Regulace translace

Regulace translace
1. Translační aparát
2.
Translace
3.
Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace
4.
Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace
5.
Translace v mitochondriích a chloroplastech
ITAF = initiation trans acting factor
„chaperone“ aktivity´konformace domény pro IRES
¨mnohočetné RNA vazebné domény
Vagner S. et al. 2001, EMBO Report 2, 893-898
2. translace- iniciace
v jakých situacích je využíván IRES
Virové napadení – IRES
fialová= virová partikule, růžová= eIF3,
eIF3 tvoří komplex 40S/IRES
napadení viry, apoptoza, stres, cell cycle G2/M
1
Apoptoza - IRES
Homeostáze buňky udržována (mimo jiné) rovnováhou mezi :
Ø  Inhibiory apoptozy (Bcl2)
blokace inhibitorů = uvolňování cytochromu C z mitochondrií
Ø  Receptory apoptozy (IAP)
Ø  Apoptotické proteázy
aktivační faktor Apaf1-interakce s prokaspázou 9
IRES se podílí na syntéze jednotlivých fází apoptozy
Stres -IRES
stresor:
teplota, hladovění, zasychání, osmotické nerovnováhy, těžké kovy,
napadení patogenem
Ø  stres – buňka se brání vzniku proteinových agregací
Ø  stres - okamžitá represe translace konstitutivních typů mRNA,
mRNA jsou z translačního aparátu odstraněny do „stres granulí“
Ø  stres – okamžitá exprese specifických stresových proteinů
HSP + sHSP
HSP: 60, 70, 90, 110, 120 kDa
sHSP: 23, 25, 28kDa v živočišných buňkách, jejich aktivita spojena s fosforylací
15 – 35 kDa, široká škála až 20 typů bílkovin v rostlinných buňkách
Stres - IRES
1.  translační aparát – tRNA
strukturní modifikace
Nepříznivé vnější podmínky – stresory:
Ø  Aktivace stresové odpovědi
Ø  Změna programu bunky: metabolická
energetická
translační – translační aparát:
modifikace TF
přeskupení mRNA
(přesun konstitutivních typů mRNA do stresových granulí)
fosforylace IF2alfa
F4E
S6 proteinu
modifikace inosinové tRNA
2
2.translace – stres
(př. interakce bílkovina – DNA, bílkovina-bílkovina a úloha fosforylace bílkoviny)
2. translace- modifikace iniciace, stres
Okamžitá exprese stresových bílkovin???
1.  mRNA kódující stresové bílkoviny nemá čepičku využívá systém IRES
2. Stresové bílkoviny přímo ovlivňují iniciaci, iniciační faktory
Ø  Hsp27 indukovaný stresem v savčích buňkách interakuje přímo s
faktorem 4G a tak brání translaci konstitutivních proteinů
Ø  overexprese Hsp70 udržuje 4G funkční a umožňuje jeho zabudování
do4F, podílí se na nastartování translace po stresu
Ø  tyto nálezy zatím jen v živočišných buňkách
Ø  u rostlin působí Hsp101 jako translační enhancer, je funkčně obdobou
TMV
Ø  vazba Hs101 na mRNA „vrací“ funkci 4G a eIF3 a tím konfigurují 40S
komplex pro expresi konstitutivních bílkovin
Buněčný cyklus - IRES
PITSLRE kinázy – rodina cyklin dependentních – regulovány cis-trans elementy
specifické pro G2/M fázi spolu s vysokou hladinou fosfoylace IF2
= aktivace IRES
2. Translace – modifikace iniciace
RIP = ribosome inactivating proteins = inhibitory = stop proteosyntézy
= cytotoxické proteiny, ribosomální jedy
mají N-glykosidázovou aktivitu, štěpí glykosidickou vazbu 28S rRNA v
60S podjednotce = neschopnost vazby ribosomu na eEF2
Přirozená obrana rostlinné buňky proti virovým infekcím
Celosia cristatae)
Ricinus communis
3
2. translace- iniciace
Iniciace je mnohostupňovým procesem
• 
Aktivace aminokyselin
• 
Aktivace 40S ribosomální podjednotky
• 
Vytvoření ternárního komplexu
• 
Vytvoření preiniciačního komplexu
• 
Aktivace mRNA
• 
Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mRNA
• 
„Scanování“ mRNA reiniciačním komplexem až po AUG kodón
• 
Vazba PABP na čepičku
• 
Recyklace eIF2.GDPNapojení PABP na čepičku
Iniciace – „čepička“ na 5´UTR =
platí vždy ???
2.
scanovací model
Regulace translace
1. Translační aparát
2.
Translace
3. 
Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace
4.
Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace
5.
Translace v mitochondriích a chloroplastech
Translace
Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci
Iniciace je klíčovým procesem
REGULACE
TRANSLACE
ELONGACE + TERMINACE
4
2.Translace - elongace
Elongace začíná nalezením prvního AUG a zformováním ribosomu
preiniciační komplex navázán na
AUG
LSU připojen po odvázání eIF6
pomocí eIF5.GTP
hydrolýza GTP = finální selekce
AUG dovršena
iniciátorová-Met tRNA v P místě
zformovaného ribosomu
2.Translace - elongace
Elongace = postupné přidávání aminokyselin k rostoucímu řetězci bílkovin
Ribosom obsahuje 4 vazebná místa pro RNA:
Ø  1 místo pro mRNA (při iniciaci)
Ø  3 místa pro tRNA (při elongaci)
A = aminoacyl-tRNA
P= peptidyl- tRNA
E = exit – tRNA
Molekuly tRNA jsou pevně drženy v místech P a A pouze při dokonalém
párování kodón-antikodón
Vazebná místa A, P a E:
tvořena ve vnitřním prostoru, na interfázi obou podjednotek
Volné A místo pro první vnitřní
kodón syntetizovaného proteinu
Zahájení elongační fáze
2.Translace - elongace
2. translace – elongace
Ternus termophilus
a)Cryoelectron mikroskopická podoba
E.coli ribosomů
b) Počítačový model 70S ribosomu
místa: A (růžová), P (zelená) a E(žlutá)
nascentní polypeptidový řetězec
zanořen do „tunelu“ v 50S poblíž
akceptorového ramínka tRNA v
P místě, proti místu kde se velká
podjednotka váže na malou
podjednotku
translačně funkční místa ribosomu viditelná na interfázi podjednotek
A= modrá, P= žlutá, E= zelená,
5
2.translation - elongation
Elongace = růst nascentní bílkoviny :
2. Translace – elongace
= aminoacyl t-RNA se pevně váže na ribosom = dekodující stádium
„pre-state“ uspořádání ribosomu
3 stupně
1.
vazba aminoacyl t-RNA na ribosom
2.
transpeptidace
3.
translokace
2.Translace - elongace
2. translace – elongace
První fáze = vstup 2. aminoacyl t-RNA do ribosomu
Ø  vždy v podobě ternárního komplexu s navázaným
elongačním faktorem aktivované formě EF1alfa .GTP
Ø  vždy na místo A
přesně na odpovídající kodón mRNA a antikodón tRNA
Elongační faktor EF1
EF1A + (EF1B)
( Prokaryota: EF-Tu)
EF1A: nalézá „správnou adresu“ pro aa-tRNA na A místě ribosomu
(EF1B): recyklační faktor
EF1A: alfa, beta, gama podjednotky
Ø  eEF1alfa:
Ø  kódována mnohočetnou genovou rodinou
Ø  exprese regulována vývojově, hormonálně a stresem
na hladině transkripce a stability mRNA
Ø  v rámci rostlinných druhů vysoká sekvenční homologie
výjímečnost eEF1alfa podjednotky:
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
katalyzuje vazbu aminoacyl-t-RNA k ribosomům
reguluje přesnost + rychlost elongace
přítomna v buňce až do 1-5% celkových bílkovin
její exprese koreluje s rychlostí růstu bez ohledu na vysokou
konstitutivní hladinu
snižuje aktivační energetickou barieru mezi konformačními stavy
ribosomů
váže se na mikrofilamenta a mikrotubuly
zvyšuje podíl F aktinu
vazba na cytoskelet:
kompartmentace translace na cytoskeletu
regulace transportu
translokace
aktivace mRNA i mRNP
zajišťuje prostorovou orientaci i organizaci translačního aparátu
6
2. translace – elongace
2. translace – elongace
elongační faktor eEF1B – recyklace eEF1A
eEF1B: alfa, beta, gama podjednotky
recyklace eEFalfa.GDP
- eEFalfa.GTP
eEFalfa.GDP + eEF1B = --- eEFalfa.GTP
míra recyklace = míra účinnosti translace
fosforylace eEF1Balfa = inhibice recyklace
= inhibice elongatce, inhibice translace
EF1A + EF1B
obdoba eIF2A + eIF2B
Vstup aminoacyl-tRNA do ribosomů na místo A,
úloha elongačního faktoru EF-TU
2.Translace – elongace
Nobelova cena za chemii 2009
Struktura a funkce ribosomů
Venkatraman Ramakrishnan
Thomas A. Steitz
Ada E. Jonath
7
2.Translace – elongace
2. translace – elongace
Funkčnost ribosomů :
labilní napojování podjednotek + konfigurační proměnlivost obou podjednotek
STRUKTURA A FUNKCE RIBOSOMU
1.  Problém přesnosti elongace
? aminoacyl-tRNA rozpozná kodon-antikodon
Jak je zajištěna:
selektivita přijímání aminoacyl-tRNA na místo A
- jak je zabráněno substituci Aa
(změna aktivity syntetizované bílkoviny)
- jak je zabráněno předčasné terminaci translace
(ribozom s redukovanou schopností
produkovat kompletní bílkoviny)
Jak se otázka řešila: ultraskturální analýzy
mutace rRNA, RP
aplikace antibiotik
Ternární komplex se navazuje do A místa
Indukuje pohyb basí A1492, A1493, G530
a tím:
„nastavena“ pozice kodón-antikodón
změna konformace 30S z „otevřeno na zavřeno“
signalizace pro hydrolýzu GTP
uvolnění EF.Tu-GDP
poloha aminoacylovaného 3´konce t-RNA v místě
A blízko 3´ konce iMet-tRNA v místě P
=
Test správného ternárního komplexu v místě A
+
Konečné usazení komplexu v místě A
Přijetí „odpovídajícího“ ternárního komplexu:
větší rychlost hydrolýzy GTP než pro
„neodpovídající“
x
Disociační rychlost v opačném uspořádání
How the ribosome increases the intrinsic selectivity, d, of codon recognition. (A)
The geometry of base pairing between U1 in first codon position and A36 in the
anticodon is monitored by A1493. (B) The geometry of base pairing between U2 in
second codon position and A35 in aminoacyl-tRNA is monitored by A1492 and G530,
while the geometry of the base pairing in third codon position (U3:G34) is less
stringently monitored, explaining the wobble hypothesis (From (Ogle and Ramakrishnan,
2005)).
Closing and opening of the 30S subunit. The subunit opens and closes by intra-subunit
rotations (red arrows) around the A site The open conformation is stabilized by
ribosomal proteins S4 and S5, while the closed conformation is stabilized by ribosomal
protein S12. Cognate aminoacyl-tRNAs and some error inducing drugs (e.g.
paromomycin) stabilize the closed conformation. Mutations in S12 tend to stabilize the
open conformation (increased accuracy) and mutations in S4 and S5 tend to stabilize
the closed conformation (decreased accuracy) (From (Ogle and Ramakrishnan, 2005)).
8
2.Translace - elongace
STRUKTURA A FUNKCE RIBOSOMU
1.  Problém přesnosti elongace
Usazení aminoacyl-tRNA do A:
Ø  závisí na hodnotě rozdílu volné energie mezi odpovídající a
neodpovídající tRNA
odpovídající tRNA: preference hydrolýzy GTP
= pevné zakotvení
neodpovídající
: prefernce disociace = odmítnutí
Ø  rozpoznání nejen Watson-Crick párováním, ale i geometrií
kodon-antikodon
Ø  rotací uvnitř SSU kolem A místa: otevřená-závřená konformace
2.translation - elongation
Elongace = růst nascentní bílkoviny :
3 stupně
1.
vazba aminoacyl t-RNA na ribosom
2.
transpeptidace
3.
translokace
2.Translace – elongace
STRUKTURA A FUNKCE RIBOSOMU
2. Problém tvorby peptidové vazby
reakce aminoskupiny acylované tRNA v místě A s carboxyl- terminál C peptidyltRNA v místě P
? ribozom katalyzuje tento proces
Úloha peptidyl transferázového centrum (PTC)
Mechanismus reakce
Jak se otázka řešila: kinetické analýzy
krystalografie
mutace rRNA v oblasti PTC
Binding of EF-Tu and tRNAs to the ribosome seen by cryo-EM. (A)
Aminoacyl-tRNA in A/T site in ternary complex, peptidyl-tRNA in P site and
deacylated tRNA in E site. (B) Pre-translocation ribosome with peptidyl-tRNA
in A site, deacylated tRNAs in P and E site (From Valle et al., 2003).
9
The peptidyl-transferase center in the 50S ribosomal subunit is attacked by
a large number of existing antibiotics, now revealed at high resolution in 50S
subunit crystal structures (Figure 8) (Franceschi and Duffy, 2006).
2. translace – elongace
Peptidyltransferázová reakce:
je katalyzovaná velkou podjednotkou ribosomu ?
E.coli 50S: zbavena téměř všech bílkovin a přesto peptidylová reakce in vitro bez omezení
proběhla = zřejmá úloha rRNA (ribozymu)
rRNA LSU = přesná orientace atomů, jež spolu
musí reagovat
= modulace elektrostatického prostředí pro přenos protonů
Ribosom váže 2 tRNA substráty:
1.  Peptidyl-tRNA v místě P je napojena na rostoucí polypeptidový řetězec
2.  Aminoacyl-tRNA v místě A s jedinou nově přivedenou aa
3.  Oba substráty uspořádány tak, že dojde k interakci:
- mezi CCA konci obou substrárů
- nukleofilní alfa amino skupinou A substrátu a 23S rRNA v
aktivním centru
2.Translace – elongace
Pro studium reakce - nutnost fixace stavu:
před reakcí
v průběhu reakce
po reakci
Kinetika rekce - rychlost vazby:
Ø  aminoacyl-tRNA do místa A = 10 vazeb/sec
Ø  vytvoření peptidové vazby = 300 vazeb/sec
Řešení: použít v místě A analogy (např. puromycin) = rychlost vazby snížena
na 50 vazeb/sec
Rychlost tanspeptidační reakce na ribosomu je 107 oproti reakci s analogy in vitro
= přesné uspořádání na ribosomu před vlastní reakcí
10
2´OH skupina A76 peptidyl-tRNA má
klíčovou roli;
její substituce vždy znamenala snížení
aktivity 106
The mechanism of peptide bond formation on the ribosome. The α-amino group of aminoacyl-tRNA in
the A site (blue) attacks (black arrow right to left) the ester bond of the peptidyl-tRNA in the
P site (red). A proton is shuttled via the OH’ group of A76 in peptidyl-tRNA in the P site (black
arrows left to right), aided by an H-bond network (Trobro and Åqvist, 2005) established with
the help of 23S rRNA bases and water molecules (not shown).
2. translace – elongace
Mechanismus katalýzy:
Ø „shuttling“ protonů z OH skupiny
A76 P místa tRNA
Ø 2´OH skupina předává proton
Ø Nukleofilní atak aminoskupiny A
místa na esterovou vazbu P místa
=
Modulace konformačních změn PTC
=
Tvorba vazeb a bourání vazeb
Peptidové vazby mezi rostoucím polypeptidovým řetězcem a novou aa
Ø  nascentní bílkovina přenesena z tRNA v P místě,
Ø  nová aa připojena na tRNA v A místě
Ø  Peptidyl t-RNA v A místě
Ø  tRNA v P místě bez aa, připravena pro „odplavení“ z ribosomu
Transpeptidázová reakce
ribosomu
=
Substrátem katalyzovaná reakce
11
2.translation - elongation
Elongace = růst nascentní bílkoviny :
Úloha elongačních faktorů
3 stupně
1.
vazba aminoacyl t-RNA na ribosom
2.
transpeptidace
3.
translokace
2. translace – elongace
2. translace – elongace
Třetí fáze = translokace
eEF2 = elongační faktor pro translokaci
Ø  katalyzuje GTP-dependentní translokaci peptidyl-tRNA
na ribosomu z místa A na P
= posun mRNA o 3 nukleotidy
= uvolnění deacylované tRNA z místa P
Ø  člen velké rodiny GTPáz
Ø  nepotřebuje recyklační faktor pro výměnu GDP na GTP
Ø  „pre-translokační ribosom“ upřednostňuje vazbu eEF2
Ø  „post-translokační ribosom“ vazbu na eEF1alfa
Ø  ribosom se posune (translokuje) podél vlákna mRNA přesně o 1 kodón
Ø  tRNA Met bez aktivovaného methioninu se pohybuje k místu E
Ø  další tRNA kovalentně vázaná na dipeptid se pohybuje na místo P
V tomto okamžiku je konformace ribosomu s volným místem A
= „post state“
= připravenost přijmout další komplex aminoacylt-RNA.EF1alfa.GTP
Ø  další aminokyselina se přidá na C-konec rostoucího polypeptidu dle
posloupnosti kodódů
Ø  tento proces se opakuje až po „stop kodón“
12
2.
Translace
2.Translace - elongace
Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci
vysoká flexibilita molekuly
ribosomální bílkoviny L1
její funkčnost zajišťuje
účinnou translaci
terciární struktura L1 ribosomálního bílkoviny
Ø 
Ø 
Ø 
L1 se váže na:
V. domenu 23S rRNA (zodpovídá za odstraňování deacylované tRNA z ribosomu)
ribosomální bílkoviny S9, S2 S10
mRNA
2. translace - terminace
2. Translace - terminace
Terminace = ukončení translace, uvolnění polypeptidového řetězce z
ribosomu
konečný stupeň translace – nezbytné molekulární signály pro rozhodnutí o
osudu komplexu: mRNA-ribosom-tRNA-peptidyl
Ø  stop kodóny: UAA UAG UGA
Ø  nezbytná přítomnost uvolňovacích faktorů RF (release factors)
13
2. translace - terminace
2. translace – terminace, stop triplety
Terminační faktory RF:
Ø 
Ø  eRF1 tvarově podobný tRNA, váže se na místo A rozezná stop kodóny
Ø  eRF3 funguje jako komplex eRF3.GTP
Ø  oba faktory katalyzují štěpení peptidyl-tRNA a tím uvolňují kompletní
bílkovinný řetězec
Ø 
Ø 
Ø 
Bacterie: RF1, RF2 = obdoba eRF1
RF3
= obdoba eRF3
Ø 
Ø 
triplety UAA, UGA a UAG =terminační signály
RF = release faktor
dekodovací mechanismus pro AMI kodony je triplet :triplet
mezi mRNA a tRNA (kodon:antikodon)
terminační signál není dekodován tRNA, ale proteinem RF1(+RF3)
část RF musí rozeznat STOP sekvenci v mRNA
terminační signál je větší než UAA, UGA a UAG,
+1 base za terminačním signálem rozhodující u všech organismů
u rostlin je využíván UGA ve 46%, UAA ve 28% (u dvouděložných)
base za 4. nukleotidem ovlivňují účinnost terminace
RF výjimečnými faktory, mají současně kontakt s :
mRNA, s ribosomem, tRNA
existuje alternativní translace, kdy není stop kodon rozeznán a je využit jiný
2. translace - terminace
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
ribosom se setká s terminačním kodonem UAA, UGA, UAG v místě A
RF1 dekoduje příslušný terminační signál na mRNA
terminační faktor se naváže na ribozom
peptidyl-tRNA je hydrolyzována
RF3 „asistuje“ , (vytváří se uvolňovací komplex RF1.RF3.GTP)
uvolnění polypeptidu
recyklace ribosomů, mRNA, tRNA a všech translačních faktorů
2. Translace – elongace
Ø  Elongace umožní postupné navazování dalších ribosomů
Ø  Vznikají polysomální struktury
přepis genetické informace z mRNA do sekvence aminokyselin
syntéza bílkoviny dovršena
14
2. translace – elongace
2. Translace - terminace
Disociace ribosomálních podjednotek a možnost okamžité
reasociace na téže molekule mRNA s využitím bílkovinných faktorů:
PABP, eIF4E a EIF4G
Syntéza bílkovin na polysomech
Polysomální
komplexy
2. translace – elongace
ribosomy
polysomy
15
2. translace – elongace
2. translace – elongace
Poly(A)-vazebné bílkoviny, eIF4E a eIF4G vytváří kruhovou strukturu
mRNA
2. translace – terminace
Disociace ribosomálních podjednotek a jejich stabilizace navázáním
stabilizačních faktorů: 60S (eIF6), 40S (eIF3)
2. translace
Ø  každá mRNA svou specifickou elongační rychlost,
průměrná rychlost = 5 AMI /sec
Ø  doba vytváření bílkoviny = „transit time“ = elongace + terminace
(stanovení = poměr frakcí polysomální : cytosolické frakci)
Ø  zpomalení pohybu ribosomů podél mRNA = zvýšení počtu (density)
ribosomů na mRNA
Ø  stimulace proteosyntézy při konstantním profilu polysomů
zvýšením elongační rychlosti
16
2. translace – elongace
Ø  rozdílná elongační rychlost u různých mRNA za stejných
Regulace translace
podmínek:
Ø  struktura 5´ a 3´UTR oblasti
Ø  neuniformní, specifická distribuce mRNA a iniciačních faktorů ve
specifických kompartmentech vytvářených cytoskeletální sítí
Ø  struktura vytvářeného nascentního polypeptidu –
Ø  počet ko-translačních modifikací ( N-glykosylací )
Ø  rozdílná afinita iniciačních faktorů k určitým mRNA
Ø  volba preferovaných nebo vzácných kodonů volených tRNA
1. Translační aparát
2.
Translace
3.
Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace
4.
Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace
5.
Translace v mitochondriích a chloroplastech
Ø  inhibitor elongace a tím i inhibitor translace: CH = cykloheximid
Děkuji za pozornost
Přijďte zase příště na kus řeči o
translaci
17