Genomika a proteomika

Genomika a proteomika
Současná charakterizace mnoha genů
a genových produktů
Lidský genom
Genomy jiných organismů
Genomové sekvence v databázích
Jaká je funkce kódovaných proteinů?
Definová
Definování proteomu
Znalost úplné genetické informace
organismu
(genomu), která se získá sekvencováním DNA a
určením funkce jednotlivých genů, umožňuje hlouběji
proniknout do podstaty fungová
fungování živých organismů
organismů.
Cílem rozluštit genom se zabývá genomika.
genomika Genetická
informace ale hovoří pouze o dědičně převzatých
schopnostech organismu. K realizaci životní
ivotních funkcí
funkcí
organismu je nutné
nutné na podkladu genů
genů vytvá
vytvářet
proteiny.
proteiny Tento děj podléhá regulaci zavisející na
mnoha vnitřních i vnějších faktorech.
Pro soubor všech buněčných proteinů se od 1995
(Wilkins) ujal pojem proteom jako komplementární
soubor proteinů k souboru genů (genomu). PROTeins
PROT
expressed by a genOME
OME..
1
Vysoce abundantní
abundantní proteiny
versus
pool má
málo abundantní
abundantních proteinů
proteinů
Pojem proteom vystihuje souhrn všech
proteinů, které jsou kódované a exprimované v
buňce (či viru) spolu s jejich interakcí
(proteinové komplexy) a funkčními vztahy.
„ a tip of iceberg“
iceberg“
Jiná
Jiná definice říká, že jde o okamž
okamžitý soubor
všech proteinů
proteinů ve vzorku (buň
(buňka, tká
tkáň) - tedy
v urč
určité
itém čase.
Zatímco genom je pojmem jednoznačně
statickým, v podstatě konstantním, proteom
je pojmem dynamickým.
dynamickým Koncentrace proteinů
se totiž neustále mění podle aktuálních potřeb
organismu (na rozdíl od genové výbavy).
příklad:
krevní
krevní sérum
albumin
40 000 000 000 pg/ml
interleukin 6
5 pg/ml
Dynamický rozsah proteinů
proteinů v krevní
krevním sé
séru
Anderson NL, Anderson NG. Mol Cell Proteomics. 2002 Nov;1(11):845-67
2
Klasifikace proteomických směrů dle
zaměření výzkumu:
Vývoj protemických
metod
Penque, D.
Proteomics Clin. Appl.
2009, 3, 155
1) Identifikace všech proteinů (intaktní hmota,
peptidové fingerprinty, de novo sekvencování,
expresní
expresní proteomika).
proteomika Proteiny jsou většinou
denaturované, ztrácí se informace jak o terciární
a kvarterní struktuře, tak o přirozené tvorbě
komplexů a funkci. Variantou je studium změn v
diferenč
ční proteomika).
proteinovém složení (diferen
proteomika
2) Tvorba komplexů, posttranslační modifikace,
interakce, funkce (funk
funkč
ční proteomika).
proteomika Použití
technik, které nedenaturují proteiny.
Proteomika pomáhá biologickému výzkumu
komplexní
směs
proteinů
extrakce
Biologie
Biologie
identifikace proteinů
separace proteinů
popis proteinových modifikací
hojnost výskytu (abundance) proteinů
hmotnostní spektrometrie
3
„human multiple affinity removal system″
= MARS (Agilent); kolonka s anti-albumin, transferrin, -IgG, -IgA, -α1-antitrypsin a –haptoglobin polyklonálními protilátkami
Vícerozmě
cerozměrná
rná kapalinová
kapalinová chromatografie
Freeman W.M. et al.,
Proteomics 2006
4
P.V.E. Edman
(1916-1977)
Nobelova cena za chemii 2002
Electrospray ionisation (ESI)
„za vyvinutí metod pro identifikaci a strukturní
analýzu biologických makromolekul"
„za vyvinutí jemných desorpčních ionizačních technik
pro analýzu biologických makromolekul pomocí
hmotnostní spektrometrie "
heated inert gas (N2)
John Fenn
Koichi Tanaka
v proteomice uspoř
uspořádání „nanospray“
nanospray“ - malé
malé objemy vzorku
5
MALDI
Některé
které použ
používané
vané matrice
Dodáním energie dojde k odpaření matrice, která se
nachází v nadbytku; v plynné fázi pak matrice nese analyt.
Analyt je tak převeden do plynné fáze nepřímo. Matrice je
zároveň donorem či akceptorem protonu, podle modu
ionizace. Vůbec první byla kyselina nikotinová.
Schéma hmotnostního spektrometru pro proteomiku
Pre-Separation
Ion Source
Liquid Chromatography
Mass Analyzer
Ion
Detector
Time-of-Flight (TOF)
Quadrupole TOF (QTOF)
Ion Trap (IT)
Fourier TransformIon Cyclotron Resonance (FT-ICR)
R. Aebersold and M. Mann, Nature (2003), 422, 198-207.
6
100
97430
% Intensity
MALDIMALDI-MS
krysí
krysí protein MVP
(M+H)+
98563
(M+2H)2+
48658
36446
58309
30811
50608
70405
90202
110000
129797
m/z
Princip identifikace proteinu pomocí PMF
Protein
Sekvence
proteinu
SEMHIKHYTTKILGFREE
GDSCPLKQWDDSKILVAV
ADKLLEYEEKILLFNSAK
YLLDESSTYKLMHDDSV
Tryptické peptidy
Teoretické
tryptické peptidy
Hmot. spektrum
Teor. hmot. spektrum
Vytvoření peaklistu
(manuálně nebo automaticky)
SEMHIKHYTTK
ILGFR
EEGDSCPLK
QWDDSK
ILVAVADK
LLEYEEK
ILLFNSAK
YLLDESSTYK
LMHDDSV
7
Export
peaklistu
de novo sekvencová
sekvencování
N-term.
„graphical probability chart“
A
B
C
D
E
C-term.
Peptidové molekuly fragmentují díky tzv. „collisionally
induced dissociation“ (CID)
- kolize s elektroneutrálními molekulami plynu v kolizní
cele (dusík, argon), běžně štěpení peptidové vazby CO-NHA
B C D
A
B
A
A
B
C
A
B
C
D
E
N-terminal
product ions
m/z
8
V ideálním případě by bylo možné z rozdílů m/z
dedukovat sekvenci:
-pokud by každá peptidová vazba podléhala disociaci se
stejnou pravděpodobností
- pokud by se v každé molekule štěpila pouze jediná
peptidová vazba
- pokud by se tvořily pouze produkty s C- a N-koncem
N-koncové fragmenty
E
B
E
C
C
R1 O
b3
R2 O
R3 O
R4
H2N - C - C - N - C - C - N - C - C - N - C - COOH
E
D
E
D
b2
b1
Ve skuteč
bohužel není
není.
skutečnosti tomu tak bohuž
D
spodní index označuje
počet AK zbytků v
produktovém iontu
Klaus Biemann, MIT
A
B
H
C
D
H
H
H
H
H
H
E
y3
C-terminal
product ions
y2
y1
C-koncové fragmenty
m/z
V praxi…
9.4
242
LVDKVIGITNEEAISTAR
b3-17
100
Rel. Abund.
směs b-iontů and y-iontů
v MS/MS spektru
MS/MS dvojnásobně
nabitých trypsinových
peptidů běžně poskytuje
jednonásobně nabité
produktové ionty.
y12
1261.4
y10
8.4
cysteins
cysteinsynthasa
ysteinsynthasa
ynthasa A
259
1091.5
y13
1374.5
9.8
LC-MS
LC-MS/MS
y12
1261.4
y10
6.8
5 6 7 8 9 10 11 12Time (min)
965.3
(M+2H)2+
MS/MS
629.0
b3
y4
b6
668.4 b8
b5 838.5 y9
y8
y13
1374.5
y11
y14
1474.4
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
b6
b5
b3
0
555.4
y4 b y5
4
y6
400
400 800 1200 1600 2000 m/z
668.4
600
b8
y9
838.5
990.5
b7
y7
800
y8 b9
b10
1000
y14
y11
b11
1200
m/z
b12
1474.4
b14
b
13
1400
b15 b16 b17
1600
1800
m/z
9
DDA – Data dependent analysis
automatická analýza peptidů během chromatografické
separace
DDA – Data dependent analysis
automatická analýza peptidů během chromatografické
separace
Krok první – vyhledávácí MS full sken, analýza spektra, identifikace
vícenásobně nabitých iontů (2,3,4x), sestavení pořadí fragmentace podle
intenzity iontů.
Krok druhý – selekce prvního nejintezívnějšího prekurzoru pro fragmentaci
prvním analyzátorem.
Selekce prekurzoru
DDA – Data dependent analysis
automatická analýza peptidů během chromatografické
separace
TopTop-down sekvencová
sekvencování
Krok třetí – fragmentace vybraného prekurzoru v kolizní cele a následná
detekce dceřinných fragmentů druhým analyzátorem.
MS/MS analýza prekurzoru
Suckau D.,
2009
10
Selektivní izolace glykopeptidů
Posttranslač
Posttranslační modifikace: fosfopeptidy
Zhang H, Li XJ, Martin DB, Aebersold RH. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using
hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol 2003;21:660–6.
Procedury pro studium membránových proteinů
Protein crossross-linking:
inking:
studium 3D struktury proteinů
proteinů
Speers AE, Wu CC
Chem. Rev. 2007, 107, 3687-3714
NaO3S
O
N
O
O
O
ON
O
O
SO3Na
O
+
NH 2
H 2N
Lys
Lys
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate,
BS3, raménko o délce 11.4Å
Protein
O
N
H
H
N
O
Cross-Linked Protein
11
Využití izotopových výměn vodíku (1H)/(2H) pro studium
protein-protein interakcí
Borch J, Jorgensen TJD, Roepstorff P: Curr Opin Chem Biol 2005: 9, 509-516
MS kvantifikace v proteomice
Komives EA: Int J Mass Spectrom 2005: 240, 285-290
Biomarkery
1. Klinická
Klinická diagnostika
SELDI – surface enhanced laser desorption/ionisation
Využití: diagnóza rakoviny prostaty, močového měchýře,
prsu a vaječníků nebo např. Alzheimerovy nemoci.
hmot. spektrometrie
array chip
výhody
jednoduchost
rychlost
selektivita
2. Mikrobiologie
retentát
3. Fyziologie a patologie
nevýhody
nízká
zká citlivost
nízká
zká přesnost urč
urč. m/z
nízké
zké rozliš
rozlišení
ení
4. Biotechnologie
12
Příklady proteinových čipů
ipů dostupných pro SELDI MS:
1. chemické povrchy
2. biochemické povrchy
Isaaq et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 587–
587–592 (2002)
Princip techniky MALDI imaging
NATURE MEDICINE • VOLUME 7 • NUMBER 4 • APRIL 2001
13
3000
3313.8
2
2175.6
2568.8
2777.8
2606.3
2984.1
3040.3
3041.4
x104
2532.6
Intens. [a.u.]
1
0
500
400
300
200
1.0
Intens. [a.u.]
2179.9
2215.8
2534.0
100
0
x104
2.0
2217.3
Intens. [a.u.]
0.5
0.0
x104
1.5
1.0
2000
0.5
0.0
Intens. [a.u.]
3313.2
3405.9
3438.2
3586.8
3629.8
4000
3770.5
3771.9
4128.6
4181.1
4435.6
4091.5
4124.3
4433.9
4533.0
5000
4811.1
4811.1
5068.5
5067.6
5651.0
4499.6
5002.3
5067.8
5652.2
6000
5696.2
5868.1
6083.1
6082.6
6083.3
6367.6
6396.8
6627.5
6307.2
6396.5
6627.8
6627.4
7000
6886.0
7174.3
7175.1
7238.5
7542.0
7595.3
8000
8256.3
8361.4
8255.7
8605.8
9000
8825.6
8846.2
9065.5
9064.0
9064.2
9618.7
9555.9
9619.5
10000
9954.9
10132.4
10250.1
P fluorescens 2115T
P fluorescens 2799
m/z
P fluorescens 3901
11000
11305.2
090729 Bremia FA matrix dried droplet suppr deflection_2\0_A9\1\1SLin
7541.7
14