Cytogenetika-03-Struktury chromosomu

Komentáře

Transkript

Cytogenetika-03-Struktury chromosomu
Cytogenetika 03
Funkční struktury
chromosomu
Magda Zrzavá
František Marec
Schéma funkčních struktur
chromosomu
2
Centromery
Centromera
= primární konstrikce
- rozděluje chromosom na raménka
- místo nasedání kinetochoru
- funkce: bezchybný rozchod chromosomů
- ztráta centromery ztráta chromosomu
- fúze chromosomů vznik dicentrického
chromosomu zastavení buněčného
dělení smrt buňky
Dělení chromosomů podle typu
centromery
• Monocetrické chromosomy –
centromerická aktivita soustředěna do
jednoho místa
Podle velikosti dělíme na:
- bodové (point) – u Saccharomyces
cerevisiae
- regionální (regional) – např.
Schizosaccharomyces pombe, člověk, kur,
Drosophila
• Holocetrické chromosomy – tzv. difuzní
centromera - kinetochor rozptýlen po
celém chromosomu
- např. Caenorhabditis elegans, motýli,
mšice
Centromery
Podle velikosti centromery rozdělujeme chromosomy na monocentrické a holocentrické
(holokinetické). Monocentrické centromery jsou lokalizované v jediném místě na chromosomu a
podle jejich délky je lze rozdělit na dva podtypy:
- bodová (point) centromera, kdy je formování kinetochoru vázáno na určitou sekvenci DNA
(např. Saccharomyces cerevisiae), zaujímá velice malou oblast (1 nukleosom), na kterou se
upíná jeden mikrotubul. U S. cerevisiae je centromerická DNA tvořena 125 bp sekvencí složené
ze tří elementů (CDEI, CDEII a CDEIII).
- regionální (regional) centromera, kde je oblast centromery sice na jednom místě, ale zabírá
větší oblast. Přestože se v těchto oblastech často nacházejí určité typy sekvencí DNA (u vyšších
eukaryot je to často tandemové repetice, např. alfa satelitní DNA u primátů), zdá se, že fungování
centromery je vymezeno spíše epigeneticky. Najdeme je např. u člověka, kura, drozofily a
Schizosaccharomyces pombe. Lidská regionální centromera je komplexní. Dvě rodiny alfa
satelitní DNA (červené a šedé šipky) se nacházejí pouze v centromeře. Alfa satelitní DNA typu I
(červená šipka) je složena z chromosomálně specifických repetitivních jednotek vyššího řádu,
obsahuje CENP-B boxy a nasedá na ní CENP-A. Alfa satelitní DNA typu II (šedé šipky) se skládá
z různých alfoidních monomerů (různě barevné trojúhelníky). Kinetochor váže 20-30 mikrotubulů.
U většiny studovaných eukaryot je funkční část centromerické DNA (jejíž délka je v řádu desítek
kilobází) obklopena pericentromerickým heterochromatinem, který může mít i několik megabází,
přičemž sekvence v těchto oblastech mohou být stejné (Plohl et al. 2014).
Holokinetické chromosomy mají kinetochor lokalizovaný po celé nebo téměř celé délce
chromosomu. Vyskytují se např. u motýlů, mšic, Caenorhabditis elegans.
Obrázky z práce Varnagelli et al. 2008
5
Monocentrické versus holokinetické
chromosomy
• Výskyt: od primitivních organismů
po vyšší rostliny a živočichy
• Metafáze - chromatidy – tvar X, V
• Nízká odolnost vůči ionizačnímu
záření a klastogenům obecně
• Výskyt: některé skupiny organismů
(prvok Nyctotherus, Nematoda;
rostliny čeledí Juncaceae,
Cyperaceae a Liliaceae; roztoči,
Hemiptera, Trichoptera,
Lepidoptera)
• Metafáze – chromatidy paralelně
• Vysoká odolnost vůči ionizačnímu
záření a klastogenům obecně
6
Monocentrické versus holokinetické
chromosomy
Výhodou kinetochoru lokalizovaného podél (témeř) celého chromosomu je to, že
dojde-li k zlomu chromosomu, oba vzniklé fragmenty se mohou přichytit k
vláknům dělícího vřeténka a mohou se dostat do dceřiné buňky. Na druhou
stranu centromera lokalizovaná do jednoho malého místa, má při
chromosomálním zlomu za následek vznik acentrického chromosomu (nemá
žádnou centromeru), a protože konce chromosomů bez telomer jsou lepivé a
mají silnou tendenci se spojit, vznikne z druhého fragmentu dicentrický
chromosom se dvěma chromatidami. Acentrický chromosom se nemůže přichytit
na dělící vřetýnko a je při buněčném dělení ztracen. Dicentrický chromosom je
pro buňku fatální, protože pokud nedojde k inaktivaci jedné centromery, obě
centromery mohou táhnout chromosom k opačným pólům buňky (tzv. anafázní
můstek), což vede k zastavení dělení a smrti buňky.
7
Centromerické proteiny
Řada funkcí:
- tvorba kinetochoru
- vazba mikrotubulů
- kontrolní bod mezi metafází a anafází
- spojení sesterských centromer
- motorové proteiny
Centromerické proteiny
S centromerami je asociovány proteiny, které zajišťují řadu funkcí (účastní se
tvorby kinetochoru, vazby mikrotubulů, kontrolního bodu mezi metafází a anafází,
spojení sesterských chromatid, atd.). Některé z nich se označují CENP, což
neznamená nic jiného než CENtromerický Protein, nemají společnou funkci ani
strukturu a byly izolovány pomocí protilátek izolovaných z jedinců
s autoimunitními chorobami. Některé jsou markery aktivních centromer a jsou
nezbytné pro jejich fungování (např. CENP-A, CENP-C, ...), jiné jsou zbytné a
nacházejí se i na neaktivních centromerách (např. CENP-B). Na obázku a na
další snímku jsou savčí centromerické proteiny, z nichž některé mají homology i
u bezobratlých a kvasinek.
Obrázek podle Sumner 2001.
8
Savčí centromerické proteiny
CENP-A – centromerická varianta histonu H3
(cenH3)
- marker aktivních centromer (i
neocentromer a umělých centromer)
- lokalizován na vnitřní ploše kinetochoru
CENP-B – vazba na CENP-B boxy v cen. DNA
- i na neaktivních cen., chybí na Y
- rozhoduje o vniku nových centromer a
inaktivaci stávajících (povolává CENPA/zprostředkuje H3K9Me3)
CENP-C a CENP-E – markery aktivních centromer, součásti kinetochoru
- potřeba pro seřazení metafázních chromosomů do roviny
hBUB1, hBUBR1, zw10 a hMAD - kontrolní bod mezi metafází a anafází
MCAK a dynein - kinetochorové motorové proteiny, na vnější straně kinetochoru
INCENps a CLiPs - drží pohromadě sesterské chromatidy
CENP-A je markerem aktivních centromer, je centromerickou variantou histonu H3 (též zvaný
CenH3, Cse4 u S. cerevisiae, CID u D. melanogaster, ceHcp-3 u C. elegans a HTR12 u
Arabadopsis thaliana). Je přítomen nejen u klasických centromer, ale i u přirozených nebo
umělých neocentromer. Jeho knock-out/knock-down způsobí neschopnost centromer vykonávat
svou funkci. Je lokalizován na vnitřní ploše kinetochoru (inner plate) a zřejmě centromerickému
chromatinu uděluje větší pevnost (rigiditu), což je potřeba, aby centromera odolala tahu
mikrotubulů při rozchodu sesterských chromatid.
CENP-B je protein savčích centromer, na jejichž DNA se váže v místech specifických sekvencí
DNA (CENP-B boxů). Může se nacházet i na neaktivních centromerách, naopak v některých
aktivních chybí (např. lidský a myší chromosom Y), není tedy nutný pro fungování centromer
(myši bez CENP-B přežívají, mají jen menší váhu a méně spermií). CENP-B je tedy zřejmě
potřebný pro ustavené nové centromery, ale není potřeba k jejímu udržení. Ukazuje se, že CENPB má dvojí roli: 1) je schopen povolat k centromerické DNA CENP-A, což je klíčové pro vznik
nových centromer (např. u umělých chromosomů), 2) navodit reprimující epigenetickou
modifikaci H3K9Me3, která vede k formování heterochromatitu. Tyto antagonistické síly rozhodují
o tom, jestli se satelitní sekvence stane centromerou nebo neaktivním heterochromatinem.
CENP-C a CENP-E jsou markery aktivních centromer, jsou součástí kinetochoru a jsou potřeba
pro seřazení metafázních chromosomu do roviny. Při jejich selhání buňka nemůže vstoupit do
anafáze. Mají homology u S. cerevisiae a rostlin (Hordeum vulgare a Vicia faba).
hBUB1, hBUBR1, zw10 a hMAD se účastní kontrolního bodu mezi metafází a anafází. BUB a
MAD mají homology u S. cerevisiae a drozofily.
MCAK (mitotic centromere-associated kinesin) a dynein (stejně jako CENP-E) jsou
kinetochorové motorové proteiny umístěné na vnější straně kinetochoru.
INCENps a CLiPs (chromatid linking proteins) drží pohromadě sesterské chromatidy, CLiPs jsou
specifické pro sesterské centromery.
Info z Sumner 2001, Varnagelli et al. 2008
9
Sclerodermia a studium kinetochorů
Sclerodermia
- autoimunitní multisystémová choroba
poškození kůže, škáry, kloubů, pojiva vnitřních orgánů, plic, ledvin
Celková sklerodermie
(Sclerodermia diffusa)
Lokalizovaná sklerodermie
Pacient tvoří protilátky proti centromerám
Protilátky proti centromerám izolované ze séra pacientů se sklerodermií
byly využívány k výzkumu kinetochorových proteinů u živočichů i rostlin kinetochorové proteiny jsou velmi konzervativní
Velký průlom ve výzkumu kinetochorů nastav v roce 1980, kdy se přišlo na to, že
pacienti s CREST syndromem (forma sklerodermie, autoimunitní choroba)
produkují protilátky proti centromerám. Protilátky byly použity pro výzkum
kinetochorových proteinů u živočichů i rostlin, což svědčí o tom, že jsou tyto
proteiny velmi konzervativní.
10
Centromerická DNA
- Často tvořena repetitivní DNA obtížné sekvenovat
- Co víme:
1) Často satelitní DNA/mobilní elementy, ale není pravidlem
2) Rychle se vyvíjí (concerted evolution), koevoluce s cent. proteiny reprodukční bariera speciace
3) Není známa univerzální eukaryotní centromerická sekvence, ale
některé motivy jsou společné pro skupinu (CENP-B box u savců).
4) Funkční centromera (desítky kbp) často obklopena
pericentromerickým heterochromatinem (i > Mb)
Centromerická DNA
Sekvenování centromerické DNA a heterochromatinu obecně je problematická záležitost, protože
obsahují repetitivní DNA, jejíž sekvence je obtížné bioinformaticky složit. Proto i u jinak
osekvenovaných genomů centromery jsou oblasti, které často osekvenované nejsou. Nicméně u
některých druhů rostlin, hub a živočichů sekvence centromerické DNA známe, a z nich vyplývá,
že: 1) velmi často je centromera tvořena satelitní DNA nebo mobilními elementy, 2) centromerická
DNA se rychle vyvíjí a liší se i mezi příbuznými druhy, 3) není známa žádná univerzální
centromerická sekvence, ale některé motivy jsou sdíleny v rámci skupiny, např. tzv. CENP-B box,
17bp sekvence, na kterou se váže CENP-B a je klíčová pro formování kinetochoru. CENP-B box
se vyskytuje v alfa-satDNA člověka a různých alfoidních satelitů v centromerách savců a podobná
sekvence se stejnou funkcí byla nalezena i u některých bezobratlých a rostlin.
SatDNA se vyvíjí podle principu tzv. concerted evolution, kdy jsou mutace mezi monomery
sjednocovány nerovnoměrným crossing-overem, genovou konverzí, replikací valivou kružnicí a
transpozicí. Těmito mechanismy se nová mutace může rychle rozšířit do všech monomerů
satDNA chromosomu nebo chromosomů.
Rychlá evoluce centromerické DNA vyžaduje koevoluci centromerických proteinů. Tyto změny
mohou vést až k reprodukční izolaci a speciaci (Plohl et al. 2014).
Lidské centromery
V centromerách lidských chromosomů jsou dva typy alfa-satDNA: monomerická a repetice
vyššího řádu (HOR, higher-order repeat). HORs se skládají z 2-20 různých 171 bazových
monomerů a jsou obvykle chromosomálně specifické. Vyskytují se v aktivní centromeře i
v pericentromerickém heterochtomatinu a jsou obklopené monomerickou alfa-satDNA (Plohl et al.
2014). Sondy k HORs se používají v lidské cytogenetice k identifikaci jednotlivých chromosomů.
Kinetochor
Kinetochory se podílejí na:
1) přichycení mikrotubulů dělícího vřeténka a
srovnání metafázních chromosomů do roviny
2) opravě chybného přichycení mikrotubulů na
chromosom
3) metafázním kontrolním bodu, kdy buňka
nepokračuje do anafáze, dokud nejsou obě
chromatidy všech chromosomů přichycené na
dělící vřeténko
4) napětí v centromerách, které je signálem pro
opuštění metafázního kontrolního bodu a
vstup do anafáze
12
Typy kinetochorů
- U některých organismů není patrný, mikrotubuly
vstupují přímo do chromatinu (kvasinky)
- Typy kinetochorů:
1) „ball and cup“ – vyšší rostliny a některý hmyz
(Orthoptera)
kinetochor = kulička sedící na prohlubni
(centromeře)
EM řezu metafázního chromosomu s
kinetochorem „Ball and cup“
2) třívrstvý (trilaminar) – nižší rostliny, většina
živočichů
- vnější a vnitřní vrstva husté, prostřední řídká.
- vnější vrstva – vazba mikrotubulů
- vnitřní – nasedá na centromeru
Model trojvrstevného kinetochoru:
chromatinová vlákna spojují vnitřní a
vnější vrstvu
Kinetochor je struktura, která zprostředkovává kontakt mezi centromerou a
mikrotubuly dělícího vřeténka. Některé organizmy (např. kvasinky) kinetochor
nemají (nebo není patrný) a mikrotubuly vstupují přímo do chromatinu.
Kinetochory jsou dvou typů: 1) „ball and cup“, kdy se kinetochor jeví jako
nepravidelná masa (kulička) sedící na prohlubni, kterou je centromera (pohárek).
Tento typ je přítomen u vyšších rostlin a u některých skupin hmyzu (Orthoptera).
Druhým typem je třívrstvý kinetochor, který je složen z husté vnější vrstvy, husté
vnitřní vrstvy sedící na centromeře, a řídké prostřední vrstvy. Většina mikrotubulů
se upíná k vnější vrstvě, ale některé pronikají až do vnitřní vrstvy. Třívrstvý
kinetochor je přítomen v pozdní profázi a metafázi, i když některé jeho složky lze
detekovat i v interfázi. Nachází se u nižších rostlin a většiny živočichů.
13
Typy kinetochorů
EM řez monocentrickým metafázním
chromosomem řasy Oedogonium
EM řez holokinetickým metafázním
chromosomem mikrojádra prvoka
Nyctotherus ovalis
NOR
Oblast organizátoru jadérka
“nucleolus organizing region“ (NOR)
• Je tvořena rDNA geny – místo
intenzivní transkripce
ribosomální RNA (=> kódují
rRNA)
• rRNA tvoří spolu s proteiny
ribosomy => NOR přímo
zodpovídá za vznik jadérka
(nucleolus)
• Počet NOR – druhově specifický
(člověk – 5 párů autosomů nese
NOR)
Místo, kde je lokalizována rDNA (geny pro 18S, 28S a 5,8S rRNA), je nazýváno
organizátor jadérka (NOR, nucleolus organizer region), protože se kolem něj v
interfázním jádře formuje jadérko. U člověka je rDNA lokalizována na praménkách pěti párů akrocentrických chromosomů, které nesou sekundární
konstrikci, což je místo, kde je právě lokalizovaná 45S rDNA. To, proč se toto
místo jeví jako konstrikce není jasné, ale protože rDNA je transkribována až do
začátku profáze, je možné, že se tato oblast jednoduše začne později
kondenzovat.
16
Schéma rDNA transkripční jednotky
vyšších eukaryot
(tato struktura vysoce konzervovaná)
rDNA jsou klastry genů kódujících ribosomální RNA. Klastr obsahuje stovky kopií
tzv. 45S rDNA, což je název pro operon obsahující kromě genů pro 18S, 5,8S a
28S rRNA i přepisující se oblasti ETS (external transcribed spacer) a ITS
(internal transcribed spacer). Kopie 45S jsou odděleny nepřepisující se oblastí
(nontranscribed spacer, NTR). Počty ribosomálních genů se u různých
organizmů liší. Ty, které mají malý genom, mají méně než 100 rRNA genů,
naopak některé rostliny a obojživelníci, kteří mají velmi velké genomy, mohou mít
až 10 000 kopií rRNA genů. Geny pro 5S rRNA jsou lokalizované mimo klastr,
často na jiném chromosomu než 45S, a jsou srovnatelně početné jako 45S.
17
Metody lokalizace NOR a jadérka
- Barvení AgNO3
vizualizuje některé proteiny v
jadérku (interfáze) a v NORech,
které byly v interfázi aktivní
(mitóza, meióza)
NORy na metafázních
chromosomech
Jadérko v interfázním
jádře
- FISH s rDNA sondou
lokalizuje i neaktivní NORy
- YOYO – fluorochrom
barvící DNA i RNA
rDNA-FISH se sondou pro 18S rDNA
pozdní profáze (YOYO-1)
Detekce rDNA na chromosomech
Klasickou metodou vizualizace NORů a jadérek je barvení dusičnanem
stříbrným. Tato metoda detekuje jadérka v interfázi a na metafázních
chromosomech NORy, které byly aktivní v předchozí interfázi. Z toho ovšem
vyplývá, že takto nemusejí (a obvykle nejsou) detekovány všechny NORy (u
člověka obvykle jen 7-8 z 10). Barvení AgNO3 detekuje některé proteiny, které
byly součástí jadérka a zůstaly asociované s NOR i během buněčného dělení.
Jsou to především RNA polymeráza I a transkripční faktory.
Další metodou vizualizace rDNA je FISH. Výhodou je to, že lze detekovat i
neaktivní rDNA.
Obrázky z Bombarová et al. 2007 a Novotná et al. 2010
18
Jadérko v interfázi
Ultrastruktura:
Fibrillar centre – lokalizace rDNA a
RNA polymerázy I syntéza rRNA
Dense fibrillar component – asociace
rRNA s ribosomálními proteiny
Granular component – skládání preribosomů
Jadérko přítomno jen v interfázi a v profázi (do rozpuštění jaderné
membrány)
Jadérko existuje pouze v interfázi a na začátku buněčného dělení (profáze) do
rozpuštění jaderné membrány. Funkcí jadérka je transkripce 45S rDNA, rozdělení
vzniklé RNA na 18S, 5,8S a 28S RNA a jejich spojení s ribosomálními proteiny v
pre-ribosomech. Jadérko se skládá z tří vrstev: vláknité centrum (fibrillar centre,
FC), obklopené tenkou vrstvou o vysoké hustotě (dense fibrillar component,
DFC) a vnější hmotou (granular component, GC). V FC jsou lokalizované rDNA a
RNA polymeráza I, v DFC se rRNA váže na proteiny a v GC dochází k skládání
pre-ribosomů.
Obrázek ultrastruktury jadérka z
http://users.path.ox.ac.uk/~pcook/students/14nucbm.html
19
Telomery
Telomery
= fyzické konce eukaryotních
chromosomů
- řada funkcí:
1) ochrana chromosomů před fúzemi
2) řeší problém replikace konců
3) omezuje počet buněčných dělení role ve stárnutí a rakovině
Telomery jsou DNA-proteinové struktury na koncích eukaryotních chromosomů.
Mají řadu funkcí: 1) Telomery chrání chromosomy před fúzemi, protože
chromosomy bez nich mají tendenci se k sobě „lepit“ a tvořit dicentrické
chromosomy. Zároveň zajišťují, že konce chromosomů nejsou rozpoznávány
reparačními mechanismy buňky jako dvouřetězcové zlomy, což by mohlo vést až
ke smrti buňky. 2) Telomery řeší problém replikace konců, tj. fakt, že díky
neschopnosti DNA polymerázy začít syntézu DNA bez volné OH- skupiny při
každé replikaci ubyde kousek DNA (viz dále). 3) Počet dělení , která může
buněčná linie absolvovat, je omezená (Hayflickův limit), což slouží jako ochrana
před rakovinným bujením. Negativní stránkou tohoto mechanismu je stárnutí, kdy
v tkáních nemohou být nahrazeny odumřelé buňky. Telomery v tomto
mechanismu díky postupnému ubývání při každé replikaci DNA slouží jako
počítadlo buněčných dělení, která buňka již absolvovala.
21
Objev telomer
Barbara McClintock
- Přirozené konce chromosomů se chovají jinak než
chromosomální zlomy
- Telomery (telos – konec a meros – část)
Chromosomy chráněné
telomerami
Chybějící telomery
Napojení chromosomů na
dělící vřeténko
Vznik dicentrického
chromosomu
Úspěšný rozchod chromosomů
Rozchod chromosomů
znemožněn
Smrt buňky
Barbara McClintock pozorovala u kukuřice, že se přirozené konce chromosomů
chovají jinak než dvouřetězcové zlomy, a že tedy musejí mít nějaký ochranný
mechanismus, který brání jejich fúzím. Tyto konce byly pojmenovány telomery z
řeckého telos – konec a meros – část (název vymyslel Herman Muller, který
objevil telomery u drozofily paralelně s McClintock). Až později byla objevena role
telomer v zachování integrity genomu, jejich struktura a způsob fungování.
B. McClintock - americká cytogenetička, 1983 dostala Nobelovu cenu za
fyziologii a medicínu za objev mobilních elementů u kukuřice. Studovala
centromery a telomer, rekombinaci, vytvořila první genetickou mapu chromosomů
kukuřice.
22
Jak telomery vypadají
Elisabeth Blackburn – práce s modelovým organismem Tetrahymena
thermophila
Prvok Tetrahymena thermophila - 2 jádra:
Micronucleus
- předáváno do další generace (ochrana DNA)
- transkripčně neaktivní
Macronucleus
- genetický materiál modifikován – nedědí se
- transkripčně aktivní
- masivní fragmentace DNA syntéza telomer
Mochizuki 2010
Objev první telomerické sekvence (TTGGGG)
V roce 1978 se podařilo Elisabeth Blackburn identifikovat v telomerách u prvoka
Tetrahymena thermophila (Ciliophora, Ciliata, Chromalveolata) sekvenci
TTGGGG , která je v telomeře v mnoha tandemově uspořádaných kopiích.
Výběr nálevníka byl geniální v tom, že tato skupina má dva typy jader.
Mikronukleus obsahuje normální chromosomy, které ale zůstávají neaktivní a
slouží jen k meióze a k přenosu genetické informace do další generace.
Makronukleus vzniká z mikronuklea fragmentací chromosomů, delecemi,
amplifikacemi a syntézou nových telomer. Výsledkem je polyploidní jádro plné
transkripčně aktivních acentrických fragmentů DNA, z nichž každý je opatřen
vlastními telomerami. Při vzniku makronuklea je tedy telomerická sekvence
zastoupena ve vysoké koncentraci. O pár let později prokázali Blackburn a Jack
Szostak, že telomerická sekvence z Tetrahymeny může iniciovat vznik nové
telomery u kvasinky.
23
Podoba telomer je velice konzervativní
Nalezeno několik variant sekvencí – často stejné v rámci velkých skupin:
TTTAGGG – většina rostlin
TTAGG – většina členovců
TTAGGG – většina mnohobuněčných živočichů
ALE existují výjimky – jiné sekvence a
mechanismy prodlužování telomer
Po objevu telomerické sekvence u Tetrahymeny se podařilo identifikovat několik
dalších telomerických sekvencí. Zajímavé je, že jsou často společné pro velké
skupiny eukaryot (např. TTTAGGG u většiny rostlin, TTAGG u většiny členovců).
Byly ale objeveny i druhy, které nemají žádnou ze známých telomerických
sekvenci, takže mohou mít buď dosud nenalezenou variantu nebo vynalezly jiný
mechanismus udržování telomer. Dva z těchto alternativních mechanismů se
podařilo prozkoumat, oba u dvoukřídlého hmyzu – 1) transpozice retroelementů u
drozofily a 2) rekombinace mezi satelitní DNA (Chironomus, Anopheles) (viz
dále).
24
Struktura telomer
Struktura telomer
DNA: Jednořetězcový převis bohatý na guanin (je prodlužován telomerázou)
invaduje do dvouřetězcové oblasti a vytvoří T-smyčku (tzv. telomerickou
smyčku). T-smyčka tak ukryje konec telomery před exonukleázami a reparačními
mechanismy buňky, které by volný konec považovaly za zlomenou DNA.
Proteiny: Na telomery se váže multiproteinový komplex shelterin. Ten obsahuje
jak proteiny, které se váží na jednořetězcový převis (Pot1 (protection of
telomeres) +TPP1 heterodimer), tak na dvouřetězcovou oblast: TRF1 a TRF2
(telomere repeat binding factors), jejich kofaktory Rap1 (repressor activator
protein 1) a Tin2 (TRF1-interacting nuclear protein 2). TRF1 a jeho interagující
proteiny zřejmě regulují prodlužování telomer tím, že ovlivňují přístup telomerázy.
TRF2 a Pot1 také ovlivňují délku telomer a navíc brání spojování konců
chromosomů.
Obrázek z Martínez a Blasco 2010
Struktura telomer u drozofily
- Telomery prodlužovány transpozicí
- Non-LTR retrotransposony – vmezeřují se
do telomery
- Konec chráněn čepičkou – proteinovým
komplexem konec není rozpoznán jako
zlom DNA + chráněn před degradací
Telomera u drozofily je tvořena non-LTR retrotransposony Het-A, TART a
TAHRE, které se do ní vmezeřují. Úplný konec telomery nese čepičku –
proteinový komplex, díky kterému je konec chromosomu chráněn před degradací
a není rozpoznán jako dvouřetězcový zlom DNA.
Obrázek z Mason et al. 2007.
26
Prodlužování telomer rekombinací
• Chromosomy dvoukřídlého hmyzu
zakončeny dlouhými satelitními
repeticemi - např.:
– pakomár Chironomus
– komár Anopheles
• Alternativní mechanismus
prodlužování telomer (ALT):
REKOMBINACE
Druhým alternativním mechanismem prodlužování telomer je rekombinace mezi
různě dlouhými telomerickými sekvencemi. Podle tohoto modelu se telomery
prodlužují invazí 3’ konce řetězce DNA s krátkou telomerou do dvoušroubovice s
dlouhou telomerou. Dlouhá telomera pak poslouží jako templát pro syntézu DNA
(čili k prodloužení telomery invadujícího řetězce). Po návratu toto prodloužené
vlákno poslouží jako templát pro prodloužení 5’ konce druhého vlákna s krátkou
telomerou.
Obrázek z Mefford & Trask, 2002
27
Telomery řeší problém replikace
konců DNA
James Watson
Při replikaci DNA dochází ke zkrácení molekuly
(problém replikace konců)
Schéma replikace DNA
DNA polymeráza neumí začít syntézu nového
vlákna DNA,
RNA polymeráza ano
dvoušroubovice
DNA
replikace DNA začíná
od RNA primerů
S každou replikací se DNA o kus zkrátí
Řešení: dlouhé nekódující úseky DNA na
koncích chromosomů neboli telomery.
Ale i telomery se musejí nějak obnovovat!
syntéza nových vláken DNA
podle původních vláken
odbourání RNA primerů
- nová vlákna nejsou kompletní
V 70. letech poznamenal James Watson, že způsob, jakým se DNA replikuje,
neumožňuje zreplikovat i její úplné konce, takže by se při každém dělení buňky
měla kousek zkrátit. Nazval tento jev problémem replikace konců. Přibližně ve
stejnou dobu pochopil Alexej Olovnikov, že zkracování konců chromosomů
může být příčinou omezeného počtu dělení normálních buněk a našel tak
souvislost mezi problémem replikace konců a Hayflickovým limitem. Zkracování
konců chromosomů funguje jako hodiny, které odměřují počet dělení, která již
buňka absolvovala a kolik jich ještě absolvovat může.
Problém replikace konců je založen na faktu, že DNA polymeráza potřebuje k
syntéze DNA volnou OH- skupinu na deoxyribóze, bez níž nedokáže začít.
Replikace DNA začíná tedy syntézou krátkých RNA primerů, protože RNA
polymeráza volný OH- konec nepotřebuje a může začít syntézu RNA kdekoli. Na
vzniklé primery nasedne DNA polymeráza a začne je prodlužovat vznikající
DNA. RNA primery jsou následně odstraněny, DNA polymeráza vyplní vzniklé
mezery DNA (využívá OH-skupiny z DNA, kterou syntetizovala předtím pomocí
RNA primerů) a řetězce jsou spojené ligázou. Jedinou výjimkou jsou úplné
začátky chromosomů, kde po odstranění RNA primeru nemá DNA polymeráza
kam nasednout a kde se tedy DNA nezreplikuje. Každou replikací DNA by se
tedy molekula DNA měla o kus zkrátit.
Problém replikace konců a jejich prodlužování je dobře znázorněn na tomto
videu:
http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s
Telomeráza
- Objevena u Tetrahymena thermophila
- Enzym doplňující telomerickou DNA
- Reverzní transkriptáza – syntetizuje DNA podle RNA
- RNA matrice je součástí enzymu
2009 – udělena Nobelova cena za
fyziologii a medicínu za objev
telomerázy
Elizabeth Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak
V roce 1985 Blackburn a Carol Greider objevily telomerázu, enzym, který
prodlužuje telomery a kompenzuje tím jejich zkracování během replikace DNA.
Telomeráza byla izolována z Tetrahymeny po páření v době formování
makronuklea, kdy se masově syntetizují telomery. Telomerázu původně
pojmenovaly telomerická terminální transferáza, později po její purifikaci zjistily,
že enzym v sobě obsahuje RNA složku, komplementární k sekvenci telomery,
která slouží jako templát pro syntézu telomerické DNA, zatímco proteinová
složka (TERT) má enzymatickou aktivitu. Telomeráza je tedy reverzní
transkriptáza, enzym, který syntetizuje DNA podle RNA matrice.
Telomeráza složena z několika podjednotek:
TERT – reverzní transkriptáza
TR (TERC) – RNA templát
Telomery - stárnutí vs. nesmrtelnost
August Weissmann
- stárnutí je způsobeno omezeným množstvím buněčných dělení
A. Weissmann
Alexis Carrel
- kultivoval kuřecí fibroblasty 34 let
stárnutí je vlastností těla, ne
buněk
- nepodařilo se zopakovat
A. Carrel
Paul Moorhead a Leonard Hayflick
- kultivace lidských fibroblastů počet
buněčných dělení omezen na 40-50
Hayflickův limit
L. Hayflick
V roce 1881 přišel německý biolog August Weismann s myšlenkou, že smrt je
důsledkem omezenému množství buněčných dělení a tím pádem i neschopnosti
tkání se donekonečna obnovovat. Tuto myšlenku napadl Alexis Carrel (nositel
Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu 1912), který ve své laboratoři pěstoval
buněčnou kulturu z kuřecích fibroblastů kontinuálně 34 let, a tvrdil, že buňky se
mohou dělit donekonečna a to, že to nedělají, je způsobeno chybnou kultivací.
Stárnutí bylo podle něj znakem mnohobuněčného těla jako celku. Jeho práci se
ale nikomu nepodařilo zopakovat a jeho koncept nesmrtelných buněk byl opuštěn
po publikování práce Paula Moorheada a Leonarda Hayflicka, kteří prokázali, že
počet dělení buněk je omezen na konkrétní počet. Kultivovali lidské fibroblasty
izolované z kůže a zjistili, že se tyto buňky přestali dělit po 40-50 děleních. Počet
dělení, které může buňka absolvovat, se nazývá Hayflickův limit.
Hayflickův limit neplatí pro všechny
Platí
Neplatí
ryby
většina savců
plazi
ptáci
obojživelníci
bezobratlí
Hayflickův limit – obrana proti
rakovině
Alexej Olovnikov
Zkracování konců chromosomů může být příčinou
omezeného počtu dělení normálních buněk
našel tak souvislost mezi problémem replikace
konců a Hayflickovým limitem (1971).
Hayflickův limit (1961) – počet dělení,
která buňka může absolvovat
telomery = marker stáří buňky (mnoho
dělení = krátké telomery)
Ale co telomeráza?
Alexej Olovnikov je ruský biolog, který v roce 1971 postuloval teorii, že příčinou
omezeného množství dělení buněk je zkracování telomer. Ty tedy slouží jako
biologické hodiny odměřující kolik dělení ještě může buňka absolvovat. Přestože
byl první, kdo tuto teorii publikoval, nebyl navržen na Nobelovu cenu, ale v roce
2009 dostal Demidovovu cenu, prestižní ocenění udělované členům Ruské
akademie věd.
Telomeráza, kmenové buňky a
rakovina
U člověka je telomeráza aktivní pouze během embryonálního vývoje
a v dospělosti v kmenových buňkách
Cca 85% lidských nádorů má aktivovanou telomerázu.
Model role telomer v stárnutí a rakovině založený na kmenových buňkách
Kmenové buňky mají, narozdíl od většiny somatických buňek, aktivní telomerázu.
Množství telomerázy je ale malé, takže ztrátu telomer jen zpomaluje, ale není
schopná jí zcela kompenzovat. Kmenové buňky se v tkáních nacházejí v nikách.
Jak buňky v tkáních odumírají, kmenové buňky proliferují, aby ztrátu
kompenzovaly. To ale vede ke zkracování jejich telomer, takže když je dosaženo
Hayflickova limitu, kriticky krátké telomery jsou rozpoznávány jako poškozená
DNA a kmenové buňky přestanou odpovídat na svou mobilizaci. Tkáň přestane
regenerovat, což nakonec vede k selhání orgánu. Pokud se kmenové buňky
naučí doplňovat si telomery, může to vést ke vzniku rakoviny. Obrázek z Donate
a Blasco 2011
V roce 1994 byla vyvinuta TRAP assay, metoda, která je schopna detekovat
přítomnost telomerázy v buňce. S její pomocí se zjistilo, že 85% nádorů obsahuje
aktivní telomerázu, která je od té doby předmětem výzkumu protinádorových
terapií.
Telomery a stárnutí
Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na:
- věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc
bazí než století stařečci)
Hayflickův limit
Telomeráza je u člověka aktivní během embryonálního vývoje, čímž je
kompenzováno zkracování telomer při masivní proliferaci buněk v rostoucím
embryu. U dospělého člověka je telomeráza aktivní jen v některých buňkách.
Proto nejdelší telomery má novorozenec a jejich délka se během života zkracuje.
34
Telomery a stárnutí
Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na:
- věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc
bazí než století stařečci)
- tkáni
Např:
Epidermis – 33 bp/rok
Střevní sliznice – 59 bp/rok
Játra – 120 bp/rok
Endotel – 147 bp/rok
Srdce – nedetekovatelné
Mozek - nedetekovatelné
Telomery a stárnutí
Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na:
- věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc
bazí než století stařečci)
- tkáni
- genetické dispozici
Těžký život bez telomerázy
Myši s deaktivovanou telomerázou měly:
- kratší život
- nestabilní genom
- zvýšený výskyt nádorů
- zkrácené telomery
Mnoho informací o roli telomerázy pochází z myší, které měly deletovanou RNA
komponentu z telomerázy. I když chybějící telomeráza nezpůsobovala všechny
projevy stárnutí, myši některé projevy měly: zkrácené telomery, genetickou
nestabilitu, sníženou reakci na stimulaci hematopoezy, kratší život a zvýšené
množství maligních nádorů.
Těžký život bez telomerázy
Lidská onemocnění způsobena nedostatkem funkční telomerázy:
Kongenitální dyskeratóza
- pigmentové skvrny na kůži, bílé skvrny v ústech, anémie
- úmrtí většinou na selhání kostní dřeně
- způsobena mutacemi v genech pro telomerázu nebo asociované proteiny
Aplastická anémie
- útlum kostní dřeně málo krevních buněk
- může být způsobena mutacemi v genech pro telomerázu
Idiopatická plicní fibróza
- zjizvení plic snížená kapacita chronický kašel, zadýchávání
- může být způsobena mutacemi v genech pro telomerázu
Dyskeratosis congenita (DKC, Kongenitální dyskeratóza) je dědičné
onemocnění, které se projevuje hyperpigmentací (tmavé skvrny na kůži), orální
leukoplakií (bílé skvrny v ústech a nehtovou dystrofií (chybějící nehty). Úmrtí ve
většině případů nastává selháním kostní dřeně, dále imunodeficiencí, dýchacími
obtížemi a rakovinou. Autosomálně dominantní forma je způsobena mutací
v genech kódujících TR nebo TERT, které redukují aktivitu telomerázy a tím i
schopnost proliferace kmenových buněk. To vede i nízkému množství bílých a
červených krvinek (aplastická anemie). Rodiny s DKC vykazují zhoršování
projevů z generace na generaci kvůli zkracujícím se teloomerám, které jsou
předávány potomkům.
Aplastic anemia (AA) je většinou získaná choroba, ale vzácně s objevují rodiny,
kde je děděná. Její příčinou je pak mutace v genech pro TR nebo TERT. Často je
spojena s DKC, ale v některých případech chybějí typické projevy. Při AA má
pacient malé množství krevních buněk a smrt nastává většinou v důsledku
selhání kostní dřeně.
Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF)
idiopathic = vyskytující se spontánně bez jasné příčiny
IPF je onemocnění, jehož příčina je často neznámá. Projevuje se vazivovými
jizvami na plicích, což zmenšuje jejich kapacitu. Symptomy jsou chronický kašel
a zadýchání bez fyzické námahy. V některých rodinách je toto onemocnění
dědičné a je způsobeno mutací v genech pro TERT a TR.
Další choroby spojené s redukcí
telomer
Lidská onemocnění bez mutací v telomeráze, ale s krátkými
telomerami, např:
Wernerův syndrom
- předčasné stárnutí po 10. roce (šedivé vlasy, slabá kůže, diabetes,
arteroskleróza, rakovina)
- rychlé zkracování telomer a nestabilita genomu
- nejčastější příčina smrti – infarkt nebo rakovina
- mutace v genu WRN (DNA helikáza) – interaguje s telomerickým proteinem
Trf2 rozplétání telomer při replikaci?
Wernerův syndrom
WS je autosomálně recesivní onemocněním jehož jedinou známou příčinou je
mutace v genu WRN, který kóduje DNA helikázu. Při tomto onemocnění bylo
pozorováno rychlé zkracování telomer a nestabilita genomu. První příznaky
nastávají obvykle po 10. roce, po pubertě následuje rychlé stárnutí. Projevy jsou:
chybějící růstové sprouty, šedivění vlasů, slabá kůže, diabetes, katarakta,
hypogonadismus, arteroskleróza a rakovina. Častou příčinou smrti je infarkt nebo
rakovina. Není známo propojení mezi funkcí helikázy a telomerami, ale tato
helikáza má silnou afinitu k telomerickému proteinu Trf2 (TTAGGG repeat
binding factor 2) a její funkcí by mohlo být rozplétání telomer pro replikaci
(Opresko et al. 2002)
Další choroby spojené s redukcí
telomer
Lidská onemocnění bez mutací v telomeráze, ale s krátkými
telomerami, např:
Fanconiho anemie
- vzácná genetická choroba, průměrná doba života 30 let
- způsobená vyřazením některého z 15 genů pro opravu DNA
- často nízká postava, abnormality kůže, rukou, hlavy, ... ,
- rakovina (nejčastěji AML)
- telomery se zkracují odlamováním spojování chromosomů nestabilita
genomu
Fanconiho anemie
FA je vzácná genetická choroba (častější u Židů Aškenazi a v Jižní Africe),
způsobená vyřazením některého z 15 genů, které se účastní reparace DNA.
Většina pacientů dostane rakovinu (většinou akutní myeloidní leukemii),
průměrný věk úmrtí je 30 let. Většina pacientů má i další problémy, často nízká
postava, abnormality kůže, rukou, hlavy, ... U FA bylo prokázáno, že dochází
k progresivnímu zkracování telomer vlivem zlomů v telomerických oblastech
(fragmenty telomer pozorovány po FISH mimo chromosomy), důsledkem je 10x
vyšší frekvence spojování chromosomů než u zdravých lidí, a tím i vysoká
nestabilita genomu (Callén et al. 2002).
Telomery a stárnutí
Délka telomer u člověka je kolem 13 000 bp, ale záleží na:
- věku (novorozenci mají telomery delší i o několik tisíc
bazí než století stařečci)
- tkáni
- genetické dispozici
- životním stylu
Negetické faktory ovlivňující délku
telomer
• Vysoký krevní tlak
• Kardiovaskulární choroby
• Obezita
• Zánět tlustého střeva
• Dlouhodobé vystavení cigaretovému kouři
• Dlouhodobý stres
Na délku telomer u člověka mají vliv i negenetické faktory – prostředí a
biochemie. Na krátké telomery mají vliv ulcerózní kolititida (zánět tlustého
střeva), obezita, vysoký krevní tlak, kardiovaskulární choroby a chronické
vystavení cigaretovému kouři. Rovněž vysoká produkce stresových hormonů
(glukokortikoidů) má negativní vliv na udržování telomer. E. Blackburn a její tým
ukázali, že staří lidé s krátkými telomerami mají kratší život a méně zdravých let.
Směry výzkumu telomer
Telomery a stárnutí
– potenciální aplikace v kosmetice – krémy/nápoje
aktivující/dodávající telomerázu
- genová terapie - aktivace telomerázy v dospělých
somatických buňkách – problematické, riziko rakoviny
Směry výzkumu telomer
Telomery a stárnutí
– potenciální aplikace v kosmetice – krémy
aktivující/dodávající telomerázu
- genová terapie - aktivace telomerázy v dospělých
somatických buňkách – problematické, riziko rakoviny
Klonování zvířat ze somatických buněk
- délka telomer klonovaných zvířat je různá
- záleží na použité buňce
Telomery a klonování savců
Dolly – první vytvořený
savčí klon
- narozena v r. 1997 – klon
z buňky mléčné žlázy
Dolly zemřela mladá (6,5 roku místo 11-12 let)
Její telomery byly kratší, než odpovídalo věku Dolly byla biologicky starší než její skutečný věk!
Robert Lanza a kolektiv (2000): 6 telat
klonovaných z dělících se nediferencovaných
buněk (fibroblastů) - dle délky telomer
dokonce biologicky mladší!!!
Klonování savců se provádí tak, že ze somatické buňky dospělého jedince je
odebráno jádro, které je vloženo do vajíčka zbaveného vlastního pronuklea. Z
této diploidní buňky se začne vyvíjet embryo, které je implantováno náhradní
matce, která je donosí a porodí. Mládě nese stejnou genetickou informaci jako
jedinec, kterému byla odebrána somatická buňka. Klonování savců je
problematické, protože má velmi malou účinnost a i narozené klony často trpí
zdravotními problémy nebo umírají bez zjevné příčiny.
Prvním klonovaným savcem byla ovce Dolly, která vnikla ze somatické buňky
odebrané z vemene dospělé ovce. Dolly zemřela poměrně mladá (cca v polovině
věku, kterého se ovce dožívají). Při analýze délky jejích telomer se ukázalo, že
neodpovídají věku Dolly, ale věku Dolly plus věku ovce, ze které pocházela
somatická buňka použitá ke klonování. Na druhou stranu to, že klon bude mít
krátké telomery, není pravidlem. Jiná práce, popisující klonování krávy, ukázala,
že narozené klony měly telomery ještě delší, než by měla přirozeně počatá telata
(Lanza et al. 2000).
45
Směry výzkumu telomer
Telomery a stárnutí
– potenciální aplikace v kosmetice – krémy
aktivující/dodávající telomerázu
- genová terapie - aktivace telomerázy v dospělých
somatických buňkách – problematické, riziko rakoviny
Klonování zvířat ze somatických buněk
- délka telomer klonovaných zvířat je různá
- záleží na použité buňce
Telomery a rakovina
- inhibice telomerázy v nádorech – často toxické in
vivo nebo neefektivní
- nejslibnější očkování proti telomeráze
Vývoj léků
Protože telomeráza a udržování telomer hraje roli ve vývoji různých malignit,
pracuje se na vývoji léků, které cílí na telomerázu nebo telomery. Navzdory
velkému úsilí jen minimum léků se dostalo až do klinických zkoušek, protože
většina vykazovala buď malou efektivitu nebo toxicitu in vivo. Roli hraje
samozřejmě i to, že o regulaci telomerázy a jejích funkcích víme stále velice
málo. Zatím nejslibnější je vakcinace pacientů s rakovinou proti hTERT epitopům
(Vonderheide 2008/2009).
46
Prodlužování telomer rekombinací
aneb proč nás vypnutí telomerázy neochrání před rakovinou
Alternativní mechanismus
prodlužování telomer (ALT):
REKOMBINACE
- nalezen i u člověka
Nepotřebují telomerázu
85% lidských nádorů má aktivní
telomerázu zbytek používá
alternativní prodlužování telomer V roce 1990 byl u kvasinek objeven způsob prodlužování telomer nezávislý na
telomeráze, v roce 1994 bylo totéž objeveno u savců. Ukázalo se, že 10-15%
nesmrtelných buněčných linií tento ALT (Alternative Lengthening of Telomeres)
systém využívá. Protože 85% lidských nádorů má aktivní telomerázu, je tato
slibným cílem pro nádorovou terapii, nicméně už teď je jasné, že na zbývajících
15% tato terapie fungovat nebude.
47
Co si odnést z této přednášky
1) Centromery – místo nasedání kinetochoru, funkce: bezchybný
rozchod chromosomů
2) Monocentrické vs. holokinetické chromosomy
3) DNA centromer – rychlá evoluce, často repetitivní DNA,
důležité jsou epigenetické markery
4) Centromerické proteiny – řada funkcí (vazba mikrotubulů,
motorové proteiny, kontrolní bod, ...)
5) NOR (organizátor jadérka) – rDNA, různé počty + různý počet
genů
6) Jadérko – transkripce rDNA, jen v interfázi a profázi
Co si odnést z této přednášky
7) Telomery – konce eukaryotních chromosomů, jsou nezbytné
pro fungování buňky (replikace konců, nelepivé konce,
Hayflickův limit).
8) Telomery jsou složené z DNA a proteinů. Sekvence
telomerické DNA je často společná pro velké skupiny
organismů. Ale existují výjimky!
9) Telomeráza, enzym prodlužující telomery, je u člověka aktivní
pouze během embryonálního vývoje a v dospělosti v
kmenových buňkách. Její aktivace v dospělých somatických
buňkách může vést k rakovině.
10) Na délku telomer má vliv i životní styl. Takže sportujte, jezte
zdravě a nestresujte se.
Don’t worry, be happy!

Podobné dokumenty

Cytogenetika-06-Pohlavni bunky

Cytogenetika-06-Pohlavni bunky Genová konverze (GK) je změna jedné alely v jinou, která byla přítomna na nesesterské chromatidě. Ke GK dochází tak, že v místě genu dojde ke c.o., čili vznikne hybridní dvoušroubovice DNA obsahují...

Více

7. – 9. prosince 2006 II. DNY DIAGNOSTICKÉ

7. – 9. prosince 2006 II. DNY DIAGNOSTICKÉ a experimentální onkologie v Olomouci. Po zkušenostech z předchozího ročníku jsme druhý ročník koncipovali jako třídenní konferenci, abychom se vyhnuli paralelním sekcím. V loňském roce jsme totiž ...

Více

restaurace frickers

restaurace frickers biologie a příbuzné) v hodnotě 50 000 Kč na volný nákup zboží od firmy Sigma-Aldrich.

Více

KaVo PHYSIO 5007. Židle pro zubní praxi

KaVo PHYSIO 5007. Židle pro zubní praxi praxích. Každý chce co nejlépe sedět. Vy jako zubní lékař, vaše asistentka i vaše recepční. Práce u počítače vyžaduje jinou pozici sezení než při ošetřování pacienta. Při práci u počítače je sedací...

Více

DNA - Laboratory of Mouse Molecular Genetics

DNA - Laboratory of Mouse Molecular Genetics vyjádřený buď ve formě proteinu nebo RNA.

Více

Vybraná témata pro výuku chemie - Učitel chemie

Vybraná témata pro výuku chemie - Učitel chemie elektronová hustota je posunuta směrem k elektronegativnějšímu atomu, v tomto případě k atomu chloru. Na atomu s nižší elektronegativitou – vodíku – v důsledku toho vzniká částečný (parciální) klad...

Více

Broumovské noviny

Broumovské noviny v Hořicích. P. Slezák: Snaha o zkrášlování životního prostředí, záchrana památek, jejich rekonstrukce (opravy) stojí město velké úsilí i peníze. O to víc nás mrzí, že někteří jedinci majetek města ...

Více