Protilátky třídy IgM proti EBV-CA Návod na použití ELISA

Protilátky třídy IgM proti EBV-CA
Návod na použití ELISA testu
Objednací číslo
EI 2791-9601 M
Protilátky proti
Virus EpsteinBarrové
Antigen kapsidu
(EBV-CA)
Třída Ig
IgM
Substrát
Ag-potažené
mikrotitrační
jamky
Formát
96 x 01 (96)
.
Princip testu: ELISA test umožňuje semikvantitativní in-vitro stanovení lidských protilátek
třídy IgM proti obalovému antigenu viru Epstein-Barrové (EBV-CA). Diagnostický kit
(souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou
potaženy EBV-CA.
V prvním reakčním kroku se v jamce inkubují ředěné vzorky séra pacientů. V případě
pozitivních vzorků, se specifické IgM (také IgA a IgG) protilátky navážou na antigeny.
K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským
IgM značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci.
Intenzita vzniklé barevné reakce je úměrná koncentraci protilátek proti antigenům EBV-CA.
Obsah kitu:
- Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky,
každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití)
- Kalibrační sérum: (lidské IgM): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně.
- Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno modře.
- Negativní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno zeleně.
- Enzymový konjugát: peroxidasou značené kozí protilátky proti lidským IgM: 1 x 12 ml,
připraveno k použití. Značeno červeně.
- Vzorkový pufr: obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti lidskému IgG):
1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně.
- Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný)
- Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen:
tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku.
- Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití1 N kyselina fosforečná
- Návod k provedení testů
- Protokol s kalibračními hodnotami.
Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až
+ 8 oC, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do
vyznačeného data expirace.
Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a
nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a
anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně
infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou
jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu,
omyjte pokožku mýdlem a velkým množstvím vody.
Příprava a stabilita reagencií
Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu.
Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a
trhnutím otevřete lepící ochranný obal . Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska
vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned
přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného
zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném
ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 oC až + 8 oC, lze je
použít po dobu nejméně dvou měsíců.
Kalibrace a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně
promíchat.
Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat.
Vzorkový pufr: Připraven k použití. Zeleně obarvený vzorkový pufr obsahuje IgG/RF –
Absorbent. Pro stanovení protilátek třídy IgM se vzorky séra nebo plazmy musí naředit tímto
pufrem.
Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství
pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou.
Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je
stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 oC až + 8 oC.
Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 oC a před
ředěním ho promíchejte.
Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití,
obsah je citlivý na světlo.
Zastavovací roztok: Připravený pro užití
Ředění séra a vzorků plasmy
Úvod: Dříve, než mají být ve vzorcích séra pacientů stanoveny protilátky třídy IgM , se musí
odstranit protilátky třídy IgG. Toto lze provést ultracentrifugací, chromatografií nebo
imunoabsorpcí. Tento proces musí být proveden tak, aby se zabránilo revmatickým faktorům
reagovat se specifickými vázanými IgG, což by vedlo k falešně pozitivním výsledkům
v testech pro IgM a dále se musí zabránit náhradě IgM za specifické IgG vázané k antigenu,
což by naopak vedlo k falešně negativním výsledkům pro IgM.
Princip: Vzorkový pufr (značeno zeleně ) obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti
lidskému IgG). IgG ze séra nebo plazmy se navážou s vysokou specificitou na tyto protilátky
a precipitují. Jestliže vzorek obsahuje revmatické faktory, tyto jsou absorbovány pomocí
komplexu IgG/anti-lidský IgG komplex.
Vlastnosti oddělení:
- Pomocí anti-lidských IgG protilátek se navážou a precipitují všechny IgG podtřídy
- IgG se z lidského séra odstraní až do koncentrace 15 mg na mililitr (průměrné sérum
dospělého člověka obsahuje koncentraci IgG okolo 12 mg na mililitr)
-Odstraní se revmatické faktory
- Výtěžek IgM frakce je téměř 100%.
Provedení: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například,
přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Inkubujte reakční směs po
dobu alespoň 10 minut při pokojové teplotě. Potom naneste vzorky podle pipetovacího
protokolu do jamek mikrotitrační desky.
Poznámky:
- Pomocí této reakční směsi nelze stanovit protilátky třídy IgG.
- Ověření účinnosti absorbentu IgG/RF se udělá tak, že se provede paralelní test na stanovení
IgG ve směsi pro IgM – stanovení IgM je spolehlivé pouze tehdy, je-li test na IgG
negativní.
-Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je
znovu.
Inkubace
Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl kalibračního séra,
pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých
mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí
300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr
v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu,
teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů
(provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte,
vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na
filtrační papír.
Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou
značené anti-lidské IgM) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte
po dobu 30 minut při pokojové teplotě.
Promývaní:
Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše
Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé
mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve
tmě.
Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační
desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový
roztok.
Měření:
Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové
délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od
přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační
desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku.
Pipetovací protokol
A
B
C
D
E
F
1
C
Poz.
Neg.
P1
P2
P3
2
P6
P7
P8
P9
P10
P11
3
P14
P15
P16
P17
P18
P19
4
P22
P23
P24
5
6
7
8
9
10
11
12
G
H
P4
P5
P12
P13
P20
P21
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem kvantitativní analýzy sér 24 pacientů (P1 až
P24). Kalibrační séra (C), pozitivní a negativní kontrolní séra (poz. a neg.) a všechny vzorky
sér pacientů byly inkubovány jednotlivě v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit
užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To
umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií.
Výpočet výsledků:
Hodnota absorbance kalibračního séra definuje horní hranici referenčního rozsahu pro
neinfikované osoby (cut-off value) doporučenou EUROIMMUN. Hodnoty vyšší, než je tato
hranice, se považují za pozitivní, pod touto hranicí za negativní. Vedle této kvalitativní
interpretace je možné také semikvantitativní vyhodnocení výsledků.
Poměry se vypočítají z následujícího vztahu:
Extinkce kontrolního vzorku nebo vzorku séra = Poměr
Extinkce kalibračního séra (cut-off)
Poměry > 1,0 se považují za pozitivní, poměry < 1,0 za negativní. Jak pozitivní, tak negativní
kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu, musí být proto zařazeny
v každém prováděném testu.
Charakteristiky testu
Kalibrace: Jelikož neexistuje referenční sérum pro protilátky třídy IgM proti EBV-CA,
vyjadřují se výsledky ve formě poměrů, které jsou v relaci ke koncentraci protilátek.
Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a poměry
určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty
pro každý kit. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne
hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a musel by se opakovat.
Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud
nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou
hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační
séra se vystaví stejnému vlivu, a proto nastalé změny jsou povětšinou zakalkulovány ve
výpočtu výsledků. Tato situace se bere následně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace
substrátu vzhledem k pokojové teplotě:
Pokojová teplota 14 oC – 18 oC
Pokojová teplota 19 oC – 23 oC
Pokojová teplota 24 oC - 30 oC
doba inkubace substrátu 18 min
doba inkubace substrátu 15 min
doba inkubace substrátu 12 min
Antigen: Jamky mikrotitrační destičky jsou potaženy afinitně purifikovanými
antigeny kapsidu viru Epstein-Barrové gp125.
Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost testu byla zkoumána určením koeficientů rozptylu
(CV) uvnitř jednoho a mezi jednotlivými měřeními za užití tří sér, jejichž hodnoty ležely
v různých bodech kalibrační křivky. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku byly stanoveny z 20
měření a koeficienty rozptylu mezi bloky ze 4 měření provedených v šesti různých dnech.
sérum
1
2
3
Koeficienty rozptylu uvnitř jednoho měření, n=20
Průměrná hodnota (extinkce)
CV (%)
0,300
5,3
0,650
7,9
0,690
4,8
Koeficienty rozptylu mezi jednotlivými měřeními, n=4 x 6
sérum
Průměrná hodnota (poměr)
CV (%)
1
2,2
4,7
2
4,5
5,4
3
4,7
5,3
Specifita: Předkládaný ELISA test detekuje protilátky třídy IgM proti EBV-CA. Nebyly
nalezeny žádné křížové reakce.
Referenční rozsah: Hladiny protilátek (IgM) proti EBV-CA byly analyzovány testem
Euroimmun ELISA ve skupině 176 zdravých dárců krve. S hodnotou pro horní hranici
poměru 1,0; bylo prokázáno, že žádný z dárců nebyl anti-EBV-CA IgM pozitivní .
Korelace mezi ELISA testem a testem založeným na měření nepřímé
imunofluorecscence (IIFT): Séra 238 pacientů trpících různými chorobami byla
analyzována pomocí testu EUROIMMUN anti EBV-CA ELISA a EUROIMMUN IIFT.
Korelace mezi těmito dvěma sérologickými testy vychází velmi vysoká. Citlivost ELISA ve
srovnání s IIFT je 83,3%. Specifita ELISA ve srovnání s IIFT je 99,0%.
Testovaný soubor
(n = 238)
ELISA
IIFT
pozitivní
20
4
pozitivní
negativní
negativní
2
206
Klinické studie: Séra 14 pacientů ve stadiu akutní infekční mononukleosy byla testována
pomocí dostupných EUROIMMUN anti-EBV- ELISA testů:
Prevalence
n
Akutní
infekční
mononukleosa
14
AntiEBVCA
(IgA)
50%
AntiEBVCA
(IgG)
86%
AntiEBVCA
(IgM)
86%
AntiEBVEA
(IgA)
14%
AntiEBVEA
(IgG)
43%
AntiEBVEA
(IgM)
64%
AntiEBNA1
(IgG)
0%
V sérologické diagnostice infekční mononukleosy se obvykle určují protilátky proti EBV-CA
(IgG a IgM třídy), stejně tak protilátky proti EBNA-1 (IgG). V provedené studii byly
protilátky proti EBV-CA přítomny ve všech 14 vzorcích sér, a to buď IgG, nebo IgM třídy.
Kromě toho, všech 14 sér bylo negativních v anti- EBNA-1 ELISA (IgG). Dvě séra byla
v anti-EBV-CA ELISA pouze IgG pozitivní. Pro definitivní určení akutní infekční
mononukleosy byla zkoumána avidita těchto IgG protilátek. V obou případech měly
protilátky pouze nízkou aviditu, což indikovalo časné stadium infekce.
Klinický význam:
Virus Epstein-Barrové je kauzativním agens vyvolávajícím infekční mononukleosu, horečnaté
onemocnění se zánětem hltanu a lymfadenopatií (zvětšením lymfatických uzlin), které je
často doprovázeno hepatosplenomegalií a řidčeji s exanthemem. Kromě toho jsou infekce
EBV často spojovány také s Burkitovým lymfomem a rakovinou nosohltanu. Infekční
mononukleosa musí být odlišována od cytomegalie a toxoplasmosy a v případě netypického
průběhu nemoci také od HIV a dalších infekcí.
Imunitní odpověď zprostředkovaná IgM proti EBV-CA, která se projeví v heterofilních
protilátkách nejdříve a zvýšení titru protilátek třídy IgG, indikuje přítomnost nedávno
proběhlé infekce EBV. Jsou-li přítomny protilátky proti jadernému antigenu viru EpsteinBarrové (EBNA), jedná se o pozdní stadium infekce. Ačkoli se EBNA antigeny označené 1 až
6 syntetizují dříve, než další EBV antigeny ( časné antigeny a antigeny virového obalu)
v průběhu infekce, jsou prezentovány imunitnímu systému až po destrukci B buněk.
Chronologický sled událostí tedy potom je takový, že se protilátky proti obalovým virovým
antigenům a časným antigenům objeví dříve, než protilátky proti EBNA.
Protilátky proti časnému EBV antigenu (EA) se vyskytují u 70 až 80 % pacientů s infekční
mononukleosou, i když jen dočasně v akutní fázi. Vysoké titry protilátek proti EA indikují
chronické stadium, či reaktivaci nemoci. Nalézáme je ale také ve spojení s Burkitovým
lymfomem a rakovinou nosohltanu.
Sérologická diferenciace mezi primární infekcí EBV a reaktivací nemoci není vždy zcela
možná. Jsou-li v séru přítomny pouze protilátky proti EBV-EA a nikoli proti EBV-CA a
EBNA, předpokládáme výskyt primární infekce. Jsou-li současně detekovány protilátky proti
EBNA, jedná se o reaktivaci infekce.
Diferenciace mezi právě probíhající infekcí a infekcí, která již po určitou dobu probíhala, je
pro sérologii největší výzvou. Dnes se nejvíce používá diferenciace založená na určení
specifických protilátek třídy IgM, které se obecně projevují pouze během počátečních stadií
infekce, ale jejichž určení je nejisté a problematické. Interferujícím faktorem může být
přetrvávající imunitní odpověď protilátek IgM, nedetekovatelná nebo zpožděná tvorba IgM,
či tvorba nespecifických IgM způsobená polyklonální stimulací B buněk. Ve 20 % všech
případů právě probíhající infekce EBV nebyly nalezeny protilátky IgM proti EBV obalovému
proteinu (EBV-CA), u 15 % případů byla tvorba těchto púrotilátek zpožděna, na druhé straně
u 4 % pacientů protilátky třídy IgM přetrvávaly. V posledních letech se pro bezpečné určení
právě probíhající infekce provádí určení avidity protilátek třídy IgG: první reakcí imunitního
systému na právě probíhající infekci je tvorba protilátek s nízkou aviditou. Jak infekce
postupuje, dochází k tvorbě protilátek IgG, které jsou již více přizpůsobeny danému antigenu
a avidita roste. Pokud nejsou v séru detekovány protilátky s vysokou aviditou, můžeme
předpokládat, že infekce je doposud v ranném stadiu. (EUROIMMUN testovací systém pro
určení avidity protilátek IgG proti EBV-CA, objednací číslo EI 2791-9601 G).
Literární odkazy:
1. Koch H.G.: Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Deutsches Arzteblatt 7: 140 –144
(1995).
2. Dopakta H.D., Schuy W.: Compact Epstein-Barr virus diagnosis based on defined antigen
mix and specific IgA. Res.Virol. 147: 53-66 (1996).
3. Selgneurin J.-M.: Diagnostik von Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Diagnose und
Labor 42: 83 –89 (1992).
4. Dolken G., Weitzmann U., Boldt C., Bitzer M., Brugger, Lohr W.: Enzyme-Linked Assay
for IgG Antiboduies to Epstein-Barr-Virus – Associated Early Antigens and Viral Capsid
Antigen. J. Immunol.Meth. 67: 225-233 (1984).
5. Porstmann T.: Epstein-Barr-Virus. Diagnostische Bibliothek 6/7 (1992).
6. Lennette E.T.: Epstein-Barr-Virus. Virology 74: 905-909 (1987).