Prenatální screening VVV

Prenatální screening VVV
Jaroslav Loucký
Ústav klinické biochemie a patobiochemie UK 2. LF a FN Motol, Imalab s.r.o., Zlín
[email protected]
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Kdy můžeme testovat nejdříve?
•
•
•
•
•
•
PGD – preimplantační genetická diagnostika
Kombinuje postupy IVF a genetického testování
Handyside a Verlinsky – 1990
Biopsie pólového tělíska vajíčka (méně často)
Biopsie blastomery embrya (častěji)
Načasování odběru – velikost embrya 8 buněk
tj. 3. den po oplodnění vajíčka
• Podmínka oplodnění – vajíčko musí být oplodněno
jednou spermií (ICSI)
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Metody používané pro testování
• Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
• PCR
• microarray
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Jaká onemocnění můžeme testovat
• Přítomnost aneuploidií (senzitivita 90%)
• Opakované potrácení plodu způsobené translokacemi
parentálního původu
• Monogenní dědičná onemocnění (srpkovitá anémie,
cystická fibróza, Huntigtonova choroba, Tay Sachsova
choroba
• Přenášení translokací
• Gonosomální mosaiku u žen
• Vždy testujeme konkrétní genetické onemocnění
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Co to vlastně je screening?
• vedle pozorování a monitorování patří mezi
způsoby hromadného testování populace
• výstupem screeningu je identifikace vysoce
rizikových probandů se snahou jim včas a
účinně pomoci
• definitivní odpověď týkající se zkoumaného
onemocnění dává diagnostický test, na rozdíl od
něj screening pouze stanovuje riziko
(pravděpodobnost) , že zkoumaný jev nastane
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Definice screeningu
• Systematická aplikace testu či vyš., kterým se
identifikují jedinci s jistým rizikem pro výskyt
určité vady nebo onemocnění.
• Smyslem screeningu je, aby nebyla prováděna
další vyšetření nebo přímé diagnostické testy u
osob, u nichž k tomu z hlediska výskytu těchto
vad neexistují žádné medicínské důvody.
N.J.Wald
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Obecné požadavky na provádění
screeningu I
• Onemocnění, porucha – jasně definovaná
• Prevalence – známá (v případě D.S. a NTD je )
• Medicínsky závažné onemocnění, pro které existuje
efektivní způsob léčby nebo jiný medicínský zásah
• Rovnocenný přístup - pacienti mají právo na rovnocenný
přístup ke screeningu
• Ekonomický – efektivní z hlediska nákladů
• Vybavení – musí být dostupné nebo jednoduše
instalovatelné
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Obecné požadavky na
provádění screeningu II
• Přijatelnost - v případě pozitivního výsledku musí existovat
další postup, který je obecně akceptovatelný, jak
z pohledu provádějících screening, tak z pohledu pacientů
• Test - musí být jednoduchý a bezpečný
• Charakter testu: - distribuce hodnot u postižených a
nepostižených jedinců musí být
známy,
- překryv hodnot musí být dostatečně
nízký
- musí být definován cut-off
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Parametry screeningu
•
•
•
•
DR - Detection rate = senzitivita
FPR – Falešná pozitivita
Prevalence onemocnění
OAPR - pravděpodobnost
pozitivního výsledku s přítomností
vrozené vývojové vady
(kombinací předchozích tří )
• Požadavky na screening - nejvyšší možná senzitivita
- nejnižší možná FPR
• Pro screening VVV – 90% DR @ 1-2% FPR
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Kdo se podílí na prenatálním
screeningu VVV
•
•
•
•
•
Gynekologové
Biochemici
Ultrazvukoví specialisté
Genetici
Molekulární biologové
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Kdy a jak se prenatální
screening může provádět ?
• V 1. trimestru, při gest. stáří plodu 10+0 až 13+6
• Ve 2. trimestru, při gest. stáří plodu 14+0 až 22+0
• Ukončení těhotenství je možno z genetické indikace
provést do 24.týdne těhotenství (zákon č. 66/1986
Sb.)
• Provádíme biochemické testy v 1. a 2.trimestru
těhotenství
• Měříme UZ parametry v 1. trimestru těhotenství
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Základní sérové markery,
původ a hodnoty u plodů s D.S.
• Tyto sérové markery jsou produkovány fetoplacentární jednotkou a jejich
hodnoty se v případě plodů s D.S. odchylují od hodnot u těhotenství s
nepostiženým plodem
•
•
•
•
•
AFP, fetální játra, snížené hodnoty ve 2. trimestru, (42%)
uE3, plod + placenta, snížené hodnoty ve 2. trimestru (52%)
F t-hCG, placenta, zvýšené hodnoty v 1., 2. trim. (61-53%)
inhibin-A, placenta, zvýšené hodnoty v 1., 2. trimestru (59%)
PAPP-A, placenta, snížené hodnoty v 1. trimestru
• Mnoho dalších látek vykazuje snížené, či zvýšené hladiny, ale nejsou tak
významné.
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Základní UZ markery
• Nuchální translucence (NT) – lze vyjádřit v MoM a
kombinovat s biochemickými markery
• Nosní kost (NB)
• Měření fronto-maxilárního úhlu
• Měření trikuspidální regurgitace
• Měření průtoku ductus venosus
Pokud jsou správně prováděny mají vysokou senzitivitu
(cca 70% procent). Problém je v tom, že se nedají vždy
vyšetřit, výsledky měření se mnohdy špatně vyhodnocují
a špatně se interpretují
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Screeningové menu 2011
• I. trimestr - kombinovaný test (PAPP-A, f β-HCG, NT)
- kontingenční (měření dalších UZ markerů)
• II.trimestr - double test (HCG, AFP)
- triple test (HCG, AFP, uE3)
- kvadruple test (HCG, AFP, uE3, inhibin A)
- vyšetřování UZ „hard“ a „soft“ markerů
• I + II trim. - sérum integrovaný
- plně integrovaný
- sekvenční forma integrovaného testu
- kontingenční forma integrovaného testu
• Toto široké spektrum testů je potenciálem pro
„screeningový chaos“
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
DR @ 5% FPR
100
94%
senzitivita (%)
90
80
79%
69%
70
60
50
40
30
20
10
0
74%
72%
81%
79%
85%
85%
79%
85%
89%
84%
30%
Věk +
SURUSS
BUN
FASTER
triple kvadruple kombinovaný
2. trimestr
1. trimestr
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
sérum
integrovaný
plně
93%
88%
1.trimestr – DR @ 5 FPR a pozorovaný
MoM u plodů s DS
Palomaki et al. A Summary Analysis of Down Syndrome Markers
In The Late First Trimester, Advances in Clinical Chemistry, Vol.43)
parametr
10.týden
11.týden
12.týden
13.týden
PAPP-A
(0,40)
42 (0,46)
36 (0,51)
29 (0,58)
F HCG
(1,72)
32 (1,82)
37 (1,98)
43 (2,21)
NT
63 (2,18)
61 (1,92)
56 (1,69)
Komb.test
85
83
81
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Screening před 10.týdnem
těhotenství
• PAPP-A 0,36 MoM @ 8.-9. týden (Wald,1996)
0,33 MoM @ 8.t. 0,37 MoM @ 9.t. (Spencer,2002)
• F HCG 1,35 MoM @ 8.t. 1,55 MoM @ 9.t. (Spencer,2002)
• ADAM 12 0,61 MoM @ 8.-9. týden
1,38 Mom @ 13.t (Spencer,2008)
• ??? – správná datace dle UZ před 8.týdnem, neznalost prevalence
D.S. v 8. a 9. týdnu, neznalost toho jak jiné abnormality mohou
ovlivňovat MoM těchto analytů….
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Celková variabilita měření
Schielen PC et al., Prenat Diagn 2006;26:711-8,
Palomaki GE et al. Genet Med 2008;10(2):131-138
• SDT = (SDA2 + SDI2 )1/2
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Celková variabilita měření
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Kontrola kvality měření NT – SEKK ?
• Kontrola kvality měření NT prováděná pomocí speciálního
počítačového programu
• Kontrola kvality měření CRL (naprosto zásadní význam pro
kvalitu prováděného screeningu)
• Kontrola kvality měření NT
• Vyhodnocení obrázků a odeslání e-mailem
• Odesílatel nezná naměřenou hodnotu
• Vyhodnocení ve skupině dalších UZ pracovníků
• Dotazník SEKK, konec roku 2010
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
NT – vliv na výsledek screeningu
Věk matky 30 let
NT
1,0 MoM
PAPP-A
0,65 MoM
MS-AFP
0,72 MoM
uE3
0,68 MoM
HCG
1,52 MoM
Inhibin-A
1,49 MoM
1:930 Negativní
Věk matky
NT
PAPP-A
MS-AFP
uE3
HCG
Inhibin-A
30 let
1,7 MoM
0,65 MoM
0,72 MoM
0,68 MoM
1,52 MoM
1,49 MoM
1:65 Pozitivní
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Statistický příspěvek NB
•
•
•
•
Celkový počet plodů s D.S 41
Nosní kost nepřítomna
29 ( 71%)
Nosní kost přítomna
13 ( 29%)
Neexistuje přímý vztah mezi nepřítomností NB
a hladinami biochemických markerů
Maternal serum biochemistry at 11-13(+6) weeks in relation to the presence or
absence of the fetal nasal bone on ultrasonography in chromosomally abnormal
fetuses: an updated analysis of integrated ultrasound and biochemical screening :
Prenat Diagn 2005 Nov;25(11):977-8315 ARTICLE AU : Cicero Simona S;
Spencer Kevin K; Avgidou Kyriaki K; Faiola Stefano S; Nicolaides Kypros
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Statistický příspěvek NB
• Dvoustupňový proces – měření NB pouze
když je riziko DS hraniční (Nicolaides,2005)
• Přítomnost NB nepřidává nic významného k současným
screeningovým protokolům. Absence NB má vysokou
pozitivní prediktivní hodnotu
( Sepulveda, 2007 )
• Doporučujeme využívat NB jako sekundární nebo kontigenční
marker ( Rosen, 2007 )
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Sekvenční integrovaný test
N J Wald, A R Rudnicka ,J P Bestwick, Sequential and contingent prenatal screening for Down
syndrome, Prenat Diagn 2006; 26: 769–777.
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Základní pravidla pro provádění
sekvenčního testu
• Dostupnost CVS
• Správné stanovení cutt-off v prvním trimestru
(1:30)
• Jedno těhotenství, jedno vyjádření rizika
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Výhody a nevýhody
provádění sekvenčního testu
Výhody
• U těhotenství s vysokým
rizikem v 1. trimestru je
proveden diagnostický test,
jehož výsledek je znám o
několik týdnů dříve.
Nevýhody
• Logisticky komplikovanější
• Část žen nesoucí plod s D.S.
by samovolně potratila před
16. týdnem
• Je nutné zajistit testování
žen z hlediska NTD, pokud
byl výsledek invazivní
diagnostiky v 1. trim.
Negativní (AFP).
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Faktory ovlivňující
výpovědní hodnotu sérových markerů
•
•
•
•
•
•
•
UZ určení délky těhotenství
Hmotnost těhotné ženy
IDDM
Vícečetná těhotenství
Etnická příslušnost
Kouření
Parita
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Další možnosti současných
screeningových postupů
• Opakovaná měření ( Cross Trimester Ratios )
– Wright DE, Bradbury I. Br J Obstet Gynaecol 2005;112:80-3.
– Wald NJ, et al. Prenat Diagn 2006;26:514-23.
Příklad:
(
Sérum integrovaný test
( 1.trim PAPP-A + 2.trim quad)
85% DR při 5% FPR
Sérum integrovaný test
+ opakované PAPP A ve 2.trim:
85% DR při 1% FPR
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Doporučení o provádění
laboratorního screeningu VVV
1. Integrovaný test
10+0 -11+3 týden: PAPP-A, resp. volný β hCG
11. - 13+6 týden: měření NT (nuchální translucence – šíjové projasnění plodu) sonografistou auditovaným u FMF Londýn
14. - 20. týden: AFP, hCG, uE3 4
Společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření.
2. Sekvenční varianta integrovaného testu
10+0 -11+3 týden: PAPP-A, resp. volný β hCG
11. - 13+6 týden: měření NT sonografistou auditovaným u FMF Londýn
Předběžné vyhodnocení testu, vysoce pozitivní screening řešit okamžitě.
Ostatní těhotné ženy pokračují do II. trimestru.
14. - 20. týden: AFP, hCG, uE3
Společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření.
3. Kombinovaný test (1.trimestr)
10+0-13+6 týden: PAPP-A, volný β HCG
11. - 13+6 týden: měření NT sonografistou auditovaným u FMF Londýn
Záchytnost tohoto testu je vyšší při odběru biochemických markerů v 10. – 11. týdnu než při odběru ve 13. týdnu.
4. Sérum integrovaný test – v místech, kde není možné měřit spolehlivě NT
10+0 -11+3 týden těhotenství: PAPP-A, resp. volný β hCG
14+0 - 20. týden: AFP, hCG, uE3
Společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření.
4. a) sekvenční varianta: u těhotných s PAPP-A pod 0,35 MoM - doporučit změření NT + fetální morfologie sonografistou auditovaný
u FMF Londýn.
5. Triple nebo double test (2.trimestr)
15+0 - 18. týden: AFP, hCG, uE3
vhodný pro ženy, které se dostaví pozdě na vyšetření v1.trimestru, nebo při později zjištěné graviditě.
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Screening z pohledu těhotné ženy
Požaduje
Akceptuje
Doporučíme
včasný výsledek
vyšší riziko invazivního
výkonu,
nižší senzitivitu screeningu,
NTD pomocí UZ později
kombinovaný test
nejspolehlivější
výsledek,
nízké riziko invazivního
výkonu
Výsledek až po 2.trimestru
(* sekvenční po 1.t u vysoce
pozitivních.)
Integrovaný test, resp.
Sekvenční formu
přijde pozdě
nižší senzitivitu,
vyšší riziko invazivního výkonu
Druhotrimestrální test
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Budoucnost prenatálního testování
• 1997
First report of free fetal DNA in maternal
circulation. (Lo YMD et al. Lancet 1997;350:485-7)
• Možnost získaní genetické výbavy plodu prostřednictvím
odběru krevního vzorku matky
Placenta
Maternal plasma
Maternal blood cells
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Dennis Lo
Chinese University of Hong Kong
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Vlastnosti mimobuněčné DNA v
maternální cirkulaci
• V plasmě matky je identifikovatelná jak mateřská mimobuněčná DNA, tak
mimobuněčná DNA fetálního původu
• Mimobuněčná DNA maternálního i fetálního původu v mateřské plasmě je
tvořena relativně malými fragmenty (150-200 bp)
• Tyto cirkulující fragmenty mimobuněčné DNA reprezentují kompletní
genetickou informaci
• Fetální DNA je placentárního původu
• Maternalní DNA pochází z krvinek
• Fetální DNA tvoří 5-25% z celkové mimobuněčné DNA (průměrně ~10%).
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Recentní práce
a postupy v oblasti LMB
• Allelic Ratio Approach Using Methylated DNA
Poon LLM et al. Clin Chem 2002;48:35-41, Tong YK et al. Clin Chem 2006;52:2194-202
• Digital PCR Approach to Determining Chromosome Copy Number
YM Dennis Lo et al.
PNAS USA 2007;104:13116-21
• Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing
DNA from maternal blood
Fan HC et al. (Stephen Quake group).
PNAS USA 2008;105:16266-71
• Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy
by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal
plasma.
Chiu RWK et al. (Dennis Lo group) PNAS USA 2008;105:20458-63.
• The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for noninvasive prenatal diagnosis.
Wright CF, Burton H. Hum Reprod Update 2009;15:139-51.
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Recentní práce
a postupy v oblasti LMB
• Stanovení alelického poměru s využitím rozdílné metylace
fetální a maternální DNA
- pouze pro heterozygotní plody
• Digitální PCR – měření malého rozdílu obsahu specifických
sekvencí na chromozomu 21 u euploidních a aneuploidních
vzorků
• Shotgun sequencing – nevyžaduje oddělení volné mimobuněčné
fetální a maternální DNA. Je nezávislá na polymorfismech a je
univerzálně použitelná pro stanovení fetálních aneuploidií
• Masivní paralelní sekvenování – vyjadřuje procento obsahu
chromozomů 21 ve vzorku a srovnává jej pomocí odchylky od
běžných euploidních vzorků
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
MPS – Implementace
na platformu Ilumina
• Příprava vzorků (cca. 270 USD)
• Příprava klastrů (cca. 600 USD)
• Sekvenování (1500 USD pro 1 celu, 7 pac.+QC)
• Počítačová analýza dat, vyhodnocení
• Délka procesu – 3 pracovní dny
• Cena zařízení – 600.000 USD
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Leden 2011
• (BMJ 2011;342:c7401doi:10.1136/bmj.c7401)
• They reported detecting 100% of fetal
T21 with a 2.1% false positive rate
(96.6% PPV) using a 2-plex protocol
(2 patient samples per lane).
• Using an 8-plex protocol, performance was not as robust: a
79.1% detection rate and 1.1% false positive rate were
observed.
Březen 2011
Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Noninvasive detection
of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a
study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol 2011;204:205.e1-11.
• 439 high risk pregnancies
• 39 correctly classified as T21
• 1 misclassified as T21
• 100% sensitivity
• 99,7% specificity
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Infanet Study Enrollment Activity
•
•
•
•
•
•
Women enrolled — 4448
Samples Stored — 4286
Karyotypes entered — 4166
Trisomies — 309
T21 — 211
T21 OAPR — 1 in 20
• Number of T21 pregnancies examined: 86 vs. 200
• MPS Protocol 2-plex/8-plex vs. 4-plex
• Instrumentation: Illumina Genome Analyzer II/IIx vs. Illumina
HiSeq 2000
• Diversity 3 cities vs. 27 Recruitment Sites
Co můžeme očekávat?
• Současné nejlepší možnosti screeningu:
Integrovaný nebo sekvenční Integrovaný Test
95% DR @ 5% FPR
90% DR @ 2% FPR
• Cíl:
>98% DR @ <1%FPR
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011
Děkuji za pozornost
Seminář ÚKBP, FN Motol Praha, 22.3.2011