebují transplantaci • teratomy nediferenciované EKB tvoří často po implantaci do těla pacienta teratomy, pokusy s diferenciaci in vitro a až poté implantace • kmenové buňky dospělé špatná diferenciace, ale 100% imunologická kompaktibilita pokud jsou ze stejného jedince 13 15/03/2010 řešení – vlastní embryonální buňky terapeutické klonování aneb přenos jader somatických i ký h b buněk ěk květen 2005 SCIENCE první úspěšné terapeutické klonování člověka ?? Woo-suk HWANG leden 2006 - skandál PG3 využití kmenových buňek kmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do postižené tkáně (např. infarkt myokardu) • pokusy na myši u které byl uměle vyvolán infarkt prokazovaly, že kmenové b ňk nejsou buňky j schopny h dif diferenciovat i t po iimplantaci l t i v srdeční d č íb buňky. ňk • u některých myši se však funkce srdce zlepšila • kmenové buňky byly označeny GFP a sledovány po implantaci do myšího srdce, bylo zjištěno, že u některých myší se transformují v nové cévy a zlepšují tak prokrvení nemocného srdce. 2003 v Praze první pacient, kterému byly po těžkém infarktu myokardu implantovány vlastní kmenové buňky z k t í dř kostní dřeně ě po zlepšení následovali další pacienti, u člověka se zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u myší. zatím však lidské kmenové buňky nemohou být nijak upravovány či značeny a tak se neví zda regenerace srdečního svalu pomocí kmenových buněk u lidí funguje jinak než u myší podobné pokusy probíhají v Německu a Holandsku 14 Snímek 28 PG3 klasický přístup pro léčbu leukemie testování např. léčba sklerózy, poranění míchy, slepota atd. galuszka; 02/04/2006 15/03/2010 využití transgenních zvířat jako bioreaktory bioreaktory:: domácí zvířata produkující mléko, do kterého je vylučován produkt transgenu. • ge je vč gen včleněn e ě do ge genomu o u zvířete v ete pod spec specifickým c ý promotorem p o oto e ββ laktoglobulínu exprimujícím se v prsních žlázách • produkt transgenu neovlivňuje život transgenního zvířete • produkce lidských proteinu: inzulín, erytropoetin atd. • pavoučí mléko: fa NEXIA začala produkovat transgenní kozy exprimující geny pro produkci pavoučího proteinu, ze kterého pavouk vyrábí sítě do mléka pavoučí vlákno je odolnější než ocel a používá se na výrobu neprůstřelných vest • SPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILK využití transgenních zvířat xenotransplantace:: xenotransplantace • • • • • • prasata jsou nejvhodnější dárce, podobná velikost, podobný imunitní systém v současné době se vyvíjejí prasata, která mají pozměněný imunitní systém, nebo modifikované povrchové proteiny buňky, tak aby je neodmítal lidský imunitní systém např. inaktivace 1,3-galaktosyl transferasy, která přenáší galaktosu na povrch prasečích buněk a kterou rozpoznává lidský imunitní systém jako antigen odstranění receptorů, které jsou důležité pro imunitní odpověď z prasečích buněk 2003 - první nezdařené pokusy s transplantací srdce a ledvin pocházející z prasete první úspěšný pokus: transplantace prasečích ostrůvkovitých buněk slinivky břišní, produkující lidský inzulín diabetikovi PROBLÉMY: etické, přenos prasečích virových onemocnění na lidi (endogenní retroviry), spousta „odpadních“ selat při selekci vhodného dárce 15 15/03/2010 využití transgenních zvířat produkce „zdravých“ zvířat zvířat:: • • produkce drůbeže z masem, které má nižší obsah tuku produkce vajec se sníženým obsahem cholesterolu atd. zvyšování odolnosti hospodářských zvířat proti nemocem buněčné klonování zaškrcení embrya • nejstarší metoda klonování • i přirozeně (jednovaječná dvojčata, normální způsob u pásovců, vždy vznikají 4 stejné klony) • u člověka docházelo k deformaci jednoho embrya polyembryonie partenogeneze • zárodek se vyvíjí z neoplodněného vajíčka vzniká pouze samičí potomstvo (haploidní jedinec) • zdařilé pokusy (i přirozeně u nižších živočichů, typické pro mravence) u savců se zatím nezdařila bez deformací embrya transplantace jádra • hlavní technika v současnosti používaná 16 15/03/2010 transplantace jádra jádro z jedince který je klonován do bezjaderného vajíčka 1. denukleace hostitelské buňky chromozomy jsou jemně nasáty ostrou mikropipetou ze zralého neoplodněného vajíčka v metafázi II oocyt denukleace cytoplast 2 přenos 2. ř jád jádra A. elektrofokusace – celá donorová (somatická) buňka dárce je elektroporována za zónu peliculu (vnější membrána oocytu) a fúzována s cytoplasmou hostitelského denukleovaného oocytu B. jaderná injekce – jádro somatické donorové buňky je mikroinjektováno do cytoplastu (honolulská metoda) transplantace jádra elekroporace somatická buňka (kmenová buňka, tuková buňka, buňky pohlavních žláz, fibroblast, neuron) cytoplast t l t 17 15/03/2010 transplantace jádra tuková buňka z vaječníku cytoplast jaderná injekce a)) disperzované p tukové buňky y b) jádra (šipky) nasáté do mikropipety c) propíchnutí zóny pelikuly d) zasunutí mikropipety až k oolemě e) aplikace piezo impulsu, který prolomí oolemu f) injekce jádra tukové buňky do ooplastu transplantace jádra genetické přeprogramování je nutné pokud je jádro klonu vzato ze somatické buňky dospělého jedince “přeprogramování” – aktivace genomu dárcovské buňky k obnovení jeho totipotence tak, aby mohla nově vzniklá buňka se dělit a diferenciovat ve všechny další typy buněk celého organismu nejlépe k němu dochází právě v cytoplasmě denukleovaného oocytu přeprogramování 18 15/03/2010 transplantace jádra vývoj embrya z buňky obsahující cizí jádro buňky po transformaci jsou pěstovány v médiu indukce embryogeneze chemicky: chlorid strontnatý implantace embrya embryo je ze živného roztoku chirurgicky přeneseno do dělohy vhodné náhradní matky vždy je vloženo několik embryí současně (malá pravděpodobnost uchycení) buněčné klonování 1958 – první pokusy o klonování, vědci dokázali poprvé totipotenci buňěk 19 15/03/2010 buněčné klonování 1986 první klonovaný savec kráva byla naklonována z buněk časného stádia embryogeneze (nemá svůj jinak starý klon!) 1993 – telata byla získána jaderným přenosem z embryonálních kmenových buněk pěstovaných in vitro 1995 – dvě ovce Megan & Morag byly naklonovány z embryonálních buněk příběh ovečky Dolly 1996 - první savec naklonovaný ze somatické buňky . • byly odebrány somatické buňky z prsní žlázy (vemeno) 6-leté ovce (genetická matka Dolly, Dolly plemeno Finn Dorset) • buňky byly přeneseny na vhodné médium in vitro a pěstovány • buňky pak byly na 5 dní přeneseny na médium bez živin aby přestaly růst (dostaly se do G0 fáze a zbavily se naprogramování na prsní žlázu) • každá z buněk pak byla elektroporačně zfúzována s denukleovaným ovčím oocytem ve stádiu metafáze II • zfúzovaná buňka byla přenesená zpět do živného média a chemicky bylo indukováno dělení a embryogeneze (SrCl2) • v 16-buněčném stádiu bylo embryo chirurgicky přeneseno do dělohy náhradní matky (plemeno Scotish blackface, skotská černohubka). • Dolly se narodila 5.6.1996 v Roslinově institutu ve Skotsku • Dolly má v podstatě tři matky – genetickou, tu co poskytla denukleované vajíčko a tu co ji donosila. 20 15/03/2010 rodokmen Dollyiny rodiny z Dollyina fotoalba Dolly a její „otec“ Ian Wilmut Dolly a její náhradní matka manžel Dolly beran David plemeno velšské horské Dolly s prvorozeným jehnětem Bonnie (13.4.1998) Dolly s třemi dalšími jehňaty (2xM a 1xŽ) 24.3.1999) 21 15/03/2010 příběh ovečky Dolly úspěšnost klonování: • na přípravu Dolly bylo zfúzováno 277 denukleovaných jader s 277 somatickými buňkami • 29 embryií přežilo • 13 se úspěšně usadilo v dělohách náhradních matek • pouze jedna donosila živé jehně vědci se přou o to zda Dolly vznikla opravdu ze somatické buňky nebo pouze z kmenové buňky přítomné ve vemeni Dolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 let (průměrný věk ovce je 12) problém ZKRÁCENÉ TELOMERY problém: - bylo statisticky potvrzeno u Dolly mitochondriální DNA: obsahuje 37 genů většinou odpovědných za regulaci energetického metabolismu (dědí se v mateřské linii). Dolly mtDNA zdědila od druhé matky, která darovala vajíčko při přenosu somatické buňky dochází i k přenosu mtDNA první matky, ta je však ve vajíčku zničena, stejně jako mtDNA spermií u člověka je dědičně vrozená hluchota spojená s mutacemi na mtDNA příběh ovečky Polly 1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen - narodila se také v Roslinově institutu ve Skotsku - byla naklonována z fibroblastu ovčího plodu, který byl in vitro geneticky modifikován - byl do něj vložen lidský gen pro alpha-1-antitrypsin pod promotorem s expresí do mléka - je to protein používaný pro terapii cystické fibrózy - ovce produkující další terapeuticky významné proteiny jsou na světě - jejích produktů se zatím nevyužívá protože je obava, že mohou mít chorobu svědivku, která může mít podobný základ jako BSE a u lidí vyvolávat Jacobs-Creutzveldovu chorobu 22 15/03/2010 myš Cumulina a její sestry 1999 první klonovaná myš z dospělé buňky na Honolulské Univerzitě na Hawaii z několika náhradních matek vzniklo 22 samičích klonů první generace, první myš byla pojmenována Cumulina z myší první generace byly odebrány somatické buňky a bylo vytvořeno 28 klonů druhé generace myši byly klonovány z tukové buňky vaječníku buňky nebyly fúzovány elektroporačně ale tzv. honolulskou technikou pomocí speciální mikropipety úspěšnost 2-4% tým se také pokoušel o naklonování myši z neuronu a poprvé se také pokusily vytvořit mužské klony ze Sertoliho buněk varlat - neúspěšně XENA – první klonované sele 2000 v Roslinově ústavu se narodilo černé sele Xena bílé prasnici metoda použitá při klonování Dolly selhala a sele bylo získáno honolulskou technikou z buňky odebrané z měsíčního plodu úspěšnost: Xena vzešla ze 110 klonovaných vajíček, které byly implantovány do 4 náhradních matek Embryos clonally derived by microinjecting the nuclei of Meishan x Meishan breed (black coat) fetal fibroblasts into Landrace breed (white coat) enucleated oocytes. These embryos are at the four-cell stage after 40 hours of culture in vitro. 23 15/03/2010 PG4 první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitou 2002 opět v Roslinově ústavu ve spolupráci s japonskou firmou PPL Therapeutics se narodilo prvních pět selat s knock-outovaným genem pro alfa 1,3alfa1 3 galaktosyltransferasu (nejsou to klony) 1,3- galaktosa na povrchu prasečích buněk způsobuje „hyperacute rejection“ –HAR při xenotransplantacích, což je rychlá humorálně imunitní odpověď lidského těla na prasečí buňky 2003 byly připraveny prasata s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3galaktosyltransferasu a vloženým lidským genem pro alfa- 1,2fukosyltransferasu, která se podílí na tvorbě univerzálně akceptovaného antigenu HT na povrchu buněk 2005 plánovány první transplantace prasečích srdcí, ledvin, slinivek, jater, kůží a krevních buněk z 1,3-GT knock-out HT transgeních prasat do lidí. první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitou standardně byly připraveny selata overexprimující lidský gen pro alfa- 1,2fukosylosyltransferasu a pomocí PCR byly vyselektováni z vrhu dva heterozygoti (samec a samice) a ti spáření dohromady samice byla ve 30 dnů těhotenství zabita a z jejího těla bylo odebráno 12 plodů, ze všech byla odstraněna hlava, končetiny a vnitřnosti a zbylá tkáň byla rozsekaná a kultivována na jednotlivé buňky buňky byly elektroporovány s linearizovaným vektorem nesoucí knockoutovaný gen pro 1,3 galaktosyl transferasu a dvojitě transgenní linie vyselektovány na neomycinu tyto buňky pak byly použity na přenos do denukleovaných oocytů honolulskou metodou HT+ HT- 24 Snímek 47 PG4 fukosyl transferasa enzym přenášející GDP fukosu na receptory na povrchu buněk sliznic člověka galuszka; 02/04/2006 15/03/2010 první klonované kotě CC se narodilo 22 prosince 2001 v texaské firmě A&M na získání CC bylo použito 188 embryí CC není stejná jako Rainbow, barva srstí a její textura je částečně ovlivněna prostředím tř dí dělohy děl h (fenomén (f é inaktivace i kti X h X-chromozomu) ) první pokus: byly použitý kožní buňky, jediná těhotná kočka nesoucí klon potratila ve 44 dnu CC byla připravena nakonec stejně jako Cumulina z tukové buňky vaječníku náhradní matka Rainbow genetická matka CopyCat genetický dárce z katalogu firmy: používají novou metodu klonování: chromatinový transfer gizmo klony malý gizmo tahini baba nanusch a tabouli cena za jeden klon: 32 000 $ nicky malý nicky kl klonování á í psů ůk komplikovanější: lik ější: cena za uložení buněk z mrtvého či živého zvířete do banky : 850 $ - nepravidelná a velmi řídká ovulace (nutnost udržovat velkou populaci náhradních matek) - vajíčka nedozrávají ve vaječnících ale až ve vejcovodech a proto je nelze jako u jiných savců získávat při sterilizaci zvířat (nutno operativně – drahé) - psí vajíčka jsou zakalené spoustou tuku a lze je těžko mikroskopicky denukleovat 25 15/03/2010 PG1 nedostatky klonování savců • • • • velmi malá klonovací úspěšnost, většinou pod 1% vysoká úmrtnost čerstvě narozených klonů „oversize offspring syndrome“ – zatím nevysvětlen časté jsou také fyzické deformace narozených plodů – časté u metody zaškrcování embrya • artritida, srdeční arytmie, respirační problémy či totální selhání imunity klonů • problém se stářím klonů - telomery druh počet použitých oocytů počet narozených klonů zemřeli po porodu myš 2468 31 (1.3%) - kráva 440 6 (1.4%) 2 ovce 417 14 (3.4%) prase 977 5 (0.5%) 11 po 6 měsících - koza 285 3 (1.1%) - počítají se pouze klony vzniknuvší z dospělé somatické buňky, do konce roku 2002 třetí metoda klonování savců • nejlevnější a nejúčinnější • upravené embryonální buňky do tetraploidních embryí • u vyšších savců tetraploidie neslučitelná se životem • tetraploidní buňky se podílí pouze na tvorbě plodových obalů a placenty • v současnosti nejpoužívanější metoda klonování • úspěšně funguje u myší 26 Snímek 51 PG1 oversize offspring syndrome - vznika pravdepodobne kultivaci casneho embrya v zivnem systemu Petr Galuszka; 14/04/2008 15/03/2010 první klonovaný primát – opice Tetra 2002 byla připravená metodou zaškrcování embrya, která do té doby u primátů, ani u člověka nefungovala z jednoho přirozenou cestou získaného embrya (ve stavu t 8 b ěk) makaka 8-buněk) k k rhesus h b l připraveny byly ři i in vitro 4 klony (dvoubuněčné embrya) 2 odumřely ještě ve zkumavce, třetí abortoval v děloze náhradní matky. Pouze Tetra se „dožila“ porodu a těší se dobrému zdraví Tetra v podstatě není klon, protože neexistuje jí totožný jedinec pokusy naklonovat makaka metodou jaderného přenosu selhávají všechna embrya získána z cizího jádra abortovala nejpozději ve stádiu blastuly bylo zjištěno že při dělení buněk dochází k náhodným přesunům chromozomů mezi buňkami 27 15/03/2010 PG8 klonování primátu jaderným přenosem 2002 firma CLONAID řízená sektou Reliánů podává spekulativní informace o klonováných lidských embryiích a dokonce i o narození prvních klonovaných dětí. leden 2004 Dr. Zavos v Londýně oznámil, že implantoval 35-leté ženě první naklonované lidské embryo z buńky jejího manžela. U ženy nedošlo k těhotenství. těhotenství Nepodal žádné bližší informace. únor 2004 tým z národní jihokorejské univerzity poprvé připravil naklonována lidská embrya (do stádia blastuly) jaderným přenosem z dospělé buňky. Pokus o implantaci embrya do náhradní matky neproběhl. prosinec 2004 tým z Pittsburgu ve spolupráci s jihokorejci připravil první nedegenerovaná embrya nukleárním přenosem makaka rhesuse. 188 těchto embryií bylo přeneseno do 25 náhradních matek. Ani u jedné však nebylo zjištěno pokročilé těhotenství. obě skupiny z embryí připravili stabilní linie kmenových buněk úspěchu dosáhli až poté co zdokonalili metodu použitou u Dolly, kdy denukleaci oocytu provedli pomocí pórů v buněčné stěně. neodstranili tak společně s jádrem esenciální bílkoviny z cytoplasmy důležité pro dělení nového jádra. klonování primátu jaderným přenosem VYUŽITÍ KLONOVANÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK TERAPEUTICKÉ KLONOVÁNÍ přenos jader somatických buněk • nejsou velké etické zábrany veřejnosti pro výzkum v této oblasti. • embryonální kmenové buňky jsou nejvíce prozkoumány a zdají se být na rozdíl od ostatních kmenových buněk nejvhodnější pro terapii. • odpadá imunologická inkompatibilita • stejné genetické stáři buňky jako buněk jejích příjemce • začíná se s prvními výzkumy v oblasti léčby nemocí, kde je specifická tkáň degenerována a může být nahrazena těmito buňkami: diabetes, osteoartritida, Parkinsonova a Altzheimerova choroba. VYUŽITÍ OPIČÍCH KLONů PRO TESTOVÁNÍ NOVÝCH LÉČIV 28 Snímek 55 PG8 období transkripčního klidu galuszka; 15/04/2008 15/03/2010 klonování primátu jaderným přenosem ETIKA celosvětový zákaz reproduktivního klonování byl schválen a vydán OSN v roce 2005 • většina vyspělých zemí má reproduktivní klonování zakázáno vlastní legislativou • USA povolená manipulace s klonovanými lidskými embryi do stáři dvou týdnů • EVROPA – povolená manipulace s embryonálními kmenovými buňkami – Holandsko, Švedsko, Řecko a Finsko, pouze s těmi vznikající jako odpad při umělých oplodněních • VÉLKÁ BRITÁNIE jediná země, kde je povoleno záměrně vytvářet lidská embrya pro zisk kmenových buněk KONZERVAČNÍ BIOLOGIE • se zabývá zachováním ohrožených druhů živočichů na Zemi • The Center for Reproduction of Endangered Wilidlife (CREW) v Cincinnati ZOO se začal zabývat klonováním ohrožených druhů • prvním klonovaným živočichem byl sameček divokého malajského gaura, kteří žijí již pouze v zajetí v ZOO. Tito živočichové pěstovaní v zajetí se však často odmítají vzájemně pářit. • jejich klonování je důležité proto, aby byla zachována genetická diverzita v málo početné populaci. • sameček Noah byl také prvním vytvořeným samčím savčím klonem, který se dožil porodu • jeho chromatin byl vložen do denukleovaného oocytu krávy plemena Holstein, která ho také porodila • Noah bohužel zemřel dva dny po porodu na infekci 29 15/03/2010 KONZERVAČNÍ BIOLOGIE • dalším ohroženým druhem „úspěšně“ naklonovaným byla antilopa bongo • zvažuje se klonování velkých červených pand. Neexistuje však vhodná náhradní matka. Vědci nechtějí použít vlastní samice pand, protože již tak málo jedinců by bylo vystaveno velkému nebezpečí. Nejbližším vhodným příbuzným říb ý je j mýval. ý l • v Austrálii chtějí klonovat Tasmánského tygra, který byl vyhuben v roce 1930. (jediný exemplář je mládě ve zkumavce, jeho DNA už však začíná být částečně fragmentovaná) • 1999 příběh španělské kozy Celie (bucardo) jak se bude klon rozmnožovat? • má smysl tyto živočichy oživovat, když stejně nebudeme schopni jim zaručit genetickou diverzitu v rámci druhu? • mamut – zatím nebyl nalezen vhodný vzorek DNA (daleká budoucnost) • dinosauři - utopie maximální životnost DNA je 10.000 let 30
