laboratorní technika pro biochemiky

LABORATORNÍ TECHNIKA
PRO BIOCHEMIKY
Tomáš Hluska, David Zalabák,
Petr Galuszka a Lenka Luhová
Katedra biochemie Přírodovědecké fakulty
Univerzity Palackého
OLOMOUC 2015
Recenzenti
Prof. Ing. Jan Káš, DrSc. – Ústav biochemie a mikrobiologie FPBT VŠCHT Praha,
Doc. RNDr. Petr Zbořil, CSc. – Katedra biochemie PřF MU Brno
3. vydání, Olomouc 2015
© Mgr. Tomáš Hluska, Mgr. David Zalabák, Ph.D., Mgr. Petr Galuszka, Ph.D., RNDr. Lenka Luhová,
Ph.D., 2015
Vydala Univerzita Palackého v Olomouci
2
Předmluva
Skripta byla sepsána jako přehledný soubor návodů pro absolvování předmětu Laboratorní
technika. Praktické cvičení jsou v zimním semestru povinni navštěvovat posluchači prvních
ročníků oboru biochemie a molekulární biologie na Přírodovědecké fakultě Univerzity Palackého.
Náplň cvičení byla koncipována tak, aby pokryla veškeré základní laboratorní techniky a
postupy ze všech chemických a biologických oborů, se kterými se bude posluchač setkávat
v praktických cvičeních během svého studia. Především je zaměřena na základní postupy
uplatňující
se
v moderní
biochemické
laboratoři
(práce
s automatickou
pipetou,
spektrofotometrie, chromatografie). Velký důraz při sestavování úloh byl kladen na to, aby
posluchači získali všechny základní návyky nutné pro bezpečnou a efektivní práci.
Skriptum je rozděleno na dvanáct samostatných laboratorních cvičení. Rozsahem odpovídá
počtu hodin, které student musí absolvovat během semestru. Každé laboratorní cvičení obsahuje
jeden nebo více úkolů, které jsou řešeny tak, aby je student stihl vypracovat během jednoho
cvičení, tzn. zhruba za 4 hodiny čistého času. První dvě cvičení jsou úvodní a absolvují je všichni
studenti společně. Dalších deset úloh je rozděleno podle náročnosti na dvě části a studenti se
střídají v jejích vykonávání po týdnech. Prvních pět úloh v první půli semestru a zbylých pět
náročnějších na konci semestru. Studenti většinou pracují v párech mohou však pracovat i
jednotlivě, záleží na obsazenosti jednotlivého kurzu. V závěru každého cvičení je uvedena
literatura, ze které autoři při sestavování čerpali, a několik otázek, na které studenti odpovídají
na základě získaných dat či studia doporučené literatury. Vypracované odpovědi odevzdávají
formou protokolu společně se stručným popisem a vyhodnocením cvičení.
Milou povinností autorů je poděkovat svým kolegům z katedry biochemie PřF UP za cenné
rady a také posluchačům oboru biochemie v letech 2001-06 a 2002-07, kteří přímo za běhu
cvičení vyjadřovali své připomínky a nejasnosti, na které byl brán zřetel při konečné podobě
tohoto učebního textu.
V Olomouci, leden 2003
Autoři
3
PŘEHLED CVIČENÍ Z LABORATORNÍ TECHNIKY PRO BIOCHEMIKY
1. Úvodní hodina
str.5
Laboratorní řád. Bezpečnost práce. Zdroje tepla v laboratoři. Měření teploty. Chemické sklo a
laboratorní nádobí. Chemikálie a jejich uchovávání. Nebezpečné látky a manipulace s nimi.
2. Základní úkony v biochemické laboratoři
str.16
Váhy a vážení. Měření objemů a pipetování. Příprava roztoků. Ředění kyselin a zásad. Pufry, jejich
příprava a použití. Měření pH.
3. Úprava biologického materiálu, precipitační techniky, centrifugace, dialýza a ultrafiltrace
str.26
Homogenizace semen ječmene, precipitace jejich proteinů síranem amonným s následnou
dialýzou a ultrafiltrací na zařízení Amicon.
4. Extrakce, filtrace, sublimace a práce s vakuovou rotační odparkou
str.35
Izolace kofeinu z čajového listí a jeho přečištění sublimací.
5. Spektrofotometrická měření
str.42
Spektrofotometrické stanovení niklu v neznámém vzorku. Stanovení obsahu proteinů
v biologickém materiálu metodou Bradfordové. Měření absorpčních spekter listových barviv.
Stanovení koncentrace DNA. Stanovení proteinové koncentrace metodou BCA s pomocí
spektrometru Agilent 8453 s automatickým podavačem a průtočným systémem
6. Destilace
str.53
Izolace silice z hřebíčku destilací s vodní parou.
7. Práce s plyny a sklem
str.58
Určení procentuálního obsahu uhličitanu vápenatého ve vaječné skořápce jeho rozložením na oxid
uhličitý. Práce se sklem a korkem.
8. Sušení, chlazení a lyofilizace
str.66
Stanovení obsahu vody v modré skalici. Příprava bezvodého silikagelu. Teoretické seznámení
s lyofilizátorem. Koncentrace roztoku proteinů pomocí gelové filtrace.
9. Krystalizace, promývání na filtru, dekantace a stanovení bodu tání
str.76
Stanovení bodu tání (čistoty) izolovaného kofeinu. Izolace a krystalizace kyseliny citrónové
z citronů. Rušená krystalizace technického síranu měďnatého.
10. Chromatografie I
str.82
Sloupcová chromatografie na iontoměničích. Regenerace ionexu.
11. Chromatografie II
str.89
Chromatografie karotenoidů na tenké vrstvě. Gelová chromatografie nízko- a vysokomolekulární
látky.
12. Práce s mikroskopem
str.98
Stavba rostlinné buňky v pokožce cibule. Plasmolýza, deplasmolýza, plazmoptýza. Pozorování fází
buněčného cyklu v kořenech cibule. Histochemická reakce na lignin.
13. Práce s mikroorganismy ve sterilním prostředí, izolace bakteriální DNA a agarosová
elektroforesa DNA
str.107
4
Laboratorní cvičení č. 1
ÚVODNÍ HODINA
LABORATORNÍ ŘÁD
1) Student je povinen se seznámit před zahájením práce v laboratoři s laboratorním řádem,
s bezpečnostními předpisy a s poskytováním první pomoci.
2) Student je povinen přicházet do laboratoře včas a řádně připraven. Musí mít provedeny
potřebné výpočty, znát vlastnosti látek, se kterými bude pracovat apod. Před zahájením
cvičení vyučující ověřuje znalosti studentů. Pokud student nemá dostatečné znalosti k řešení
dané úlohy, cvičení vykoná v náhradním termínu.
3) Každá absence musí být omluvena. Má-li student vážné osobní důvody, pro které se nemůže
zúčastnit cvičení, sdělí to vedoucímu předem. Každá zameškaná úloha musí být nahrazena. Na
termínu náhradního cvičení se dohodne posluchač s vedoucím cvičení.
4) Při práci v laboratoři musí mít student pracovní plášť a vhodnou obuv.
5) Studenti pracují ve dvojících. Před zahájením práce zkontrolují podle přiloženého seznamu
pracovní stůl a jeho vybavenost. Všechny závady zjištěné před zahájením práce nebo v jejím
průběhu neprodleně hlásí vedoucímu cvičení.
6) Při práci je nutné postupovat přesně podle zadané úlohy a pokynů vyučujícího. Před
používáním přístrojů se musí student nejprve seznámit s jejich obsluhou.
7) Průběh práce a dosažené výsledky si každý student zaznamenává do protokolárního sešitu. Po
skončení cvičení předloží výsledky vedoucímu cvičení.
8) Následující cvičení odevzdává každý student vypracovaný protokol, který musí obsahovat:
jméno studenta, studijní kombinaci, datum, název úlohy, stručný princip úlohy, stručný
pracovní postup, výsledky, diskusi a závěr (tabulky, grafy).
9) Po skončení práce je student povinen dát své pracovní místo do pořádku, řádně umýt sklo a
opláchnout je destilovanou vodou.
10) Student smí opustit laboratoř až po kontrole dosažených výsledků a stavu pracovního stolu
vyučujícím.
11) Po skončení práce uzavřeme vodu a vypneme elektrické spotřebiče.
12) V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit.
13) Studenti jsou povinni dodržovat bezpečnostní předpisy.
14) Práce s jedovatými, těkavými a páchnoucími látkami se provádí pouze ve spuštěné digestoři.
15) Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami
a jedovatými látkami.
16) Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění je nutné ihned hlásit vyučujícímu a
v případě potřeby poskytnout okamžitě první pomoc.
17) Práce v chemické laboratoři je zakázána těhotným ženám a matkám do konce 9. měsíce po
porodu. Posluchačka je povinna vedoucímu cvičení okamžitě oznámit graviditu či nedávný
porod.
5
BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI
1) Provádíme pouze práce podle pokynů vyučujícího a pracovního návodu.
2) Seznámíme se s rozmístěním hasících přístrojů a s únikovými východy z laboratoře.
3) V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a nekouříme. Po skončení práce si důkladně umyjeme
ruce.
4) K jídlu a pití (mimo laboratoř) nikdy nepoužíváme chemické sklo.
5) Tašky a oblečení uložíme do skříní mimo laboratoř.
6) Při práci v laboratoři vždy nosíme pracovní plášť a vhodnou obuv.
7) Neprovádíme samovolné opravy nebo úpravy na elektrické instalaci a přístrojích.
8) Chemikálie nikdy nezkoušíme ústy a neinhalujeme výpary.
9) Nepipetujeme ústy.
10) Při práci se žíravinami a jinými nebezpečnými látkami si chráníme obličej a oči ochranným
štítem, ruce gumovými rukavicemi.
11) Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu. Dbáme, abychom vnější stěny nádob nebo
pracovní místo nepotřísnili chemikáliemi.
12) Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem
po tyčince do vody za současného míchání a chlazení.
13) Při provádění pokusů ve zkumavkách držíme ústí zkumavek odvrácené od obličeje (svého
i spolupracovníků).
14) Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň. Při destilaci hořlavin je nezbytné
z okolí odstranit zásobní láhve hořlavin a kontrolovat průtok vody chladičem. Hořlaviny nikdy
nezahříváme přímým plamenem, používáme lázně nebo topná hnízda.
15) Zvýšenou pozornost věnujeme hlavně manipulaci s hořlavinami I. třídy, které mají teplotu
vzplanutí do 21C (aceton, ether, methanol, ethanol, benzín, benzen a toluen).
16) Pokud vypukne požár, je každý povinen pokusit se ho zdolat vlastními silami (hasicím
přístrojem, improvizovanými hasicími prostředky). Je nutno dále vypnout elektrický proud a
pokusit se odstranit z okolí požáru hořlavé látky (zejména kapaliny) a nádoby se stlačenými
plyny. Nelze-li požár zvládnout vlastními silami, je nutné neprodleně volat požárníky (tel.číslo
150).
17) Střepy a jiné odpadky s ostrými hranami musí být odkládány do nádob zvlášť k tomu
určených.
18) Zbytky jedů a organických rozpouštědel likvidujeme podle pokynů vyučujícího.
19) Při práci s etherem dbáme úzkostlivě na bezpečnostní opatření (možnost vznícení i od
horkých součástí).
20) V případě nehody okamžitě informujeme vyučujícího a poskytneme první pomoc. Vedoucímu
cvičení je třeba hlásit i každé nepatrném poranění, bolesti hlavy, hučení v uších apod. Ve
všech případech je nutno sepsat protokol o poranění pro případ pozdějších komplikací.
6
PRVNÍ POMOC PŘI NEHODĚ
Při poleptání kůže silnou zásadou nebo kyselinou zasažené místo ihned důkladně omyjeme
proudem vody. Při poleptání kyselinou provedeme neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu
sodného (20 g.L-1), při poleptání zásadou zředěnou kyselinou octovou (5 g.L-1).
Při zasažení oka chemikálií ihned oko vypláchneme slabým proudem vody. V případě zasažení
zásadou oko vypláchneme borovou vodou (roztok kyseliny borité 30 g.L-1). Jedná-li se o kyselinu,
použijeme k výplachu roztok boraxu (20 g.L-1). V každém případě je nutné vyhledat očního lékaře.
Při poleptání sliznice v ústech provedeme důkladný výplach úst vodou a následně
neutralizaci výplachem zředěnou kyselinou octovou (poleptání zásadou) nebo hydrogenuhličitanem
sodným (poleptání kyselinou).
Při požití louhu se doporučuje pít zředěnou kyselinu octovou (0,5 - 2,0 g.L-1), při požití
kyseliny pijeme suspenzi oxidu hořečnatého nebo hydroxidu hlinitého ve vodě. Po požití jedů je
charakter první pomoci specifický podle druhu otravy, doporučuje se vypít aspoň 0,5 l vody a
vyvolat zvracení. Je vždy nutné vyhledat odborné lékařské ošetření.
Hořící oděv hasíme přikrývkou nebo sprchovou vodou. Při likvidaci větších plamenů
použijeme hasící přístroje. Při malých popáleninách ošetříme postižené místo mastí na spáleniny a
zakryjeme sterilním obvazem. Větší popáleniny ošetří lékař.
Při pořezání sklem odstraníme z povrchové rány sklo, okolí otřeme zředěným peroxidem
vodíku (3%) a ovážeme sterilním obvazem. Větší zranění ošetří lékař.
Nebezpečné látky v chemické laboratoři:
Amoniak je značně těkavý. Páry leptají sliznice a ve vysokých koncentracích může působit
smrtelně. Postižený potřebuje naprostý klid a pobyt na čerstvém vzduchu. Při nadýchání či požití
je nutné podávat hodně vody s octem nebo citronem, později olivový olej s kousky ledu.
S amoniakem pracujeme vždy v digestoři.
Chlor, brom silně leptají dýchací orgány. Jejich účinky se projevují až po několika
hodinách (kašel, dušení). Postiženého přeneseme na čerstvý vzduch a zajistíme klid. Nenutíme ho
dýchat zhluboka a nikdy nezavádíme umělé dýchání. Je možné vdechovat vodní páru s amoniakem
nebo ethanolem, či 2% roztokem sody. Asanace rozlitého bromu se provádí thiosíranem.
Kyanovodík a kyanidy jsou prudce jedovaté látky mandlového zápachu. Páry kyanovodíku
způsobují i v nepatrných koncentracích okamžitou smrt. Plyn proniká i pokožkou. Při práci
s kyanovodíkem používáme vždy plynovou masku. Při otravě nutná okamžitá lékařská pomoc.
Dlouhodobě zavádíme umělé dýchaní, popř. zabezpečíme vdechování kyslíku. Kyanidy působí jako
inhibitory dýchacího řetězce mitochondrií. Smrtelná dávka je zhruba 200 mg. Při otravě je
potřeba okamžitě vypláchnout žaludek, popř. vyvolat zvracení. Podáváme zředěný peroxid vodíku.
Injekčně se podává methylenová modř a thiosíran. Páry kyanovodíku se uvolňují v kyselém
prostředí z kyanidů!
Oxid uhelnatý je prudce jedovatý plyn, který nelze zjistit čichem. Vytěsňuje kyslík
z vazebného místa na hemoglobinu. Již po krátkém nadýchání otupuje a způsobuje smrt
zadušením. Postiženého vyneseme na čerstvý vzduch a zavádíme umělé dýchání s inhalaci kyslíku.
Nitrózní plyny mohou způsobit i při vdechnutí malého množství smrt. Postiženého je třeba
nechat vdechovat volně kyslík a přičichávat amoniak. Nezavádíme umělé dýchaní a poskytneme
absolutní klid.
Oxid siřičitý vyvolává při vdechování křečovitý kašel. Postiženého je třeba přenést na
čerstvý vzduch, popř. jej nechat vdechovat páry etanolu nebo kyslíku.
7
Sulfan je prudce jedovatý plyn. Při nadýchání je potřeba postiženého ihned vynést na
čerstvý vzduch. Dojde-li k otravě a ztížení dýchání, je nutné okamžitě inhalovat kyslík a zavádět
umělé dýchání i při zdánlivé smrti.
Rtuť je jedovatá nejen ve svých sloučeninách, ale i v parách a prachu. Při otravě je
potřeba podávat prostředky na zvracení (mýdlová voda) a vypláchnout žaludek. Pak podávat bílek
v mléce, vodnou suspenzi hořčíku s mandlovým olejem, roztok taninu nebo železný prach. Při
rozlití asanovat malé kapičky sirným květem nebo posbírat mosazným plíškem. Při rozbití
rtuťového teploměru je nutno vždy řádně odstranit veškerou rtuť z prostředí, jelikož ta pak
může v laboratoři způsobovat dlouhodobé otravy.
Olovo je nebezpečné v parách a jeho sloučeniny způsobují dlouhodobě chronickou otravu,
tzv. saturnismus. Po požití je třeba podávat velké množství roztoku MgSO4, vyvolat zvracení a
pak podávat mléko a vodu s bílkem. Po práci s kovovým olovem si vždy řádně opláchněte ruce.
Methanol působí škodlivě jednak vdechováním par, jednak požitím. V první fázi vyvolá
opojení později křeče. Větší dávky způsobují trvalé oslepnutí a smrt. Na rozdíl od etanolu se
velice dobře vstřebává i kůži. Při práci s metanolem proto vždy pracujeme v ochranných
pomůckách. Při požití metanolu se jako antidotum podává etanol, který je daleko lepším
substrátem lidské alkoholdehydrogenasy a zabraňuje tak tvorbě toxického formaldehydu z
metanolu.
Benzen, toluen, naftalen působí škodlivě na červené krvinky. Při požití vyvolává zvracení.
Je nutný klid, popř. umělé dýchaní.
Fenol je značně toxická látka leptající kůži, kterou se rychle vstřebává a způsobuje
celkovou intoxikaci. Potřísněnou kůži omýváme 25% alkoholem nebo glycerolem. Při práci
s fenolem se vždy chráníme rukavicemi.
Zvláště nebezpečnou skupinou látek, se kterými se můžete v chemické laboratoři setkat,
jsou látky mutagenní a karcinogenní. Jejichž nebezpečnost tkví v tom, že nezpůsobují akutní
otravy, ale dlouhodobým působením mohou vyvolat nádorové onemocnění. Při práci s těmito
látkami pracujeme vždy dle daným předpisů a chráníme se ochrannými pomůckami. Mezi
karcinogeny, které se často používají v biochemické laboratoři patří: benzen, styren,
chloroform, ethidium bromid a akrylamid.
Při práci s infekčním materiálem je nutno zachovávat všechna hygienicko-preventivní
opatření, abychom nenakazili sebe ani své okolí. Za potenciálně infekční materiál je nutno
považovat všechny tělesné tekutiny (moč, sliny, krev) a živočišné tkáně, případně extrakty z nich
připravené.
LABORATORNÍ SKLO A PORCELÁN
Mezi laboratorní sklo řadíme veškerý skleněný materiál, se kterým se setkáváme
v chemické laboratoři. Laboratorní sklo má vysokou odolnost k minerálním kyselinám a zásadám.
Z fyzikálních vlastností skla je nejdůležitější jeho tepelná roztažnost. Obecně mají skla měknoucí
při vyšších teplotách větší odolnost proti náhlým tepelným změnám. Setkáváme se především se
třemi druhy skla:
1) Sklo měkké – sodno-draselno-vápenaté se používá na výrobu nádobí, které není
vystavováno tepelnému namáhání. Má velký koeficient roztažnosti, takže nesnese kolísání teploty.
Musí se zahřívat nebo ochlazovat velmi opatrně. Má nízký bod tání a proto se dá snadno roztavit
v plameni nad kahanem. Změklé sklo se pak dá lehce opracovávat.
2) Sklo tvrdé - borosilikátové slouží na výrobu skleněného nádobí, které můžeme zahřívat
nad plamenem. Zhotovuje se z něj veškeré varné a odměrné sklo. Borosilikátové sklo má
nazelenalou barvu a vyznačuje se odolností proti praskání, vysokým bodem tání a vysokou
chemickou odolností. Nejběžnější obchodní značky jsou Sial, Simax, Duran či Pyrex.
8
3) Sklo křemenné – se vyznačuje vysokou chemickou a tepelnou odolnosti. Je však velice
křehké a využívá se pouze ke zhotovování speciálních nádob a zařízení, např. kyvet pro
spektrofotometrii (propouští UV záření).
Obecnou vlastností skla je jeho křehkost. Zbytečnému praskání zamezíme řádným
uchycením do svorek a lapáků s čelistmi s korkovou výztuží, popř. s navlečenými gumovými
hadičkami. Při práci s agresivními látkami či ve vakuu není vhodné používat korek a gumové
hadice. Pracujeme pak se zábrusovým sklem, které se dá vzájemně stavebnicově propojovat.
Zábrusové baňky, chladiče, teploměry, zátky atd. jsou normalizované. Nejčastější rozměry
zábrusů jsou NZ 14,5/15; NZ 29/32; NZ 40/45 (čísla znamenají průměr zábrusu v mm ve zúžené
a širší části). Práce se zábrusy je rychlá a pohodlná. Zábrusy je však třeba vždy řádně promazat
silikonovou vaselinou, aby nedocházelo k jejich „zatuhnutí“.
Vedle skleněného nádobí používáme v chemické laboratoři velice často též nádobí a
pomůcek z porcelánu (třecí a odpařovací misky, žíhací kelímky, váženky, lžičky, Bűchnerovy
nálevky aj.). Tvrdý chemický porcelán má vysokou mechanickou a chemickou odolnost. Je citlivý na
údery a lehce se tříští hlavně při prudkých změnách teploty. Je stálý proti vzdušnému kyslíku i za
žáru, vodu povrchově neváže a je v ní i za vysokých teplot nerozpustný. Chemickým činidlům
vzdoruje asi stejně dobře jako chemické sklo. Chemický porcelán může být drsný či glazurovaný.
Glazura jeho vlastnosti nijak výrazně neovlivňuje.
Chemické nádobí čistíme ihned po práci, dokud nečistoty a zbytky chemikálií na stěnách
ještě nezaschly. Zpravidla si vystačíme s postupy známými z domácnosti, tj. použití saponátového
prostředku a důkladné omytí vodou. V laboratoři však nezapomene na poslední krok, kterým je
řádné vypláchnutí destilovanou vodou. Pokud na stěnách ulpěly kousky ve vodě nerozpustných
nečistot použijeme mechanických pomůcek jako jsou kartáče, útržky filtračního papíru nebo
jemný písek. Toto mechanické čištění však nesmí sklo poškrábat, i nepatrné škrábnutí může
způsobit při zahřívání prasknutí skla. Když ani mechanické čištění nevede k odstranění nečistot,
přichází na řadu chemické čištění. Použijeme rozpouštědlo, které čištěný materiál nekoroduje a
ve kterém je nečistota rozpustná. Nejčastěji se využívají v laboratoři dostupné minerální
kyseliny. Při této činnosti dbáme na dodržování bezpečnostních předpisů a používáme ochranné
pomůcky. Vysokou čistící schopnost má tzv. kyselina chromsírová, což je dichroman sodný
rozpuštěný v koncentrované kyselině sírové. Sklo se do této směsi namočí přes noc a ráno se pak
důkladně opláchne v roztoku detergentu, pod tekoucí vodou a nakonec ve vodě destilované.
Chromsírová směs se po čase vyčerpá, což se projeví zeleným zbarvením (redukce dichromanu na
ion chromitý). Taková směs je pak málo účinná a musí se připravit nová.
Zvláštní nároky jsou kladeny na sklo používané v molekulárně biologické laboratoři, kde se
velice často pracuje s bakteriálními kmeny a jinými mikroorganismy a je velké riziko bakteriální
kontaminace z okolí. Proto se snažíme používat pro manipulaci s těmito organismy pouze sterilní
plasty na jedno použití. Pokud je nutno použít skleněné či jiné dražší nádobí, musí se předem
sterilizovat ve speciálních tlakových nádobách (autoklávy) a následně vysušit v sušárně na 105C.
Zvláštní péče je pak věnována sklu, které se používá pro manipulaci s RNA. Hrozí totiž nebezpečí
kontaminace ribonukleasami, což jsou degradační enzymy RNA, které jsou velice stabilní a
odolávají i běžné sterilizaci. Sklo se proto před sterilizaci namáčí do roztoku jejich inhibitoru
diethyl pyrokarbonátu.
CHEMICKÉ NÁDOBÍ A APARATURY
Mezi základní vybavení každé chemické laboratoře patří baňky a kádinky. Kádinky mají
rovné dno a na horním okraji mohou mít zobáček. Mohou být i kalibrovány, ale tato kalibrace
slouží pouze k orientačním účelům, rozhodně podle ní nelze odměřovat přesné objemy. Baňky mají
tvar členitější, rozdělený na vlastní baňku a hrdlo. Dno mohou mít jak rovné, tak kulaté, ty se pak
používají hlavně pro práci za sníženého tlaku. Baňky a kádinky jsou převážně tenkostěnné,
9
1
2
7
13
21
8
14
22
3
23
4
5
9
15
24
6
10
16
17
25
26
11
18
12
19
27
20
28
Obrázek 1: Laboratorní nádobí: 1/ kádinka s výlevkou, 2/ kádinka bez výlevky, 3/destilační
baňka se zábrusem a kulatým dnem, 4/ destilační baňka se zábrusem a plochým dnem, 5/
hruškovitá baňka, 6/ Erlenmeyerova baňka se zábrusem, 7/ baňka trojhrdlá, 8/ titrační baňka, 9/
frakční baňka, 10/ baňka odsávací, 11/ odměrná baňka, 12/ dělicí nálevka kulovitá, 13/ dělící
nálevka hruškovitá, 14/ nálevka s dlouhým stonkem, 15/ nálevka s krátkým stonkem, 16/ násypka,
17/ Büchnerova nálevka, 18/ skleněná frita pro vakuovou filtraci, 19/ promývačka, 20/ láhev se
šroubovacím uzávěrem, 21/ úzkohrdlá zábrusová láhev, 22/ zkumavka, 23/ zkumavka se
šroubovacím uzávěrem, 24/ centrifugační kyveta, 25/ Petriho miska, 26/ krystalizační miska,
27/ odpařovací miska, 28/ hodinové sklo.
10
jednou z vyjímek je silnostěnná baňka odsávací. Slouží k filtraci za sníženého tlaku a je určená
pouze k tomuto účelu, v žádném případě v ní nelze provádět nějaké chemické reakce, plnit
horkými kapalinami nebo zahřívat. Baňka konického tvaru se nazývá Erlenmayerova. Baňku
s postranním tubusem nazýváme frakční.
Slovem nálevka označujeme v laboratoři větší počet pomůcek. Obyčejné nálevky slouží
k přelévání kapalin a jednoduchým filtracím. Pro urychlení filtrace se používají nálevky
s žebrovaným vnitřním povrchem nebo dlouhým a úzkým stonkem. Tzv. dělící nálevky se používají
k řadě procesů, jako je extrakce, sušení, přikapávání atd. Velmi často používanou je, z porcelánu
vyrobená, Büchnerova nálevka mající dírkované dno, na které se při filtraci vkládá kolečko
filtračního papíru. Podobně vypadají i skleněné frity, které mají místo dírkovaného dna
sintrované sklo propouštějící rozpouštědla. Zábrusové láhve na čištění plynů se nazývají
promývačky. Zásobní láhve na chemikálie se dělí podle typu hrdla na reagenční láhve se
šroubovacím víkem, sloužící především k uchovávání kapalin a širokohrdlé se zábrusovou zátkou
tzv. prachovnice, ve kterých přechováváme pevné látky. K přechovávání malých množství pevných
látek používáme lékovky. Protáhlá neuzavíratelná skleněná nádobka se nazývá zkumavka, slouží
k provádění chemických reakcí v malých objemech. V poslední době jsou velmi populární plastové
zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Nádoby podobného tvaru, většinou také šroubovací,
používáme k centrifugaci a nazýváme je kyvety. Bývají zhotovovány většinou z tvrzených plastů.
Hodinová skla slouží k přikrývání nádob, k sušení, vážení a přenášení vzorků pevných látek.
Analogicky můžeme využívat i dvoudílné Petriho misky, jež se hlavně používají pro kultivace
mikroorganismů. Odpařovací misky bývají většinou vyrobeny z porcelánu. Nejsou vhodné
k přímému zahřívání v plameni stejně jako misky krystalizační. Pro odpařování roztoku používáme
vždy vodní lázeň. K drcení a roztírání pevných vzorků slouží třecí misky s tloučkem. Jediným
porcelánovým nádobím, které snáší přímý oheň, jsou žíhací kelímky.
Chemické sklo většinou nepoužíváme samostatně, ale sestavujeme ho do různých aparatur,
např. aparatura na destilaci, sublimaci apod. Aparatury sestavujeme na kovových stojanech nebo
kovových klecích. Na svislé tyče stojanů a klecí připevňujeme kruhy, svorky nebo držáky pomocí
svorek (obr. 2). Na kovové kruhy zpravidla pokládáme azbestové síťky, na které stavíme kádinky
v případě jejich zahřívání kahanem. Kruhy pro zahřívání nikdy nezaměňujeme s kruhy filtračními,
které jsou vyloženy dřevěnou nebo umělohmotnou vložkou a slouží k držení nálevky při filtraci
nebo dělící nálevky při dělení kapalin. Kruh na stojanu se často nahrazuje trojnožkou.
K upevňování skleněných součástí malého průměru používáme tzv. klemy, což jsou držáky s malým
obvodem ramen. Pro uchycování chladičů pak používáme chladičové držáky s velkým rozpětím
ramen. Klemy a držáky se nesmějí nikdy dotýkat skleněných částí aparatury přímo kovem. Bývají
vyloženy korkem nebo potaženy gumovou hadicí. Při sestavování jakékoli aparatury musíme dbát
na to, aby v aparatuře nenastalo pnutí, které by při zahřátí vedlo k prasknutí některé ze
skleněných součástí. Při sestavování aparatury ze zábrusového skla nikdy neopomeneme zábrusy
řádně promazat vazelinou.
Obrázek 2: Sestavování aparatur. A – nesprávné uchycení křížové spojky, B – správné uchycení,
C – chladičový držák, D – klema.
11
ZDROJE TEPLA V CHEMICKÉ LABORATOŘI
V laboratořích, do kterých je zaveden plyn, nám jako zdroj pro zahřívání může sloužit
plynový kahan. Kahan je jednoduché zařízení sloužící k tvorbě směsi vzduchu a plynu, která se
spaluje a vytváří na konci trubice plamen. Podle způsobu, jakým je k plynu přiváděn a mísen
vzduch, rozlišujeme tři typy kahanů: Bunsenův, Tecluho a Mékerův. Pokud je do plynu přiváděno
dostatečné množství vzduchu hoří nesvítivým plamenem, který je výhřevnější než plamen svítivý,
jež získáme zamezením přívodu vzduchu. Z toho plyne pravidlo, že čím více vzduchu smísíme
s plynem, tím výhřevnější plamen získáme. U Bunsenova a Mékerého kahanu se přívod vzduchu
reguluje otáčením pohyblivého prstence, který odkrývá nebo zakrývá otvory v těle kahanu.
Kahany zapalujeme vždy při uzavřeném přívodu vzduchu. V laboratoři často narazíme i na kahan
lihový, který má daleko nižší výhřevnost než kahany plynové. Výhodou však je jeho velikost a
jednoduchost. Lze ho použít všude tam, kde potřebujeme vzorky či chemické reakce jen zahřát.
Používá se hlavně při zkumavkových reakcích a pro sterilizaci materiálu při práci
s mikroorganismy.
V současné době se však jako hlavní zdroje tepla v chemických laboratořích využívají
elektrické vařiče a topná hnízda. Na elektrický vařič pokládáme vždy azbestovou síťku. Topná
hnízda používáme hlavně na zahřívání destilačních baněk. Jde o elektrický vařič, u kterého je
elektricky vyhřívaná speciální tkanina vytvarovaná do polokoule tak, aby obalila destilační baňku.
Existuje několik typů topných hnízd podle velikosti zahřívané baňky. U topného hnízda lze kromě
regulace příkonu většinou regulovat i to, zda je vyhřívaná pouze spodní část baňky, nebo baňka
celá. Při práci s topnými hnízdy je třeba hlavně dávat pozor, aby do hnízda nevnikla kapalina
(voda). Dojde-li k tomu, neprodleně přístroj vypneme.
Protože každé přímé zahřívání klade vysoké nároky na materiál nádob, je výhodné předávat
teplo zdroje prostřednictvím různých lázní. Podle materiálu, který tvoří podstatu lázně je možné
dělení na vzdušné, vodní, olejové, pískové, kovové a solné. Vzdušné lázně se moc často nepoužívají
vzhledem k tomu, že vzduch je ze všech materiálů nejméně vodivý. Nejjednodušší formou vzdušné
lázně je prázdná kovová nádoba zahřívána kahanem nebo vařičem. Nejčastěji používáná je lázeň
vodní, která je vhodná k zahřívání látek až do bodu varu vody a k destilaci kapalin vroucích
přibližně do 80°C. Nejjednodušší vodní lázní je obyčejný hrnec, který je vyhříván elektrickým
vařičem. V laboratoři se lze setkat i se speciálními vodními lázněmi, které mají různě nastavitelné
otvory pro zahřívání odlišných velikostí baněk a odpařovacích misek. Pro zahřívání nad teplotu
varu vody se nejčastěji používají lázně olejové. Náplní může být buď olej minerální, který lze
použít do teploty 250°C, nebo silikonový použitelný až do teplot okolo 400°C. Vzhledem k teplotní
roztažnosti je nutno olejem naplnit nádobu sloužící jako obal lázně jen asi do poloviny, jinak by při
zvýšení teploty mohl olej přetéci. Při zahřívání je nutno do olejové lázně vždy vložit teploměr a
průběžně kontrolovat teplotu, aby nedošlo k jejímu přehřátí. Obvykle platí, že teplota lázně, má
být o 20-30°C vyšší než žádaná teplota reakční směsi. Je důležité, aby se do olejové lázně
nedostala voda. Při teplotě nad 100°C by pak došlo k prskání a pěnění oleje, který by mohl
způsobit popáleniny osobě pracující s lázní nebo požár. Solné a kovové lázně slouží k zahřívání nad
300°C. Používá se směs několika solí, např. dusičnan sodný a draselný o bodu tání 219°C a
nízkotající slitiny, jako je Woodoův kov s bodem tání 65°C. Vždy je však důležité vyjmout baňku
před ztuhnutím lázně. Výhodou těchto lázní je vysoká tepelná vodivost použitých materiálů. Od
používání písečných lázni se už v podstatě v dnešní době ustoupilo.
K žíhání a tavení většího množství látek nám slouží elektrické odporové pece. Pro syntézy
v proudu plynu nebo reakce ve vakuu užíváme pece trubkové, pro žíhání v kelímcích nám slouží
kelímkové pícky a pro tavení většího množství látek pece muflové.
12
VAKUUM A JEHO ZDROJE
V laboratorní praxi je velmi často třeba pracovat za sníženého tlaku. Sníženého tlaku vakua se využívá hlavně při destilaci, filtraci či sušení, kde výrazně ovlivňuje těkavost látek.
Vakuum je stav uzavřeného prostoru, ve kterém je tlak plynu nebo páry nižší než tlak
atmosférický okolního prostředí.
Zařízení vytvářející vakuum nazýváme vývěvou. V laboratoři se můžeme setkat s vývěvami
několika typů, které se liší tlakem, proti kterému čerpají, mezní hodnotou vakua a sacím výkonem.
Nejjednodušším typem vývěvy je vývěva vodní. Jedná se o zúženou trubici, kterou tryská proud
vody. V okolí ústí trysky je vzduch strháván ve směru proudu vody a je zde napojena odvodná
hadice, která se druhým koncem napojuje na evakuovanou aparaturu. Vodní vývěva pracuje tedy
přímo proti atmosférickému tlaku. Mezní tlak vakua je dán tenzí vodní páry (pro vodu o teplotě
10°C to je 1333 Pa). Mezi vodní vývěvu a aparaturu vždy zařazujeme pojistnou nádobu
(promývačku), aby nedošlo při poklesu tlaku vody v potrubí ke vniknutí vody do aparatury. Vývěvy
dále mohou být rotační olejové nebo mechanické, jejich konstrukce je již složitější. Základním
stavebním prvkem rotační olejové vývěvy je rotor se šoupátkem, které rozděluje prostor mezi
rotorem a pláštěm na dvě části. Otáčením rotoru se jeden prostor zvětšuje a nasává vzduch a
druhý prostor se zároveň zmenšuje a vzduch je vytlačován za součinnosti ventilu z vývěvy.
Hlavním pravidlem při práci s vývěvou je, že vždy po skončení práce nejdříve znovu zavzdušníme
aparaturu a až poté vypneme zdroj vakua. Zabráníme tím vniknutí vody do aparatury, či nasátí
agresivních látek do vývěvy a její poškození.
MĚŘENÍ TEPLOTY
Pro měření teploty byla přijata mezinárodní teplotní stupnice, definovaná pomocí bodu
tuhnutí vody a varu vody. Další pevné body mezinárodní stupnice jsou: bod varu síry – 444,6°C,
bod tání stříbra – 960,8°C a bod tání zlata – 1062,4°C. Všechny tyto teploty jsou definovány za
atmosférického tlaku jedné atmosféry. Teplotu měříme teploměry, které mohou být trojího typu:
dilatační, odporové a termočlánky.
Dilatační teploměry využívají roztažnosti kapalných, popřípadě pevných či plynných látek.
Nejčastěji používané jsou teploměry rtuťové. Dovolují měřit teplotu od –38,9°C do 650°C. Pro
měření nízkých teplot se teploměry plní toluenem (-80°C až 100°C), etanolem (-100°C až 70°C),
petroléterem (-150°C až 120°C) či pentanem (-190°C až 20°C). Pro vyšší teploty se pak používá
jako náplň kapalné galium (do 1000°C) a cín (do 1500°C).
Odporové teploměry využívají závislosti odporu vodiče na teplotě. Těmito teploměry lze
měřit teplotu s přesnosti na tisíciny stupně.
Termočlánky jsou založeny na termoefektu – dva dráty ze dvou různých kovů spojené na
obou koncích dávají vznik elektrického proudu, jsou-li oba spoje udržovány na rozdílné teplotě.
Příkladem nejčastěji používaných termočlánku je: měď – konstantan (do 600°C), železo –
konstantan (do 900°C), platina – platinarhodium ( do 1600°C).
VODA V BIOCHEMICKÉ LABORATOŘI
Vzhledem k tomu, že obyčejná tekoucí voda obsahuje značné množství solí, je pro jakékoli
pokusy v biochemické laboratoři nepoužitelná. Používáme ji pouze tehdy, když nepřichází do styku
s ostatními reagenciemi, tedy jako rozpouštědlo, např. pro chlazení.
Základním způsobem úpravy vody je destilace. Každá biochemická laboratoř bývá vybavena
vlastní destilační aparaturou. Destilovaná voda postačí pro většinu biochemických operací, ale pro
některé speciální účely nemusí být její čistota vhodná. Obsahuje především některé kationty,
které se do ní dostávají ze součástí destilační aparatury, skla a elektrod. Její kvalitu lze zvýšit
13
opakovanou destilací tzv. redestilací, která se provádí ve speciální aparatuře z křemenného skla
neuvolňující kationty.
Pro speciální účely, např. v laboratoři molekulární biologie, kde vadí i sebemenší
kontaminace vody, se používá voda deionizovaná, která se ještě následně sterilizuje v autoklávu.
Příprava deionizované vody je založená na kombinaci několika separačních metod vedoucí
k odstranění jednotlivých skupin kontaminantů. Souprava je většinou složená z dílčích separátorů
odstraňujících hrubší nečistoty (filtry), ionty (iontoměniče), nepolární látky (adsorbent) a jako
poslední bývá zapojen membránový filtr. Některé aparatury pracují i na principu reverzní osmózy.
Jednotlivé filtry je však nutno po několika měsících provozu vyměňovat a příprava deionizované
vody není proto levnou záležitostí.
Hlavním kritériem čistoty vody je její specifická vodivost. U běžně destilované vody se
pohybuje okolo hodnoty 10 S.cm-1. Deionizovaná voda pak mívá tuto hodnotu ještě o řád nižší.
Připravenou destilovanou či deionizovanou vodu skladujeme převážně v plastových nádobách.
Skleněné nádoby nejsou pro dlouhodobější uskladnění vhodné, jelikož se do vody zpětně uvolňují
některé kationty. A pokud to podmínky dovolují, skladujeme vodu v chladu a ve tmě, čímž
zabráníme možné kontaminaci autotrofními mikroorganismy.
CHEMIKÁLIE A JEJICH UCHOVÁVÁNÍ
Jako výchozí látky pro práci v laboratoři používáme většinou průmyslově vyráběné
chemikálie opatřené výrobcem štítkem udávající nám základní informace o dané chemikálii.
Chemikálie jsou dodávány výrobcem ve vhodném obalu, proto se snažíme je dále
nerozdělovat do obalů jiných. Pokud je to nutné, vždy použijeme vhodný obal a dodržujeme
základní pravidla. Látky kapalné uchováváme v láhvích s dvojím uzávěrem. Látky hygroskopické
chráníme proti vzdušné vlhkosti utěsněním víčka, např. parafilmem. Hydroxidy a jejich roztoky
neskladujeme v zábrusových lahvích. Látky citlivé na světlo skladujeme v tmavých nádobách a ve
tmě. Skladování chemikálií v laboratoři má svůj pevný řád, který vychází z bezpečnostních
pravidel, a proto vždy používanou chemikálii vracíme na původní místo. Usnadníme tím i práci
kolegům, kteří budou s danou chemikálii následně pracovat. Důraz je kladen především na
hořlaviny a látky výbušné, které nikdy nesmí být uskladněny pohromadě ve větším množství. Jedy
skladujeme ve speciálních železných skříních pod zámkem. Pozor dáváme taky na uskladnění
těkavých látek v uzavřených prostorách (lednice), skladujeme je tak, aby nedocházelo
k uvolňování jejích par.
Na štítku chemikálie je především její název, sumární vzorec, množství, čistota a
molekulová hmotnost. Dále mohou být uvedeny některé důležité fyzikální vlastnosti a
bezpečnostní informace (obr. 3 a 4). U pevných látek bývá uvedená forma např. krystalický
(crystalisatum), bezvodý (anhydricum), práškový (pulveratum). Podle rostoucí čistoty (tzn.
klesajícího obsahu nečistot) chemikálie dělíme na:
a)
technické chemikálie
b)
- surové (crudum)
- technické (technicum)
- čištěné (purum)
čisté chemikálie
-
čisté (purissimum)
pro analýzu (p.a., per analysi)
chemický čisté (purissimum speciale)
14
Chemikálie o vyšší čistotě jsou pak označeny přímo účelem, pro který slouží, např. pro UV
spektrofotometrii, molekulární biologii atd. S čistotou chemikálií však prudce roste jejich cena,
proto chemikálie o vysoké čistotě používáme jen pro tyto speciální účely a je-li to nezbytně
nutné.
Obrázek 3: Příklad štítku chemikálie firmy Sigma. A – název chemikálie, B – katalogové číslo, C
– informace o čistotě a fyzikální vlastnosti, D – doporučená manipulace a podmínky skladování, E –
údaje o riziku, F – minimální obsah, I – piktogram označující rizika, L – sumární vzorec a
molekulová hmotnost.
Obrázek 4: Piktogramy používané pro označení nebezpečných chemikálií.
15
Laboratorní cvičení č. 2
ZÁKLADNÍ ÚKONY V BIOCHEMICKÉ LABORATOŘI
VÁHY A VÁŽENÍ
Ke stanovení váhového množství látky užíváme v chemické laboratoři váhy. Princip vážení
je znám po staletí: jde o srovnávací metodu, kdy se srovnává neznámá hmotnost nějakého
předmětu (navažovací lodička, mikrozkumavka se vzorkem) se známou hmotností standardu
(závaží). Mechanické zařízení řešilo toto srovnání pomocí docílení rovnováhy na páce a mělo tvar
známých miskových vah, které vešly v obecné povědomí i jako symbol používaný pro zobrazování
spravedlnosti. Až do nedávna byly i nejpřesnější analytické váhy postaveny na stejném principu a
vážení obsahovalo postupné přidávání závaží různé (i velmi malé) velikosti. Takový postup byl
samozřejmě zejména pro začátečníky velmi zdlouhavý a možnosti chyb četné.
V současné době patří všechny formy dvoumiskových vah historii a v laboratoři se
setkáváme výhradně s vahami jednomiskovými používající promítací stupnice na stínítko a tedy
zapojených do elektrické sítě. Existují dva rozdílné typy vah lišící se váživostí tzn. maximální
hmotností, kterou můžeme vážit, a přesností, se kterou na nich můžeme hmotnost stanovit:
1) Váhy technické mají podle provedení váživost od 100 g do několika kilogramů. Přesnost
nebývá větší než 5.10-2 g.
2) Váhy analytické mají váživost obvykle 100 g a přesnost v řádu 10-4 g.
K orientačnímu zjištění hmotnosti předmětů, které budeme dále vážit přesněji, a ke
zjišťování výtěžků čistících operací používáme tzv. předvážky. Slouží k vážení předmětů do
200 g s přesností  0,1 g. V dnešní době se už používají převážně elektronické typy s digitálním
displayem. Jejich forem je řada a procházejí stále vývojem od jednodušších s mechanickoelektrickým snímačem hmotností přes snímače, kdy je měřen elektrický signál potřebný k vrácení
misky po zatížení do nulové polohy pomocí servomotorku, až k snímačům tenzometrickým.
V našem praktiku nalezneme dva typy analytických vah: robusnější mechanické a moderní
elektronické. K účelům cvičení z laboratorní techniky budeme používat především mechanické
jednomiskové váhy. Jejich princip je znázorněn na obrázku 5. Je zřejmé, že jde vlastně o
klasické jednoramenné váhy pouze upravené pro co nejsnazší obsluhu. Podstatou jejich funkce je
rovnováha na vahadlu, které je zpravidla z lehké slitiny. Aby pohyb vahadla mohl být co
nejjemnější, je jeho osou břit, tj. trojboký hranol z velmi tvrdého materiálu (achát) spočívající
hranou na vyleštěné podložce. Je patrné, že jakékoli prudké pohyby vahadla by v tomto
uspořádání kladly na břit extrémní nároky a velice brzy by byl břit opotřebován. Proto je v
klidovém stavu břit z podložky zvednut a mechanismus spočívá v pevných lůžkách. Tomuto stavu
říkáme aretace. Je pravidlem, že veškeré manipulace, jako je vkládání vzorku do vah či přidávání
nebo ubírání závaží, provádíme výhradně na zaaretovaných vahách. Odaretování, tj. spuštění břitu
na podložku, lze provést pouze v situaci, kdy očekáváme na vahadle rovnováhu. Tento úkon je
nutné provádět pomalu a jemně. Váhy jsou konstruovány tak, že při odaretování se zapojí
elektrický proud a rozsvítí se stinítko, na které je promítána stupnice.
16
Obrázek 5: Schéma jednomiskových vah (B – břit, V – vahadlo, Z – závaží, M – miska, P – protizávaží, S – stupnice).
Z obrázku 5 je zřejmé, že na jedné straně vahadla je upevněná miska a závěs, na kterém
jsou ovladatelná závaží až do hodnoty váživosti, na straně druhé pak pevné protizávaží. Je-li
miska vah prázdná, je miska se závěsem a závažími právě vyvážená protizávažím a po odaretování
se na světelné stupnici promítne nula. Pokud tomu tak není, jde nejčastěji o malou změnu polohy
zrcátek promítající stupnice, kterou lze při odaretovaných vahách upravit korigačním šroubem na
pravé zadní straně vah.
Pokud na misku vah vložíme nějaký předmět, je rovnováha porušena a k jejímu obnovení
musíme ze závěsu vyzvednout odpovídající závaží. K tomu slouží ovládací mechanismum na levé
dolní straně skříně vah. Skládá se ze tří soustředných šroubů. Pravým vnitřním ovládáme desítky
gramů, středním jednotky a vnějším levým pak desetiny gramů. Hodnoty sejmutých závaží se
ukazují v okénku stupnice. Pokud jsou sejmuta závaží zhruba odpovídající skutečné hmotnosti
váženého předmětu, ukáže se hodnota setin a tisícin na světelné stupnici po odaretování vah.
Desetitisíciny odečteme na základě nonia, tzn. že pravý malý šroub vedle stupnice desetitisícin
nastavíme tak, aby ryska na světelné stupnici byla vyrovnána s nejbližší možnou hodnotou tisícin.
Na stupnici desetitisícin pak odečteme danou hodnotu.
Pro veškeré vážení platí základní pravidlo: chemikálie (kapalné ani pevné) nesmí přijít do
přímého styku s miskami vah! Veškerá manipulace s chemikáliemi (přidávání a ubírání) se musí
provádět zásadně mimo váhy. Případné nečistoty na vahách je třeba okamžitě odstranit
štětečkem.
ÚKOL č. 1: Určete průměrnou hmotnost a chybu měření váženého předmětu
POSTUP
Na analytických vahách postupně určete hmotnost deseti stejných předmětů (porcelánový
kelímek, mikrozkumavka, kyveta) a určete aritmetickou průměrnou hmotnost jednoho předmětu a
chybu měření. Vážení provádějte následovně:
1/ Stanovte, případně upravte, nulovou polohu vah. Aretační šroub má dvě polohy. Váhy jsou plně
odaretovány až ve druhé spodní poloze!
2/ Vážený předmět zvažte na předvážkách na desetiny gramů.
3/ Vážený předmět vložte na misku zaaretovaných vah a nastavte závaží souhlasně s hodnotou
získanou na předvážkách.
17
4/ Opatrně odaretujte. Pokud dojde k prudkému pohybu světelné stupnice a stupnice se dostane
mimo rozsah, váhy zpátky zaaretujte a nastavte závaží o desetinu gramu vyšší či nižší.
5/ Toto provádějte tak dlouho, až se vám podaří světelnou stupnici nastavit v jejím rozsahu.
Vyčkejte až do ustálení rovnováhy.
6/ Poté dolaďte šroubem na desetitisíciny gramu rysku souhlasně se stupnicí a odečtěte získanou
hodnotu s přesností na čtyři desetinná místa.
Nezapomínejte vždy při odaretovaných vahách zavírat obě boční dvířka, aby nebyla rovnováha
rušena okolním prouděním vzduchu.
7/ Váhy zaaretujte a vyjměte vážený předmět. Po skončeném vážení je třeba vrátit všechna
závaží zpět a překontrolovat nulovou polohu vah.
VYHODNOCENÍ
Při měření se můžete dopustit nahodilých a systematických chyb. Zatímco systematické
chyby mohou být zapříčiněny například nevhodným postupem při měření, špatnou kalibrací apod. a
nelze je odstranit opakovaným měřením za stále stejných podmínek, chyby nahodilé můžete
výpočtem konečné hodnoty z dostatečně velkého počtu měření z větší části eliminovat.
Opakovaným měřením se vliv nahodilých chyb zmenší.
Měřenou veličinu označíte A, při n počtu měření naměříte postupně hodnoty A1 až An.
Nejlepším odhadem veličiny A je pak průměr nalezených hodnot Â.
n
 Ai
Â
i 1
n
Čím je n větší, tím se hodnota  více blíží správné hodnotě A. Jestliže je odchylka každého
měření od této střední hodnoty označená xi:
xi  Ai  Â
pak je střední chybu výsledku (aritmetického průměru) definovaná takto:
n
x
 
a výsledek se píše ve tvaru:
2
i
i 1
n 1
A  Â
Výsledky měření zapište do tabulky a určete aritmetickou průměrnou hmotnost jednoho
předmětu a střední chybu výsledku.
MĚŘENÍ OBJEMŮ KAPALIN
K odměřování objemů kapalin slouží odměrné válce, pipety, byrety, pyknometry a odměrné
baňky.
Odměrné válce (obr. 6-1) se používají jen k přibližnému odměřování kapalin.
Na přesnější měření objemů se používají pipety (buď pouze pro určitý objem, obr. 6-2,
nebo dělené obr. 6-3,4) a byrety u nichž je možno kohoutkem nebo pomocí tlačky regulovat
vytékání kapaliny (obr. 6-5). Všechny tyto nádoby jsou kalibrovány na vylití, tzn., že z nich vyteče
18
přesně vyznačený objem. Při plnění pipet je třeba vždy dbát toho, aby ústí pipety bylo stále
ponořeno pod hladinou kapaliny. Při jeho vynoření nad hladinu dochází k nasátí vzduchu do pipety,
což může zapříčinit i vniknutí kapaliny do úst. Po nasátí kapaliny nad rysku označující požadovaný
objem uzavřeme horní konec pipety ukazovákem – ne palcem. A opatrným uvolňováním prstu po
kapkách vypouštíme kapalinu. Při odečítání je nutno mít oko ve stejné úrovni se značkou.
Odečítáme vždy spodní okraj menisku.
1
2
3
4
5
6
7
Obrázek 6: Pomůcky k měření objemů. 1. kalibrovaný odměrný válec, 2. odměrné baňky, 3.
pipeta, 4. pipeta dělená, 5. byrety, 6. automatická pipeta, 7. automatická pipeta multikanálová.
Jedovaté kapaliny a koncentrované kyseliny a zásady nenasáváme nikdy do pipety ústy, ale
používáme speciální násadky či gumové balónky. Jelikož je pipeta kalibrována na vylití, nikdy se
nevyfukuje, ale její obsah se nechá pouze vytéct a její špička se otře o dno nebo o stěnu
nádobky, do které kapalinu odměřujeme.
V současné době se v biochemické či molekulárně biologické laboratoři se skleněnými
pipetami téměř nesetkáváme, plně je nahradily pipety automatické (obr. 2-6,7) umožňující
přesnější a pohodlnější odměření daného objemu. Jsou vhodné i pro pipetování mikrolitrových
objemů. Automatické pipety jsou vyráběny pro různé rozsahy objemů (5-1 mL, 1000-200 L, 20020 L, 20-2 L a 2-0,2 L). Objem se nastavuje otočením šroubu na stupnici. Nasávání a
vypouštění kapaliny přes nasaditelnou špičku je ovládáno pístem, který má tři polohy – klidovou,
pro nasávání a pro vypouštění (obr. 7).
klidová poloha
poloha pro nasávání
poloha pro vypouštění
Obrázek 7: Polohy automatické pipety při nasávání a vypouštění kapaliny.
19
Byrety, sloužící k regulovanému odběru kapalin při titracích (obr. 6-5), jsou skleněné
trubice opatřené dělícími značkami. Před výtokem je umístěn kohoutek nebo pružná tlačka s
hadičkou. Některé byrety mají pro lepší odečítání objemu zadní stěnu z bílého skla s modrým
pruhem ve středu.
Odměrné baňky (obr. 6-2), stejně jako pyknometry (nádobky pro stanovování hustoty), jsou
kalibrovány na dolití – to znamená, že při jejich naplnění obsahují právě požadovaný objem. Hrdlo
odměrných baněk je poměrně úzké, po celém obvodu opatřené ryskou. I zde je třeba plnit tak,
aby se spodní okraj menisku dotýkal rysky a při plnění mít oko v úrovní rysky. Podobně jako
odměrné válce i odměrné baňky se vyrábějí v objemech od 5 mL do 2 L. Odměrné baňky se
používají k přípravě roztoků o přesné koncentraci. Vlastní směšovaní složek roztoku provádíme při
ne zcela zaplněné baňce a teprve po úplné homogenizaci a vyrovnání teplot (teplota na kterou je
baňka kalibrována, je uváděna na plášti baňky - většinou 20C) opatrně doplňujeme rozpouštědlem
po rysku.
ÚKOL č. 2: Práce s automatickou pipetou
Seznamte se se sadou automatických pipet a vyzkoušejte si princip, na kterém fungují.
Připravte tři suché 25 mL kádinky. Kádinku předem zvažte na analytických vahách, a poté do ní
napipetujte pipetou z rozsahem 1-5 mL desetkrát po jednom mililitru destilované vody a opět
zvažte. Stejně postupujte s pipetou o rozsahu 1000-100 L. Pipetujte 10x po 200 L a 10x po
400 L. Do třetí zvážené kádinky, pak pipetujte 10x po 100L a 10x po 20L pipetou s rozsahem
200-20 L.
Uvědomte si, jakou hustotu má destilovaná voda, a vypočítejte, jaké hmotnosti by měly mít
kádinky s vodou. Pokud jste nedosáhli požadované hmotnosti, zopakujte pipetování znovu po
konzultaci s vedoucím cvičení.
PŘÍPRAVA PUFRŮ A MĚŘENÍ pH
Výběr vhodného pufru se řídí především požadovanou hodnotou pH, iontovou silou, možnými
interakcemi s ostatními komponentami reakční směsi apod. Má-li mít pufr dostatečnou pufrační
kapacitu, musíme vybrat takovou slabou kyselinu nebo zásadu, jejíž pKa se neodlišuje od
požadované hodnoty pH o více než 1. Pufrační kapacita závisí také na celkové koncentraci
(molaritě) pufru. Očekáváme-li například, že pH roztoku v průběhu reakce bude klesat (např. při
studiu lipasové reakce, kdy jsou do roztoku uvolňovány ionty H+ disociací vznikajících mastných
kyselin), pak volíme pufr o vyšší koncentraci a s pKa pod hodnotou pH, v níž začínáme pokus.
Složení vhodného pufru lze nalézt v laboratorních příručkách. Podle tabulek smícháme
příslušné (obvykle dva) roztoky pro dosažení nominální hodnoty pH. Vždy je nutné skutečnou
hodnotu pH měřením ověřit a případně ji upravit roztokem kyseliny nebo zásady. Jednodušší je
připravit pufr prostou úpravou pH roztoku zvolené soli, kyseliny nebo báze. Pro jeho požadovanou
hodnotu vybereme vhodnou slabou kyselinu nebo zásadu (ev. je v návodu pro práci s daným
materiálem určena) a vypočteme navážku tak, abychom získali potřebný objem pufru o zvolené
koncentraci. Navážené množství rozpustíme v menším objemu vody (asi 80 % konečného objemu).
Pak nastavíme požadované pH roztokem silné (v některých případech i slabé) kyseliny či zásady a
nakonec doplníme vodou na vypočtený objem. Pouze při užití pufrů o více složkách (pokrývajících
široké rozmezí pH) nelze takto postupovat a musíme je namíchat podle tabulky, zkontrolovat a
eventuálně upravit pH.
Většina pufrů podléhá mikrobiální kontaminaci (nejen organické kyseliny, ale i např. fosfát
zplesniví při 0-4 oC během týdne). Pro některé účely je lze konzervovat (azid, toluen, thymol),
20
většinou jsou ale uchovávány v chladničce bez konzervace. Takto skladujeme jen menší množství
připraveného pufru, které brzy spotřebujeme (maximálně do týdne). Připravíme-li si větší
množství pufru do zásoby, uchováváme ho zmrazený v plastové láhvi. Před použitím je nutno
rozmrazit celé množství pufru a roztok zamíchat. Po odebrání potřebného objemu je možné
zbytek opět zmrazit. Popřípadě můžeme pufry autoklávovat. Při manipulaci s takto ošetřenými
roztoky musíme dodržovat sterilní podmínky a pufr zpětně nekontaminovat, např. nesterilní
špičkou automatické pipety.
Hodnotu pH roztoku ovlivňuje jeho ředění, zejména v extrémních hodnotách stupnice (pod
3 a nad 11), v rozmezí fyziologických hodnot již méně. Proto se raději vyhneme přípravě
koncentrovanějších zásobních roztoků, z nichž bychom pak ředěním připravovali pracovní roztok.
Také teplota ovlivňuje pH pufru změnou pKa slabé kyseliny nebo báze. Tabelované hodnoty pH
jsou obvykle vztaženy na 18, 20 nebo 25 oC. V biochemii často pracujeme za chladu, kdy se pH
může lišit od hodnoty nastavené při přípravě pufru za teploty místnosti. Např. měření pH
závislosti enzymové reakce by mohlo být více či méně zkresleno, pokud se podstatně liší teplota
experimentu od teploty, při které byl pufr připraven. V případě nutnosti lze upravit hodnotu pH
za příslušné teploty.
Běžné pufry užívané v biochemických laboratorních postupech pokrývají neutrální až mírně
alkalickou oblast o pH 6,0 – 9,0. Některé operace se provádějí v prostředích více kyselých či
bazických. Nejběžnější kyseliny a báze, užívané k přípravě pufrů v biochemii, jsou v přehledu
uvedeny v tabulce 1. Vedle požadované hodnoty pH se výběr složek řídí také jejich možnými
specifickými vlivy na reakční směs. Někdy může dojít k vysrážení některých komponent směsi
pufrem (K+-chloristanem, soli železa a Ca2+-fosfátem, komplexy borátů se sacharidy apod.), k
interakci složek pufru s bílkovinami (Cl- iont s albuminem), k reakci s analytickými činidly a k
inhibici enzymů (v některých případech barbituráty). Naopak někdy mohou být složky pufru
využity jako substráty (citrát, acetát) aj. Pro biochemické účely se používají vedle běžných
anorganických a organických látek i speciální kyseliny a báze, vhodné pro jejich inertnost k dalším
složkám reakčních směsí (viz vysvětlivky pod tabulkou 1).
Koncentrace H+ iontů v roztoku se stanovuje spektrálními či elektrochemickými metodami.
První z nich využívají toho, že změna pH vyvolá v některých organických sloučeninách
(acidobazických indikátorech) změnu struktury lišící se spektrálními vlastnostmi (absorpce či
fluorescence). Ve druhém případě se využívá změny elektrochemického potenciálu vlivem pH.
Nejjednodušší spektrální metody měření pH jsou vizuální metody, kdy se sleduje změna
zbarvení indikátoru při změně pH. K této změně dochází u jednotlivých indikátorů v určité oblasti
pH (nalezneme v chemických laboratorních tabulkách). Pro stanovení hodnoty pH musíme vybrat
indikátor, u kterého dochází k barevné změně v přesně definovaném intervalu pH. Jsou vhodné
pro indikaci dosažení požadované hodnoty pH, pro indikaci bodu ekvivalence při acidobazických
titracích, kontrolu udržování pH apod. Používají se ve formě vodného či ethanolického roztoku
(0,04 - 0,10 %), který se přikápne ke sledovanému vzorku. Pro universální použití slouží směsi
indikátorů pokrývající svými barevnými přechody celou škálu pH nebo její část, která nás zajímá.
Užívají se ve formě papírků napuštěných příslušnou směsí indikátorů. Souprava je doplněna
barevnou stupnicí, s kterou porovnáváme zbarvení papírku po namočení do vzorku a ustálení
zbarvení.
Barevný přechod indikátoru můžeme přesněji sledovat pomocí spektrofotometrických
přístrojů. To umožňuje též kvantifikovat barevný přechod při změně pH (stanovení pKa). Tento
způsob však není běžně užíván, je omezen na speciální případy (např. měření pH uvnitř buněk a
organel nebo v nevodných rozpouštědlech). Při použití fluorescenčních indikátorů jsme zcela
odkázáni na měření pomocí přístrojů – fluorimetrů. Tento způsob nemá visuální alternativu.
21
Tabulka 1: Přehled nejčastěji užívaných pufrů v biochemii.
a
d
f
Kyselina
Báze
rozsah pH
KH2PO4
Na2HPO4
6,0 – 8,0
HCl
Trisa
6,8 – 8,6
HCl
Imidazol
6,0 – 8,0
MESb
NaOH
5,2 – 7,2
MOPSc
NaOH
5,2 – 7,1
TESd
NaOH
6,5 – 8,5
HEPESe
NaOH
6,5 – 8,5
HCl
5,5-diethylbarbituran-Na
6,8 – 9,6
Kys boritá
Tetraboritan-Na
7,0 – 9,3
Tricinf
NaOH
7,2 – 9,1
Hcl
Glycin
1,1 – 3,7
Glycin
NaOH
8,2 – 10,0
Kys. citronová
NaOH, KOH
2,2 – 6,2
NaHCO3
Na2CO3
9,0 – 11,0
Na2HPO4
NaOH
11,0 – 12,0
NaClO4
NaOH
1,8 – 12,0
HCl
NaOH
2,0 – 12,0
Kys. citronová
Na2HPO4
2,2 – 8,0
Tris(hydroxymetyl)aminometan, b kyselina 2-(N-morfolino)etansulfonová, c kyselina 3-(N-morfolino)propansulfonová
kyselina N-Tris(hydroxymetyl)metyl-2-aminoetansulfonová, e kyselina N-2-hydroxyetylpiperazin-N’ -2-etansulfonová
N-Tris(hydroxymetyl)metylglycin
Potenciometricky se pH určuje měřením potenciálu vhodné elektrody. Prakticky se užívá
pouze skleněná elektroda. Její tělo je tvořeno skleněnou trubičkou, responsivním elementem je
tenká skleněná membrána obvykle tvaru baničky na spodním konci. Je naplněna standardním
vnitřním roztokem (0,1 M HCl), v němž je ponořena argentchloridová elektroda (Ag drátek
pokrytý vrstvičkou AgCl). Pro speciální účely mohou mít elektrody různý tvar, např. ploché
k měření pH na povrchu gelu, jehlové, mikroelektrody pro měření v mikrozkumavkách aj.
Při práci s pH-metrem se řídíme návodem výrobce. Obecný postup a zásady práce, zejména
zacházení s elektrodou, lze shrnout do několika bodů:
1) S elektrodou manipulujeme opatrně. Skleněná banička je velmi tenká a křehká. Míchá-li se
měřený roztok, dbáme na to, aby byla mimo dosah pohybujícího se míchadla (ověříme
předem). To bývá aktuální při malých objemech vzorku.
2) Před každým vyjmutím elektrody z roztoku odpojíme její elektrický obvod příslušným
tlačítkem na pH-metru.
3) Elektroda, kterou používáme, nesmí vyschnout. Uchováváme ji ponořenu v pufru o pH, při
kterém nejčastěji měříme. Pokud se s ní denně nepracuje, kontrolujeme ji a doplňujeme
22
odpařenou vodu. Nemá-li se s ní pracovat delší dobu (např. přes prázdniny), je lépe ji omýt
destilovanou vodou a po uschnutí vysušit a bezpečně uložit.
4) Suchou elektrodu (novou nebo dlouhodobě uloženou) je nutno před užitím připravit dle návodu
výrobce. Obvykle se máčí několik hodin v 0,1 M HCl.
5) Referenční kalomelová elektroda může být samostatná nebo kombinovaná se skleněnou. Její
těleso tvaru skleněné trubičky je vyplněno vnitřním roztokem (KCl o různé koncentraci,
obvykle nasycený roztok) a vodivé spojení s vnějším měřeným roztokem zajišťuje (nejde-li o
otevřenou elektrodu) průlinčitá přepážka (frita). Ta je u samostatné elektrody na spodním
konci. U kombinované elektrody tvoří referenční elektroda plášť kolem skleněné a frita je
umístěna na boku tohoto pláště nad baničkou skleněné elektrody. V horní části tělesa
kalomelové elektrody je uzavřený otvůrek, jímž v případě potřeby doplňujeme vnitřní roztok
tak, aby bylo zajištěno vodivé spojení s vývodem na konektor. V případě, že máme nasycenou
kalomelovou elektrodu, se tímto otvůrkem doplňuje pevný KCl tak, aby na dně kalomelové
elektrody vždy bylo možno zahlédnout několik krystalů.
6) Před měřením je nutno přístroj s elektrodou kalibrovat. Elektrodu vyjmeme z roztoku,
v kterém je uchovávána (nezapomeneme rozpojit obvod), opláchneme destilovanou vodou,
odsajeme přebytek vody (filtračním papírem nebo buničitou vatou) a ponoříme do
standardního pufru o pH nejbližším tomu, který bude mít měřený roztok (obvykle bývá
k disposici sada standardních pufrů o pH 4, 7 a 9). Současně ponoříme i referentní elektrodu.
Používáme-li kombinovanou elektrodu, zkontrolujeme, zda je boční vývod referentní
elektrody zcela ponořen pod hladinu. Nastavíme teplotní korekci na teplotu pufru
a kalibračním knoflíkem nastavíme na stupnici nebo digitálním výstupu hodnotu pH
standardního pufru. Elektrodu pak vyjmeme a po opláchnutí ji ponoříme do měřeného vzorku.
Jeho pH nám ukáže výchylka či digitální výstup pH-metru. Kalibraci je nutno provádět vždy
po zapnutí přístroje nebo měníme-li pH měřených vzorků o více než 1. Též při dlouhodobých
měřeních ji občas zkontrolujeme.
7) Některé přístroje umožňují nebo dokonce vyžadují kalibraci na dva pufry, v tomto případě
můžeme pracovat v širším rozmezí pH, aniž bychom vždy znovu museli přístroj kalibrovat.
Zvolíme si vhodné pufry ohraničující oblast, v které hodláme pracovat. Na jeden z nich
nastavíme výchozí hodnotu. Po ponoření elektrod do druhého pufru nastavíme jeho hodnotu
jiným knoflíkem, kterým nastavujeme směrnici závislosti potenciálu na pH. Ta by měla být 59 mV.pH-1, její podstatný pokles indikuje malou citlivost elektrody a je třeba zvážit její
výměnu, event. úpravu.
ÚKOL č. 3: Připravte 1/4 litru 0,1M Tris/acetátového pufru o pH 7,6 a 1/4 litru 0,02M Kfosfátového pufru, pH 7,0
POSTUP
1/ Vypočtěte hmotnost Tris báze - tris(hydroxymetyl)aminomethan (Mr = 121,14), potřebné na
přípravu 250 mL pufru o koncentraci 0,1 mol.L-1.
2/ Odvažte toto množství na předvážkách na jedno desetinné místo do 500 mL kádinky.
3/ Do kádinky přilijte asi 400 mL destilované vody, vložte elektromagnetické míchadlo a na
elektromagnetické míchačce míchejte až do úplné homogenizace roztoku.
4/ Podle návodu nakalibrujte pH metr a poté upravte pH roztoku na hodnotu 7,6 pomocí
koncentrované kyseliny octové. Přídavky kyseliny provádějte pomocí Pasteurovy pipety za stálého
míchání roztoku.
23
5/ Až se hodnota pH stabilizuje (asi jednu minutu je konstantní) vyjměte elektrodu, řádně ji
opláchněte a vraťte ji do ochranného obalu s roztokem.
6/ Pufr z kádinky přelijte kvantitativně pomocí nálevky do 500 mL odměrné baňky a opatrně
doplňte objem po rysku střičkou s destilovanou vodou.
7/ Hotový pufr přelijte do zásobní láhve.
Stejně postupujte při přípravě 250 mL 0,02 M K-fosfátového pufru, navážky kyselého (KH2PO4,
Mr = 136,09) a bazického (K2HPO4, Mr = 174,18) fosforečnanu si vypočítejte podle následující
tabulky:
Tabulka 2: Příprava K-fosfátového pufru. Na 0,2 M pufr je třeba smíchat: x mL 0,2 M
bazického roztoku fosforečnanu a y mL 0,2 M kyselého roztoku fosforečnanu.
pH
x 0.2 M K2HPO4 (mL)
y 0.2 M KH2PO4 (mL)
6,0
12,3
87,7
6,5
31,5
68,5
7,0
61,0
39,0
7,5
84,0
16,0
8,0
94,7
5,3
Hodnotu pH pufru zkontrolujte na pH metru a případnou odchylku od pH 7,0 upravte kyselinou
fosforečnou nebo hydroxidem draselným.
PŘÍPRAVA ROZTOKŮ
Základním pravidlem pro jakoukoli přípravu roztoků, vzorků pro analýzu nebo pro účely
preparace nebo čištění sloučenin je, že se rozpouštěná látka přidává do vody a nikdy naopak. Při
přípravě odměrných roztoků přenášíme kvantitativně navážku nebo odměřené množství kapaliny
do vody, která zaujímá asi 1/3 – 1/2 objemu baňky. Kvantitativní přenesení znamená, že navážku
krystalické látky sklepneme do malé nálevky zasunuté do hrdla odměrné baňky, spláchneme
větším množstvím destilované vody ze střičky, vodou ze střičky dále do nálevky vydatně
opláchneme navažovací lodičku a nakonec nálevku vypláchneme vodou ze střičky po celém vnitřním
povrchu. Rozpouštění můžeme urychlovat pouze mícháním krouživým pohybem celé odměrné
baňky, nikdy ne tyčinkou nebo míchadlem. Teprve po úplném rozpuštění navážky a vyrovnání
teploty baňky s okolím můžeme baňku doplnit po rysku destilovanou vodou (poslední kapky
přidáváme pipetou). Pokud je látka, jejíž roztok připravujeme, kapalná, funkci navažovací lodičky
může převzít malý odměrný válec, který se pak rovněž do odměrné baňky vyplachuje. Pokud
kapalnou složku do vody v odměrné baňce pipetujeme, jsme problémů s kvantitativním přenesením
vzorku ušetřeni. Po doplnění odměrné baňky po rysku nezapomeneme obsah důkladně promíchat.
Naplněnou baňku uzavřeme čistou, suchou, v současné době nejčastěji polyethylenovou zátkou a
několikrát obrátíme dnem vzhůru a zpět. Zátku přitom stále v hrdle baňky přidržujeme palcem.
ÚKOL č. 4: Příprava koncentrační řady roztoku kyseliny askorbové pro kinetická měření
Při biochemických experimentech se často setkáte s potřebou připravit sestupnou
koncentrační řadu roztoků o přesných koncentracích, jako třeba při měření kinetických
parametrů různých enzymových systémů, kdy se měří enzymatická aktivita při různé koncentraci
substrátu v reakční směsi. Jako příklad lze uvést měření Michaelisovy konstanty KM, což je
konstanta udávající koncentraci substrátu za daných podmínek, při které enzymová reakce
probíhá polovinou maximální rychlosti. Pro toto stanovení je nutno změřit aktivitu enzymu při
24
různých (minimálně pěti) koncentracích substrátu, které jsou v rozmezí maximálně jednoho
řádu. Pro vyhodnocení lze použít několik různých způsobů, jedno z nejznámějších je vyhodnocení
podle Lineweavera a Burka, které vychází z linearizovaného dvojitého reciprokého vynesení
závislosti koncentrace substrátu na reakční rychlosti (aktivitě) enzymu. Převrácená hodnota
průsečíku přímky se zápornou osou x pak udává hodnotu Michaelisovy konstanty.
Pro lepší a přesnější vyhodnocování je proto vhodné sestavit koncentrační řadu tak, aby
převrácené hodnoty výsledné koncentrace substrátu v reakční směsi byly celá čísla s lineárními
rozestupy např. 1,2,3,4… Vzhledem k tomu je pak nutno přizpůsobit a připravit zásobní roztoky
jednotlivých koncentrací substrátu. Nižší koncentrace se většinou připraví ředěním roztoku o
nejvyšší koncentraci.
Zamyslete se nad přípravou koncentrační řady roztoku kyseliny askorbové (Mr = 176,1) tak,
aby konečné hodnoty koncentrací resp. jejich převracené hodnoty byly v intervalu od 1-5. Jako
výchozí roztok si připravte 20 mM roztok a počítejte s tím, že budete dávat 50 L zásobního
roztoku kyseliny askorbové do reakční směsi o celkovém objemu 1 mL. Doplňte následující
tabulku:
číslo
roztoku
destilovaná
voda
(mL)
k.askorbová k. askorbová –
20 mmol.L-1 zásobní roztok
(mL)
(mmol.L-1)
1
2
3
4
5
k.askorbová
konečná konc.
v reakční směsi
S (mmol.L-1)
převrácená hodnota
konečné konc. k.
askorbové
1/S
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Jinou a pravděpodobně přesnější metodou sestavení této kalibrační řady je postupné
rozřeďování roztoku o vyšší koncentraci na roztok o koncentraci nižší. Použijete sadu 5
odměrných baněk. Do první připravte roztok o nejvyšší koncentraci, jeho vypočtený podíl pak
pipetou přeneste do druhé odměrné baňky a doplňte po rysku. Stejně postupujte k nejnižší
koncentraci. Tuto metodu proveďte prakticky a připravte výše uvedenou koncentrační řadu
kyseliny askorbové použitelnou pro kinetické měření a vyhodnocení podle Lineweavera a Burka.
Doporučená literatura:
Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.
Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
25
Laboratorní cvičení č. 3
ÚPRAVA
BIOLOGICKÉHO
MATERIÁLU,
CENTRIFUGACE, ULTRAFILTRACE.
PRECIPITAČNÍ
TECHNIKY,
DIALÝZA,
ÚPRAVA BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU
K biochemickým studiím se používá nejrůznější biologický materiál, který příroda
poskytuje. Vzhledem k jeho různorodosti je technika zpracování mnohdy velmi odlišná a řídí se
účelem, k jakým studiím má být použit. Způsob zpracování materiálů bývá často odlišný podle
toho, zda má být výchozí surovinou pro izolaci, detekci nějaké sloučeniny či skupiny látek nebo
zda chceme studovat jejich metabolismus.
Má-li být izolována nějaká látka nebo skupina látek z biologického materiálu (např. vitamín,
bílkovina, sacharid apod.) je důležité zvolit vhodnou výchozí surovinu. Pro izolaci se hodí nejlépe
takový biologický materiál, v kterém je požadovaná látka v nejvyšší koncentraci, je dostupný a
jeho cena přijatelná. Vybraný živočišný, rostlinný nebo mikrobiální materiál je třeba v prvním
kroku zhomogenizovat. Rozrušení rostlinných a živočišných buněk nedělá obvykle potíže. Jinak
však je tomu při izolacích z buněk mikroorganismů. Buněčná stěna mikroorganismů je velmi
rezistentní a její narušení vyžaduje zvláštní postupy, viz níže.
1) Mletí
Suchý materiál může být rozemlet v různých typech mlýnků. Semena se melou v kulových
mlýnech nebo mlýnech s otočnými noži. K mletí živočišných materiálů se velmi dobře hodí masový
strojek. Tkáň se v něm řeže a drtí. Hrubost nebo jemnost lze regulovat vložením vhodné
destičky, kterou se rozemletý materiál protlačuje. Všechny uvedené strojky a mlýnky většinou
může nahradit běžný univerzální kuchyňský robot, který je vybaven mixerem, mlýnkem, masovým
strojkem i struhadly.
2) Homogenizace
Na rozdíl od mletí nasucho je v biochemické práci chápána homogenizace jako důkladné
rozmělnění materiálu za přídavku vody nebo vhodných pufru či fyziologických roztoků.
Pro homogenizaci malých množství je nejvhodnější roztírání materiálu ve třecí misce za
přídavku mořského písku, skelného prachu nebo jiného abraziva. Tužší materiály se před
homogenizací zmrazí kapalným dusíkem, který je učiní křehčími k rozmělnění. Homogenizaci lze
rovněž provést ve výkonném mixeru.
K narušení buněčné stěny a membrány mikroorganismů, tzv. desintegraci, se používá ještě
některých speciálních metod. Např. působení chemických činidel (detergenty), působení enzymů
štěpích polysacharidy buněčných stěn (lysozym, celulasa), krátké působení ultrazvuku, opakované
zmrazování a rozmrazování. Přehled nejužívanějších homogenizačních technik je uveden v tabulce
3.
PRECIPITAČNÍ METODY
V počátečních fázích izolací biopolymerů jsou většinou používány méně pracné metody
fázové separace, jako jsou precipitace (frakcionace), dialýza či vsádková adsorpce. Tyto metody
nemají zpravidla velké rozlišení, umožňují však snadné a rychlé zakoncentrování preparátu po
základní extrakci biologického materiálu. Srážení se provádí pomocí neutrálních solí, změnou pH,
organickými rozpouštědly či teplotou.
26
Tabulka 3: Přehled nejpoužívanějších homogenizačních technik.
METODA
PŘÍKLAD POUŽITÍ
PRINCIP
Šetrné
lyse buněk
erythrocyty
porušení buněčné membrány osmotickým
tlakem
působení enzymů
bakterie
štěpení buněčné stěny specifickými
enzymy
působení chemikálií
extrakce kvasinek toluenem
částečná solubilizace buněčné stěny
homogenizace
jaterní tkáň
mechanické porušení buněk protlačováním
úzkou štěrbinou
mletí
svalová tkáň, semena
působení střižných sil, mechanické
porušení tkáně
Střední
mixování v nožových
mixeréch
živočišná a rostlinná pletiva
působení střižných sil
mletí s abrazivy
rostlinné tkáně, bakterie
mechanické porušení buněk
Intenzivní
ultrazvuk
buněčné suspenze
náhle změny tlaku a teploty při zániku
vznikajících mikrobublin
kuličkový mlýn
buněčné suspenze
mechanické porušení buněk rychlou vibrací
skleněných kuliček
Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích závisí na jejich solvatačním obalu, tj. vrstvě
molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Přičinou solvatačních obalu jsou
elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se
s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a
posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem
ionizovaných skupin biopolymerů – dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymerů mezi
sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se snižuje tloušťka
solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se snižuje i rozpustnost proteinu.
Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i
typem soli a hodnotou pH. Nejnižší je rozpustnost v izoelektrickém bodě, tj. hodnota pH, při
které má molekula biopolymeru neutrální náboj.
Při frakcionaci organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se
využívá rozdílná rozpustnost proteinů v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace
organického rozpouštědla se zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinů, což nakonec vede
k jejich vysrážení. Frakcionace organickými rozpouštědly se může kombinovat se změnami
koncentrace solí, pH a teploty.
1) Tepelná denaturace
Tato metoda se používá zejména při izolaci některých termostabilních enzymů
v počátečních fázích purifikačního procesu. Často se do roztoku přidává substrát, koenzym nebo
inhibitor příslušného enzymu, neboť přítomnost těchto látek vede ke tvorbě komplexů enzym –
ligand, které se zpravidla vyznačují zvýšenou odolností vůči denaturačním vlivům. Roztok je
27
zahřát po jistou dobu na určitou teplotu, pak je rychle ochlazen v ledové lázni a koagulované
balastní biopolymery, zejména termolabilní proteiny, se odstraní centrifugací nebo filtrací. Jako
příklad můžeme uvést přípravu kvasničné alkoholdehydrogenasy, kdy se extrakt v prostředí
pyrofosfátového pufru zahřeje po dobu 15 minut na teplotu 55C na vodní lázní a balastní
proteiny se odstraní centrifugací.
2) Vysolování neutrálními solemi
Precipitovatelnost určitého proteinu z vodného roztoku je závislá na druhu použité soli,
iontové síle, hodnotě pH, teplotě a koncentraci proteinů. Při vysolovacím efektu se uplatňuje
daleko více povaha aniontu než kationtu. Dvojmocné a vícemocné anionty precipitují proteiny
většinou mnohem účinněji než anionty jednomocné. Nejčastěji používanou solí pro vysolování
biopolymerů je síran amonný. Jeho výhodou je značná rozpustnost (např. ve srovnání s Na2SO4),
která je jen nepatrně závislá na teplotě, a malý denaturační vliv. Doporučuje se používat
dostatečně čistý síran amonný bez obsahu kovových iontů, které by mohly interagovat s proteiny
a katalyzovat některé oxidační reakce. Jiné soli se používají jen ve speciálních případech, např.
síran hořečnatý k izolaci -globulinové frakce ze séra nebo chlorid sodný k precipitaci
fibrinogenu. Díky své velké kapacitě a tlumivé schopnosti by byly fosforečnany ideálními
srážedly, ale pro svou špatnou rozpustnost se v praxi používají jen velmi omezeně. Často
používanou solí pro precipitaci některých enzymů je i chlorid manganatý.
Tabulka 4: Tabulka uvádí množství pevného síranu amonného, které je třeba přidat k
jednomu litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech saturace roztoku síranem
amonným.
0
10
15
20
25
30
33
35
40
Výsledná koncentrace síranu amonného (% saturace)
33
35
40
45
50
55
60
65
70
10
15
20
25
30
56
84
28
114
57
144
86
176
118
28
57
88
107
120
153
185 220 256 294 333 373
29
59
30
78
49
91
61
123
93
155
125
19
30
12
62
43
31
196 209 243 277
137 150 183 216
45
95
100
313 351 390 430 472 516 561 610 662 713
251 288 326 365 406 449 494 540 592 640
75
80
85
90
767
694
415 459 506 556 605
657
189 225 262 300 340 382 424 471 520 569
158 193 230 267 307 348 390 436 485 533
619
583
94
74
127
107
162
142
198 235 273 314 356 401 449 496
177 214 252 292 333 378 426 472
546
522
63
31
94
63
129
97
164 200 238 278 319 364 411 457
132 168 205 245 285 328 375 420
506
469
32
65
99
134
171
210 250 293 339 383
431
33
66
33
101
67
137
103
176
141
214 256 302 345
179 220 264 307
392
353
34
69
34
105
70
143
107
314
275
35
72
36
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
183 227 269
147 190 232
111
74
153
115
194
155
237
198
38
77
117
157
39
77
38
118
77
39
Výchozí koncentrace síranu amonného (% saturace)
Vlastní precipitace se provádí tak, že se do roztoku biopolymerů sůl zpravidla přidává po
malých dávkách v pevném stavu nebo jako nasycený vodný roztok za stalého míchání, aby nedošlo
k lokálnímu přesycení. Vysolování probíhá při konstantní teplotě, chlazení není vždy nezbytné.
Optimální koncentrační rozsah pro frakcionaci daného proteinu je nutno najít empiricky.
Množství síranu amonného, potřebného k dosažení určitého stupně nasycení, lze snadno zjistit
z tabulky 4. Po přidání takového množství síranu amonného, které odpovídá 30% množství
potřebného ke vzniku nasyceného roztoku této soli (v praxi označováno jako 30% nasycení), se
28
srážejí nukleové kyseliny a poměrně málo proteinů. Mezi 30 – 75% nasycení pak precipituje
většina proteinů. V tomto rozmezí je třeba nasycení zvyšovat po poměrně malých dávkách. Po
přidání příslušného množství soli se roztok biopolymeru míchá ještě asi 20 minut a precipitát se
oddělí centrifugací. Pokud je daný biopolymer obsažen v precipitátu, lze po rozpuštění sraženiny
získat jeho koncentrovaný roztok. Síran amonný se z roztoku oddělí většinou dialýzou, gelovou
chromatografií nebo ultrafiltrací.
3) Srážení biopolymerů ostatními látkami
Poměrně starou metodou je precipitace biopolymerů organickými rozpouštědly. Tyto látky
snižují dialektrickou konstantu prostředí, tím přispívají ke snížení rozpustnosti a k vysrážení
biopolymeru (zvyšují se elektrostatické interakce mezi nabitými skupinami biopolymeru a
molekuly se pak snáze shlukují do precipitujících agregátů). Při izolaci nukleových kyselin se
používá srážení koncentrovaným ethanolem (pro kvantitavní odstranění nukleových kyselin
z roztoku se často používají ribonukleasy a deoxyribonukleasy). Při separaci proteinů se
organická rozpouštědla využívají málo, je zde nebezpečí denaturace, které se snižuje udržováním
roztoku při teplotě 0C. Ethanolová precipitace má výhodu v tom, že odpadá potřeba dialýzy.
Kromě ethanolu se především pro frakcionaci plazmových (sérových) proteinů používá methanol,
aceton a ether. Při separaci citlivějších proteinů jsou organická rozpouštědla nahrazována
některými kyselinami, jako je kyselina kaprylová, rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) a
nebo organickými polymery, např. polyethylenglykolem. Ke zvýšení specifičnosti srážení je možné
do roztoku přidat nějaké specifické ligandy bílkovin, např. kofaktory nebo zinečnaté ionty.
V poslední době se také začal pro některé kyselé proteiny používat bazický protamin sulfát,
nízkomolekulární protein izolovaný z rybího spermatu. Princip kyselé či bazické frakcionace
spočívá v pomalém okyselení či zalkalizování roztoku biopolymerů na určitou hodnotu pH pomocí
silné kyseliny či zásady, na které se ponechá po určitou dobu (1 hod) a po odstranění vysrážených
balastů vrátí na původní hodnotu.
Pokud nám jde o kvantitativní oddělení biopolymerů z roztoku, tzn. deproteinizaci,
použijeme drastičtějších metod srážení. Lze využít např. srážecí schopnost iontů těžkých kovů
(Hg2+, Pb2+, Cd2+) nebo složitějších aniontů, které tvoří s proteiny těžko rozpustné komplexy
(kyseliny trichloroctová, pikrová, chloristá, fosfowolframová atd.). Tyto metody používáme tehdy
když se nezajímáme o biopolymery, ale naopak o nízkomolekulární složky biologického materiálu.
CENTRIFUGACE
Centrifugace čili odstřeďování patří k nejběžnějším operacím v biochemické laboratoři.
Dovoluje oddělit složky suspenze nebo emulze na základě rozdílných hustot. Bývá často rychlejší
a pohodlnější než filtrace a v některých případech vede i k lepšímu oddělení pevné a kapalné fáze.
Kromě nahrazení nebo doplnění filtrace, zvláště je-li suspendovaná látka velmi jemná, špatně
filtrovatelná a filtrace zdlouhavá, má odstřeďování v biochemii i jiný význam. Slouží k některým
speciálním preparativním a analytickým účelům (např. izolace mitochondrií diferenční
centrifugací). Dále je to příprava buněčných struktur gradientovou centrifugací a z analytických
aplikací pak především stanovení relativních molekulových hmotností sloučenin a stanovení čistoty
izolovaných preparátů.
Při odstřeďování působí na sedimentující částice odstředivá síla (P), kterou lze vyjádřit
vztahem:
P = m.r.2
kde m je hmotnost částice, r je poloměr otáčení a  je úhlová rychlost. Pro praktické výpočty se
však zavádí veličina relativní odstředivé zrychlení R, které udává, kolikrát je toto zrychlení větší
než zemské gravitační zrychlení g a je dána vztahem:
R = 1,118.r.N2.10-5
29
kde N je počet otáček za minutu a r je poloměr otáčení v cm. Je nutno ji uvádět jako hlavní
charakteristiku centrifugace. Ze vzorce je zřejmé, že pouhý údaj počtu otáček za minutu
necharakterizuje proces centrifugace.
Aby se nemuselo v každém případě vypočítávat relativní odstředivé zrychlení, výrobci
často dodávají k odstředivkám diagramy, z nichž se hodnota R snadno odvodí. Běžně se relativní
odstředivé zrychlení odečítá také z univerzálního nomogramu, viz obrázek 8.
Existuje celá řada typu centrifug, které se liší velikostí (od malých stolních až po
velkoobjemové průmyslové odstředivky), dosahovaným zrychlením a tvarem rotorů (výkyvné a
úhlové). Ve výkyvných rotorech jsou kyvety uloženy v pouzdrech, která jsou volně zavěšena
v čepech vlastního rotoru a kyvety jsou během odstřeďování ve vodorovné poloze. Naproti tomu
v úhlových rotorech jsou kyvety fixovány v určitém úhlu (45 - 50) k ose otáčení.
Zvláštní kategorii tvoří ultracentrifugy, na nichž lze dosáhnout relativního odstředivého
zrychlení 100.000 x g a více. Liší se od běžných centrifug zejména tím, že prostor s rotorem musí
být při odstřeďování evakuován. Používají se pro dělení biopolymerů a subcelulárních částic
v hustotním gradientu sacharosy nebo cesných solí. Tyto techniky lze provádět jak v analytickém,
tak i v preparativním měřítku. Analytické centrifugy jsou navíc opatřeny optickým zařízením
umožňujícím sledovat rozhraní tvořená jednotlivými sedimentujicími látkami.
Obrázek 8: Nomogram na výpočet relativní odstředívé síly R.
RPM počet otáček za
minutu (revolutions per
minute)
xg relativní odstředivé
zrychlení (R)
poloměr rotoru – vzdálenost
osy rotoru od středu dna
kyvety (v mm)
RPM
xg
poloměr rotoru
Pro většinu prací preparačních i analytických jsou požadovány centrifugy chlazené. Chlazení
centrifug je zajišťováno chladicími agregáty, zabudovanými do jediného provozního celku
s centrifugou a je ovládáno termostatem. Protilehlé kyvety (u vysokootáčkových centrifug lépe
všechny kyvety) musejí být staticky a dynamicky vyváženy. Z bezpečnostních důvodu i z hlediska
ochrany centrifugy je nutno klást na vyvažování kyvet zvýšenou pozornost. Každá nepřesnost
v dynamickém i statickém vyvážení se mnohonásobně projeví zvětšením odstředivého tlaku na
30
jednu stranu osy. Osa se nerovnovážným zatížením snadno ohne nebo se poškodí ložisko. Při
chodu odstředivky se při nepřesném vyvážení projevují silné vibrace. Statického vyvážení se
dosáhne tak, že se na technických váhách s přesnosti na jeden gram vyváží protilehlá pouzdra
s kyvetami naplněnými suspenzí určenou k centrifugaci. Daleko větší pozornost je třeba klást
dynamickému vyvážení protilehlých kyvet. Protilehlé kyvety musí mít stejnou velikost, hmotnost a
stejně umístěné těžiště. To znamená, že protilehlé kyvety musí být naplněny stejnou suspenzí,
přesněji řečeno suspenzi o stejné hustotě. Nelze tedy například při precipitaci síranem amonným
kyvetu s tímto roztokem vyvážit kyvetou s destilovanou vodou.
DIALÝZA
Tato separační technika využívá difúze nízkomolekulárních látek membránou nepropustnou
pro velké molekuly a částice z roztoku o vyšší koncentraci do roztoku o koncentraci nižší.
V okamžiku, kdy se koncentrace látek procházejících membránou na obou stranách membrány
vyrovnají, proces se zastaví. Molekuly proteinů neprocházejí pro svou velikost otvory dialyzačních
membrán. Dialýza umožňuje v biochemii např. snadné oddělení solí od roztoků proteinů (při
vysolování proteinů síranem amonným), uplatňuje se i při krystalizaci proteinů. Nejčastěji se
využívá tam, kde chceme vysokomolekulární látky zbavit nízkomolekulárních nečistot.
Dříve se používaly pro dialýzu membrány typu: kolodium, celofán, pergamen anebo i
membrány zvířecího původu (střeva, vaječná blanka, různé měchýře). Nyní jsou komerčně
dostupné umělé membrány s vhodnou velikosti pórů ve tvaru dlouhé trubice různého průměru,
běžným laboratorním slangem nazývané dialyzační střeva. Potřebný díl dialyzační trubice se
odstřihne a na jednom konci pevně zaváže nebo uzavře speciální svorkou. Před naplněním novou
trubici vždy pořádně propláchneme a necháme chvíli namočenou v destilované vodě, je třeba
vymýt glycerol, kterým jsou trubice impregnovány. Po naplnění preparátem určeným k dialýze se
uzavře i druhý konec trubice a vloží se do nádoby s vodou nebo pufrem o nízké iontové síle.
Snažíme se, aby dialýza byla co nejrychlejší. Rychlost dialýzy závisí na koncentračním spádu.
(zpočátku je rychlejší, postupně se zpomaluje), který je především ovlivněn poměrem objemů vně
a uvnitř membrány. Dále rychlost tohoto procesu závisí na teplotě, na počtu a velikostí pórů
v membráně, na síle membrány, na elektrických interakcích mezi membránou a difundujícími
částicemi a na velikosti plochy membrány. Míchání a obvykle i výměna kapaliny velmi zrychlují
postup dialýzy. Protože dialýza trvá zpravidla desítky hodin, provádí se obvykle přes noc při
teplotě 0 - 4C, aby se zabránilo denaturaci proteinů a množení mikroorganismů.
ULTRAFILTRACE
Podobně jako dialýza, používá se ultrafiltrace pro separaci či zakoncentrování
rozpuštěných látek s molekulovou hmotností vyšší než 10-4. Ultrafiltrace je proces, při kterém
rozpouštědlo a rozpuštěné látky až do určité kritické velikosti procházejí membránou na základě
tlakového gradientu (obr. 9), určujícím faktorem je pórovitost membrány. Při ultrafiltraci
můžeme využívat buď pozitivní nebo negativní tlak. Pozitivního tlaku dosahujeme inertním plynem,
převážně dusíkem a udržujeme ho nad filtrovaným roztokem (retentát). Roztoky se filtrují pod
tlakem 0,05 až 0,5 MPa anebo působením odstředivé síly v centrifuze. Naopak negativní tlak
udržujeme pomocí vakua, které působí v prostoru již přefiltrovaného roztoku (difuzát).
Rozpouštědlo a rozpuštěné látky s menšími relativními molekulovými hmotnostmi než jsou póry v
membráně procházejí do ultrafiltrátu. Látky s vyššími molekulovými hmotnostmi se pak nad
membránou postupně zahušťují. Zakoncentrovaný retentát můžeme zředit čistým rozpouštědlem
a pokračovat v ultrafiltraci. Tím se postupně snižuje podíl nízkomolekulárních látek v retentátu.
Při tomto způsobu dialýzy, nazývaném diafiltrace, se požadovaného výsledku dosáhne za 1/10 až
1/100 času potřebného pro konvenční dialýzu.
31
Hlavním požadavkem na membránový filtr je, aby s dostatečnou rychlosti propouštěl
rozpouštědlo (vodu) a nízkomolekulární látky a aby jeho póry měly standardní rozměr. Tyto
vlastnosti nemají klasické celofánové či celulosové membrány používané pro klasickou filtraci či
dialýzu, jejichž stěna má šířku 0,1 – 1,0 mm. Proto se membránové filtry zhotovují z anizotropních
polymerů se šířkou stěny 0,1 – 1,5 m. S takovými filtry by se však těžko manipulovalo, a proto se
připevňují na podpůrný materiál, který má obvykle podobné chemické složení a jeho póry jsou
podstatně větší než póry ultrafiltru. Průměr pórů membránových filtrů se pohybuje v rozmezí od
0,1 do 50 nm.
Obrázek 9: Zařízení pro ultrafiltraci.
1/
2/
3/
4/
5/
6/
7/
8/
9/
10/
11/
elektromagnetické míchadlo
zásobník na dusík
ocelová láhev s dusíkem
regulátor tlaku
elektromagnetické míchadlo
tlakový zabezpečovací ventil
přívodová hadice dusíku
ultrafiltrační cela
svírací stojan
odtok difuzátu
kontrola rychlosti míchání
V biochemických laboratořích se nejčastěji setkáváme s ultrafiltračními celami a filtry
firmy Amicon (obr. 10). Tato firma dodává filtry s póry o průměru 0,2 - 20 nm, které umožňují
dělit látky s relativními molekulovými hmotnostmi od 500 do 300.000 Da. Podle typů jsou odolné
vůči vodě a různým organickým rozpouštědlům, dá se s nimi pracovat až do teploty 200C a lze je
vystavit působení zředěných kyselin, hydroxidů a oxidačních látek. Při správném zacházení se
mohou ultrafiltry používat mnohonásobněkrát za sebou. Pro účinnou ultrafiltraci musíme zajistit,
aby se zadržované molekuly nehromadily na povrchu filtru a nezacpávaly jeho póry, toho
dosáhneme kontinuálním mícháním nebo probubláváním.
Obrázek 10: Ultrafiltrační cela Amicon 8200.
1/
víko
2/
nádoba na retentát
3/
nosič membrány s odvodnými kanálky
4/
spodní šroub
5/
stojan na celu
6/
magnetické míchadlo
7-8/ těsnění
9-10/ přívod dusíku
11/ odvod difuzátu
32
ÚKOL č. 5: Homogenizace semen ječmene, precipitace jejich proteinů síranem amonným
s následnou dialýzou a ultrafiltrací na zařízení Amicon
Nabobtnaná semena obilnin jsou vhodným zdrojem pro studium enzymů aktivních v raných
fázích vývoje rostlin, zejména pro vysoké aktivity a snadnou finanční dostupnost. V naší
laboratoři se ze semen ječmene a pšenice izoluje cytokinin dehydrogenasa (EC 1.5.99.12), enzym
odbourávající rostlinné hormony cytokininy s nenasyceným postranním řetězcem, např.
isopentenyladenin či zeatin. Naklíčený ječmen (slad) je také výborným zdrojem amylas, enzymů
významných v technologické praxi, především v lihovarnictví a pivovarnictví. Ve sladu jsou
zastoupeny dva enzymy, které štěpí (1-4) glykosidovou vazbu polysacharidů: -amylasa (1,4--Dglukan-glukanonhydrolasa, EC 3.2.1.1) a -amylasa (1,4--D-glukan-maltohydrolasa, EC 3.2.1.2).
Jak napovídají systematické názvy, první enzym štěpí molekulu škrobu ve vnitřní části řetězce za
vzniku dextrinu (glukanů), kdežto druhý odštěpuje disacharid maltosu z neredukujícího konce
řetězce.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
50 g nabobtnalých ječmenných obilek, 0,1 M Tris/acetátový pufr, pH 7,6, pevný síran amonný,
Nesslerovo činidlo na amonné ionty.
Strojek na mletí masa, centrifuga, kyvety, třecí miska s tloučkem, elektromagnetická míchačka,
míchadlo, miska s ledem, dialyzační střevo, spona na dialyzační střevo, odměrné válce,
ultrafiltrační cela Amicon, ocelová láhev s dusíkem, předvážky, zkumavky, pipety, kádinky, lžička.
POJMY
Precipitát - pevná, usazená část po centrifugaci
Supernatant – čirá kapalina nad precipitátem
Difuzát – kapalina procházející membránou při ultrafiltraci
Retentát – roztok vysokomolekulárních látek neprocházející ultrafiltrační
membránou a zůstávající v ultrafiltrační cele.
POSTUP
Nabobtnaná semena rozemelte na strojku na maso a navažte přesně 50 gramů rozemleté
kaše. Proteiny extrahujte dvojnásobným objemem (100 mL) 0,1 M Tris/acetátového pufru, pH
7,6. Extrakt nechejte za občasného míchání stát 10 minut na ledu. Po deseti minutách extrakt
rozdělte do dvou kyvet, které je třeba pečlivě vyvážit na předvážkách. Centrifugujte 20 minut
při maximálním možném g (12.000 x g). Supernatant opatrně přelijte do čisté kádinky a
odměrným válcem změřte objem. 1/2 mililitru extraktu odeberte do mikrozkumavky a změřte
v něm obsah proteinů (navazuje na lab. cvičení č. 5). Podle tabulky 4 zjistěte potřebné množství
síranu amonného pro 50% nasycení, toto množství síranu amonného odvážte a důkladně rozetřete
ve třecí misce. Do kádinky s extraktem dejte elektromagnetické míchadlo a kádinku umístěte do
misky s ledem na elektromagnetickou míchačku. Po dobu 20 minut postupně k extraktu přidávejte
odvážené množství síranu amonného, další přídavek vždy až po rozpuštění předešlého. Dokonale
rozpuštěný extrakt se síranem amonným rozdělte do dvou kyvet a centrifugujte (12.000 x g, 20
min). Supernatant odstraňte a precipitát rozpusťte v 10 mL 0,02 M Tris/acetátového pufru, pH
7,6, který připravíte naředěním 0,1 M pufru. 5 mL rozpuštěného precipitátu nalijte do předem
namočeného dialyzačního střeva a nechejte dialyzovat přes noc proti stejnému pufru v 1 L
kádině.
Ze zbylých 5 mL rozpuštěného precipitátu odeberte do mikrozkumavky 0,5 mL (vzorek č. 1)
a zbytek umístěte do ultrafiltrační cely Amicon, kterou si předem sestavíte dle návodu. Celu
umístěte do misky s ledem na elektromagnetickou míchačku a napojte láhev s dusíkem přes
33
gumovou hadici a redukční ventil. Otevřením láhve s dusíkem se vytvoří v cele tlak, který spustí
vlastní ultrafiltraci. Difuzát jímejte do předem připraveného 5 mL odměrného válce. Po odkapání
3 mL difuzátu (vzorek č. 2), uzavřete přívod dusíku, otevřete celu a k retentátu přidejte 20 mL
0,02 M Tris/acetátového pufru, pH 7,6, celu uzavřete a opět spusťte ultrafiltraci. Difuzát
jímejte do odměrného válce a po odkapání 18 mL (vzorek č. 3), zopakujte předcházející krok
(vzorek č. 4). Po ukončení druhé fáze ultrafiltrace celu otevřete a zbylý retentát opatrně
převeďte pomocí pipety do mikrozkumavky (vzorek č. 5), tak aby jste se špičkou pipety nedotkli
filtru. Určete objem zahuštěného retentátu a změřte v něm obsah proteinů (navazuje na cvičení
č. 5). Celu poté důkladně vypláchněte destilovanou vodou a vraťte vedoucímu cvičení.
Nezapomeňte také zkontrolovat redukční ventil láhve s dusíkem, zda je správně uzavřen a zda
manometr ventilu ukazuje nulový tlak.
Stanovení amonných iontů reakcí s Nesslerovým činidlem
Princip: Amonné ionty reaguji s Nesslerovým činidlem (tetrajodortuťnatan draselný) za
vzniku červenohnědého produktu, který lze stanovit kolorimetricky s maximem při 436 nm.
NH4+ + 2 HgI42- + 4 OH  NH2I.Hg2O + 7 I + 3 H2O
Do 7 zkumavek napipetujte 1,5 mL destilované vody, přidejte 0,5 mL vzorku odebraných
během ultrafiltrace: 1/ vzorek č. 1, 2/ vzorek č. 2, 3/ vzorek č. 3, 4/ vzorek č. 4, 5/ vzorek č. 5
6/ dialyzační pufr z právě probíhající dialýzy, 7/ čerstvý dialyzační pufr jako blank a nakonec 0,1
mL Nesslerova činidla do každé zkumavky, po 5 minutách okem porovnejte zabarvení
v jednotlivých zkumavkách.
VYHODNOCENÍ
1) Popište a zhodnoťte purifikační proces. Srovnejte dva způsoby odsolení proteinů, které jste
použili. Využijte výsledků reakce s Nesslerovým činidlem. Navrhněte alternativní kroky, které
by jste mohli použít pro homogenizaci, precipitaci a odsolení izolovaných proteinů.
2) Pomocí metody Bradfordové vám vaší kolegové v rámci úlohy Spektrofotometrie stanoví
množství proteinů v 10 L homogenátu (extrakt z obilek po centrifugaci) a zahuštěného
vzorku po odsolení v ultrafiltrační cele Amicon. Ze získaných údajů vypočtěte množství
proteinů (extrahovatelných) v jednom gramu obilek a procentuálně stanovte obsah proteinů,
které vyizolujete z tohoto extraktu po 50% vysolení síranem amonným.
3) Zamyslete se a s pomocí literatury vypište biologicky aktivní látky, které jsou přítomné
v obilkách. Zkuste se zamyslet nad jejím kvantitativním obsahem.
Doporučená literatura:
Peč, P. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.
Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.
Procházka, S. a kol.: Fyziologie rostlin, Academia Praha, 1998.
Dey, P.M. a kol.: Plant Biochemistry, Academia Press London, 1997.
34
Laboratorní cvičení č. 4
EXTRAKCE, FILTRACE, SUBLIMACE A PRÁCE S VAKUOVOU ODPARKOU
EXTRAKCE
Jako extrakce je označováno převedení látky z jedné fáze, v níž je rozpuštěna nebo
suspendována, do fáze jiné. Toto převedení je možné, neboť látka se v určitém poměru rozdělí
mezi obě fáze. Distribuce rozpuštěné látky mezi dvě kapalné fáze se řídí Nernstovým
rozdělovacím zákonem:
ca/cb = K
Podle něj je poměr koncentrací látky ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách při určité
teplotě a po dosažení rovnováhy konstantní. K se nazývá rozdělovací koeficient.
Extrakce látky je podle toho snadná tehdy, jestliže je v extrakčním rozpouštědle mnohem
lépe rozpustná než v druhé fázi, čili je-li rozdělovací koeficient značně odlišný od jedničky. Pro
látky s rozdělovacím koeficientem menším než 100 jediná extrakce nestačí. V takovém případě je
nutno extrakci vícekrát opakovat s čerstvým rozpouštědlem.
Pro jednotlivé typy extrakce se historicky vyvinula některá označení, která budou společně
se stručnými definicemi uvedena:
Macerace - látka v pevné fázi je za studena opakovaně
extrahována dávkami rozpouštědla.
Digesce - látka v pevné fázi je za tepla extrahována
opakovanou dávkou rozpouštědla. Nejčastěji tuhou látku
zahříváme s rozpouštědlem pod zpětným chladičem a směs
poté filtrujeme nebo dekantujeme. Nejčastěji se používá
Soxhletův přístroj, v němž je extrakt stále zahušťován.
Přístroj pracuje automaticky. Ve varné baňce je rozpouštědlo,
později již roztok, které se odpařuje a jeho páry odcházejí
širokou trubicí na levé straně středního dílu přístroje (obr. 11)
do zpětného chladiče. Zde dochází k jejich kondenzaci. čisté
rozpouštědlo stéká do papírové patrony v níž je umístěn
extrahovaný materiál. Hladina roztoku ve střední části
přístroje neustále stoupá. V okamžiku, kdy její výška dosáhne
úrovně horní části tenké přepadové trubičky, dojde k jejímu
přetečení zpět do varné baňky. Tak je možno vyextrahovat
značné množství látky s malým množstvím rozpouštědla.
Obrázek 11: Soxhletův přístroj
Perkolace - látkou v pevné fázi prosakuje vlastní tíhou rozpouštědlo. Přívodem čistého
rozpouštědla je hladina kapaliny v perkolátoru udržována stále ve stejné výši. To zabezpečuje,
aby na vyextrahovávaný materiál v horních vrstvách přicházelo stále nové rozpouštědlo (obr. 12).
Vytřepávání – látka je z roztoku extrahována jednou dávkou rozpouštědla nebo opakovaně
dalšími dávkami (frakční vytřepávání). Vytřepavání provádíme tak, že vodný roztok nebo méně
často suspenzi látky smísíme v dělící nálevce asi z 1/3 až 1/4 objemu extrakčního činidla. Dělící
nálevka má být naplněna nejvýše do 2/3 objemu. Uzavřeme ji zábrusovou zátkou a nejdříve
35
protřepeme, přičemž držíme zátku i kohout. Pak otočíme dělící nálevku vypouštěcí stopkou vzhůru
a otevřením kohoutu zrušíme vzniklý přetlak. Třepání a odpouštění tlaku opakujeme obvykle 3-4 x.
Pracujeme-li s kyselinami, zásadami či jinými žíravinami, používáme ochranné pomůcky! Jednotlivé
fáze se většinou oddělí po chvíli stání. Spodní vrstvu vypouštíme kohoutem, horní odléváme
hrdlem dělicí nálevky.
Jedním vytřepáním extrakční výtěžky bývají většinou nízké, v optimálním případě
odpovídají Nerstovu rozdělovacími zákonu. Provádíme proto extrakci vždy nejméně 3-4 x.
Účinnější je vždy opakovaná extrakce menším množstvím rozpouštědla než extrakce celým
množstvím najednou.
Nejčastěji používaná extrakční činidla jsou:
Lehčí než voda: diethylether, benzen, hexan
Těžší než
uhličitý
voda:
methylendichlorid,
chloroform,
chlorid
FILTRACE
Filtrace je oddělování fází pomocí propustného
materiálu, který dovoluje průchod pouze jedné z obou fázi.
Obyčejně se pod pojmem filtrace rozumí oddělování pevné
fáze od kapaliny nebo plynu. Filtrace je v laboratoři velice
běžnou operací. Nejčastější je filtrace kapalin, prováděná
buď za účelem zbavení kapaliny mechanických nečistot, nebo
k izolaci pevné složky, např. při krystalizaci.
Obrázek 12: Perkolátor
Filtrační materiál je určován chemickým charakterem filtrovaného roztoku. Může to být
neklížený, tzv. filtrační papír nebo i pórovitá skleněná nebo porcelánová frita, vrstva azbestu
nebo skelné vaty apod. Rychlost filtrace závisí na ploše a vlastnostech filtračního prostředí, na
počtu a velikosti pórů, na tlaku a teplotě při filtraci, na povaze sraženiny i na viskozitě filtrované
kapaliny.
Základní pomůckou při filtraci je filtrační nálevka, do níž se vkládá vhodně složený papírový
filtr. Filtrační papír je vyráběn s různou velikostí pórů. Filtr se zhotovuje ze čtverce filtračního
papíru složeného pravoúhle na čtvrtiny a sestřiženého do tvaru kruhové výseče. Rozevřením
takto upraveného papíru vzniká kuželový filtr, který je z jedné poloviny trojnásobný a z druhé
jednoduchý. Tento tzv. hladký filtr filtruje pouze špičkou a poměrně pomalu. Rychleji pracuje
filtr skládaný, nazývaný též francouzský. Připraví se z kruhové výseče, která je vějířovitě
překládána směrem od středu k obvodu. Při skládání francouzského filtru je nutno dbát, aby při
několikerém překládání nedošlo k poškození filtru ve špičce (obr. 13). Je proto nezbytné, aby
jednotlivé záhyby neprocházely jedním bodem. Před vložením do nálevky se doporučuje složený
filtr rozevřít a obrátit tak, aby původně vnější stěna filtru tvořila vnitřní stěnu. Tím je možné
předejít znečištění filtrátu vlákny papíru uvolněnými během skládání a nečistotami z rukou.
Skládaný filtr se opírá o stěny nálevky jen hranami, a proto filtruje téměř celou svou plochou na
rozdíl od hladkého filtru, který filtruje jen špičkou. Filtrace francouzským filtrem je podstatně
rychlejší než filtrace hladkým filtrem téhož průměru.
36
Obrázek 13: Skládání hladkého a francouzského filtru
Nálevka s filtrem se vkládá do
filtračního kruhu připevněného na železném
stojanu. Pod ní je umístěná kádinka pro
zachycení filtrátu. Stonek nálevky se při
filtraci dotýká špičkou svého šikmo
seříznutého stonku stěny kádinky, přibližně
ve dvou třetinách výšky (obr. 14). Filtrát pak
klidně stéká po stěnách nádoby a
nevystřikuje. Při filtraci naléváme roztok na
filtr po skleněné tyčince, která se ve
vhodném úhlu přiblíží stěně filtru. Proud
kapaliny je vždy třeba směřovat proti místu,
kde je papírová vrstva trojitá. Sníží se tím
nebezpečí protržení filtru. Filtr se plní vždy
několik milimetrů pod okraj. Při filtraci
sraženiny je vhodné ji nechat usadit u dna
kádinky a na filtr nejprve nalévat čirý
matečný roztok, který rychle protéká ještě
nezaneseným filtrem. Teprve nakonec se ve
zbytku kapaliny rozvíří sraženina a vše se
nalije na filtr.
Obrázek 14: Filtrace za normálního tlaku.
Při promývání sraženiny na filtru se sedlina nejprve pomocí střičky spláchne do spodní části
filtru. Proud vody je třeba řídit od okraje filtru k jeho špičce. Promývání se provádí tak dlouho,
až je reakce filtrátu negativní na látku přítomnou v matečném roztoku. Důkaz se provádí citlivým
činidlem v malém podílu filtrátu.
Pro horké roztoky, u nichž hrozí, že se při ochlazení část rozpuštěné látky vyloučí na filtru
a ucpe jeho póry je nutno používat nálevky s vyhřívaným pláštěm, plášť může být vyhřívám horkou
vodou nebo elektricky. Jednoduše je možno improvizovat filtraci za horka nálevkou se
seříznutým stonkem, která je položena na hrdle kádinky. Plášť nálevky je pak přímo vyhříván
parami vroucího roztoku.
37
Podstatně urychlit filtraci je možno použitím sníženého tlaku, odsáváním vzduchu
v prostoru pod filtrem. Pro filtraci za sníženého tlaku užíváme Büchnerovy nálevky (obr. 1-17),
skleněných nebo porcelánových nučí a filtračních kelímků. Nejednodušší zařízení pro filtraci za
sníženého tlaku je Büchnerova nálevka s odsávací baňkou. Dno Büchnerovy nálevky je jemně
dírkované, na ně pokládáme filtrační papír tak, aby všechny otvory byly zakryty a papír
nepřečníval podél stěn nálevky vzhůru, poněvadž by vzniklými kanálky procházel filtrovaný roztok
do odsávací baňky. Nálevka je v odsávací baňce upevněná pryžovou vložkou nebo zátkou. Mezi
odsávací baňku a vývěvu je vhodné umístit pojistnou láhev (prázdnou promývačku), která
zabraňuje vniknutí vody z vývěvy do odsávací baňky nebo roztoku do vývěvy. Vniknutí vody do
odsávací baňky zabráníme, odpojíme-li baňku od vývěvy před zastavením toku vody ve vodní
vývěvě.
Při filtraci látek reagujících s filtračním papírem (koncentrované kyseliny, KMnO4 a pod.)
používáme skleněné frity, kde funkci filtračního papíru zastává do filtračního kelímku vtavená
skleněná pórovitá destička. Velikost pórů je odstupňována v řadě S1-S2-S3-S4-S5, velmi malé
póry jsou určeny pro filtraci biologických materiálu. Vzhledem k velké hustotě frit (pomalá
filtrace) filtrujeme vždy za použití sníženého tlaku. Nevýhodou skleněných frit je jejich značná
cena a hlavně jejich obtížné čištění.
SUBLIMACE
Sublimace je podobně jako krystalizace jednou ze základních metod čištění a oddělování
jednotlivých složek směsi. Děj je založen na tom, že tenze par tuhých látek se s rostoucí
teplotou zvyšuje, a proto lze mnohé látky převést do plynného skupenství, aniž roztají, a páry
opět přímo zkondenzovat v tuhou látku. Bod sublimace je teplota, při níž se tenze par tuhé látky
vyrovná s vnějším tlakem. V porovnání s krystalizací má sublimace v mnoha případech značné
výhody. Sublimovaný preparát totiž neobsahuje mechanické nečistoty, které i při pečlivé
krystalizaci mohou doprovázet výsledný produkt. Při sublimaci jednoduchých směsí se obyčejně
pracuje s malými ztrátami a jednoduchá sublimace často nahradí i několikrát opakovanou
krystalizaci. Vhodnost použití sublimace jako čistící a separační techniky záleží na vlastnostech
dané látky. Rozmezí teplot a tlaků, za nichž lze sublimaci použít je možno zjistit ze stavového
diagramu příslušné látky (viz fyzikální chemie).
Zařízení a způsob sublimace se řídí podle toho, jaké vlastnosti má mít sublimát. Čím nižší je
teplota chlazeného prostoru, v němž páry kondenzují, tím jemnější krystaly se vytvářejí. Vyšší
kondenzační teploty podporují naopak vznik větších a vyvinutějších krystalů.
Nejjednodušším zařízením pro provedení sublimace s nepříliš nízkou sublimační teplotou
mohou být dvě zabroušená hodinová skla (viz obr. 15-1). Na spodní sklo umístíme sublimovanou
látku, přikryjeme druhým sklem a opatrně zahříváme. Sublimující látka se usazuje na horním
hodinovém skle. V případě, že sublimovaná látka padá do surového produktu, můžeme mezi skla
položit perforovaný filtrační papír, na němž se sublimovaná látka zachytí. Jiným jednoduchým
zařízením je porcelánová miska a na ní postavená nálevka (obr. 15-2). Nálevka má mít o něco menší
průměr než miska. Stonek nálevky opatříme volnou vatovou ucpávkou. Mezi misku a nálevku opět
vkládáme perforovaný filtrační papír. V případě, že sublimační teplota je nízká, použijeme pro
sublimaci aparaturu znázorněnou na obrázku 15-3. Surový produkt nasypeme na dno suché
kádinky, kterou uzavřeme baňkou. Do baňky zavádíme až ke dnu stále čerstvou chladící vodu.
Sublimující látka se pak usazuje na kulatém dně baňky. Po skončení sublimace baňku opatrně
sejmeme a usazené krystaly špachtlí seškrábneme.
38
1
2
3
Obrázek 15: Různé způsoby sublimace
Látky při normálním tlaku nesublimující nebo sublimující
jen pomalu, případně látky, které se při sublimaci za vyšší
teploty rozkládají, lze často sublimovat při sníženém tlaku.
K tomuto účelu používáme aparatury podle obrázku 16.
ODPAŘOVÁNÍ VE VAKUU
Odpařování ve vakuu je v biochemické laboratoři jeden z
nejčastějších způsobu odpařování rozpouštědla z roztoků
látek. Dá se použít na roztoky jak nízko- tak
vysokomolekulárních látek, jejichž objem může být od
několika mililitrů až po litry a využívá se při něm efektu
snížení bodu varu při sníženém tlaku v systému.
Odpařování malých objemů do 2 mL se dělá
v evakuovaném exikátoru nad vhodným sorbentem vody (P2O5,
NaOH, CaCl2). Vzorek se umístí do mikrozkumavky, a nebo jiné
vhodné nádoby, které jsou v exikátoru uloženy tak, aby vodní
páry měly k sušidlu co nejkratší cestu.
Obrázek 16: Aparatura pro
sublimaci za sníženého tlaku
Hlavní výhodou této metody je, že je levná a dostupná v každé laboratoři, nevýhodou je
dlouhý čas (řádově hodiny) a nemožnost odpařit jiné rozpouštědlo než vodu. Nevýhody se
odstraňují přístroji pracujícími na podobném principu, kde se páry rozpouštědla neustále odsávají.
Při vakuovém zahuštování roztoků, kde je použito organické rozpouštědlo nastává utajený var, což
může často způsobit napěnění vzorku či jeho vystřiknutí. Tyto problémy se dají odstranit
odpařováním vzorku za současné centrifugace. Zařízení se obvykle skládá z centrifugy, která
může být vyhřívaná, z vymrazovací části a z vakuové pumpy.
Nejběžnější způsob odpařovaní středních objemů je odpařování na vakuové rotační
odparce. Rotační vakuová odparka se skládá z odpařovací baňky, pohonné jednotky a z vhodného
chladiče s kondenzační baňkou a musí být doplněná zdrojem vakua (vodní vývěva, membránová
vývěva). Odpařovací baňka se většinou během odpařování ponoří do vodní lázně, kde je vyhřívána
na zvolenou teplotu. Vakuum vytvořené v prostoru s roztokem snižuje její bod varu a rotační
pohyb baňky způsobuje intenzivní míchání odpařované směsi spojené se stálým obnovováním filmu
na kapaliny na vnitřním povrchu baňky. Tímto se zamezuje přehřívání kapaliny, zvyšuje se
odpařovací povrch a zkracuje dráha bublin páry z vnitřního prostoru baňky na povrch roztoku.
Důsledkem je intenzivní odpařování kapaliny, jejíž páry kondenzují ve vodním chladiči, umístěném
mezi zdrojem vakua a odpařovací baňkou, a stékají do kondenzační baňky. Schéma vakuové
odparky je na znázorněno na obrázku 17.
39
Obrázek 17: Schéma vakuové rotační
odparky: 1 – odpařovací baňka, 2 – pohonná
jednotka, 3 - vodní chladič, 4 – kondenzační
baňka, 5 – napouštěcí uzávěr.
ÚKOL č. 6: Izolace kofeinu z čaje a jeho přečištění sublimací
Alkaloidy jsou nejpočetnější skupinou rostlinných látek sekundárního metabolismu. Dosud
jich bylo izolováno kolem sedmi tisíc. Z chemického hlediska se dají alkaloidy popsat jako
organická báze s jedním nebo několika heterocyklickými dusíkovými atomy v molekule. V přírodě
se vyskytují ve formě solí s organickými kyselinami. Alkaloidy obsahuje 10 až 20 % všech vyšších
rostlin. Byly nalezeny ve všech jejich částech, ale nejvíce jsou přítomné především v semenech,
kořenech a kůře stromů. Kofein patří do skupiny purinových alkaloidů (purin je složen ze dvou
heterocyklů – pětičlenného a šestičlenného a obsahuje celkem 4 atomy dusíku na molekulu).
Molekula kofeinu má navíc dvě oxo-skupiny (xantin) a je třikrát methylovaná. Kofein je nejhojněji
zastoupen v semenech kávovníku a kakaovníku a listech čaje. Má povzbudivý účinek na centrální
nervovou soustavu a srdeční činnost, podporuje činnost ledvin a zvyšuje tvorbu moči. Stimulační
účinek kofeinu, stejně jako theofylinu z čaje, je založen na inhibici enzymu fosfodiesterasy,
která odbourává látky mající podobnou strukturu a přenášející nervový vzruch, jako je např.
cyklický adenosinmonofosfát.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
Kádinky, vařič, filtrační papír, nálevka, dělicí nálevka, vakuová odparka, železný stojan s kruhem,
pipety, odpařovací miska, vodní lázeň, baňka, korková zátka, skleněné trubice, hadice,
mikrozkumavka, špachtle, parafilm, čajové listy, octan olovnatý, ethanol, chloroform, 5% roztok
hydroxidu sodného.
POSTUP
Před začátkem práce si zapněte vodní lázeň u vakuové odparky a vodní lázeň v digestoři na
odpařování vzorku, aby jste předešli časovým prodlevám.
Na předvážkách odvažte tři gramy čajového listí a povařte v kádince na vařiči 5 minut v 50
mL destilované vody. Mezitím si připravte 20 mL roztoku octanu olovnatého (w/v = 5%), přidejte
ho k čajovému odvaru a povařte dalších 5 minut. Připravte si francouzský skládaný filtr a po
vychladnutí roztok přefiltrujte. Filtrát odpařte zhruba na 20 mL objemu kapaliny. S použitím
dělící nálevky pak proveďte extrakci odparku s 15 mL chloroformu třikrát po sobě. Spojené
extrakty v organickém rozpouštědle promyjte v dělící nálevce destilovanou vodou (15 mL) a potom
stejným objemem roztoku hydroxidu sodného (w/v = 5%). Přečištěný chloroformový extrakt
zahustěte na vakuové odparce. Postupujte následovně:
40
1) Extrakt přelijte do 250 mL baňky s kulatým dnem a zábrusovým hrdlem. Nezapomeňte vložit
varné kuličky. Baňku připevněte svorkou na levé ústí vakuové odparky.
2) Zapněte vodní lázeň na 60C a pomoci šroubu umístěte baňku do polohy, kdy je její spodní
stěna omývána vodou ve vodní lázni.
3) Uzavřete tlačkou hadici na pravé straně vakuové odparky.
4) Do chladiče pusťte mírným proudem vodu a zkontrolujte, zda-li je utěsněna kondenzační
baňka.
5) Spusťte vývěvu a evakuujte odparku.
6) Spusťte rotaci baňky.
7) Po skončení odpařování nejprve uvolněte tlačku na pravé trubici odparky a teprve pak vypněte
vývěvu.
Odparek rozpusťte v etanolu a baňku kvantitativně etanolem vypláchněte. Ethanolický
roztok odpařte na vodní lázni v odpařovací misce.
Připravte si aparaturu k sublimaci podle obrázku 15-3. Odparek kvantitativně převeďte na
dno kádinky aparatury. Rozhraní mezi chladicí baňkou a kádinkou utěsněte parafilmem. Aparaturu
zahřívejte na vařiči s azbestovou síťkou až do doby, kdy skončí vývoj sublimujících par.
Nezapomeňte pustit vodu. Po skončení sublimace zastavte vodu a oddělejte zátku s trubicemi.
Krystalky kofeinu vyloučené na dně baňky se pokuste pomocí špachtle kvantitativně převést do
předem zvážené mikrozkumavky.
VYHODNOCENÍ
1) Popište a zhodnoťte postup izolace. Navrhněte jiné metody, kterými by jste mohli nahradit
jednotlivé kroky.
2) Uveďte výtěžek izolace kofeinu a navrhněte způsob, jak by jste určili jeho čistotu.
3) Za pomocí literatury navrhněte analytickou reakci, kterou by jste dokázali kofein.
Doporučená literatura:
Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.
Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.
Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
Čtrnáctová, H. a kol.: Didaktika a technika chemických pokusů, Vydavatelství Karolinium Praha,
1992.
41
Laboratorní cvičení č. 5
SPEKTROFOTOMETRICKÁ MĚŘENÍ
Viditelné záření tvoří malý úsek z oblasti elektromagnetického vlnění v rozmezí délek 400700 nm. Přilehlá oblast rozmezí vlnových délek 200-400 nm se nazývá blízká ultrafialová oblast,
700-2000 nm se pak nazývá blízká infračervená oblast. Celá oblast vlnových délek se také nazývá
oblastí elektronových spekter.
Prakticky v každé biologicky zaměřené laboratoři se dnes setkáváme s přístroji pro měření
spektrálních veličin ve viditelné a ultrafialové oblasti. Tzv. spektrofotometry, pro registraci
spekter v oblasti od 200 (někdy 185 nm) do 700 nebo 1000 nm. Není divu, vždyť téměř všechny
biologicky zajímavé látky (kromě sacharidů) mají v této oblasti, kterou označujeme zkratkou UVVIS (ultraviolet - visible), charakteristické absorpční pásy a jejich koncentraci lze proto
většinou poměrně snadno stanovit na základě jejich spektrálních vlastností.
Určování koncentrace roztoků není jedinou možností využití absorpční spektrofotometrie.
Již po několik desetiletí je známo, že absorpční vlastnosti závisejí na interakci příslušného
chromoforu s okolím. Z toho vyplývá, že vlnová délka absorpčního maxima i intensita absorpce
mohou být ovlivněny řadou procesů, které biochemika enormně zajímají. Uveďme zde pro ilustraci
několik příkladů:
-
Při denaturaci biopolymeru (bílkoviny nebo nukleové kyseliny) se mění jeho absorpční
spektrum, protože chromofory se dostávají do jiného mikroprostředí (u bílkovin zevnitř
globule do vodného prostředí, v DNA z jádra helixu, kde těsně interagují se sousedy
vodíkovými a patrovými interakcemi).
-
Protože fenolátový ion má jiné vlastnosti než nedisociovaný fenol, je možné ze změny
spekter bílkoviny při zvyšování pH roztoku určit titrační křivku tyrosinových zbytků a z ní
pak usoudit na jejich lokalizaci v molekule proteinu.
-
Při nekovalentní vazbě různých ligandů na biopolymer se často mění jejich spektrum; to
dovoluje touto metodou určit počet navázaných ligandů a asociační konstantu.
ODVOZENÍ LAMBERT - BEEROVA
ZÁKONA
Interakcí záření s hmotou, tj. s atomy a molekulami, dochází k jeho absorpci, tj. k přijetí
kvanta energie a zvýšení energie atomu (molekuly) z původního základního stavu do stavu
exitovaného. Při absorpci záření v oblasti 200-2000 nm dochází převážně k exitaci elektronového
systému, resp. valenčních elektronů zúčastněných atomů a molekul. Vlastní interakce záření
s hmotou se sleduje na absorpčním spektru, tj. na záznamu závislostí množství absorbovaného
záření na jeho vlnové délce.
Předpokládejme, že na spekrofotometrickou kyvetu s optickou drahou I, která obsahuje
absorbující látku, dopadá světlo o intensitě Io. Pokles intensity světla dI v důsledku jeho
absorpce vrstvou roztoku o tloušťce dl, pak bude
-dI = k.I.dl
kde k je konstanta úměrnosti. Po separaci proměnných a integraci (interval 0 - 1) získáme vztah
log
Io
 j.c
I
42
zvaný Lambertův zákon, kde I je intensita světla vystupujícího z kyvety.
Analogicky můžeme postupovat při studiu závislosti poklesu intensity světla na koncentraci
absorbující látky při konstantní délce kyvety. Zde vycházíme z předpokladu, že dI bude, přes
jinou konstantu j, úměrné vzrůstu koncentrace dc, tedy:
-dI = j.I.dc
Opět integrujeme, tentokrát v intervalu 0 až c, a získáme Beerův zákon:
log
Io
 j.c
I
Zaměřme se nyní na veličiny na levé straně obou rovnic. Veličina Io je intensita světla, které do
kyvety vstupuje, a I je intensita světla vystupujícího. Nabízí se vyjádřit poměr těchto hodnot
jako frakci světla pohlceného v kyvetě; tato veličina se pak nazývá transmitance T:
T =
I
Io
a často se vyjadřuje v procentech. Z fyzikálního pohledu není přirozenějšího popisu absorpčních
efektů než pomocí této veličiny. Ta však byla v posledních letech téměř opuštěna, neboť pro
praktické laboratorní používání trpí zásadním nedostatkem: není přímo úměrná koncentraci
absorbující látky. Přímou úměru zajišťuje veličina na levé straně obou výše uvedených vztahů,
která se nazývá absorbance A; tedy
A = log
Io
1
 log
I
T
Dříve se místo ”absorbance” užívalo termínu ”extinkce” (označení E); v anglosaské, zejména
americké literatuře, toto označení tvrdošíjně přežívá. Evropský čtenář by si měl být jist, že
pojmy absorbance a extinkce (a podobně i absorpční a extinkční koeficient) jsou naprosto
ekvivalentní.
Poněkud jinak bychom měli hledět na pojem optická hustota, zkracovaný O.D. nebo OD (optical
density). Prochází-li paprsek kyvetou, může být jeho intensita snižována i jinými jevy než
absorpcí (pohlcením fotonu spojeným s excitací molekuly do vyššího energetického stavu). Pro
zeslabení intensity v důsledku absorpce je vhodný termín absorbance, zde také většinou platí, jak
uvidíme dále, Beerův zákon. Pokud však je intensita paprsku zeslabována například rozptylem
záření na velikých částicích (agregátech molekul při turbidimetrických měřeních, buňkách při
proměřování růstových křivek v mikrobiologii apod.), je vhodné toto zeslabení kvantifikovat jako
optickou hustotu. Ta je definována stejně jako absorbance, tedy
OD = log
Io
I,
ale nemá přímou souvislost s jevem absorpce. Jinými slovy, optická hustota je pojmem
nadřazeným, kdy jenom v některých případech je totožná s absorbancí.
Spojíme-li oba výše uvedené zákony, získáme jeden z nejznámějších fyzikálně-chemických
vztahů, zvaný Lambert-Beerův zákon:
43
A = .c.l
kde  je konstanta úměrnosti, odvoditelná z výše definovaných konstant k a j. Jinými slovy, je to
absorbance roztoku o jednotkové koncentraci absorbující látky v kyvetě o jednotkové délce.
Vzhledem k tomu, že, jak vyplývá z definiční rovnice, je absorbance bezrozměrná veličina, musí
mít  rozměr (délka-1. koncentrace-1). Za jednotkovou délku zde prakticky vždy považujeme 1 cm.
Podle toho, v jakých jednotkách dosazujeme koncentrace, nabývá pak  různých rozměrů.
Pokud je koncentrace vyjádřena v jednotkách mol.l-1, má  rozměr cm-1.l.mol-1 a hovoříme o
molárním absorpčním (postaru extinkčním) koeficientu. Jeho rozměr lze dále upravit vykrácením
délkových jednotek, čímž získáme tvar cm2.mmol-1; je dobré si uvědomit, že tento rozměr je
zcela totožný s výše uvedeným základním tvarem a mmol nemá nic do činění s nějakou milimolární
koncentrací. Jiným, zcela ekvivalentním rozměrem, je M-1.cm-1, kde M označuje molaritu; tento
dokonale pochopitelný tvar je užíván zejména v anglosaské literatuře.
Až doposud jsme uvažovali o přítomnosti jediné absorbující látky ve zkoumaném roztoku.
Tento stav je však u reálných vzorků spíše výjimečný. Většinou je přítomno několik látek, které
absorbují při dané vlnové délce. Měřená absorbance je pak součtem všech dílčích absorbancí.
URČOVÁNÍ KONCENTRACE ROZTOKŮ POMOCÍ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE
Jak je patrno z definice absorbance, při jejím měření potřebujeme znát intensity (nebo
lépe světelné toky) dvou paprsků: tzv. referenčního (srovnávacího - Io), jenž nebyl oslaben
absorpcí, a měrného (I), který prošel kyvetou se vzorkem. Podle způsobu měření dělíme
spektrofotometry na několik základních typů:
1) Jednopaprskové přístroje mají jedinou optickou dráhu. Paprsku se nejdříve postaví do cesty
referenční vzorek (v laboratorní mluvě zvaný blank). Množství světla, jež jím prošlo, je
zaregistrováno jako Io. Poté je do optické dráhy umístěn měřený vzorek, zaregistruje se I a
z obou údajů je vypočtena absorbance. Na starších a jednodušších přístrojích tohoto typu se
nastavují dva parametry: při zacloněném paprsku se kompensuje tzv. temný tok, který
detekční zařízení poskytuje i v situaci, kdy na něj žádné světlo nedopadá (označení "0"
souvisí s nulovou transmitancí při zacloněném paprsku), poté se do paprsku umístí referenční
vzorek, jehož absorbance je z definice nulová (transmitance 100%). Toto nastavení je nutno
provádět pro každou vlnovou délku, a proto se přístroje tohoto typu nepoužívají pro měření
spekter. U moderních přístrojů se závislost Io na vlnové délce pro referenční vzorek uloží do
paměti a po změření této závislosti pro vzorek (I) se vypočtou hodnoty absorbancí pro
všechny vlnové délky. Princip jednopaprskového spektrofotometru je na obrázku 18.
2) Dvoupaprskové přístroje mají oddělené dráhy pro referenční paprsek a pro vzorek. V každém
okamžiku proto mohou registrovat I i Io a vypočítat absorbanci. Tyto přístroje, obvykle
poněkud dražší, dovolují velmi snadno měřit různé typy diferenčních spekter a mívají i lepší
optické parametry (monochromatičnost světla).
3) Pro úplnost se zmiňme o nejnovějším typu spektrofotometrů, tzv. diod-array-detectors
(DAD). Tato koncepce se objevila v polovině 80. let. Ostatní spektrofotometry mají
monochromátor umístěn před kyvetovým prostorem, takže vzorkem prochází pouze vybrané
("monochromatické") světlo, které je pak přímo zpracováno detektorem. V DAD přístrojích
prochází všechno světlo (polychromatické) vzorkem a teprve poté je rozloženo mřížkou; řada
světlocitlivých diod pak analyzuje množství světla jednotlivých vlnových délek, které prošlo
vzorkem, respektive referenčním roztokem. Toto experimentální uspořádání má sice poněkud
nižší kvalitu optických parametrů (rozlišovací schopnost z hlediska spektrální čistoty), jeho
44
předností je však fantastická rychlost měření, neboť intensita světla všech vlnových délek se
snímá v jediném okamžiku. Proto je toto uspořádání vhodné zejména pro kinetická měření
nebo jako detektory chromatografických zařízení (HPLC).
monochromátor
detektor
čočka
lampa
kyveta
se vzorkem
zesilovač
výstup
Obrázek 18: Princip jednopaprskového spektrofotometru.
Při stanovení koncentrace pomocí měření absorbance se setkáváme s řadou úskalí. Dále
probereme nejběžnější příčiny, jež vedou k chybám.
Prvořadým úkolem je proměřit závislost absorbance na koncentraci absorbující látky.
Můžeme volit kteroukoli vlnovou délku, až na výjimky však volíme vlnovou délku absorpčního
maxima stanovované látky, a to ze dvou důvodů: je zde nejvyšší citlivost stanovení a přesnost
stanovení zde nejméně závisí na přesnosti nastavení vlnové délky. Závislost absorbance na
koncentraci by měla být přímková a procházet počátkem. Směrnice této přímky je rovna
absorpčnímu koeficientu. Setkáváme se však často s odchylkami od této nejjednodušší závislosti.

Přímka neprochází počátkem. Taková situace je vždy artefaktem: při nulové koncentraci
látky musí být absorbance nulová. Dosti obvyklou chybou je to, že při počítačovém
vyhodnocení je zvolen nevhodný přímkový model, povolující nenulový úsek na ose y. Pokud
přímku "nelze přinutit", aby procházela počátkem, bývá chyba v nevhodné volbě
referenčního roztoku, nečisté referenční kyvetě apod.

Závislost není přímková. K tomuto jevu dochází v případě, kdy se látka vyskytuje v několika
spektrálně odlišitelných stavech, přičemž koncentrace jednotlivých složek roztoku závisí
na celkové koncentraci. Jako typický příklad se uvádějí oligomerní rovnováhy, kdy oligomer
má jiné absorpční spektrum než monomerní jednotky. V těchto případech, kdy neplatí
Beerův zákon, nelze snadno určit koncentraci z měření při jediné vlnové délce.

Pokud látka fluoreskuje, je část absorbovaného světla opět vyzářena. Světlo při vyšších
hodnotách absorbance zdánlivě snižuje její hodnotu. Závislost absorbance na koncentraci
je pak zakřivená a limituje k nějaké hodnotě.
Při stanovování koncentrace skupiny látek bývá problémem zvolit vhodný "obecný" standard.
Typickým příkladem je zde stanovování koncentrace proteinů. Aromatické postranní řetězce
bílkovin absorbují v UV oblasti v okolí 280 nm. Často se volí jako standard hovězí sérový albumin,
jehož A jednoprocentního roztoku činí 6.8. Zastoupení aromatických aminokyselin v albuminu je
však ve srovnání s většinou bílkovin relativně nízké a hodnota jeho specifického absorpčního
koeficientu je v "rodině" rozpustných bílkovin nepoužitelná. Na obrázku 19 je srovnání spekter
albuminu a imunoglobulinu při stejné koncentraci.
45
1,6
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e
3
2
1,4
1,2
1
0,8
0,6
1
0,4
0,2
0
210
230
250
270
290
310
330
vlnová délka [nm]
Obrázek 19: Absorpční spektra. 1 - hovězího sérového albuminu (1 mg.mL-1), 2 - lidského
imunoglobulinu G (1 mg.mL-1) a 3 - DNA (0.1 mg.mL-1), optická délka kyvety 1 cm.
V biologickém materiálu často komplikuje spektrofotometrické měření zákal, jenž
nekontrolovaně zvyšuje turbiditu roztoku, která se pak přičítá ke skutečné absorbanci. Právě zde
by bylo vhodnější mluvit o optické hustotě, jejíž vztah ke koncentraci bývá mnohem
komplikovanější než přímá úměrnost Beerova zákona. Dobrým vodítkem pro posouzení, zda
turbidita významně ovlivňuje změřenou absorbanci při dané vlnové délce, je tvar absorpčního
spektra: křivka by měla poměrně rychle klesat k nule, zatímco v zakalených vzorcích klesá
mnohem pomaleji. Pokud je tímto způsobem zjištěn zákal (pro bílkoviny není u 330 nm OD nulová),
je nutno pokusit se vliv zákalu na měřenou absorbanci nějakým způsobem snížit. Např. pro
bílkoviny se odčítá registrovaná "absorbance" u 330 nm od měřené absorbance v maximu u 280
nm.
Jak jsme již ukázali, absorbance při určité vlnové délce je součtem absorbancí všech
přítomných absorbujících látek. Při studiu roztoků biologicky aktivních látek se málokdy setkáme
se situací, že by v inkriminované oblasti spektra (zejména v UV) absorbovala jediná složka
roztoku. V tom případě musíme velmi opatrně posoudit, zda další absorbující látky neovlivňují naše
stanovení. Proto bývá velmi vhodné nespokojovat se s měřením absorbance při jediné vlnové délce,
ale proměřit vždy relevantní závislost absorbance na vlnové délce (absorpční spektrum) a podle
jeho tvaru usoudit, zda nějaká cizí látka naše stanovení neruší. Typickým problémem tohoto typu
je překryv spektra bílkoviny příměsí nukleových kyselin, které mají, díky vysokému obsahu
aromátů, velmi vysoký specifický absorpční koeficient (viz obrázek 19).
ÚKOL č. 7: V neznámém vzorku spektrofotometricky stanovte koncentraci niklu v síranu
nikelnatém
MATERIÁL a CHEMIKÁLIE
Spektrofotometr Shimadzu UV-1204, kyvety, kádinky, tiskárna, programová karta SPEKTRUM,
25 mL odměrné baňky, pipety, 0,5 M síran nikelnatý.
46
POSTUP
Připravte si sadu 5 roztoků síranu nikelnatého o koncentracích 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 a 0,3 M
přesným ředěním zásobního roztoku o koncentraci 0,5 M. Postupujte tak, že do odměrných baněk
na 25 mL pipetujte 5 mL automatickou pipetou vypočtené množství zásobního roztoku. Roztoky
v baňkách doplňte po značku vodou, uzavřete zátkou a dobře promíchejte.
Naučte se obsluhovat spektrofotometr Shimadzu UV-700. Přístroj zapněte a následující
měření provádějte vždy přesně podle návodu na obsluhu přiloženého u přístroje. Případné
nejasnosti konzultujte s vedoucím cvičení.
Proměření absorpčního spektra 0,3 M roztoku síranu nikelnatého od 600 nm do 800 nm po 10 nm:
1) Na spektrofotometru nastavte nejnižší vlnovou délku tj. 600 nm.
2) Připravte si kyvetu s blankem (destilovaná voda), vložte ji do kyvetového prostoru a přístroj
vynulujte funkcí AUTOZERO.
3) Do kyvetového prostoru vložte novou kyvetu s měřeným roztokem a odečtěte příslušnou
absorbanci. Kyvetu plňte vždy do 3/4 objemu tak, aby světelný paprsek procházel měřeným
roztokem, ne však plnou, aby se při manipulaci roztok nevyléval do přístroje. Před každým
měřením optickou stěnu kyvety otřete vatovým tampónem.
4) Postup zopakujte pro všechny vlnové délky, vždy i s předcházející kalibrací na destilovanou
vodu.
5) Na závěr podle návodu a pomocí programové karty SPECTRUM proměřte kontinuálně celé
spektrum 0,3 M roztoku od 800-300 nm a to tak, že se funkcí RETURN vrátíte do základní
nabídky spektrofotometru a postupujete podle návodu. Získané spektrum vytiskněte. Maxima
absorpční křivky zjistíte použitím funkce PEAK.
Získanou závislost absorbance na vlnové délce vyneste do grafu na milimetrový papír a
porovnejte s vytištěným kontinuálním spektrem. V místě maximální absorbance odečtěte vlnovou
délku, při které budete provádět další měření (porovnejte s automatickým vyhledáním maxima
funkcí PEAK).
Sestrojení kalibrační křivky
Na spektrofotometru nastavte získanou maximální vlnovou délku. Přístroj vynulujte na
destilovanou vodu a bez další kalibrace proměřte sadu připravených roztoků nikelnatých iontů.
Mezi každým měřením kyvetu důkladně propláchněte destilovanou vodou a vysušte, aby
nedocházelo k ředění a míchání vzorku. Po kalibraci na vodu měření celé sady ještě 2x zopakujte.
Na závěr dejte do kyvety neznámý vzorek a změřte jeho absorbaci. Pokud absorbance
překračuje rozmezí hodnot získaných při kalibračním měření, vzorek vhodně nařeďte
destilovanou vodou a měření zopakujte.
VYHODNOCENÍ
U každé koncentrace vypočtěte průměrnou hodnotu ze tří naměřených absorbancí.
Získanou závislost absorbance na koncentraci vyneste do grafu na milimetrový papír. Z grafu, tzv.
kalibrační křivky, pak jednoduše odečtete koncentraci neznámého vzorku. Pozor, berte v úvahu
případné ředění neznámého vzorku.
47
ÚKOL č. 8: Praktická aplikace spektrofotometrie v biochemické laboratoři - stanovení
obsahu proteinů v biologickém vzorku metodou Bradfordové s vazbou barviva Coomassie
Brilliant blue
Barvivo Coomassie Brilliant blue G250 se váže na proteinové molekuly v kyselém pH dvěma
způsoby. Trifenylmethanová skupina se váže na nepolární části proteinu a anion sulfoskupiny na
bazické skupiny ve vedlejších řetězcích aminokyselin (arginin a lysin). Po vazbě barviva na
proteiny dochází k barevné změně, která je úměrná množství proteinu. Reakce je velmi citlivá u
albuminu a řady globulárních proteinů. Stanovení je však rušeno řadou interferujících látek, které
jsou známy. Metoda je díky své jednoduchosti a citlivosti široce používána. Jako kalibrační
protein se používá hovězí sérový albumin (BSA). Barevný produkt barviva s proteinem vykazuje
absorpční maximum při 595 nm.
MATERIÁL a CHEMIKÁLIE
Spektrofotometr, kyvety, pipety, zkumavky, vortex, činidlo Bradfordové, kalibrační křivka na
BSA.
POSTUP
Do pěti zkumavek napipetujte po 2 mL činidla Bradfordové. Do první a druhé přidejte po
10 L extraktu z ječmenných obilek, do třetí a čtvrté přidejte po 2 L zahuštěného retentátu
z vysoleného extraktu (vzorky dodají kolegové dělající cvičení č. 3) a pátou ponechte jako blank.
Zkumavky promíchejte na vortexu (přístroj pro rychlé a účinné promíchání zkumavek) a nechejte
5 minut stát při laboratorní teplotě. Na spektrofotometru nastavte vlnovou délku 595 nm. Do
kyvetového prostoru umístěte v kyvetě vzorek číslo 5 se samotným činidlem Bradfordové a
přístroj vynulujte, poté postupně proměřte všechny čtyři připravené vzorky. Po každém vzorku
kyvetu vypláchněte ethanolem, jelikož se barvivo Coomassie Brilliant blue váže na stěny
skleněných i plastových kyvet.
VYHODNOCENÍ
Hodnoty absorbanci si zaznamenejte a z kalibrační křivky na BSA (dodá vedoucí cvičení)
odečtěte obsah proteinů v daném vzorku. Množství proteinu pak přepočtěte na 1 mL vzorku.
ÚKOL č. 9: Měření absorpčních spekter listových barviv
V listech zelených rostlin se vyskytuje větší množství lipofilních barviv, jejichž
charakteristickou vlastností je rozpustnost v tucích a tukových rozpouštědlech. Pro fotosyntézu
mají hlavní význam chlorofyly a, b a karotenoidy. Jsou značně citlivé vůči vzdušnému kyslíku a
světlu. Každé barvivo má své typické maximum, které můžeme pozorovat na absorpčním spektru.
MATERIÁL a CHEMIKÁLIE
Spektrofotometr Shimadzu UV-1204, kyvety, tiskárna, programová karta SPEKTRUM, třecí
miska s tloučkem, špachtle, nálevka, filtr, kádinky, pipety, mořský písek, uhličitan vápenatý,
hexan, zmražený špenát.
POSTUP
Odvážte 2 g listu špenátu a rozetřete je v třecí misce s malým množstvím mořského písku a
uhličitanu vápenatého (na špičku špachtle), na konec přidejte 5 mL hexanu a znovu rozetřete.
Směs přefiltrujte přes malý filtr do kádinky.
Do spektrofotometru vložte programovou kartu SPEKTRUM a nastavte rozsah vlnových
délek od 800 do 200 nm, pracujte podle návodu přiloženého u spektrofotometru a nezapomeňte
48
zapnout wolframovou lampu pro měření v UV oblasti. Do křemenné kyvety pro UV měření (dodá
vedoucí cvičení) nalijte do 3/4 objemu hexan a spektrofotometr vynulujte funkcí BASECORR. Po
té do kyvety nalijte hexanový extrakt a proměřte absorpční spektrum. Pokud některá maxima
výrazně převyšují absorbanci nad 1,0 vzorek řeďte a to tak dlouho dokud nedostanete čitelné
spektrum. Spektrum vytiskněte a pomocí funkce PEAK odečtěte absorpční maxima spektra.
Poznámka: Pro měření v blízké UV oblasti, tzn. 190-350 nm, se používají kyvety ze
speciálního křemenného skla, které na rozdíl od skla obyčejného a plastu UV záření propouští.
S těmito kyvetami je však nutno pracovat velmi opatrně, jelikož jejich cena mnohonásobně
převyšuje cenu běžných kyvet.
VYHODNOCENÍ
1) Odečtěte maxima na absorpčním spektru a pomocí literatury se pokuste zjistit, která barviva
se vám podařilo extrahovat ze špenátu. Na základě absorpčního spektra zkuste taky porovnat
vzájemně jejich kvantitativní zastoupení v listech špenátu. Z literatury také nastudujte,
která další barviva jsou v listech obsažena a vysvětlete, proč jste nepozorovali jejich maxima
na absorpčním spektru.
2) Zamyslete se a s pomocí literatury uveďte několik dalších příkladů využití spektrofotometrie v biochemii.
ÚKOL č. 10: Spektrální stanovení koncentrace DNA
Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorbance je při 260
nm. Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší přítomnost proteinů (280 nm) a
aromatických látek. Pokud je DNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 1.9.
Koncentraci DNA lze získat podle vztahu:
cDNA (g/ml) = 62.9 * A260 – 36.0 * A280
POSTUP
Do 1 cm křemenné kyvety napipetujeme vhodně zředěnou DNA (10-100x). Vzorek DNA dodá
vedoucí cvičení. Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm proti TE
pufru a odečteme absorbance při 280 a 260 nm.
VYHODNOCENÍ
Pomocí výše uvedeného vzorce určete koncentraci a čistotu neznámého vzorku DNA.
ÚKOL č. 11: Stanovení proteinové koncentrace metodou BCA s pomocí spektrometru Agilent
8453 s automatickým podavačem a průtočným systémem
I přes časovou náročnost nabízí Bicincholinová metoda (BCA) několik výhod, oproti
standardně používané metodě Bradfordové. Činidlo Bradfordové je totiž poměrně citlivé na řadu
sloučenin obsažených ve vzorku a může tedy snadno dojít ke zkreslení výsledků. Mezi látky, které
49
nejčastěji interferují s metodou Bradfordové, patří především detergenty (Triton X-100, Tween
20 apod.), které se běžně používají jako součást extrakčních pufrů. Naproti tomu metoda BCA
není citlivá na přítomnost těchto látek. Navíc citlivost této metody je poměrně vysoká a lze měřit
proteinové koncentrace v rozmezí 100-1500µg/mL.
Využitím spektrofotometru vybaveného automatickým podavačem vzorku (tzv.
autosamplerem) lze navíc podstatně zkrátit vlastní dobu měření. Přístroj lze naprogramovat tak,
aby metoda probíhala plně automaticky, a není tedy potřeba přítomnost obsluhy, která se může
věnovat jiné činnosti. Využitím autosampleru tak lze snadno a rychle zpracovat velké objemy
vzorků. Vnesení chyb způsobených nepřesným pipetováním je taktéž minimalizováno, jelikož
dávkování vzorku probíhá automaticky.
V následující úloze si tedy vyzkoušíte měření neznámého vzorku pomocí metody BCA.
Nejprve si připravíte činidlo BCA, smícháním dvou složek A a B v poměru 50 : 1. Vždy připravte
jenom tolik činidla, kolik opravdu spotřebujete (počítejte však s rezervou pro několik vzorků). V
dalším kroku je třeba připravit si standardy nutné k sestavení kalibrační křivky. Standardy
připravíte vhodným naředěním zásobního roztoku proteinu BSA o známé koncentraci. Paralelně se
standardy si vhodným naředěním připravíte i neznámý vzorek, v němž budete stanovovat
koncentraci proteinů. V posledním kroku ke všem standardům a vzorku napipetujete 1,5 ml činidla
BCA, necháte minimálně 30 minut inkubovat. Během této doby máte dostatek času k zapnutí
všech potřebných komponent spektrofotometru a nastavení metody, jelikož inicializace přístroje
zabere minimálně 15 minut. Na závěr úlohy provedete samotné měření a výsledky vyhodnotíte.
MATERIÁL a CHEMIKÁLIE
Spektrofotometr Agilent 8453 vybavený automatickým podavačem (autosampler),
zkumavky kompatibilní s autosamplerem Agilent, automatické pipety, Reagent A, Reagent B,
hovězí sérový albumin (BSA, proteinové standardy od 0,1 – 2,0 mg/ml)
POSTUP
A. Příprava činidla
Připravte si pracovní roztok BCA (Working Reagent, WR) pro stanovení proteinové
koncentrace: 50 dílů Reagent A + 1 díl Reagent B. Pro stanovení pomocí autosampleru Agilent ve
zkumavkách je třeba 1,5 ml roztoku na jeden vzorek, na manuální stanovení v kyvetách postačí 1,0
ml roztoku. WR je stabilní několik dnů při laboratorní teplotě v uzavřené nádobě.
B. Příprava vzorků pro měření ve zkumavkách
1. Připravte si vhodné ředění vašich vzorků. Oblast linearity pro standardy BSA je v rámci
této metody 0,1 až 2,0 mg/ml. Připravte si tedy standardy o koncentracích 0,5; 1,0 a 1,5 mg/ml.
2. Odpipetujte 100 µl každého z vybraných standardů a z vašich vzorků do označené
zkumavky. Pro blank (na odečtení pozadí) pipetujte 100 µl vody.
3. Do každé zkumavky pipetujte 1,5 ml WR. Každou zkumavku dobře protřepejte na
vortexu a ponechte inkubovat při laboratorní teplotě po dobu minimálně 30 min (lépe inkubovat
45 až 60 min). Pro zvýšení citlivosti je rovněž možné inkubovat reakci 30 min při 60°C, za těchto
podmínek je ovšem snížena oblast linearity (asi 5-300 µg/ml proteinu).
50
C. Příprava spektrofotometru pro měření
1. Zapněte všechny moduly systému: spektrofotometr Agilent 8543 (levý dolní roh), pumpu
1FS (kolébka na předním panelu přístroje), autosampler Agilent (kolébka na zadní straně
přístroje vedle napájecího kabelu) a termostat Agilent 89090A (levý dolní roh). Teplota na
termostatu je pro toto měření nastavena na hodnotu 28°C.
2. Zapněte počítač a přihlaste se do systému (účet: amin, heslo: dabi).
3. Spusťte program (Instrument 1 Agilent Sys, operátor HPST, OK) a vyčkejte na
inicializaci přístroje.
4. Pro jednoduché stanovení koncentrace proteinů použijte metodu BCA_BASIC (File >
Load method > BCA_BASIC.M). Stanovení probíhá při vlnové délce 562 nm. Pro optimální hodnoty
stanovení ponechte přístroj před samotným měřením alespoň 15 min. zapnutý.
D. Kvantifikace vzorků ve zkumavkách za použití autosampleru
1. Naložte všechny zkumavky do autosampleru v následujícím pořadí: blank (WR+voda),
standard 1, standard 2, standard 3 … a následně všechny vaše vzorky. Pozice v autosampleru jsou
číslovány zleva doprava počínaje pozicí číslo jedna vlevo dole na prvním stojánku. Pro manuální
ovládání raménka autosampleru použijte ikonu zkumavky (klikněte na ikonu zkumavky a zvolte buď
Next position nebo Autosampler Control). V menu Autosampler Control lze přímo volit číslo
pozice pomocí zadání čísla pozice (Vial Number) a následně příkazu Go To…
2. Před tím, než provedete novou kalibraci, ověřte, zda tabulka standardů neobsahuje již
nějaké kalibrační hodnoty. Přepínání mezi tabulkou vzorků (Samples) a standardů (Standards) lze
provést pomocí příslušných nabídek pod ikonou kalibrační křivky. Vymazat tabulku standardů s
aktuálně požívanými hodnotami kalibrace lze provést pomocí příkazu Clear > Standards (podobně
lze vymazat i tabulku vzorků).
3. Znovu zkontrolujte správné řazení zkumavek standardů a vzorků a proveďte kontrolu
systému. Na pozici číslo jedna můžete otestovat měření pozadí (klikněte na nabídku Blank).
Jeden nástřik spotřebuje více než 1 ml roztoku; ověřte, že ve všech zkumavkách je dostatečné
množství roztoků. Při dlouhodobém měření odečítejte pozadí dostatečně často (nejméně jednou
za půl hodiny).
4. Spuštění sekvence měření se provádí z nabídky Automation (levý dolní roh). Vyplňte
požadované hodnoty v menu Automation. Save results to: název vašeho měření; Blank: First time
only; Standards: vyplňte tři zvolené hodnoty koncentrace BSA pro tvorbu kalibrační křivky;
Controls: použité kontroly ve vašem experimentu, pokud nějaké máte; Samples: maska pro
označení vzorků; Dilution: použité ředění (zadejte vaše ředění nebo ponechte nevyplněné);
Number of samples: DŮLEŽITÉ! Zde vyplňte počet vašich vzorků.
5. Spusťte sekvenci měření (Run Automation). Systém postupuje zleva doprava v pořadí
blank, standardy 1, 2 a 3, dále pak následují vaše vzorky v počtu uvedeném v nabídce Automation.
6. Systém provede automaticky vyhodnocení výsledků na základě vygenerované kalibrační
křivky. Jsou-li hodnoty kalibrace nevyhovující, lze provést novou, manuální kalibraci (předtím je
nutno vymazat současné hodnoty kalibrace, viz. výše) nebo zopakovat novou sekvenci měření
pomocí Automation.
7. Výsledky měření i kalibraci můžete uložit pomocí příslušných příkazů (File > Save >
Samples As… / Standards As… > …).
8. Na závěr vašeho měření promyjte systém vodou z připravené zkumavky, vypněte
program (neukládejte vaše změny do používané metody!) a postupně vypněte všechny moduly
systému.
51
Doporučená literatura:
Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.
Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.
Procházka, S. a kol.: Fyziologie rostlin, Academia Praha, 1998.
Voet, D. A Voet, J. G.: Biochemie, Victoria Publishing Praha, 1995.
52
Laboratorní cvičení č. 6
DESTILACE
Destilace je metoda užívaná k dělení a čištění směsi kapalin, které se navzájem liší bodem
varu. Všeobecně platí, že těkavější složky směsi přecházejí v páry snadněji, takže plynná fáze má
jiné složení než kapalná směs a destilát (kondenzát) vzniklý kondenzaci těchto par, který bude
bohatší na těkavější složku. Chceme-li dosáhnout dokonalého rozdělení směsi dvou kapalin jedinou
destilací v jednoduché aparatuře, musí se jejich body varu lišit alespoň o 50C a destilované látky
nesmějí vytvářet azeotropní směs (směs s konstantním bodem varu). Dle povahy kapalné směsi
volíme destilační metodu. Je-li kapalina znečištěna pouze malým množstvím těkavých látek, pak ji
čistíme jednoduchou destilací nebo pouhým odpařováním. Máme-li směs látek s velmi blízkými
body varu, pak používáme tzv. frakční destilaci (neboli rektifikaci). Je-li destilovaná látka
termicky málo stabilní a rozkládá se při nižší teplotě, než je její bod varu, pak jsme nucení použít
destilace vakuové. Destilace s vodní párou užíváme k oddělení těch látek, které těkají s vodní
párou při nižší teplotě než je jejich bod varu.
ODPAŘOVÁNÍ
Odpařování používáme tam, kde nemáme zájem o odpařené rozpouštědlo. Metodu provádíme
na porcelánové misce či v kádince. Odpařovací nádobu zahříváme buď na elektrické vodní lázni
(při odpařování látek s bodem varu do 100C), nebo kahanem přes síťku s azbestem (není-li
odpařovaná složka hořlavá). Při odpařování hořlavých látek volného plamene nikdy nepoužíváme a
z bezpečnostních důvodu těkavou složku raději oddestilujeme. Rychlost odpařování závisí na
teplotě (s rostoucí teplotou se zrychluje) a při bodu varu je nebezpečí, že rychle se vyvíjející
páry budou strhávat i zahušťovanou složku. Dále závisí na ploše povrchu kapaliny a na rychlosti
odtahu par z prostoru nad kapalinou.
D
B
C
A
Obrázek 20: Součásti destilační aparatury. A/ varná baňka, B/ Claisenův nadstavec, C/
chladič, D/ alonž.
DESTILACE ZA NORMÁLNÍHO TLAKU
Je to nejběžnější druh destilace a užíváme ji všude tam, kde kapalina přechází snadno
v páry při teplotě, za které se není třeba obávat rozkladu destilované látky. Destilační aparatura
(obr. 20) se skládá z varné baňky (nejčastěji se používá frakční baňka). Varnou baňku nevolíme
příliš velkou a plníme ji maximálně do 3/4 objemu. Uzavíráme ji přes Claisenův nádstavec vrtanou
zátkou, již prochází teploměr. Jelikož má při destilaci směsi vroucí kapalina obvykle vyšší bod
varu než kondenzát, je vhodnější neponořovat teploměr do kapaliny, nýbrž odečítat teplotu
odváděných par. Páry vysokovroucích látek (s bodem varu nad 150C) můžeme kondenzovat ve
vzdušném chladiči (obr. 21-1), v ostatních případech používáme vodní chladič Liebigův (obr. 21-2).
Ještě účinnější je chladič kuličkový (obr. 21-3) nebo spirálový (obr. 21-4), který musíme při
sestavování destilační aparatury postavit do šikmé polohy tak, aby se v něm nezdržoval
kondenzát. Na konci chladiče upevníme alonž, pomocí níž stéká kondenzát do jímací nádoby
(předloha). Velice výhodné jsou aparatury zábrusové, obzvláště při práci s agresivními látkami.
53
Obrázek 21: Chladiče - 1/vzdušný, 2/ Liebigův,
3/ kuličkový, 4/ spirálový.
1
2
3
4
Poznámka: V dokonale hladkých nádobách může
při zahřívání kapalin dojít k tzv. utajenému
varu. Je to metastabilní stav, který vznikne
přehřátím kapaliny o několik stupňů nad její bod
varu. Náhodný impuls pak vyvolává prudký var,
vzkypění a přetečení destilované směsi do
předlohy. Abychom zabránili vzniku utajeného
varu, vkládáme do varné baňky tzv. varná
tělíska (skleněné kuličky, úlomky polévaného
porcelánu, drcenou cihlu apod.).
VAKUOVÁ DESTILACE
Destilace za sníženého tlaku užíváme tehdy, chceme-li dělit složky z roztoku, v němž je
jedna složka při vyšších teplotách labilní. Abychom zabránili rozkladu, musíme při destilaci snížit
bod varu roztoku za použití vakua. Aparaturu pro destilaci za sníženého tlaku sestavujeme
obvykle z částí s normalizovanými zábrusy (obr. 22). Zvláště výhodné se jeví použití Claisenova
nástavce, který spojuje frakční baňku se zábrusovým chladičem a má nahoře dva otvory. Do
jednoho otvoru vkládáme zábrusový teploměr, do druhého skleněnou trubičku protaženou do
kapiláry, která zasahuje do destilované kapaliny. Význam kapiláry, která spojuje atmosféru
s destilovanou kapalinou je v tom, že se při destilaci udržuje konstantní vakuum a zároveň se
zajistí promíchávání vroucí kapaliny zaváděním mírného proudu vzduchu. Proud vzduchu
regulujeme kohoutem na horní části skleněné trubice, který může být nahrazen nasazením
gumové hadice s tlačkou. Kapilárou se také zabraňuje riziku utajeného varu, který je u vakuové
destilace daleko pravděpodobnější. Destilační baňku zahříváme vždy jen na vodní lázni nebo
topném hnízdě a nikdy nepoužíváme baňky s plochým dnem, které by nevydržely podtlak. Na
varnou baňku s Claisenovým nádstavcem je napojen chladič, který je ukončen vakuovou alonží
vedoucí destilát do předlohy. Alonž je napojena na zdroj vakua. Mezi předlohou a zdrojem vakua
se často zapojuje pojistná nádoba (promývačka) a manometr. Destilaci za sníženého tlaku
provádíme při tlaku 100 - 1000 Pa. Snížení tlaku vede ke snížení bodu varu kapalin. Var kapaliny
nastává, jak známo tehdy, když se tenze jejich par rovná atmosférickému tlaku, v tomto případě
tlaku v aparatuře. Použitím dobré vodní vývěvy je možno snížit bod varu kapaliny o 80-90C.
DESTILACE S VODNÍ PAROU
Podle Daltonova zákona je tlak nad směsí dvou nebo několika kapalin roven součtu
parciálních tlaků jednotlivých složek. Jelikož var kapaliny nastane v okamžiku, kdy tenze její páry
se rovná okolnímu – atmosférickému tlaku, je zřejmé, že bod varu takové směsi bude nižší než
body varu jednotlivých oddělených složek. Jako příklad uvedeme pro jednoduchost směs anilinu a
vody, která vře při 98C, když tenze vodní páry činí 9,42.104 Pa a tlak par anilinu je 7,07.103 Pa.
Bod varu samotného anilinu pak 184.4C. Destilace s vodní parou je tedy založena na využití
Daltonova zákona. Používá se hlavně v organické chemii. Tímto způsobem je totiž možno
předestilovat látky, které mají bod varu i vyšší než 200C při teplotách nižších než 100C a
uchránit je tak před nežádoucím rozkladem.
Obrázek 22: Vakuová destilace.
Při destilaci s vodní parou používáme aparatury sestavené dle obrázku 23. Aparatura se
skládá z vyvíječe vodní páry, jimž je varná baňka uzavřená 2x vrtanou zátkou. Jedním otvorem
prochází dlouhá skleněná trubice sahající až ke dnu nádoby. Je to tzv. pojistná trubice a jejím
úkolem je zabránit při náhlém poklesu tlaku ve vyvíječi nasátí kapaliny z destilační baňky. Podtlak
se vyrovná nasátím vzduchu pojistnou trubicí. Vodní pára pak probublává destilační baňkou,
kterou zahříváme souběžně s vyvíječem vodní páry. Destilační baňku většinou upevňujeme
vzhledem k ostatní aparatuře do šikmé polohy a to proto, aby kapalina, rozstřikována proudem
vodní páry, nevnikla do chladiče a neznečišťovala tak kondenzát.
H
B
E
D
F
C
A
G
Obrázek 23: Aparatura pro destilaci s vodní parou. A/ vyvíječ vodní páry, B/ pojistná trubice,
C/ destilační baňka, D/ Claisenův nádstavec E/ chladič, F/ alonž, G/ předloha, H/ místo pro
teploměr.
55
ÚKOL č. 12: Izolace hřebíčkové silice z hřebíčku destilací s vodní parou
Hřebíčková silice obsahuje vedle malých množství jiných látek 85 – 90% eugenolu a 9 –10%
acetyleugenolu. Tyto látky mají teploty varu 249 a 253C a jsou ve vodě jen velmi málo rozpustné.
Při teplotě varu vody však mají značnou tenzi páry a lze je proto z hřebíčku snadno vydestilovat
s vodní parou při teplotě nižší než 100C. Ze získané vodní emulze se silice vyextrahuje do
vhodného rozpouštědla. Oddestilováním rozpouštědla z extraktu lze získát čistou hřebíčkovou
silici.
Eugenol je fenolická látka obsažená hlavně v nezralých plodech rostlin čeledi Myrtaceae
jako je Pimento officinalis či Caryophyllum aromaticum u nás známých jako nové koření (jamajský
pepř) a hřebíček. Eugenol se používá v zubním lékařství jako lokální anestetikum. Působí také jako
aktivátor žaludečních trávicích enzymů a s tím také souvisí obliba těchto druhů koření téměř ve
všech světových kuchyních.
MATERIÁL
Třecí miska s tloučkem, topné hnízdo na 250 mL a 500 mL, vodní lázeň, stojany, svorky, baňky,
korkové zátky, skleněné trubice, chladiče, alonže, Erlenmaeyerovy baňky, kadiny, teploměr, dělicí
nálevka, odměrný válec, skleněné kuličky, hřebíček, hexan.
POSTUP
Sestavte destilační aparaturu pro destilaci s vodní párou dle obrázku 23. Obě baňky
umístěte do topných hnízd. Zábrusy dobře promažte silikonem. Vyvíječ vodní páry naplňte do 2/3
vodou a na jeho dno nezapomeňte dát skleněné kuličky (varné kamínky). Do trojhrdlé baňky
nasypte 10 gramů jemně rozdrceného a ve třecí misce rozetřeného hřebíčku a přilijte 100 mL
destilované vody. Zaváděcí trubičku z vyvíječe vodní páry zaveďte do trojhrdlé baňky. Mírným
proudem pusťte do chladiče vodu. Zapněte nejdříve vyhřívání vyvíječe vodních pár a až začnou
do destilační baňky unikat vodní páry spusťte i vyhřívání druhé baňky zhruba na polovinu
stupnice. Během destilace neustále kontrolujte aparaturu, případně regulujte teplotu vyhřívání.
Suspenzi silice s vodou jímejte do připravené předlohy. Z časových důvodu ukončete destilaci asi
po 1/2 hodině i v případě, že veškerá silice nebude z hřebíčku vydestilovaná.
Ze získané směsi vody a silice vyextrahujte silici hexanem. Předestilovanou směs nalijte do
dělící nálevky, přidejte k ní 15 mL hexanu a po uzavření nálevky zátkou obsah důkladně protřepte
(viz úloha č. 4 – Extrakce). Pozor na vnitřní přetlak, odstraníte ho otočením nálevky a otevřením
ventilu. Po důkladném protřepání vyčkejte až se v nálevce vytvoří rozhraní dvou vrstev. Spodní
vrstvu tj. vodu se zbytkem silice odlijte do kádinky. Roztok silice v hexanu (horní vrstva) pak
přelijte do SUCHÉ Erlenmayerovy baňky. I minimální množství vody způsobí zakalení silice po
oddestilování hexanu. Extrakci zopakujte ještě dvakrát vždy s novým podílem hexanu, který
přidáváte k vodné fázi. Jednotlivé podíly silice v hexanu spojte a oddestilujte rozpouštědlo.
Sestavte aparaturu pro destilaci za normálního tlaku. Roztok silice přelijte do malé
zábrusové baňky (100 mL), na kterou nasadíte Claisenův nadstavec s vodním chladičem. Baňku
zahřívejte opatrně na vodní lázni (vařič s hrncem). Během destilace je nutno regulovat teplotu
vodní lázně. Udržujte ji mezi 80 - 90C. Zároveň sledujte teplotu v destilační aparatuře. Jakmile
přestane hexan destilovat, destilaci zastavte a nechte aparaturu zchladnout. Mikropipetou
převeďte silici do předem odvážené mikrozkumavky a určete její objem a hmotnost.
Oddestilovaný hexan přelijte do láhve k tomu určené.
Pozor: Hexan je hořlavina I. třídy, nepoužívejte v blízkosti práce s ním otevřeného ohně.
Zabraňte, aby se dostala voda dovnitř topného hnízda. Pokud se tak stane okamžitě
odpojte hnízdo z elektrické sítě.
56
VYHODNOCENÍ
1) Určete výtěžek hřebíčkové silice a vypočtěte její hustotu.
2) Stanovte teplotu varu hexanu a srovnejte ji s tabulkovou hodnotou.
3) Zamyslete se nad tím, proč je výhodnější destilaci s vodní parou provádět výše popsaným a
provedeným způsobem, než destilovat danou látku společně s vodou v jedné baňce.
4) Do protokolu zakreslete vzorce eugenolu a acetyleugenolu a pokuste se odvodit jejich
systematické názvy.
Doporučená literatura:
Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.
Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
Mareček, A. a Růžička, A.: Laboratorní technika pro nechemické obory, Vydavatelství MU Brno,
1997
Chemické analytické tabulky
57
Laboratorní cvičení č. 7
PRÁCE S PLYNY A SKLEM
V současné době jsou téměř všechny plyny dostupné komerčně v tlakových lahvích. Občas
si však potřebujeme v laboratoři připravit malé množství plynu sami. Nejjednodušším zařízením
k tomuto účelu je Oswaldova baňka (obr. 24). Její princip je patrný z obrázku: k tenkostěnné
skleněné baňce je přes korkovou zátku připojena dělící, popř. klasická nálevka. Na dno baňky
dáváme tuhou látku, případně suspenzi s vodou, ke které z dělící nálevky přikapáváme vhodnou
kapalinu, se kterou tuhá látka reaguje za vzniku žádaného plynného produktu. Uvolněný plyn se
odvádí trubičkou. Dokonalejším zařízením je Kippův přístroj (obr. 25), v němž se při přerušení
odběru plynu vývoj plynu samovolně zastaví. Do střední části C se na dírkovanou kaučukovou
destičku vloží tuhá kusovitá látka. Do horní části D nalijeme tolik kyseliny, aby zaplnila celou
spodní část a dostala se do styku s tuhou látkou. V tomto okamžiku se začne uvolňovat plyn. Je-li
kohoutek B uzavřený, vzniklý plyn vytlačí kapalinu z části A, čímž přeruší další vývoj plynu.
Kohoutkem je tedy možno vývoj plynu regulovat. Horní rezervoár D uzavíráme zátkou,
zamezujeme tak unikání nežádoucích plynů do ovzduší.
D
C
Obrázek 24: Oswaldova baňka.
Obrázek 25: Kippův přístroj A/ spodní prostor pro
kapalinu, B/ odvaděč plynu, C/ střední prostor pro pevnou
látku, D/ zásobník na kapalnou složku reakce.
Laboratorně lze běžné plyny připravit následovně:
1) Reakcí tuhé látky s kapalinou
CO2:
kusový mramor + 4 M kyselina chlorovodíková
CaCO3 + 2 HCl  CaCl2 + H2O + CO2
H2S:
kusový sulfid železnatý + 3 M kyselina chlorovodíková
FeS + 2 HCl  FeCl2 + H2S
H2:
granulový zinek + 4 M kyselina chlorovodíková
Zn + 2 HCl  ZnCl2 + H2
58
Cl2:
manganistan draselný + konc. kyselina chlorovodíková
2 KMnO4 + 16 HCl  2 KCl + 2 MnCl2 + 8 H2O + 5 Cl2
oxid manganičitý + konc. kyselina chlorovodíková
MnO2 + 4 HCl  MnCl2 + 2 H2O + Cl2
chlorové vápno + konc. kyselina chlorovodíková
ClOCl2 + 2 HCl  CaCl2 + H2O + Cl2
SO2:
měď + konc. kyselina sírová
Cu + 2 H2SO4  CuSO4 + H2O + SO2
disiřičitan draselný + 2 M kyselina sírová
K2S2O5 + H2SO4  K2SO4 + H2O + 2 SO2
C2H2: karbid vapenatý + voda
CaC2 + 2 H2O  Ca(OH)2 + C2H2
O2:
katalytický rozklad 30% peroxidu vodíku účinkem burelu
MnO
2 H2O2 
2  2 H2O + O2
HCl:
chlorid sodný + konc. kyselina sírová
2 NaCl + H2SO4  Na2SO4 + 2 HCl
HN3:
chlorid amonný + 50% hydroxid amonný
NH4Cl + KOH  KCl + H2O + NH3
HBr:
bromid sodný + 85% kyselina fosforečná
3 NaBr + H3PO4  Na3PO4 + 3 HBr
2) Reakcí dvou kapalin
O2:
15% peroxid vodíku + nasycený roztok manganistanu draselného v 1 M kys. sírové
2 KMnO4 + 5 H2O2 + 4 H2SO4  2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O + 5 O2
SO2:
nasycený roztok hydrogensiřičitanu sodného + 3 M kyselina sírová
NaHSO3 + H2SO4  NaHSO4 + H2O + SO2
CO:
dehydratací kyseliny mravenčí účinkem konc. kyseliny sírové
H SO
2
HCOOH 
4  H2O + CO
CO2:
nasycený roztok hydrogenuhličitanu draselného + 3 M kyselina sírová
KHCO3 + H2SO4  KHSO4 + H2O + CO2
HCl:
dehydratací kyseliny chlorovodíkové účinkem konc. kyseliny sírové
N2:
10% roztok chloridu amonného + 10% roztok dusitanu sodného
NH4Cl + NaNO2  NaCl + 2 H2O + N2
59
3) Zahříváním tuhých látek
t
CO2:
2 NaHCO3 
 Na2CO3 + H2O + CO2
O2:
2 KClO3 2  2 KCl + 3 O2
N2O:
NH4NO3 
 2 H2O + N2O
NO2:
2 Pb(NO3)2 
 2 PbO + 4 NO2 + O2
NH3:
CaO + 2 NH4Cl 
 CaCl2 + H2O + 2 NH3
H2S:
zahříváním směsi parafínu, síry a kaolínu (Al2O3)
t ,MnO
t
t
t
4) Zahřívaním kapalin
NH3:
konc. roztok amoniaku
HCl:
konc. kyselina chlorovodíková
Většina laboratorně připravených plynů, stejně jako plynů odebíraných z lahví, není zcela
čistá a suchá. Sušení a čištění plynů provádíme zpravidla v promývačce, U-trubicích a sušících
válcích. Absorpční prostředky pro jednotlivé plyny uvádí tabulka 5:
PLYN
Vodík
PŘÍMĚSI
LÁTKY ZACHYCUJÍCÍ
PŘIMĚSI
AsH3, PH3
KMnO4 , KOH
H2O
konc. H2SO4
Amoniak
H2O
CaO, KOH
Dusík
O2
alkalický roztok pyrogalolu
Různé
CO2, H2S, SO2
25% roztok KOH
H2O
P2O5, silikagel, bezvodý CaCl2
Cl2
roztok Na2S2O3
Tabulka 5: Absorpční prostředky používané pro čištění laboratorně připravených plynů.
PLYNY V TLAKOVÝCH LAHVÍCH
Pro použití ve větších množstvích se plyny do laboratoří dodávají v ocelových lahvích. Plyny
obtížně zkapalnitelné (kyslík, vodík, dusík, vzduch) jsou v nich stlačeny na vysoký tlak až 1500
MPa, plyny snáze zkapalnitelné (chlor, amoniak, SO2, CO2) jsou v ocelových láhvích pod tlakem
daleko nižším. Některé plyny se z bezpečnostních důvodu nedají komprimovat na vysoký tlak.
Příkladem může být acetylen, který se proto dodává v ocelových láhvích vyplněných porézní
hmotou nasáklou acetonem, ve kterém se acetylen dobře rozpouští. Obsah láhve je označen
barevným pruhem pod hrdlem láhve a kromě toho musí být technické údaje o láhvi blízko pod
hrdlem vyraženy.
60
Přehled barevných označení tlakových láhví:
modrá……………..…kyslík
zelená……………….dusík
červená………….…vodík
stříbrošedá……..vzduch
bílá………………….…acetylen
žlutá………………………..chlor
fialová..……………….….amoniak
černá…..………………....oxid uhličitý
perlově šedá…………..oxid siřičitý
pastelově zelená…..oxid dusný
Kromě barevného označení jsou ventily k láhvím s hořlavými plyny opatřeny levotočivým
závitem, ventily k láhvím s nehořlavými plyny mají závit pravotočivý. Ocelové láhve je nutno
chránit před zbytečným zahříváním a před nárazem, kdy by skryté vady materiálu a koroze oceli
mohly způsobit explozi. V laboratoři je proto nutné uložit láhve do speciálního stojanu nebo
připoutat řetězem k pevné opoře.
Odběr plynů z láhví můžeme provádět pouze přes redukční ventily různých typů. Pro plyny
dodávané pod vysokým tlakem, používáme nejčastěji redukční ventil zobrazený na obrázku 26.
Redukční ventil našroubujeme na vývod láhve pomocí matice. Těsnící kroužek nesmí být
poškozený, aby mohl dokonale těsnit. Dříve než otevřeme ventil na láhvi, uzavřeme na doraz
uzavírací ventil a odšroubujeme otáčením doleva regulační šroub tak, abychom necítili tlak
pružiny. Po otevření ventilu na láhvi ukáže manometr vyžadovaný tlak plynu v láhvi. Zašroubováním
šroubu naregulujeme vyžadovaný tlak na manometru. Láhev je takto připravená k odběru plynu.
Pomalým otáčením uzavíracího ventilu nastavíme vyžadovaný tlak proudu plynu, přičemž tlak
odebíraného plynu se samovolně reguluje prohýbáním membrány a dosednutím čepu do ložiska. Do
redukční komory zasahuje pojistný ventil, kterým unikne plyn, když se redukční zařízení pokazí.
Redukční ventily, zejména na kyslík, se nesmí nikdy z bezpečnostních důvodů mazat organickými
mazadly a ani těsnící složky nesmějí být z organických látek. Užívají se proto kroužky azbestové
a olověné.
Obrázek 26: Redukční ventil.
K zachycování a krátkodobému skladování plynů používáme tzv. plynojemy s uzavíracími
kapalinami. Nejjednodušším zařízením je zkumavka nebo válec naplněný vodou a ponořený dnem
nahoru do větší nádoby s vodou. Plyn zavádíme do zkumavky ohnutou trubičkou. Je-li zkumavka
kalibrována, pak mluvíme o tzv. eudiometru (obr. 27), jehož se užívá ke stanovení objemu
vzniklého plynu. Větší množství plynu uchováváme ve skleněných nebo kovových plynojemech.
Jednoduchý plynojem představují dvě láhve, opatřené dole tubusem a navzájem spojené pryžovou
61
hadicí. V jedné láhvi je v hrdle pryžová zátka s trojcestným kohoutem. Toto zařízení umožňuje
nasávání plynu při plnění a zároveň nastavení libovolného přetlaku při odběru plynu. Plyny
nasáváme tak, že láhev s trojcestným kohoutem naplníme zcela uzavírací kapalinou. Pak ji pomocí
trojcestného kohoutu spojíme s prostorem, v němž se vyvíjí plyn. Jakmile prázdnou láhev snížíme,
začne se plnit uzavírací kapalinou, která do ní protéká z láhve opatřené trojcestným kohoutem.
Tím nad kapalinou jímáme plyn, který se nasává do prostoru, v němž původně byla kapalina. Po
uzavření kohoutu můžeme plyn nad kapalinou uchovávat. Chceme-li plyn odebírat, spojíme
nastavením trojcestného kohoutu láhev s prostorem, kam má být plyn transportován a druhou
láhev zvedneme nad hladinu láhve s plynem.
ÚKOL č. 13: Práce se sklem a korkem
Naučte se řezat a otavovat skleněné trubičky, ohýbat je, vytahovat z nich kapiláry a
zatavovat jejich konce.
Skleněné trubice nebo tyčinky se při řezání položí na stůl a nožem na sklo nebo jemným
pilníkem se udělá asi na polovinu obvodu vryp. Trubice se uchopí oběma rukama co nejblíže vrypu
tak, aby byly palce opřeny do trubice na opačné straně vrypu. Mírným tahem a současným tlakem
se trubice rozlomí. Nedá-li se trubice snadno rozlomit, je nutné vryp prohloubit, neboť by
trubice mohla prasknout nepravidelně. Tlustostěnné trubice a trubice o velkém průměru se řežou
tak, že se udělá vryp po celém obvodu trubice a na rysku se přiloží za stalého pomalého otáčení
silný rozžhavený drát ohnutý do půlkruhu. Ostré hrany trubic je třeba hladce otavit. Zamezí se
tak zbytečným úrazům pořezáním, zároveň je tím usnadněno vsazování trubic do pryžových hadic
nebo zátek. Konec trubice se otáčí a zahřívá v plameni tak dlouho, až sklo začne měknout, což se
projeví jasně žlutou barvou plamene. Pozor, při delším zahřívání by se konec trubice mohl zúžit a
nakonec by se úplně uzavřel.
Při ohýbání trubice je důležité rovnoměrné prohřátí trubice po celé délce ohybu. Trubici je
třeba držet v plameni podélně a stále ji otáčet a posouvat, aby se dosáhlo rovnoměrného ohřevu.
Zahřívá se tak dlouho, až se sklo začne vlastní váhou ohýbat. Po vytažení trubice z plamene je
nutno ji ihned ohnout do požadovaného tvaru a sečkat, až sklo dostatečně ztuhne. Plného tvaru
ohnutí lze dosáhnout, když se během ohýbání do trubice mírně fouká při utěsnění druhého konce.
Při vytahování kapilár je opět nutné důkladné prohřátí trubice v délce zhruba 6 cm. Když
sklo dostatečně změkne, stlačí se oba konce trubice mírně k sobě, aby se na nažhaveném úseku
nahromadilo více skloviny. Po vyjmutí trubice z plamene se ihned rychlým tahem vytáhne kapilára
do požadované délky a šířky. Po ochlazení skla se kapilára vylomí ze zbytku trubice, popř. odřízne
nožem na sklo. Konec kapiláry lze zatavit krátkým podržením v plameni.
Skleněné trubice se mohou spojovat stavováním jen v případě, jsou-li ze stejného skla nebo
ze skla podobných vlastností. Při spojování trubic stejného průměru je postup takový, že se jedna
z trubic na jednom konci zazátkuje a volné přilehlé konce trubic se protaví v plameni. Mimo
plamen se trubice přiloží rozžhavenými konci k sobě a za stálého otáčení se lehce stlačí. Trubice
se musí dokonale stavit, a spojení musí být bez nejmenších otvorů. Nahromaděné sklo ve sváru se
vyrovná foukáním po předchozím protavení, do otevřeného konce trubice. Při stavování trubic
nestejného průměru je potřeba širší trubici vytažením zúžit na průměr menší trubice.
Na vrtání otvorů do korkových a gumových zátek se užívá korkovrtů, což jsou tenkostěnné
mosazné trubice na jednom konci naostřené. Korková zátka se nejprve změkčí ponořením na
několik minut do vařící vody. Pro vrtání se vybírá vždy korkovrt s o něco menším průměrem než má
trubička, která se bude do otvoru vsazovat. Zátku je třeba položit na tvrdou podložku a vrtat
kolmo k ploše zátky šroubovitým pohybem. Po provrtání zátky se vyvrtaná hmota odstraní
62
z korkovrtu tyčinkou a korkovrt se vytáhne. Trubičky se do otvorů vsouvají šroubovitým
pohybem. Trubičku je lépe držet co nejblíže zátce a z bezpečnostních důvodů nejlépe v hadříku.
MATERIÁL
Skleněná trubice o průměru 6 mm s tenkou stěnou, skleněná trubice o průměru 6 mm s tlustou
stěnou, nůž na sklo, podložka, hořák, korková zátka, korkovrt, gumová hadice.
POSTUP
Podle přiložených materiálů se seznamte se základní charakteristikou práce s chemickým
sklem a práci s korkovrtem. Naučte se řezat a otavovat skleněné trubičky, ohýbat je, vytahovat
z nich kapiláry a zatavovat jejich konce. Pokuste se o vyfouknutí baničky.
Na závěr využijte dovedností, které jste se naučili. Sestavte aparaturu dle obrázku 27,
kterou budete potřebovat pro následující úkol. Využijte skleněné trubice se širší stěnou,
korkovou zátku, do které pomocí korkovrtu vyvrtáte dva otvory (jeden pro dělící nálevku a druhý
pro připravenou odvodovou trubici). Pro lehčí manipulaci s aparaturou tuto trubici připravte
dvoudílnou a díly propojte gumovou hadicí.
Obrázek 27: Aparatura pro měření objemů plynu uvolněného chemickou reakcí (eudiometr).
ÚKOL č. 14: Určete procentuální obsah uhličitanu vápenatého ve vaječné skořápce jeho
rozložením na oxid uhličitý.
Někteří živočichové a rostliny jsou schopní akumulovat ve svých tělech potravou a živinami
přijímaný vápník ve formě uhličitanu. Tato ryze anorganická látka pak díky své pevnosti a tvrdosti
plní především roli ochrannou a je vylučována na povrch, např. někteří zástupci měkkýšů nebo u
vejcorodých obratlovců chrání vajíčka, kde je hlavní složkou jejich obalů. O přítomnosti
uhličitanu vápenatého ve vaječné skořápce se dá přesvědčit jejím rozkladem koncentrovanou
kyselinou chlorovodíkovou a jímáním uvolněného oxidu uhličitého dle následující rovnice:
CaCO3 + 2 HCl  CO2 + H2O + CaCl2
Plyn uvolněný během reakce se může jímat pomocí jednoduše zhotoveného eudiometru a
z objemu lze vypočítat na základě Avogadrova zákona množství původního CaCO3.
63
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
Dělící nálevka, Erlenmayerova baňka, korková zátka s odvodovou trubicí, skleněná vana, odměrný
válec bez podstavce, stojan, svorka, sifónová láhev s bombičkami plněnými CO2, váženka, třecí
miska s tloučkem, teploměr, předvážky, analytické váhy, vaječné skořápky, parafilm, konc. HCl a
CaCO3.
POSTUP
Ve třecí misce rozetřete o něco více než 1 gram vaječné skořápky zbavené organických
složek (bílek). Na analytických vahách odvažte přesně 1 g rozmělněné skořápky a nasypte na dno
suché Erlenmayerovy baňky. Poté sestavte a pomocí parafilmu neprodyšně uzavřete aparaturu
sestavenou v předchozí úloze. Vanu naplňte pomocí sifónové láhve vodou sycenou CO2, tím
zabráníte možnému rozpouštění uvolňovaného CO2 během vlastního pokusu ve vodě skleněné vany.
Skleněný válec eudiometru naplňte sycenou vodou. Nejlépe se to dělá tak, že se celý válec
položí do vany s vodou a pak se opatrně vyzvedne, aniž se jeho hrdlo dostane nad hladinu. Pomocí
volné skleněné trubice opatrně vžeňte pod hrdlo válce bubliny tak, aby se hladina vody ve válci
posunula přesně na dobře zapamatovatelnou rysku stupnice (100 mL). Poté vsuňte do válce
odvodovou trubici z aparatury.
Do uzavřené dělící nálevky eudiometru opatrně nalijte koncentrovanou HCl. Celý pokus
zahájíte opatrným vypouštěním HCl na vzorek. Dbáte přitom na to, aby vám uvolňovaný CO 2
neprobublával přes kyselinu v dělící nálevce (kohout otvírejte vždy jen krátce a po přídavku ihned
zavírejte). Po skončení vývoje plynu odečtěte jeho objem na stupnici eudiometru a ten použijte
pro výpočet.
Pro kontrolu proveďte celý pokus znovu s přesně odváženým 1 gramem čistého CaCO3.
Poznámka: Rozklad a vývoj CO2 u skořápky je na rozdíl od čistého CaCO3 zpomalen napěněním
vzorku, proto vyčkejte až do rozložení veškerého vzorku (15-20 min).
VYHODNOCENÍ
Avogadrův zákon praví, že za normálních podmínek (273,15 K a 101,3 kPa) objem jednoho
molu plynu zaujímá 22,414 litrů. Objem CO2 uvolněný při pokusu se proto musí přepočíst na tyto
podmínky, tj. zjistit objem Vo jaký by plyn zaujímal při 273,15 K (OC) a tlaku 101,3 kPa. Při
výpočtu vycházejte ze stavové rovnice:
p.V/T = p0.V0/T0
kde veličiny se symbolem 0 udávají hodnotu za standardních podmínek. Tlak v laboratoři je nutno
korigovat na tensi par uzavírající kapaliny paq, která se liší s teplotou a musí se od atmosférického
tlaku odečíst. Zjistíte ji z následující tabulky:
Teplota (C)
15
16
17
18
19
20
21
22
Tenze par (kPa)
1,705
1,817
1,937
2,062
2,197
2,337
2,486
2,642
Teplota (C)
23
24
25
26
27
28
29
30
Tabulka 6: Korekce atmosférického tlaku v laboratoři.
64
Tenze par (kPa)
2,809
2,982
3,167
3,360
3,565
3,778
4,005
4,241
Po úpravě stavové rovnice dostáváte:
V0 = (p – paq).V.T0 / p0.T
Nezapomeňte, že teplotu T i T0 je nutno uvádět v Kelvinech, T získáte připočtením 273,15
k teplotě ve stupních Celsia. Současný atmosférický tlak v laboratoři vám sdělí vedoucí cvičení.
K výpočtu množství původního CaCO3 je pak nutné si uvědomit, že reakce probíhá
stechiometricky podle koeficientů (z jednoho molu CaCO3 se uvolní jeden mol CO2), a dále že
jeden mol je látkové množství soustavy, která obsahuje právě tolik částic (atomů, molekul, iontů
či jiných částic), kolik je atomů v 0,012 kg uhlíku C12. Jeho hmotnost je číselně rovna poměrné
molekulové (atomové, iontové) hmotnosti uvažované látky.
Určete procentuální obsah CaCO3 ve vaječné skořápce a správnost výpočtu i měření si
ověřte výpočtem hmotnosti CaCO3, přes CO2 uvolněný jeho rozkladem z přesně naváženého 1
gramu CaCO3. Získané hodnoty komentujte a vyhodnoťte přesnost vašeho pokusu.
Doporučená literatura:
Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.
Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
Pazdera, P. a Potáček, M.: Laboratorní cvičení z organické chemie, Vydavatelství UJEP Brno,
1984.
65
Laboratorní cvičení č. 8
SUŠENÍ, CHLAZENÍ A LYOFILIZACE
Sušením se rozumí proces, kdy zbavujeme látku pevnou, kapalnou či plynnou vody nebo jiné
nežádoucí kapaliny a jejích par. V praxi se nejčastěji setkáváme s odstraňováním vody, ve které
většina chemických reakcí probíhá. A nebo naopak je třeba vodu odstranit z reakční směsi u
reakcí, kde i v malém množství může průběh reakce nepříznivě ovlivnit. Vlhkost a vodu lze
odstraňovat jednak fyzikálně – sušením v proudu horkého vzduchu, zahříváním nebo chemicky vhodným dehydratačním činidlem. Podle způsobu jak vážou vodu lze tato činidla rozdělit do
následujících skupin:
-
látky hygroskopické, které snadno vytvářejí hydráty, patří sem bezvodé soli a jejich nižší
hydráty (např. K2CO3, Na2SO4, KOH)
-
látky odstraňující vodu ze směsi tím, že s ní chemicky reagují (P4O10, BaO, CaO, Na, B2O5)
-
látky poutající vodu fyzikální adsorpcí (silikagel, Al2O3, některé polymery)
SUŠENÍ PLYNŮ
Plyny sušíme v promývačkách (obr. 27), sušících věžích (obr. 28) a U-trubicích (obr. 29), do
kterých umísťujeme sušící činidlo - pevnou látku (do sušících věží a U-trubic) a hygroskopické
kapaliny (do promývaček). Stupeň vysušení je závislý na tloušťce vrstvy sušícího činidla a dobrém
styku plynu s ním. Toho můžeme dosáhnout vložením frity do promývačky a propojením několika
promývaček za sebou. Sušící věže a U-trubice plníme tak, aby hmota kladla plynu všude stejný
odpor a plyn případně neprocházel kanálky v ní. Promývačky plníme do 1/3 jejich objemu.
Obrázek 27: Promývačky.
Obrázek 28: Sušící věž.
Při výběru sušidla je nutno brát v úvahu, zda je plyn inertní nebo zda má bazický či kyselý
charakter. Bazické plyny, jako např. amoniak, nejčastěji sušíme pevnými hydroxidy. Kyselé (H2S,
HBr) a inertní (N2) pak oxidem fosforečným, silikagelem či nejúčinněji kyselinou sírovou (tab. 7)
Velmi účinným způsobem sušení plynu je jeho vymrazení. Provádí se tak, že plyn vedeme U-trubicí
ponořenou do chladící směsi (viz níže).
66
Někdy je důležité zabránit vzdušné vlhkosti přístupu do aparatury (destilace). To
provádíme napojením trubice plněné bezvodým chloridem vápenatým na konec aparatury.
Obrázek 29: U-trubice
Plyn
čištění
Sušení
Identifikace
Vodík
roztok KMnO4
konc. H2SO4, P4O10
pevný KOH
CaCl2
hoří, tvoří výbušnou směs
se vzduchem
Kyslík
Dusík
alkal.roztok
pyrogallolu
konc. H2SO4, P4O10
podporuje hoření,
CaCl2
žhnoucí špejle vzplane
konc. H2SO4, P4O10
nepodporuje hoření,
CaCl2
žhnoucí špejle zhasne
CaO. KOH, NaOH
pH papírkem, konc.HCl
konc. H2SO4, P4O10, CaCl2
Ba(OH)2, Ca(OH)2
konc. H2SO4, P4O10
roztok K2Cr2O7,
CaCl2
pH papírek
CaCl2
roztok olovnaté soli
Amoniak
oxid uhličitý
roztok NaHCO3
oxid siřičitý
sulfan
voda
pH papírek
chlor
roztok KMnO4
konc. H2SO4,
jodoškrobový papírek,
voda
CaCl2
barva žlutozelená
konc. H2SO4 , CaCl2
pH papírek
chlorovodík
Tabulka 7: Sušení a čištění plynů.
SUŠENÍ KAPALIN
Kapalné látky se suší v uzavřených lahvích či dělících nálevkách přímým stykem se sušícím
činidlem za občasného protřepávání. Aby bylo sušení účinné je třeba ho provádět i několik hodin.
Používá se jen přiměřené množství sušidla, aby nedocházelo ke zbytečným ztrátám sušené
kapaliny zachycením časti kapaliny v sušidle. Podmínkou samozřejmě je, aby sušidlo s kapalinou
chemicky nereagovalo a nerozpouštělo se v ní. Často se používají vápenaté soli CaCl2, CaCO3 a
bezvodá skalice modrá či uhličitan sodný. Bazické kapaliny, jako třeba pyridin, se suší hydroxidem
sodným, draselným a barnatým. Organická rozpouštědla se dobře zbavují vody reakcí
s alkalickými kovy (pozor na nebezpečí výbuchu při velkém obsahu vody), P4O10, nebo
Grinardovými sloučeninami. Netěkavé kapaliny se nejlépe vysuší azeotropní destilací. V posledních
67
letech se s oblibou začaly na vysoušení organických rozpouštědel používat syntetické
křemičitany.
SUŠENÍ PEVNÝCH LÁTEK
Ve velké většině případů je sušení pevných látek založeno na volném odpařování vlhkosti. To
může probíhat za normální nebo zvýšené teploty, ve vakuu nebo za normálního tlaku. Před
počátkem sušení je třeba vždy odstranit co největší množství vody mechanicky – dokonalým
odsátím, vylisováním apod. Nejjednodušším způsobem sušení, je rozprostření sušené látky v tenké
vrstvě na filtračním papíru či porcelánové misce na volném vzduchu. Je možné provést sušení za
zvýšené teploty v sušárně nebo pod infralampou. Filtrační papír však snáší teploty jen do 100ºC,
při vyšších teplotách je třeba použít vhodnější podložku. V sušárně nikdy nesmějí být sušené látky
těkavé nebo látky se zbytky těkavých hořlavých rozpouštědel, jejichž páry by mohly se vzduchem
vytvořit třaskavou směs. Pro sušení při teplotách vyšších než 200ºC se používají muflové pece
nebo sušící pícky.
Obrázek 30: Exsikátory:
klasický
vakuový
Chemickou cestou je možno vysoušet
různými dehydratačními činidly. Vysoušení
obvykle provádíme v uzavřených nádobách –
exsikátorech, které mohou být i pod vakuem
(obr. 30). Rychlejšího vysoušení malých
množství látek lze dosáhnout v tzv.
vysoušecích
pistolích
(Abderhaldenův
přístroj) rovněž napojených na vakuum (obr.
31). Látka (A) je zde vyhřívána párami vroucí
kapaliny o vhodném bodu varu (C), kdežto
sušidlo je ve zvláštní baňce mimo vyhřívaný
prostor
(B).
Nejběžnější
vysoušecí
prostředky používané v exsikátorech jsou
shrnuty v tabulce 8. Kyselinu sírovou a oxid
fosforečný nenaléváme přímo na dno
exsikátoru, ale zvlhčíme kapalinou skleněné
kuličky a tím zvětšíme absorpční povrch.
A
B
C
Obrázek 31: Abderhaldenův přístroj.
68
Sušidlo
bezv. CuSO4
98% H2SO4
bezv. CaCl2
CaO
Mg(ClO4)2.3H2O
silikagel
100% H2SO4
KOH
bezv. Mg(ClO4)2
P4O10
zbylé mg H2O na litr sušeného vzduchu při 25ºC
1,4
0,3
0,25 – 0,14
0,2
0,031
0,02
0,003
0,002
0,0005
0,000025
Tabulka 8: Sušidla vhodná pro použití v exsikátorech a jejich účinnost.
CHLAZENÍ
V chemické laboratoři se velmi často setkáváme s chlazením. Chlazení hraje důležitou roli
při krystalizačních pochodech, při destilaci látek s nízkou teplotou bodu varu. Chladit musíme
silně exotermické reakce.
Při izolacích biomolekul, u nichž je nutné zachovat jejich biologickou funkci (enzymová
aktivita) je třeba celý proces izolace provádět při teplotě okolo 0ºC. Tím zabraňujeme denaturaci
proteinů, která in vitro nastává již při teplotách nad 4ºC. Ve velkých biochemických ústavech
k tomuto účelu slouží celé speciální chladící místnosti, tzv. „cold roomy“. V našich podmínkách
můžeme chlazení při izolaci dosáhnout použitím misek s drceným ledem, popř. provádět nenáročné
úkony (dialýza) v ledničkách (viz. lab. cvičení č. 3).
K dlouhodobému uchovávání mnohých chemikálií a
biologického
materiálu
je
třeba
snížené
teploty.
V biochemické laboratoři proto velice často narazíme na
lednice a mrazící boxy vyhrazené k tomu účelu. Pro uchovávání
vzorku RNA a kompetentních bakteriálních řetězců je pak
nezbytný hlubokomrazící box s teplotou -80ºC. Případně se
mohou tyto vzorky uchovávat v Dewarových nádobách
s tekutým dusíkem (-196ºC, obr. 32). Tekutý dusík se také
používá na rozrušování a snadnější homogenizaci biologického
materiálu. Dewarovy nádoby mají dvojité stěny mezi nimiž je
vakuum. Stěny bývají většinou postříbřeny, aby docházelo
Obrázek 32: Dewarova nádoba.
k menším ztrátám sáláním. Chlazení kapalným vzduchem se
Průřez a celkový pohled.
moc často nepoužívá (-180ºC), jelikož při manipulaci s ním
hrozí nebezpečí exploze.
Nejčastěji se však setkáváme s chlazením vodou. Běžná vodovodní voda mívá teplotu kolem
12ºC a pomocí různých průtokových systémů (chladič) můžeme dosáhnout jejího rovnoměrného
proudění kolem chlazených nádob. Účinnějšího chlazení než je chlazení drceným ledem, lze
zajistit chladícími směsmi, což jsou směsi drceného ledu s elektrolytem. Při přípravě směsi je
třeba dbát na dobré promísení obou složek a na to, aby byl zabezpečen dokonalý styk chlazeného
povrchu s chladícím prostředím. Směsi NaCl s ledem (1:3) lze dosáhnout teploty -21ºC.
Nejúčinnější je pak směs CaCl2.6H2O (3:2) s teplotou -49ºC. Dalším poměrně snadno dostupným
69
chladícím prostředkem je pevný oxid uhličitý – suchý led. Používá se ho nejčastěji ve směsi
s různými nízkotuhnoucími organickými rozpouštědly, ve kterých se rozpouští a která ochlazuje
často na teploty nižší, než je jeho bod sublimace. Unáší-li plynný oxid uhličitý s sebou páry
těkavého rozpouštědla směs se dále ochlazuje v důsledku odpařování kapaliny. Použitím
následujících rozpouštědel s pevným CO2 docílíme těchto teplot:
ethylenglykol
chloroform
aceton
ether
absolutní ethanol
-15ºC
-77ºC
-86ºC
-90ºC
-100ºC
LYOFILIZACE – MRAZOVÁ SUBLIMACE
Lyofilizace je jedním z nejšetrnějších způsobu odstraňování vody z vodných roztoků.
Používá se především k zakoncentrovávání roztoků biologicky aktivních látek, které jsou náchylné
na vyšší teploty a nemohou být zakoncentrovány klasickými způsoby (destilace, odpařování na
vakuové rotační odparce). Podstatou lyofilizace je odsublimování vody ze zamraženého vzorku
pod vakuem. Vakuum by mělo být silné okolo 1-3 kPa. Lyofilizovat se dají pouze vodné roztoky
látek. Přítomnost organických rozpouštědel je nežádoucí, protože snižuji teplotu tuhnutí vody a
zvyšují riziko roztopení vzorku během lyofilizace. Nedostatečné zmrazení vzorku a jeho
roztopení během lyofilizace se projevuje napěněním a může způsobit denaturaci nativního
proteinu (ztráta enzymové aktivity). Vzorek před lyofilizací je nutno odsolit, jelikož se po jeho
zakoncentrování (odstranění většího podílu vody) zvedne koncentrace soli nad mez rozpustnosti.
Zvýšená pozornost by se měla také věnovat lyofilizaci tlumivých roztoků. Rozdílná krystalizace
solí ve vícesložkových pufrech může zapříčinit značné posuny hodnoty pH a způsobit tak opět
denaturaci proteinu.
Na lyofilizaci větších objemů se používají skleněné nádoby, které vydrží zamrazení na
­70C. Menší objemy lze zamrazovat a lyofilizovat přímo v plastových mikrozkumavkách. Ústí
nádoby, ve které se nachází vzorek, je třeba při lyofilizaci zakrýt porézním materiálem, jelikož
lyofilizovaný produkt je velmi lehký a prachovitý a mohl by ho proud vodní páry strhnout do
kondenzátoru. Vzorky se předem vychlazují buď několikahodinovým zamrazením
v hlubokomrazících boxech (-80C), nebo umístěním do chladící lázně zhotovené z pevného CO2 a
acetonu. Mikrozkumavky se vzorkem mohou být zamraženy přímo krátkým ponořením do
kapalného dusíku. Před začátkem vlastní lyofilizace je třeba prostor pro kondenzaci vodních par
dokonale vychladit. Před koncem lyofilizace se do systému pomalu vpouští vzduch a po zrušení
vakua se odeberou vzorky a vypne vývěva. Kdyby se vývěva vypnula před zrušením vakua, mohl by
se olej z vývěvy nasát do kondenzačního systému.
Vlastní zařízení na lyofilizaci (obr. 33) se liší typ od typu podle výrobce. Obecně se však
vždy skládá ze zdroje vakua - výkonné olejové vývěvy, mrazící jednotky spojené s prostorem pro
uložení vzorku a kondenzací par. Přístroj je pak vždy opatřen kontrolním a regulačním zařízením
pro registraci parametrů (teplota, tlak) během lyofilizace. Některé moderní lyofilizátory bývají
vybaveny navíc chlazenou centrifugou, do které se umísťují lyofilizované vzorky. Odstředivou
silou je pak zabráněno vybublání či vypěnění vzorku, který se před vlastní lyofilizací již nemusí
zamrazovat a tím se celý proces značně urychluje.
70
Obrázek 33: Základní princip jednoduchého lyofilizátoru.
V laboratořích, které nedisponují finančně nákladným zařízením na lyofilizaci, lze tepelně
nestabilní vodné roztoky biopolymerů zakoncentrovávat ultrafiltrací (viz. lab. cvičení č. 3) nebo
ještě jednodušším způsobem založeném na principu gelové filtrace. Do roztoku se přidá asi
třetina jeho objemu suchého hydrofilního gelu, např. Sephadex G-25, používaného pro
molekulovou vylučovací chromatografii (gelovou filtraci, viz. lab. cvičení č. 11). Voda a
nízkomolekulární látky se pohlcují částečkami Sephadexu, který bobtná a vysokomolekulární látky
zůstávají v roztoku. Po několika minutách se Sephadex oddělí od roztoku centrifugací. Proces se
dá samozřejmě i několikrát opakovat. Nevýhodou jsou však značné ztráty biopolymeru. Během
zakoncentrovávání nedochází ke změnám pH ani iontové síly.
ÚKOL č. 15: Stanovení obsahu krystalové vody ve skalici modré
U mnohých krystalických látek se účastní stavby jejich struktury i molekuly vody. Takové
krystaly se nazývají hydráty a vázaná voda vodou krystalovou. Jako příklad lze uvést dihydrát
chloridu barnatého BaCl2.2H2O, skalici zelenou FeSO4.7H2O aj. Kromě látek tvořících pouze
jediný hydrát, jsou známy i takové, které tvoří hydrátů několik. Obsah krystalové vody potom
závisí na teplotě, při které látka krystalizuje. Uhličitan sodný vyloučený z roztoku za varu je
monohydrát, krystalický za laboratorní teploty je dekahydrát (obsahuje deset molekul vody) a
jeho preparát vykrystalovaný při -20ºC obsahuje patnáct molekul vody, tzv. pentadekahydrát.
Hydráty krystalizující při nižší teplotě mívají zpravidla vyšší obsah hydrátové vody. Obsah
hydrátové vody bývá často ovlivněn jinou složkou v roztoku. Např. přítomnost kyseliny snižuje
stupeň hydratace. Tak síran měďnatý může z roztoku obsahující nadbytek kyseliny sírové
krystalizovat i při laboratorní teplotě jako tri- nebo monohydrát.
Stálost hydrátů závisí na parciálním tlaku vodní páry nad příslušným hydrátem. Je-li tento
parciální tlak stejný jako tense vodních par v okolí, je hydrát na vzduchu stálý. Je-li tento
parciální tlak větší, než je tense vodní páry v okolí, ztrácí krystal samovolně část hydrátové vody,
aby se rozdíl tenzí vyrovnal. V opačném případě, je-li tense vodních par v okolí vyšší, hydrát
71
samovolně přijímá vodu z okolí a dochází k jeho vlhnutí případně až rozpouštění. Látky, které
ochotně přijímají vodu z prostředí, se označují jako hygroskopické.
Hydrát lze částečně nebo úplně zbavit krystalové vody tím, že se tense jeho vodních par
zvýší zahřáním nebo že se značně sníží tense vodních par v okolí (tj. umístěním krystalohydrátu
do exsikátoru nad silně hygroskopickou látku. Pro dehydrataci zahřáním stačí obvykle teplota
mezi 100-300ºC. Při použití teploty vyšší může kromě dehydratace docházet i k hlubšímu rozkladu
látky. Před dehydratací je třeba látku vždy důkladně rozetřít. Neučiní-li se tak, může unikající
vodní pára větší krystaly roztrhat a dochází ke ztrátám vyletováním drobných částic a prskání
z kelímku.
MATERIÁL
Elektrická sušárna, třecí miska s tloučkem, porcelánový kelímek, analytické váhy, kleště,
exsikátor, lžička, pentahydrát síranu měďnatého.
POSTUP
V sušárně s teplotou vyregulovanou na 150ºC vysušte porcelánový kelímek do konstantní
hmotnosti. Tzn. že se hmotnost kelímku po dalším sušení již nesnižuje. Hmotnost kelímku stanovte
asi po 1/2 hodině sušení a následně ověřte vždy po 10 minutách. Hmotnost vysušeného kelímku si
zapište. Manipulaci s kelímkem provádějte v exsikátoru, kde ho taky necháte po sušení
vychladnout. Kelímku se nedotýkejte rukou, ale vždy kleštěmi. Rukou přenášíte na kelímek zpět
vlhkost. Mezitím rozetřete asi 1,5 gramu skalice modré ve třecí misce. A do vysušeného a
zváženého kelímku přesně odvažte asi 1 g rozetřené CuSO4.5H2O (tzn. na analytických vahách
stanovíte hmotnost přibližně 1 gramu s přesností na 4 desetinná místa, např. budete mít 1,0584 g
skalice modré). Sušárnu vyregulujte na 110ºC a kelímek s pentahydrátem v ní sušte opět do
konstantní hmotnosti (asi 1/2 hodiny). Po vychladnutí v exsikátoru přesně zvažte.
VYHODNOCENÍ
Podle úbytku hmotnosti určete, kolik molekul vody ztratil pentahydrát síranu měďnatého
při teplotě 110ºC.
ÚKOL č. 16: Příprava bezvodého silikagelu
Silikagel je amorfní forma oxidu křemičitého. Je netoxický a chemicky odolný vůči většině
kyselin, je však citlivý vůči zásaditým látkám. Silikagel je používán především ve formě granulátu
a kuliček, což značně zvětšuje jeho povrch a umožňuje tak, aby lépe vázal vzdušnou vlhkost.
Správně připravený silikagel může vázat vlhkost až do 40% své váhy. K indikaci nasycenosti
silikagelu se používá chlorid kobaltnatý, do jehož roztoku se silikagel vměšuje, a tím získává
typickou narůžovělou barvu. Po vysušení CoCl2 ztrácí krystalickou vodu a mění zabarvení na
intenzivní modř. Modrý silikagel je tedy připraven k použití. Adsorpcí vody pak postupně znovu
přechází do růžového zabarvení a je opět nutno ho regenerovat vysušením.
MATERIÁL
Elektrická sušárna, kleště, exsikátor, lžička, kádinka, porcelánová miska, hexahydrát chloridu
kobaltnatého, technický silikagel.
POSTUP
Do 100 mL kádinky navažte 20 g technického silikagelu. Do další kádinky si připravte 10 mL
přibližně 4% roztoku CoCl2.6H2O. A tento roztok vlijte do silikagelu a pořádně promíchejte.
Narůžovělý preparát vysušte mezi filtračními papíry a rozestřete na porcelánovou misku v co
nejtenčí vrstvě. Misku vložte do sušárny a vyregulujte teplotu na 150ºC. Přibližně každých 15
72
minut silikagel v misce promíchejte skleněnou tyčinkou a sušte až do doby, kdy má intenzivně
modrou barvu (asi 1 hod). Modrým silikagelem naplňte dno exsikátoru nebo ho uložte do suché
zábrusové láhve (rozhodne vedoucí cvičení).
ÚKOL č. 17: Příprava, sušení, čištění a důkaz vodíku
Vodík je nejlehčí plyn, bez chuti, bez zápachu. Jeho teplota varu se pohybuje okolo 252,7ºC stupňů Celsia a teplota tání je -259ºC. Ve vodě se rozpouští velmi málo a téměř vždy
(kromě stavu zrodu) se vyskytuje ve formě dvouatomových molekul. Vodík jako plyn je směsí
svých tří izotopů. Prócium - má v jádře pouze jeden proton, deuterium neboli těžký vodík má ve
svém jádře kromě protonu také jeden neutron, a proto má i vlastní značku - D, tricium - jeho
jádro obsahuje již dva neutrony. Zjistilo se však, že existují i izotopy s nukleonovým číslem 4 a 5.
Ve sloučeninách s vodíkem bývá vazba polární. Vodík má ve sloučeninách většinou kladný náboj, ale
s některými kovy se váže ve formě aniontu a vznikají tzv. hydridy. S přechodnými kovy tvoří
sloučeniny, které mají charakter tuhých roztoků a tvoří v nich také někdy kovovou vazbu. Celkově
se slučuje více s nekovovými než kovovými prvky. Za normální teploty je málo reaktivní, ale pokud
se teplota zvýší, slučuje se dobře s kyslíkem a halovými prvky za uvolnění velké tepelné energie.
Tento prvek má silně redukční vlastnosti - za zvýšené teploty redukuje např. oxidy, sulfidy nebo
chloridy až na elementární kov. Vodík se dá získat uvolněním z vody alkalickými kovy nebo kovy
alkalických zemin již za studena (většina ostatních kovů ho uvolňuje z vody až za zvýšené teploty).
Uvolňuje ho i rozžhavený uhlík. Nejčastěji se však připravuje buď elektrolýzou vody nebo reakcí
zinku s kyselinou chlorovodíkovou případně sírovou.
Pozor: Při práci s vodíkem je třeba dbát zvýšené opatrnosti a dodržovat bezpečnostní
předpisy, hrozí nebezpečí vzniku třaskavé směsi se vzduchem.
MATERIÁL
Dělící nálevka, frakční baňka, korková zátka, skleněné trubice, hadičky, U-trubice, promývačka,
vana, špejle, kyselina chlorovodíková, práškový zinek, hydroxid draselný, konc. kyselina sírová,
dětský bublifuk.
POSTUP
Sestavte aparaturu pro přípravu vodíku sestávající z dělící nálevky a frakční baňky.
Korkovou zátkou ve frakční baňce vyveďte skleněnou trubici, na kterou postupně napojíte Utrubici naplněnou pevným KOH a promývačku s konc. kyselinou sírovou. U-trubici a dělící nálevku
řádně upevněte do stojanu. Na vývod z promývačky napojte skleněnou trubici asi o délce 20 cm.
Připravte si skleněnou vanu naplněnou do 1/4 vodou. Na dno frakční baňky nasypte přáškový zinek
a do dělicí nálevky nalijte přibližně 20 mL kyseliny chlorovodíkové (ředění vodou 1:1).
Zkontrolujte, zda jsou všechny spoje řádně napojeny, a zaveďte skleněnou trubici z promývačky
pod hladinu vody ve vaně.
Opatrně začněte přikapávat HCl na zinek a sledujte vývoj vodíku (unikající bubliny do vany).
Skleněnou trubicí ve vaně vyjměte a snažte se vyfukovat bubliny bublifukem. Pokud vývoj vodíku
ustane přilijte na zinek další podíl kyseliny chlorovodíkové. Když máte vodík vznikající v aparatuře
dostatečně vyčištěný, budou vám vznikající bubliny létat vzhůru ke stropu. Hořící špejlí opatrně
bubliny zapalujte.
Nikdy nedávejte zapálenou špejli k ústí přívodové trubičky z aparatury na přípravu
vodíku. Nebezpečí výbuchu!!!
73
VYHODNOCENÍ
1) Popište co se stalo, když jste přiblížili špejli k bublinám.
2) Proč jste na čištění a sušení vodíku použili H2SO4 a KOH? K jakým chemickým dějům dochází?
ÚKOL č. 18: Zakoncentrování roztoku proteinů pomocí gelové filtrace
V biochemické laboratoři se budete velice často setkávat s požadavkem na
zakoncentrovávání naředěných roztoků biopolymerů. Existuje řada způsobů, jak snížit v roztoku
množství vody a nízkomolekulárních látek tak, aby vysokomolekulární látka zůstala ve stejném
množství. Lze k tomu využít dialýzy, ultrafiltrace či lyofilizace. Tyto procesy jsou však většinou
dosti zdlouhavé a musí se řešit problém denaturace biologicky aktivních biopolymerů. Jeden
z nejrychlejších a nejšetrnějších způsobu zahuštění vysokomolekulární látky je založen na
principu gelové filtrace a prakticky ho provedete se vzorkem standartního hovězího sérového
albuminu (BSA – bovine serum albumin).
MATERIÁL
Automatické pipety, Hamiltonova pipeta, mikrozkumavky, zkumavky, špachtle, vortex, stolní
pikofuga, spektrofotometr, kyveta, kalibrační křivka pro metodu Bradfordové, roztok BSA, suchý
Sephadex G-50 Coarse, Bradfordové činidlo.
POSTUP
Do mikrozkumavky odpipetujte přesně 1 mL ze zásobní láhve roztoku BSA a přisypte
špachtlí suchý Sephadex G-50 tak, aby po nabobtnání zabral asi 1/3 objemu (na špičku špachtle).
Směs nechte asi 10 minut stát za laboratorní teploty a za občasného promíchání na vortexu. Poté
mikrozkumavku asi 2 minuty centrifugujte na pikofuze. Do čisté mikrozkumavky opatrně přeneste
čirý supernatant nad usazeným Sephadexem a pomocí automatické pipety nejpřesněji odhadněte
jeho objem. Objem si zaznamenejte a do čisté mikrozkumavky odeberte 12 L a označte jako
vzorek 2. Ke zbylému supernatantu opět přisypte suchý Sephadex asi do 1/3 objemu, za
občasného vortexování opět nechejte stát 10 minut a po 2 minutové centrifugaci odeberte a
přesně změřte pipetou objem supernatantu. 12 L odeberte do čisté mikrozkumavky jako vzorek
3. Se zbytkem celý proces ještě jednou zopakujte a dostanete tak vzorek 4.
Metodou Bradfordové změřte obsah proteinů vždy v 5 L vzorku. Každé měření provádějte
2x. Nachystejte si 9 zkumavek do každé pipetujte 2 mL Bradfordové činidla a pomocí
Hamiltonové pipety přidejte 5 L vzorku, 9 zkumavka je blank (slepý vzorek, pro vynulování
spektrofotometru). Vzorek číslo 1 je zásobní roztok BSA. Zkumavky s činidlem a vzorkem krátce
zvortexujte a nechejte 5 minut stát při laboratorní teplotě. Poté změřte absorbanci při 595 nm.
Hodnoty si zaznamenejte a pomocí kalibrační křivky stanovte obsah proteinu.
VYHODNOCENÍ
Sestavte si tabulku z naměřených hodnot – objem, obsah proteinu v 1 L, celkový obsah
proteinu ve vzorku. Vypočtěte kolikrát se vám podařilo zahustit původní roztok BSA a jak velkých
ztrát jste se přitom dopustili (tzn. kolik BSA vám zbylo z původního množství obsaženého v 1 mL
zásobního roztoku).
74
Doporučená literatura:
Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.
Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
Mareček, A. a Růžička, A.: Laboratorní technika pro nechemické obory, Vydavatelství MU Brno,
1997.
Klečková, M. a Šindelář, Z.: Školní pokusy z anorganické a organické chemie, Vydavatelství UP
Olomouc, 1993.
75
Laboratorní cvičení č. 9
KRYSTALIZACE, PROMÝVÁNÍ NA FILTRU, DEKANTACE A STANOVENÍ BODU TÁNÍ
KRYSTALIZACE
Krystalizace je proces vylučování pevné fáze z taveniny nebo rozpuštěné pevné látky
z roztoku. Z našeho hlediska má význam pouze krystalizace z roztoku, což je jedna ze základních
metod čištění pevných látek.
Čištění látek krystalizací spočívá v jejím rozpuštění ve vhodném rozpouštědle, vyčištění
roztoku filtrací a opětné vyloučení látky z roztoku v krystalické formě. Látku lze ke krystalizaci
přivést několikerým způsobem:

Krystalizace volným odpařováním. Volným odpařováním roztoku za normální teploty dojdeme
ke stavu, kdy je roztok při dané teplotě nasycen a látka se pak vylučuje z roztoku ve velkých,
dobře vyvinutých krystalech.

Krystalizace volným chladnutím. Při tomto způsobu krystalizace si nejprve připravíme za
varu nasycený roztok, přefiltrujeme a kádinku s vroucím roztokem vložíme do termostatu,
který udrží roztok několik hodin teplý. Krystalky, které po vychladnutí roztoku získáme, jsou
velké a pěkně vyvinuté.
Výše popsané dva způsoby krystalizace jsou časově náročné a hodí se především pro čištění
látek, jejichž rozpustnost není výrazně závislá na teplotě.

Rušená krystalizace. Opět nejdříve připravíme za horka (nebo varu) nasycený roztok a ten
pak za trvalého míchání krouživým pohybem krystalizační nádoby prudce ochladíme na teplotu
tekoucí vody. Získáme tak velké množství drobných krystalů, které odfiltrujeme od tzv.
matečného louhu, jenž obsahuje zbytek krystalizované látky a většinu nečistot. Novým
odpařením matečného louhu můžeme získat další, ovšem již méně čisté podíly. Rušené
krystalizace užíváme u látek, u nichž je rozdíl v rozpustnosti za studena a za horka
dostatečně velký.

Krystalizace vyvolaná změnou složení rozpouštědla. Změnou složení rozpouštědla lze
z roztoku vyloučit tu látku, která je v dané směsi nerozpustná. V praxi to provádíme tak, že
k vodnému roztoku přidáváme alkohol, aceton nebo jiné méně polární rozpouštědlo, které je
mísitelné s vodou. V takto získané směsi se brzy překročí součin rozpustnosti rozpouštěné
látky, která se pak začne vylučovat v krystalech.
O nasycenosti roztoku se přesvědčíme u rychle krystalizujících látek např. tak, že kapku
roztoku přeneseme tyčinkou na hodinové sklíčko. Když se roztok zakalí vyloučenými krystaly, je
již dostatečně zahuštěn. U řady látek se na hladině lehkých nasycených roztoků vytváří vlivem
chladného okolního vzduchu tzv. krystalizační blána (plovoucí krystaly).
Aby látka krystalizovala z roztoku, musí být porušená fázová rovnováha dané soustavy, tj.
roztok musí být přesycen. Dále je pro krystalizaci nutné, aby vznikala nepatrná krystalizační
centra, jež pak narůstají v krystaly. Vlastní pochod krystalizace se skládá z tvorby jader, k niž
dojde porušením fázové rovnováhy roztoku ochlazením na teplotu nižší než je mez nasycenosti, a
z růstu krystalů na vytvořených jádrech. Tvorba jader závisí na intenzitě chlazení, na rychlosti a
způsobů míchání, na teplotě, na vlastnostech látky a také na nečistotách obsažených v roztoku.
Je známo, že vznik velkého počtu jader je podporován rychlým ochlazením, intenzivním mícháním
a malou molární hmotností rozpuštěné látky. Počet vznikajících jader se projevuje na tvaru a
velikosti krystalů. Při malém počtu jader se pomalu tvoří velké krystaly s plně vyvinutými
plochami. Velký počet malých krystalizačních center podmiňuje naopak vznik drobných krystalů
se špatně vyvinutými plochami. Všechny uvedené faktory pak mají vliv na krystalizační výtěžek,
což je poměr množství vykrystalizované látky k výchozímu množství látky.
Jemné krystaly zadržují na svém povrchu mnoho matečného louhu, špatně se filtrují a
promývají. U velkých krystalů hrozí naopak nebezpečí zadržení matečného louhu v eventuálních
dutinách. Pro získání čisté látky je proto důležité i udržení přiměřené zrnitostí krystalů.
Některé látky mají sklon k tvorbě přesycených roztoků, to znamená, že ani po přestoupení
meze rozpustnosti, např. ochlazením, látka nekrystalizuje. V takovém případě stačí někdy
k vyvolání krystalizace tření stěny kádinky ostrohrannou skleněnou tyčinkou. Když i to selhává je
možno vyvolat krystalizaci naočkováním, tj. vhozením několika krystalků látky do roztoku.
Doba trvání krystalizace je velmi různá a nelze ji všeobecně předepsat. V některých
případech stačí pouze vyčkat na ochladnutí roztoku, jindy je nutné ponechat při nízké teplotě
řadu dní. Výsledek krystalizace rovněž závisí na správné volbě rozpouštědla. Při jeho výběru je
třeba brát v úvahu, že každá látka se nejlépe rozpouští v rozpouštědlech, která jsou ji chemicky
nejpříbuznější. Důležitým požadavkem při volbě rozpouštědla je to, aby rozdíl rozpustnosti za
horka a za studena byl co největší. V případě, že se takové rozpouštědlo nepodaří nalézt, je nutno
část rozpouštědla odstranit odpařením. Přílišné odpaření rozpouštědla není však žádoucí, protože
se tím čistící efekt krystalizace snižuje. Odpaření rozpouštědla lze provést několika způsoby:

volným odpařením na vzduchu nebo v exsikátoru. Tento způsob se obyčejně používá jen pro
rozpouštědla s nízkým bodem varu.

odpařením na vodní lázní. Při postupném odpařování rozpouštědla postupně dochází
k vylučování krystalů, které je nutno tyčinkou občas promíchat, aby došlo k porušení
krystalické blány tvořící se na povrchu kapaliny.

oddestilováním rozpouštědla za normálního nebo sníženého tlaku. Tento způsob je
nejekonomičtější (regenerace rozpouštědla).
Na závěr je nutno připomenout fakt, že i když u většiny látek rozpustnost s teplotou roste,
existuji též látky, jejichž rozpustnost je v určitém rozpouštědle prakticky nezávislá na teplotě
(chlorid sodný ve vodě), případně i látky, jejichž rozpustnost s rostoucí teplotou klesá (např.
monohydrát uhličitanu sodného ve vodě).
PROMÝVÁNÍ NA FILTRU A DEKANTACE
Promývání na filtru slouží k oddělování vyloučené sraženiny z roztoku od matečného louhu,
nehledě na to, zda je sraženina amorfní či krystalické povahy. Tuto operaci lze provést několika
způsoby: centrifugací, filtrací, odsátím nebo přímo dekantací v reagenční nádobě.
Při dekantaci necháme sraženinu usadit na dně nádoby, ve které ke srážení došlo a čirý
matečný louh jednoduše odlijeme. Na dně nám kromě sraženiny samozřejmě zůstane ještě
spousta matečného louhu i s nečistotami. Abychom tyto nečistoty odstranili, přilijeme čiré
rozpouštědlo, dobře promícháme, sraženinu necháme opět usadit a čirý roztok dekantujeme. Tuto
operaci můžeme opakovat několikrát, až do té doby než se zbavíme veškerých stop nečistot, o
čemž se obvykle přesvědčíme příslušnou kvalitativní zkouškou. Dekantace se většinou používá na
promývání sraženin amorfních, které se nedají promýt na filtru, jelikož ucpávají póry filtru.
Dekantace se nehodí na promývání krystalů po krystalizaci. Při přídavku čirého rozpouštědla by
samozřejmě docházelo ke zpětnému rozpouštění krystalů a tím k velkým ztrátám produktu.
Při promývání krystalů po krystalizaci je třeba řádně odkapat matečný louh a jeho zbytky
odstranit promytím. Je nutné zvážit jakou kapalinu a jaké množství na promytí použít. Většinou se
promytí provádí malým množstvím rozpouštědla, použitým pro krystalizaci. Při promývání je třeba
dbát značné opatrnosti, zvláště tehdy, je-li produkt v rozpouštědle dobře rozpustný. V tomto
případě může totiž dojít ke ztrátám produktu. Nejdokonalejší promytí lze dosáhnout, je-li
77
produkt na filtru při odpojené vývěvě promíchán s čistým rozpouštědlem, které je pak znova
odsáto. Promývání je vhodné několikrát opakovat.
Matečný louh odsáváme na Büchnerově nálevce, do které vložíme papírový filtr o vhodném
průměru. Papír by měl zakrýt všechny póry v nálevce, ale neměl by vystupovat nad její dno. Pokud
je krystalizace prováděná v agresivním rozpouštědle, které by mohlo reagovat s celulosovým
filtrem, je vhodnější použít na odsátí a následné promytí skleněnou fritu, do které se již filtrační
papír nevkládá. Nevýhodou těchto frit je jejich časté ucpávání a špatné čištění. Po důkladném
odsátí matečného louhu odpojíme vývěvu a malým množstvím čistého rozpouštědla, nejlépe ze
střičky, omýváme krystaly. Rozpouštědlo smývá z povrchu krystalů zbylé stopy matečného louhu a
případně rozpouští i zbytky nezreagovaných reakčních komponent. Po krátkém působení
promývací kapalinu vždy odsajeme, toto opakujeme několikrát. Abychom zamezili větším ztrátám,
je vhodné používat promývací kapalinu co nejstudenější. Při promývání je nutno mít na zřeteli, že
je mnohem efektivnější promývat sraženinu vícekrát malými podíly promývacího roztoku než
celým množstvím najednou. Je pravidlem neplnit Büchnerovu nálevku výše než pět milimetrů nad
filtr.
Zmínku zasluhuje i správné oddělení pevné fáze od filtru. Jestliže ze skleněné frity
můžeme produkt seškrabat tyčinkou nebo špachtlí, z Büchnerovy nálevky produkt v žádném
případě nevyškrabujeme nebo nedáváme sušit i z nálevkou, protože tak bychom produkt znečistili
částečkami filtračního papíru. Správný postup spočívá v přiklopení nálevky hodinovým sklem
vhodného průměru, otočení stonkem vzhůru a silným fouknutím do stonku. Filtr s produktem
vypadne na sklo, kde ho osušíme lehkým přitlačením čtverečku filtračního papíru. Produkt potom
sloupneme z filtračního papíru.
ÚKOL č. 19: Izolace kyseliny citrónové z citrónové šťávy
Kyselina citronová - C3H4OH(COOH)3 je bílá krystalická látka rozpustná ve vodě a slabě
rozpustná v organických rozpouštědlech. Její vodné roztoky jsou o něco kyselejší než kyselina
octová. Stopy kyseliny citrónové lze nalézt v mnoha rostlinných i živočišných organismech,
protože patří mezi intermediáty bazálního metabolismu (Krebsův cyklus). Velké množství této
kyseliny je obsaženo ve šťávě citrusových plodů, ze které ji lze vysrážet vápenatými ionty. Ze
vzniklého citrátu vápenatého je možné vlastní kyselinu citrónovou vytěsnit silnější kyselinou
sírovou za vzniku síranu vápenatého. Komerčně se získává fermentací cukrů plísní Aspergillus
niger. Používá se jako aditivum do jídel a nápojů pro vytvoření příjemné kyselé chuti. Dále se
využívá v medicíně, textilnictví (modrotisk) a jako leštící prostředek na kovy.
MATERIÁL
Vařič, vodní lázeň, exsikátor, lis na citróny, kádinky, Pasteurovy pipety, skleněná tyčinka, pH
papírky, Bűchnerova nálevka, odsávací baňka, vývěva, filtrační papír, skleněná frita se zábrusovou
baňkou, porcelánová krystalizační miska, citrón popř. citrónová šťáva, 20% amoniak, 25% roztok
CaCl2, 30% kyselina sírová.
POSTUP
Pomocí kuchyňského lisovače citrónů vymačkejte šťávu z jednoho citrónu a přelijte ji do
100 mL kádinky. 20% amoniakem šťávu zneutralizujte. Pasteurovou pipetou opatrně přidávejte za
stálého míchání amoniak a pomocí pH papírku kontrolujte hodnotu pH. Ve slabě zásaditém
prostředí šťáva tmavne. Silně zásadité prostředí je nežádoucí, jelikož by při srážení chloridem
vápenatým vznikal hydroxid vápenatý a rušil by následnou izolaci. Neutrální šťávu zfiltrujte za
sníženého tlaku na Bűchnerově nálevce a přiveďte k varu. Za varu pak šťávu vysrážejte 25%
roztokem CaCl2. Vzniklou sraženinu citrátu vápenatého odfiltrujte na skleněné fritě a promyjte
horkou vodou (připravte si ji současně při srážení zahřátím v kádince na vařiči). Sraženinu
kvantitativně převeďte do čisté kádinky a rozpusťte v 10 mL 30% kyseliny sírové. Citrát
78
vápenatý má daleko větší rozpustnost ve vodě za studena než za horka. Kádinku postavte na vařič
a opět zahřejte. Vařte asi 5-10 minut. Kyselina sírová uvolňuje z citrátu vlastní kyselinu
citrónovou za vzniku nerozpustného síranu vápenatého. Roztok odstavte, opatrně přidejte asi 20
mL studené destilované vody a nechejte vychladnout. Síran vápenatý odsajte na skleněné fritě.
Filtrát přelijte do porcelánové misky a na vodní lázni zahustěte ke krystalizaci. Misku
s krystalizačním roztokem nakonec dejte do exsikátoru, odsajte vzduch a nechejte krystalizovat
do příštího cvičení.
VYHODNOCENÍ
1) Zapište chemické rovnice všech reakcí, které jste provedli.
2) Vypočtěte výtěžek krystalizace a stanovte tak přibližné množství kyseliny citrónové
v jednom citrónu.
ÚKOL č. 20: Rušená krystalizace technické skalice modré
V tomto úkolu použijeme krystalizaci jako čistící metodu. Skalice modrá se v normálním
stavu vyskytuje jako pentahydrát, tzn. jedna molekula síranu měďnatého krystalizuje s pěti
molekulami vody. Tvoří trojklonné jehlicovité krystaly. Technická skalice bývá často znečištěná
síranem železnatým. Přídavkem malého množství kyseliny dusičné do krystalizačního roztoku
zoxidujeme dvojmocné železo na trojmocné, to pak během krystalizace zůstává v matečném
louhu. Síran železitý má totiž na rozdíl od síranu měďnatého daleko větší rozpustnost. Podobným
způsobem můžeme od sebe oddělovat různé soli lišící se svou rozpustností v daném rozpouštědle.
MATERIÁL
Třecí miska s tloučkem, kádinky, vařič, nálevka, kleště, Pasteurova pipeta, stojan s kruhem,
filtrační papír, skleněná tyčinka, podložní sklíčko, Bűchnerova nálevka, odsávací baňka, vývěva,
miska s drceným ledem, technická skalice modrá, konc. kyselina dusičná.
POSTUP
Na předvážkách odvažte 5 gramů technické skalice modré a jemně utřete ve třecí misce.
Pomocí tabulek vypočtěte množství vody potřebné na rozpuštění tohoto množství za laboratorní
teploty. Skalici v tomto množství rozpusťte a přidejte několik kapek koncentrované kyseliny
dusičné. Roztok na vařiči přiveďte k varu a zfiltrujte. Filtrát zahustěte ke krystalizaci
vyvařením. Průběžně provádějte zkoušku: skleněnou tyčinkou kápněte kapku roztoku na podložní
sklíčko a sledujte, zda roztok krystalizuje. V momentě, kdy je roztok připraven, vložte kádinku
do misky s rozdrceným ledem a vyčkejte, až se vyloučí krystalky CuSO4.5H2O. Produkt odsajte
na Bűchnerově nálevce a vysušte mezi kousky filtračního papíru. Matečný louh znovu zahustěte a
již popsaným způsobem tak získáte druhý produkt krystalizace.
VYHODNOCENÍ
1) První i druhý produkt po vysušení zvažte a vypočítejte procentové výtěžky krystalizace.
Který produkt bude mít větší čistotu?
2) Do kádinky se 100 mL vody jste nasypali po 10 gramech oxidu chromitého, kamence draselnohlinitého a skalice modré. Pomocí chemických tabulek navrhněte postup, jak by jste tyto tři
látky od sebe oddělili pomocí metod popsaných v této úloze.
79
STANOVENÍ BODU TEPLOTY TÁNÍ
Bod tání je teplota, při níž je tuhá látka v rovnováze se svou taveninou. Je to jedna ze
základních fyzikálních veličin vedle bodu varu, hustoty, indexu lomu světla, optické aktivity apod.
charakterizujících každou látku. Stanovení této veličiny a srovnání s tabelovanou hodnotou je
zvláště pro organického chemika nejrychlejší metodou určení čistoty dané látky. Anorganické
sloučeniny mají obvykle příliš vysoký bod tání. Čisté látky mají ostrý bod tání. Již nepatrné
znečištění látky se projeví značným snížením bodu tání a to i tehdy, jestliže nečistoty mají bod
tání vyšší. Kromě snížení bodu tání pozorujeme i zvětšení intervalu bodu tání. Tohoto jevu
využíváme ke zkoušení identity dvou látek s týmž bodem tání. Stejná množství obou látek
dokonale promísíme a stanovíme pak bod tání (tzv. směsný bod tání). Je-li nezměněn, jsou obě
látky identické, je-li ve srovnání s bodem tání složek nižší, jde o různé látky. Mnohé látky se
v okamžiku kdy roztají, zároveň rozloží. Rozklad se obvykle projeví ztmavnutím nebo vývojem
plynu. Bod rozkladu je zpravidla neostrý a závisí na rychlosti zahřívání.
Prakticky bod taní stanovujeme tak, že malý vzorek látky napěchovaný ve skleněné
tenkostěnné kapiláře umístíme do lázně dobře vodící teplo, tj. do kapaliny nebo do kovového
bloku, a pomalu zahříváme tak, aby se podmínky co nejvíce blížily rovnovážným. Přitom sledujeme
teplotu lázně a pozorujeme látku. Jako teplotu tání označíme teplotu, při níž se objeví kapalná
fáze.
Přístroje pro stanovení teploty tání nazýváme bodotávky. Pro látky s teplotou tání nižší než
120C používáme skleněné bodotávky. Jsou to skleněné nádobky, které bývají plněny kapalinou o
vhodné tepelné kapacitě, např. silikonovým olejem, glycerolem apod. Vhodným tvarem nádobky se
dosahuje toho, že při pozvolném zahřívání dochází k proudění kapaliny a současnému prohřívání
vzorku a teploměru, na kterém je kapilára se vzorkem připevněna. Na obrázku 34 je skleněný Pbodotávek. U látek s vyšší teplotou tání používáme kovové bodotávky, tzv. Thieleho bloky. Jsou to
bloky z kovu dobře vedoucího teplo, do kterých jsou vyvrtány svisle tři otvory (obr. 35). Do
prostředního otvoru vkládáme teploměr, do zbývajících kapiláry se vzorkem. U kovového bloku je
pomalého zahřívání dosaženo tím, že nezahříváme přímo blok, ale tyčku, kterou je blok zároveň
upevněn do stojanu. Vzorek pozorujeme v procházejícím světle lampičky upevněné na stojanu za
vzorkem.
Obrázek 34: Skleněný P-bodotávek
Obrázek 35: Thieleho kovový blok
V laboratorní praxi se často používá speciálních zařízení určených pro práci
v mikroměřítku. Jsou to v podstatě upravené mikroskopy s elektricky vyhřívaným stolkem, který
je opatřen teploměrem. Na tento tzv. mikrovýhřevný stolek pokládáme vzorek v uspořádání
běžném pro mikroskopování a během zahřívání jej pozorujeme v mikroskopu a čekáme na stav,
kdy se krystaly změní v rovnovážnou směs pevné a kapalné fáze.
80
ÚKOL č. 21: Stanovte teplotu bodu tání kofeinu
V této úloze ověříte čistotu vámi izolovaného kofeinu z čajového listí pomocí jedné
z nejrychlejších a nejspolehlivějších metod. Teplotu bodu tání budete stanovovat pomocí
moderního bodotávku firmy STUART SCIENTIFIC. Jeho princip je založen na Thieleho kovovém
bloku. Bodotávek je ovládán elektronicky s digitálním výstupem. Lze na něm měřit současně tři
vzorky, umístěné v kapilárách. Odečet se dělá okem pomocí zvětšovacího okuláru.
MATERIÁL
Bodotávek STUART SCIENTIFIC, kapiláry, skleněná trubice, kofein čistý, kofein izolovaný ve
cvičení č. 4.
POSTUP
Do předem připravených kapilár (úloha č. 7) vložte vzorek vámi izolovaného kofeinu a
vzorek čistého kofeinu. Kapiláry plňte následujícím způsobem. Otevřeným koncem kapiláry
nahrňte malé množství suchého vzorku, zbytek kolem kapiláry otřete a kapiláru nechejte asi 5x
volně padat svisle postavenou trubicí dlouhou asi 1,5 metru na tvrdou podložku. Vzorek látky se
tak dobře napěchuje do malého objemu na dně kapiláry. Sloupeček by měl být vysoký asi 2 mm.
Zapněte bodotávek hlavním vypínačem. Kapiláry se vzorkem vložte do bodotávku a zkontrolujte,
zda je vzorek dobře viditelný. Funkcí MODE nastavte teplotu, na kterou chcete zahřívat (270ºC),
a poté tlačítkem START spusťte výhřev. Kolem předpokládaného bodu tání pozorně sledujte oba
vzorky a odečtěte hodnoty bodu tání pro čistý i pro izolovaný kofein.
VYHODNOCENÍ
1) Porovnejte obě získané hodnoty bodu tání. V literatuře či na internetu vyhledejte uváděnou
hodnotu bodu tání pro kofein a případné rozdíly vysvětlete.
2) Nakreslete vzorec kofeinu a vysvětlete od které základní sloučeniny je odvozen.
Doporučená literatura:
Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.
Mareček, A. a Růžička, A.: Laboratorní technika pro nechemické obory, Vydavatelství MU Brno,
1997.
Klečková, M. a Šindelář, Z.: Školní pokusy z anorganické a organické chemie, Vydavatelství UP
Olomouc, 1993.
81
Laboratorní cvičení č. 10
CHROMATOGRAFIE NA IONTOMĚNIČÍCH
Současnou práci v biochemickém výzkumu a ve studiu přírodních látek si nelze bez
chromatografických metod představit. Jejich principem je rozdělování látek mezi stacionární a
mobilní fázi na základě rozdílných afinit složek k uvedeným fázím. Mobilní fáze je buď kapalina
nebo plyn, stacionární fáze může mít velmi různorodou formu např. částečky tuhé fáze, tenká
vrstva kapaliny na pevných částicích, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry atd. Objevení
principu chromatografie je připisováno ruskému botanikovi M. S. Cvětovi (1872-1919), který
rozdělil chloroplastové pigmenty z rostlinných extraktů na sloupci uhličitanu vápenatého.
Chromatografické metody se mohou dělit podle různých kriterií, nejčastější dělení je podle
podstaty procesu zodpovědného za separaci, podle skupenství mobilní fáze, způsobu provedení
(sloupcová, tenkovrstevná, papírová atd.) nebo podmínek (nízkotlaká, střednětlaká nebo
vysokotlaká kapalinová chromatografie). Podle podstaty procesu je můžeme rozdělit do
následujících kategorii. Je však třeba mít na paměti, že zejména při dělení biopolymerů (bílkovin,
nukleových kyselin) se jedná často o kombinaci dvou nebo více separačních principů. Tak
například při rozdělovací chromatografii může docházet také k adsorpci proteinu na povrch
sorbentu nebo se uplatňuje síťový efekt porézních sorbentů (gelová permeační chromatografie).
ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE
Patří k nejstarším a nejrozšířenějším metodám. Pevný adsorbent je obtékán vhodným
rozpouštědlem, které unáší analyzovanou směs látek. Na povrchu adsorbentu dochází k různě
silné adsorbci těchto látek a tím k jejich rozdělení. Nejčastěji užívanými adsorbenty jsou látky
pórovité struktury jako jsou silikagel, Al2O3, CaCO3, hydroxylapatit či aktivní uhlí. Při adsorpci na
polárních sorbentech hrají největší úlohu interakce typu ion - dipól a dipól – dipól, zatímco u
nepolárních sorbentů to jsou převážně van der Waalsovy síly. Adsorpční chromatografie může
být v provedení sloupcovém (CC – column chromatography) nebo tenkovrstevném (TLC - thin layer
chromatography).
Zvláštním případem adsorpční chromatografie je hydrofobní chromatografie biopolymerů
(zejména proteinů), která využívá jejich schopnosti adsorbovat se na hydrofobní skupiny a
povrchy. Vytěsnění adsorbovaných biopolymerů se provádí nejčastěji snížením iontové síly, popř.
přídavkem organického rozpouštědla. Jako adsorpční hydrofobní materiály se nejčastěji
používají polysacharidové či polyglykolmethakrylátové matrice s navázanými alkylovými řetězci
(Sepharosa, Spheron).
ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE
Principem je dělení látek mezi dvě navzájem nemísitelná nebo omezeně mísitelná
rozpouštědla a je charakterizováno rozdělovací konstantou K, která je rozdílná pro jednotlivé
složky směsi a liší se pochopitelně i pro různé systémy rozpouštědel. Volbou složení těchto
systémů lze ovlivnit účinnost rozdělení složek směsi. Rozdělovací chromatografie je uspořádána
tak, že jedna z kapalných fází je zakotvena na inertní pevný nosič (silikagel, filtrační papír,
křemelina, škrob) a stává se tak fází stacionární, zatímco druhá fáze - mobilní - přes tuto
přetéká. Látky ze separované směsi se rozpouštějí mezi obě fáze. Na pevný nosič se zakotvuje
především vodná stacionární fáze, která má k nosiči vyšší afinitu a jako mobilní je pak používaná
směs organických rozpouštědel. Častou formou rozdělovací chromatografie je papírová
chromatografie (PC – paper chromatography). Vývoj nových sorbentů a automatizace pak daly
vzniknout novému a v současnosti jednomu z nejpoužívanějších typů chromatografie –
vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC – high performence liquid chromatography). Při
HPLC se pracuje za vysokého tlaku, nazývá se také často jako vysokotlaká kapalinová
82
chromatografie. Umožňuje několikanásobně rychlejší a citlivější analýzy všech typů látek oproti
klasickým sloupcovým metodám.
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Je založena na biochemických interakcích, jako jsou interakce enzym – substrát nebo
protilátka – antigen, které probíhají s vysokou selektivitou. Princip spočívá v navázání příslušného
substrátu či antigenu chemickou reakcí na určitý sorbent, kterým se pak naplní kolona. Enzym
nebo protilátka jsou selektivně vychytávány z analyzované směsi a následně mohou být z kolony
vymyty. Afinitní chromatografie se ku příkladu využívá k čištění protilátek z krevního séra.
GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE (GPC – GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY)
Dělí látky na základě velikosti jejích molekul a blíže se s ní seznámíme ve cvičení č. 11.
CHROMATOGRAFIE NA IONTOMĚNIČÍCH
Chromatografie na měničích iontů neboli ionexová chromatografie je určena pro separaci
látek nesoucích náboj. Při výměně iontů se ionty, které jsou elektrostaticky vázány k pevnému a
chemicky inertnímu podkladu, reversibilně vyměňují za ionty z roztoku:
R+A + B  R+B + A
R+A je měnič iontů s navázaným aniontem A - anex a B odpovídá aniontům v roztoku.
Měnič kationtů - katex obsahuje záporně nabité skupiny, které reversibilně vážou kationty.
Afinita iontů k ionexu není stejná, ale závisí na velikosti náboje a na poloměru hydratovaného
iontu. Rozdíly v nábojových vlastnostech, jichž ionexová chromatografie využívá, jsou u
biologických látek značné, proto tímto způsobem lze oddělit i látky jinak velmi podobných
vlastností. Při vazbě iontu na ionex je však třeba počítat i s dalšími vlivy a to zejména s van der
Waalsovými a polárními interakcemi. Síla vazby je také ovlivněna iontovou silou a hodnotou pH
prostředí. Dále je třeba si uvědomit, že látky nesoucí stejný náboj jako ionex nebudou zachyceny
vůbec.
Jako chromatografický materiál slouží pro ionexovou chromatografii různé inertní matrice,
které mají na svém povrchu kovalentně navázané kladně nebo záporně nabité funkční skupiny (viz
tab. 9). Charakter funkčních skupin udává sílu ionexu, jejich celkové množství a využitelnost
určuje kapacitu ionexu. Označení slabé, střední a silné ionexy vyjadřuje stupeň disociace skupin v
závislosti na pH. Zatímco silné ionexy jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH, disociace
slabých ionexů je naopak na pH silně závislá. Slabé katexy ztrácejí náboj při pH pod 6 slabé
anexy při pH nad 9.
ANEXY
FUNKČNÍ SKUPINA
Aminoethyl (AE-)
OCH2CH2NH3 Cl-
Diethylaminoethyl (DEAE-)
OCH2CH2N+H(CH2CH3)2 Cl-
Kvarterní aminoethyl (QAE-)
OCH2CH2N+(C2H5)2CH(OH)CH3 Cl-
KATEXY
Karboxymethyl (CM-)
OCH2COO H+
Fosfo (P-)
PO4H2 H+
Sulfopropyl (SP-)
CH2CH2CH2SO3 H+
Tabulka 9: Funkční skupiny ionexů.
83
Jako matrice se v ionexové chromatografii používají tři druhy materiálů: syntetické
pryskyřice, jako je např. nejčastěji používaný polystyren zesíťovaný divinylbenzenem, celulosa a
konečně gely na bázi polyakrylamidu, dextranů nebo agarosy.
Hlavní fáze ionexové chromatografie jsou ekvilibrace ionexu, navázání látek ze vzorku
a vymytí nenavázaných složek, změna podmínek, která vede k selektivní desorpci, a konečně
regenerace ionexu (obr. 36).
Ekvilibrace ionexu se provádí startovním pufrem před tím, než je na kolonu aplikován
vzorek. Výběru druhu pufru i pH je třeba věnovat značnou pozornost. Zdaleka ne všechny pufry
jsou pro ionexovou chromatografii vhodné a to i v případě, že je splněna podmínka vhodného pH.
Iontová síla startovního roztoku, který používáme při prvním stupni chromatografie, by neměla
být příliš nízká, protože ekvilibrace ionexu je obtížnější a zdlouhavá, zpomaluje se výměnná
kinetika, čímž se zhoršuje chromatografické rozlišení. Dochází rovněž ke smršťování ionexu a tím
se mění průtok kolonou. Obvykle se doporučuje iontová síla 0,05 – 0,1 M.
1.
2.
3.
4.
5.
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
+
+ +
protiionty
startovacího pufru
separované látky
gradientové ionty
Obrázek 36: Průběh ionexové chromatografie. 1 - ionex v rovnováze s protiionty (ekvilibrace
ionexu), 2 - náhrada protiontů nabitými skupinami ze separované směsi, 3 - ionty s malou afinitou
k ionexu jsou desorbovány a nahrazeny protionty z pufru, 4 - desorpce zbývajících iontů změnou
podmínek (náhrada gradientovými ionty), 5 - náhrada gradientových iontů protionty startovního
pufru (regenerace ionexu).
Vlastní separační proces probíhá ve dvou oddělených fázích. V prvním kroku dochází k
sorpci (navázání) látky, určené k separaci na ionex. Ve druhé fázi musí být navázané látky z
kolony desorbovány. Ionexová chromatografie se obvykle provádí buď vsádkově nebo v kolonách.
Je třeba vzít v úvahu, že rozměry kolony, resp. rozměry chromatografického materiálu v koloně,
mají zásadní význam pro úspěšnost separačního procesu. Výšku kolony je třeba zvolit takovou, aby
látky ze směsi byly adsorbovány v horní části kolony, nejméně však 1-2 cm od dolního okraje.
Velice složité směsi je nutno dělit na delších sloupcích, pro laboratorní měřítko se však většinou
vystačí se sloupci do 20 cm. Průměr sloupce závisí na tom, kolik ionexu je nutno do sloupce
umístit (při předem zvolené výšce). Průměr sloupce tedy závisí na požadované kapacitě ionexové
náplně. Kolony pro ionexovou chromatografii mají obvykle větší průměr a jsou krátké.
Na kolonu aplikujeme vzorek, který by měl být rozpuštěn v ekvilibračním pufru nebo
alespoň by měl mít pH odpovídající zvolené hodnotě a nízkou iontovou sílu. Při ionexové
chromatografii nezáleží na objemu aplikovaného vzorku, pouze na množství separovaných látek ve
vzorku. Jestliže totiž aplikujeme takové množství, že je přesažena kapacita kolony, část
separovaných látek se nenaváže a vymyje se z kolony v mrtvém objemu. Ideální je, obsahuje-li
vzorek takové množství dělených látek, které odpovídá asi 80-90% kapacity ionexu.
84
Desorpce látek vázaných na ionexu se zpravidla provádí změnou složení elučního pufru.
Mění se buď pH nebo iontová síla roztoku, výjimečně oba tyto faktory současně. V praxi to
znamená, že do pufru, kterým promýváme kolonu, přidáme sůl ve vysoké koncentraci. Převážně se
používá KCl v koncentracích od 0,1 do 2,0 M. V případě eluce změnou pH použijeme nový pufr o
odlišném pH.
Jestliže se složení elučního roztoku rychle mění (příkré gradienty), látky se vymývají s
mnohem menším objemem eluentu, rozlišení může být však nižší. Jsou-li vlastnosti separovaných
látek známy, lze gradienty utvářet tak, aby bylo dosaženo maximálního rozlišení a přitom
rovnoměrného rozložení chromatografických vrcholů. V oblasti, kde se eluuje najednou několik
látek, by měl být gradient mírný. Strmých gradientů by se mělo užít tam, kde se od sebe
chromatografické vrcholy příliš vzdalují. Gradienty vytváříme většinou ve dvou spojených
nádobách, do kterých nalijeme dva odlišné pufry. Pomocí míchadla je rovnoměrně mísíme a
nanášíme na kolonu. Nejpříkřejší gradient může být vytvořen pouhou výměnou elučního pufru.
Při sloupcové chromatografii (chromatografie na koloně) je chromatografický materiál
umístěn do chromatografické kolony (skleněná nebo kovová trubice) a vytvoří tak sloupec, na
němž probíhá dělení. Po aplikaci vzorku na kolonu dochází vlivem toku mobilní fáze k pohybu
jednotlivých složek kolonou a k jejich separaci. Náplň kolony je různá, podle toho o jaký typ
chromatografie se jedná. Kolony si můžeme naplnit v laboratoři sami nebo lze zakoupit kolony již
naplněné, které jsou dodávány řadou firem. To platí zejména o kolonách pro chromatografické
techniky, kdy dělení probíhá za zvýšeného tlaku (HPLC) na sorbentech s velmi malým průměrem
částic (několik mikronů) a správné naplnění kolony je jedním z rozhodujících faktorů pro kvalitní
separaci látek. Hlavní podmínkou je, aby kolona byla naplněna kontinuálně a náplň byla v celé své
délce kompaktní bez jakýchkoliv heterogenit. Moderní zařízení pro kapalinovou sloupcovou
chromatografii se skládá z rezervoárů mobilních fází, dávkovače vzorku, kolony s
chromatografickým materiálem, čerpadel (popř. gradientového mixéru), detektoru měřícího eluát
– vytékající mobilní fázi (spektrofotometr, refraktometr, hmotnostní spektrometr apod.), jímače
frakcí a výstupu analyzovaných dat (zapisovač, počítač).
Charakteristickou veličinou pro každou separovanou látku je eluční objem nebo eluční čas,
označovaný VR, resp. tR. Eluční objem představuje celkový proteklý objem mobilní fáze od
nanesení rozdělované látky na kolonu po dosažení maximální koncentrace této látky v eluátu.
Eluční čas je pak analogicky doba od nástřiku po dosažení maxima eluční křivky dané látky. Eluční
objem VR může být ještě dále charakterizován jako součet VR´, tj. skutečný eluční objem, a VM
mrtvý objem kolony.
VR = VR´ + VM
Mrtvý objem kolony se dá charakterizovat jako celkový objem, který v koloně zaujímá
mobilní fáze. Experimentálně se dá určit tak, že se na kolonu aplikuje inertní látka, která není na
koloně zadržována žádnými silami a její eluční objem se pak rovná mrtvému elučnímu objemu (obr.
37).
Obrázek 37: Eluční profil při sloupcové kapalinové chromatografii. VM – mrtvý eluční objem, VR1
a VR2 eluční objemy látek 1 a 2.
85
ÚKOL č. 22: Rozdělení směsi aminokyselin na silném katexu
Zvláštní, leč v biochemii velmi významnou skupinu látek tvoří ty, jejichž nábojové vlastnosti
závisí na pH (aminokyseliny, peptidy a bílkoviny) a tudíž mohou být separovány jak na anexech tak
na katexech. Volba ionexu v tomto případě závisí zejména na hodnotě izoelektrického bodu (pI).
Izoelektrický bod amfipolární látky je hodnota pH, při které má její molekula nulový náboj. Při pH
nižším, než je izoelektrický bod, nese látka kladný náboj a váže se na katex. Při pH nad
izoelektrickým bodem má záporný náboj a váže se tedy na anex. U aminokyselin to znamená, že
při pH nižším, než je pI, dává molekule náboj skupina NH3+ a při pH vyšším pak skupina COO-. Při
dělení proteinů je třeba brát také v úvahu jejich stabilitu v závislosti na pH. Izoelektrický bod
proteinu je součtem izoelektrických bodů všech aminokyselin v něm obsažených.
V této úloze budete dělit směs tří aminokyselin, které se značně liší hodnotou svého pI na
sloupci silného katexu. Aminokyseliny se navážou na katex v silně kyselém prostředí, kdy má
většina z nich záporný náboj a postupně se budou vymývat vzrůstající hodnotou pH elučního
pufru. V eluátu budete aminokyseliny detekovat pomocí ninhydrinového činidla. Barevnou reakci
s ninhydrinem poskytují všechny volné aminokyseliny. Aminoskupina aminokyselin poskytuje
s ninhydrinem červeno-fialové zabarvení po zahřátí na 100ºC, kromě prolinu a asparaginu, které
dávají žluté zabarvení. Arginin budete dokazovat specifickou Sakaguchiho reakcí, kdy jeho
guanidinová skupina reaguje s bromnanem a α-naftolem v alkalickém prostředí za vzniku malinově
červeného produktu.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
Skleněná kolona (25 cm) s gumovou zátkou a hadičkou, stojan se svorkou, kádinky, pH metr,
rozprašovač aerosolu, filtrační papír, odměrná baňka, Pasteurovy pipety, kulatý stojan na
zkumavky, stříkačka, zkumavky, odměrný válec, kapkovací destička, elektrický fén, sušárna,
automatická pipeta, skelná vata Akuver, 50 mM citrátové pufry podle McIlvaine pH 3 a 6, 50 mM
Tris/HCl pufr pH 9, katex Amberlite IR 120 v citrátovém pufru pH 3, 2,5% vodný roztok serinu,
valinu a argininu (směs), 2,5% vodný roztok argininu, 0,4% etanolický roztok ninhydrinu, alkalický
roztok bromnanu sodného, etanolický roztok α-naftolu, 10% roztok hydroxidu sodného.
POSTUP
Příprava kolony: Skleněnou kolonu s kohoutem upevněte vertikálně do stojanu. Na dno
kolony umístěte chomáč skelné vaty Akuver tak, aby pokryla celé dno. Regenerovaný katex
Amberlite IR 120 rozmíchejte asi ve dvojnásobku objemu citrátového pufru, pH 3 a nalijte do
kolony, jejíž kohout je otevřený. Sledujte rychlost, s níž se katex usazuje, a neustále dolévejte
nové podíly ionexu tak, aby nedošlo k vytvoření vrstev katexu. Katex musí tvořit jeden kompaktní
sloupec. Až sahá sloupec asi 3 cm pod ústí kolony, nechejte katex pořádně usadit a pufr odpusťte
asi 1/2 cm nad hladinu katexu a kohoutem kolonu uzavřete. Při chromatografii nikdy nenechejte
sloupec náplně vyschnout! Poté umístěte na kolonu provrtanou gumovou zátku s hadičkou, která
vede do litrové odměrné baňky umístěné nad kolonou obsahující zásobní eluční pufr – citrátový
pufr pH 3. Stříkačkou nasajte pufr tak, aby kontinuálně protékal. Zátkou uzavřete kolonu a dole
ji kohoutem otevřete. Pod výtok z kolony umístěte 50 mL kádinku a promývejte kolonu citrátovým
pufrem, pH 3 tak dlouho, až hodnota pH eluátu dosáhne hodnoty pH 3. Eluát z kolony průběžně
proměřujte na pH metru.
Nanesení vzorku: Před nanesením vzorku na kolonu vypusťte veškerý pufr nad sloupcem
kolony a kolonu uzavřete. Poté opatrně automatickou pipetou naneste na kolonu 1 mL směsi
aminokyselin a kolonu otevřete. Po vsáknutí vzorku do kolony automatickou pipetou naneste na
kolonu 3 mL elučního pufru – citrátový pufr, pH 3 a nechejte vsáknout. Poté opět napojte zátku
s hadičkou ze zásobního rezervoáru.
Sběr frakcí eluátu: Od okamžiku nanesení vzorku na kolonu měřte pomocí odměrného válce
pod kolonou objem eluátu. Do kruhového stojanu si připravte sadu 10 kalibrovaných zkumavek
86
označených 1 až 10 a po odkapání 10 mL eluátu z kolony jímejte frakce po 5 mL do jednotlivých
zkumavek.
Detekce eluátu: Aby jste zjistili, ve kterých zkumavkách jsou aminokyseliny, odeberete
z každé zkumavky automatickou pipetou 20 μL vzorku a necháte je po kapkách vsáknout do
filtračního papíru (3  10 cm), kde budete mít čísly označené body jako frakce. Kapku vždy
vysušíte elektrickým fénem. Její průměr by neměl přesáhnout 1 cm. Po vysušení papír v digestoři
postříkáte aerosolem ninhydrinového činidla z rozprašovače a dáte do sušárny zahřát na 10 minut
při 110 oC. Frakce obsahující aminokyseliny se zbarví červeno-fialově. Pokud je i desátá skvrna
intenzivně zabarvená ve vymývání a detekci budete pokračovat. V této fázi jsou ze směsi
odděleny kyselé aminokyseliny.
Pokud už nejsou v posledních či dalších zkumavkách aminokyseliny, uzavřete kohout a
v zásobní odměrné baňce vyměníte pufr za citrátový pufr, pH 6 a necháte ho protéct hadičkou až
k zátce. Poté zátkou uzavřete znovu kolonu a do čistých zkumavek budete jimát frakce 11-20
opět po 5 mL. Po najímání všech frakcí proměříte a zapíšete pH ve zkumavkách a provedete
detekční test na aminokyseliny s ninhydrinem. Pokud již 20 zkumavka neobsahuje aminokyseliny
vyměníte eluční pufr za 50 mM Tris/HCl pufr, pH 9 a jímáte další frakce 21-30, které obsahují
bazické aminokyseliny. Opět proměříte pH jednotlivých zkumavek a uděláte test na
aminokyseliny.
Během celé chromatografie provádějte na kapkovací destičce test na arginin. Vždy
v rozmezí zhruba 20 vytečených mililitrů z kolony odeberete do jamky na kapkovací destičce asi
4 kapky eluátu, přidáte k nim jednu kapku 10% NaOH, 2 kapky etanolického roztoku α-naftolu a
kapku alkalického bromnanu. Reakci si nejprve vyzkoušejte s jednou kapkou zásobního roztoku
argininu. U pozitivní reakce si poznačte zhruba objem vytečeného eluátu od začátku
chromatografie.
VYHODNOCENÍ
1) Sestrojte eluční profil chromatografie (chromatogram) – závislost objemu vytečeného eluátu
na pH a vyznačte místa, ve kterých z kolony vytékaly aminokyseliny.
2) Rozhodněte, která z aminokyselin (valin, arginin, serin) vytékala jako první, druhá a třetí a
proč? Pomoci vám může specifický test na arginin, popř. literatura.
3) Napište iontové formy všech tří aminokyselin, které existují ve vodných roztocích o pH 2, 6 a
10.
ÚKOL č. 23: Regenerace ionexu
Po skončené eluci se obvykle provádí regenerace ionexu. V malých analytických pokusech je
regenerace někdy neekonomická, protože množství ionexu v koloně je velmi malé a práce spojená
s regenerací je nákladnější. Pracuje-li se však ve větším měřítku, je třeba regeneraci provést.
Jestliže již byly eluovány všechny látky nanesené na kolonu, uskuteční se regenerace promytím
startovním pufrem. Kontrolu ekvilibrace provedete tak, že změříme pH a vodivost ve vytékající
kapalině. Jestliže však některé látky zůstanou zadrženy v koloně, je třeba je vymýt. Chcete-li tak
učinit u látek navázaných silami iontové povahy, zvýšíte iontovou sílu. K odstranění látek, které na
koloně vyprecipitovaly nebo jsou velmi pevně vázány, se dá použít 0,1 M NaOH, detergentů, které
se na ionex neváží, nebo organických rozpouštědel, jako je např. ethanol.
Většina ionexů, kromě gelových, se však musí po každém použití znovu nastavit do
požadovaného cyklu (zregenerovat). Jinak jejich kapacita rapidně klesá. Živcové ionexy se
střídavě promývají v 1-4 M roztocích HCl a NaOH, přičemž mezi jednotlivými cykly se vždy
nadbytečné ionty vymyjí destilovanou vodou do neutrální reakce. U celulosových ionexů se
používají mírnější podmínky - maximálně 0,5 M roztoky kyseliny či zásady. Pořadí kyseliny a
87
zásady je vždy takové, že anex se nejprve promyje v roztoku kyseliny a katex hydroxidu. Po
vymytí vodou se pak anex regeneruje v hydroxidu a katex v kyselině, po vymytí nadbytečných
iontů se ionexy stabilizují v pufru, ve kterém začíná dělení.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
Vývěva, skleněná nálevka s fritou, odsávací baňka, kádinky, skleněná tyčinka, pH papírky, pH
metr, konc. kyselina chlorovodíková, hydroxid sodný, citrátový pufr pH 3, použitý katex z kolony
Amberlite IR 120 (z předchozího cvičení).
POSTUP
Připravte si 100 mL 1 M roztoku NaOH. Použitý katex odsajte na fritě a přeneste do
roztoku hydroxidu. Za občasného míchání skleněnou tyčinkou nechejte stát katex v roztoku
hydroxidu asi 1/2 hodiny. Roztok hydroxidu poté dekantujte a promývejte několikrát
destilovanou vodou. Nakonec odsajte a na fritě ještě několikrát promyjte vodou až do neutrální
reakce. Pomocí pH papírku analyzujte výtok ze stopky frity. Připravte si 100 mL 1 M roztoku HCl
a katex do něj převeďte a nechejte za občasného míchání stát při laboratorní teplotě. Po 1/2
hodině opět dekantujte a na fritě promývejte až do neutrální reakce. Poté katex ekvilibrujte
v citrátovém pufru, pH 3, a to tak dlouho, až je jeho pH totožné s pH pufru.
Poznámka:
Roztoky hydroxidů připravujte vždy tak, že budete přidávat pevný hydroxid do vody.
Reakce je silně exotermická, a kdyby jste lili vodu přímo na hydroxid, mohlo by dojít
k přehřátí skla a jeho prasknutí.
Stejně tak postupujte při ředění kyseliny, přidávejte ji vždy do vody.
Ionexy a ostatní strukturované náplně chromatografických kolon nikdy nemíchejte na
elektromagnetických míchadlech, mohlo by dojít k jejich narušení.
Doporučená literatura:
Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.
Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.
Anzenbacher, P. a Kovář, J.: Metody chemického výzkumu pro biochemiky, VN MON Praha, 1986.
Voet, D.A. a Voet, J.G.: Biochemie, Academia Publishing Praha, 1995.
88
Laboratorní cvičení č. 11
CHROMATOGRAFIE NA TENKÉ VRSTVĚ A GELOVÁ CHROMATOGRAFIE
GELOVÁ CHROMATOGRAFIE
Tento typ chromatografie je jednou z nejpoužívanějších metod v preparativní chemii
biopolymerů. Na rozdělování látek při gelové chromatografii mají rozhodující vliv rozměry jejich
molekul. Na pórovitém gelu (také nazývaném molekulové síto) dochází k zadržování malých
molekul tím, že pronikají do nitra částic gelu (obr. 38). Molekuly, které jsou tak veliké, že
neprojdou póry, se nezadržují a vymývají se z kolony rychleji. Malé molekuly jsou tedy
zpomalovány více než velké a jednotlivé složky směsi se uvolňují ze sloupce v pořadí klesající
velikosti molekuly (relativní molekulové hmotnosti, viz obr. 39). Kriteriem rozdělení látek je
velikost pórů v částicích gelu. Gel by neměl obsahovat žádné specificky ani nespecificky
adsorbující skupiny, aby nedocházelo k dělení látek jiným mechanismem. Jde v podstatě o typ
rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina, kde stacionární fáze je kapalina
zakotvená v gelu. Stejná kapalina tvoří mobilní fázi, která protéká mezi částicemi gelu.
V literatuře se můžeme setkat s různými názvy pro
gelovou chromatografii. Pro oddělování látek s velmi
rozdílnými molekulovými hmotnostmi, např. při odsolování
bílkovin, používáme hlavně termín gelová filtrace. Proces
separace látek s blízkými molekulovými hmotnostmi je pak
nazýván jako gelová permeační chromatografie (GPC – gel
permeation chromatography). Často se také můžeme setkat
s termínem kapalinová vylučovací chromatografie, který je
z teoretického hlediska asi nejvhodnější.
Obrázek 38: Zadržování
částic v pórech gelu.
Jednotlivé typy gelů lze charakterizovat tzv. frakcionačním rozsahem gelu, což je rozmezí
molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž jejich změna způsobuje změnu v elučním
objemu (objem mobilní fáze, který proteče kolonou od nanesení vzorku až po dobu, kdy je daná
látka z kolony vymývána, viz cvičení č. 10). Nejčastěji používaným typem gelu jsou Sephadexy.
Obrázek 39: Princip gelové chromatografie
89
Sephadexy jsou vyráběny z fragmentů dextranu, což je polysacharid s relativní
molekulovou hmotností okolo 107 – 108, který vzniká ze sacharosy působením bakterie
Leuconostoc mesenteroides. Dextranová vlákna se pak zesíťují příčnými vazbami působením
epichlorhydrinu (obr. 40). Stupeň zesíťování a s tím související velikost póru lze ovlivnit
vzájemným poměrem epichlorhydrinu a dextranu. Jednotlivé typy Sephadexů se označují číslicí a
písmenem. Na odsolování se nejčastěji používají Sephadexy s nižším číslem. Pro dělení látek o
vyšších molekulových hmotnostech Sephadexy G-75, G-150 nebo jiné typy gelů, jako je
Sepharosa, Sephacryl, Bio-gel atd.
Obrázek 40: Část zesíťované struktury Sephadexu
Gelové permeační chromatografie se velmi často užívá pro stanovování relativní molekulové
hmotnosti makromolekul. Před vlastní chromatografii daného vzorku je nutno provést separaci
standardů o známé relativní molekulové hmotnosti a z jejich elučních objemů sestrojit závislost.
Většinou vynášíme závislost retenčního času na logaritmu molekulové hmotnosti. Z retenčního
času vzorku o neznámé hmotnosti, který je chromatografován za stejných podmínek jako směs
standardů, pak jednoduše odečteme jeho relativní molekulovou hmotnost. Podmínkou je, aby
vzorek nebyl znečištěn látkami o přibližně stejné molekulové hmotnosti, které zkreslují retenční
čas vzorku. Důležité je také vhodné zvolení typu gelu tak, aby se do jeho frakcionačního rozsahu
vešly všechny standardy a samozřejmě i vzorek. Na obrázku 41 je znázorněn eluční profil směsi
standardů na koloně Superosy 12 HR používané v systému FPLC (fast protein liquid
chromatography).
Odsolování roztoků biopolymerů pomocí gelové chromatografie (gelová filtrace) bývá často
vhodnější než dialýza. Odsolováním nestabilních biopolymerů dialýzou dochází někdy k jejich
denaturaci z důvodu časové náročnosti procesu. Používá se nejčastěji Sephadex G-25, pro
odsolování biopolymerů s relativní molekulovou hmotností nad 30. 000 je pak vhodnější Sephadex
G-50. Důležitá je také délka kolony, při větších objemech nanášeného vzorku je nutno úměrně
zvyšovat délku náplně v koloně tak, aby se během průtoku směs nízko a vysokomolekulárních látek
stačila od sebe oddělit. Obecně se udává, že při gelové chromatografii by měl činit objem
nanášeného vzorku maximálně 1-2% z celkového objemu kolony. Pro gelovou chromatografii se
proto používají kolony 75 cm dlouhé a často i delší.
90
Obrázek 41: Typický chromatogram směsí proteinů na koloně Superosy 12 HR. 1 – protilátka
IgG (Mr 160.000), 2 – hovězí sérový albumin (Mr 67.000), 3 – β-laktoglobulin (Mr 37.000), 4 –
cytochrom c (Mr 12.400), 5 - vitamin B12 (Mr 1.355), 6 - cytidin (Mr 246).
CHROMATOGRAFIE NA TENKÉ VRSTVĚ
Tato varianta provedení chromatografického pokusu se nejčastěji provádí u adsorpční,
případně u rozdělovací a ionexové chromatografie. TLC používáme především pro analýzu
zkoumané směsi, v menší míře pro preparativní účely. Hlavní využití má TLC při separaci
nepolárních látek.
Pro tenkovrstvou chromatografii se používají sypané vrstvy (např. oxid hlinitý, celulosa),
které jsou však kvůli mechanické stabilitě méně vhodné než vrstvy lité. Adsorbent je nanášen na
podložku ve stejnoměrné vrstvičce pomocí skleněné tyčinky s gumovými zarážkami (viz obr. 42).
Obrázek 42: Příprava sypané tenké vrstvy.
Obrázek 43: Vyvíjení sypané vrstvy
v horizontální poloze. A – deska s vrstvou,
B – rozpouštědlo.
Lité vrstvy se připravují ze suspenze stacionární fáze (např. silikagel) a pojidla (např.
sádra). Nejpoužívanější jsou komerčně dostupné lité vrstvy Al2O3 na hliníkové fólii známe pod
názvy Silufol či Alufol. Cenově dražší jsou vrstvy, kdy je jako nosič použito sklo a na něj upevněn
silikagel nebo celulosa. S oblibou se používají i polymerní nosiče s nanesenou vrstvou polyamidu.
91
Vlastní
provedení
tenkovrstvé
chromatografie může probíhat v několika
uspořádáních. Klasické je šikmé uspořádání,
kdy desku s tenkou vrstvou umístíme do
vyvíjecí nádoby (chromatografická komůrka)
asi pod úhlem 20 stupňů a na dno nádoby
nalijeme rozpouštědlo (obr. 43). Důležité je,
aby
chromatografická
komůrka
byla
uzavřena a atmosféra uvnitř se mohla
nasytit párami rozpouštědla. Pokud je deska
umístěná v komůrce vertikálně, mluvíme o
chromatografii vzestupné nebo sestupné,
v závislosti na tom, zda je rozpouštědlo
umístěno dole nebo nahoře. Vzestupná
chromatografie se provádí ve speciálních
komůrkách, ve kterých lze vyvíjet i více
chromatogramu najednou (obr. 44). Při
sestupné chromatografii se jako nosič
většinou používá speciální chromatografický
papír (komerčně dodávaný pod značkou
Whatman), který se zavěsí do nádobky
s rozpouštědlem (obr. 45).
Obrázek 44: Vyvíjecí komora pro větší
počet desek.
Připomeňme jen, že papírová chromatografie je založená na principu rozdělovací
chromatografie, na rozdíl od výše uváděných chromatografii na tenkých vrstvách, které
především fungují na principu adsorpční chromatografie. Papírová chromatografie ve vertikálním
uspořádání se provádí většinou jako kruhová. Doprostřed papíru umístíme knot, kterým vzlíná
rozpouštědlo a kolem něj nanášíme vzorky, které pak migrují k okraji papíru (obr. 46).
Obrázek 45: Zařízení pro sestupnou
papírovou chromatografii
Obrázek 46: Kruhové vyvíjení papírové
chromatografie
Velkou předností chromatografie na tenkých vrstvách je velká časová úspora, malá
spotřeba látek i rozpouštědel, minimální experimentální zařízení a snadné provedení. Jelikož při
TLC a papírové chromatografii nemůžeme přímo zjistit charakteristickou veličinu udávající
mobilitu dané látky – eluční objem či retenční čas jako u sloupcové chromatografie, používá se
pro charakterizaci a identifikaci látek jiná veličina, tzv. retenční faktor Rf. Retenční faktor
udává poměr vzdálenosti středu skvrny látky od startu (VM) ku vzdálenosti čela mobilní fáze (VR),
tj. vzdálenost kam až doputuje mobilní fáze.
Rf = VM / VR
Při separaci směsi látek je vždy žádoucí provádět i chromatografii standardů v tomtéž
pokusu. Identifikace je pak snadnější. Kvantitativní vyhodnocení se provádí denzitometricky nebo
vyškrabáním a následnou elucí jednotlivých skvrn (změřením koncentrace látek v eluátech).
Detekce látek při tenkovrstevné a papírové chromatografii se provádí různými způsoby:

přímá – skvrny barevných látek jsou dobře vidět pouhým okem (např. rostlinná barviva),

absorpce světla v UV oblasti – používá se adsorbentu obsahující fluoreskující složku, po
osvětlení UV světlem deska fluoreskuje pouze v místech rozdělených látek jsou vidět tmavá
místa,

fluorescence – některé látky po ozáření UV světlem samy svítí (např. některé alkaloidy),

specifické barvení – chromatogram se obvykle vyvíjí postříkáním nějakým specifickým
činidlem, které se separovanou látkou tvoří barevné produkty, např. ninhydrin je specifické
činidlo na aminokyseliny, se kterými dává fialově-červené produkty,

izotopové techniky – látky jsou označeny radioaktivními izotopy a při vyhodnocování se měří
vznikající radioaktivita.
ÚKOL č. 24: Chromatografie karotenoidů z papriky na tenké vrstvě
Karotenoidy jsou rostlinná barviva rozpustná v tucích, v přírodě hojně zastoupená ve všech
rostlinných druzích, obvykle zbarvena žlutě, oranžově a červeně. Některé typy karotenoidů se
nacházejí i v říši živočišné, dávají například charakteristické zabarvení plameňáků, kanárků, raků
nebo třeba slunéčka sedmitečného. Z chemického hlediska je lze řadit do skupiny terpenoidů,
tzn. látek odvozených od izoprenové podjednotky. Používají se především jako nezávadná,
přirozená barviva v potravinářském a kosmetickém průmyslu. V rostlinném organismu jsou
nezbytné pro růst a fotosyntézu, pro člověka jsou nezastupitelným zdrojem vitaminu A, jehož
jsou prekurzorem. V současné době se také hovoří o jejich schopnosti snižovat některá rizika
rakoviny. Hojně se využívají jako antioxidanty zachycující pro organismus nebezpečné volné
radikály.
Lycopen (rajče)
Beta-karoten (mrkev)
Kapsantin (paprika)
93
(kukuřice)
Obrázek 47: Nejznámější typy karotenoidů, jejich vzorce a typicky výskyt.
Extrakt z papriky (Capsicum annum) obsahuje 37 – 54 pigmentů, počet závisí na způsobu
izolace. Většina z nich je na bázi karotenoidů. Hlavním pigmentem papriky je červený kapsantin a
kapsorubin, žluto-oranžový beta-karoten a žluté luteiny a xantofyly. Karotenoidy z papriky
budete chromatografovat v nepolárním benzenu. Mobilita jednotlivých molekul závisí na jejich
polaritě, tzn. především na počtu hydroxy skupin.
POZOR: Pracujete s karcinogenním benzenem. Chraňte se rukavicemi a pracujte v digestoři!
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
Skleněná vana, velká a malá skleněná deska, skleněná tyčinka s gumičkami, odměrné válce, třecí
miska s tloučkem, pipety, kádinky, nálevka, filtrační kruh, filtrační papír, vodní lázeň, odpařovací
miska, umělohmotné zátky, Silufol, Al2O3 pro chromatografii, benzin, benzen, červená paprika.
POSTUP
Odvážte 1 gram suché papriky a ve třecí misce jej rozetřete s 10 mL směsi benzin -benzen
(4:1). Karotenoidy společně s dalšími látkami přejdou do rozpouštědla. Extrakt odfiltrujte přes
hladký suchý filtr do kádinky. Pozor, veškeré sklo musí být dokonale suché! Na vodní lázni
zfiltrovaný extrakt odpařte do sucha a odparek rozpusťte v 1 mL čistého benzinu.
Příprava sypané tenké vrstvy: Menší skleněnou destičku si položte na stůl a na jeden
z jejich konců nasypte hromádku oxidu hlinitého určeného pro chromatografii. Pak opatrně
skleněnou tyčinkou na konci s gumičkami projeďte po celé délce skla tak, aby se na jeho povrchu
vytvořila jednolitá vrstva oxidu hlinitého. Destičku opatrně chytněte za hrany a přeneste do
ploché skleněné vany, na jejíž jeden konec si předem položíte dvě umělohmotné zátky (obr. 43).
Destička je umístěná šikmo pod úhlem asi 20º. Asi centimetr od spodního okraje naneste
jako souvislou čáru v délce okolo 3 centimetrů extrakt z papriky. Vzorek nanášejte automatickou
pipetou s rozsahem 20-200 mikrolitrů. Na dno nádoby nalijte čistý benzen tak, aby začal vzlínat
po destičce nahoru a nádobku překryjte velkým sklem. Chromatogram nechejte vyvíjet a sledujte
rozdělování jednotlivých barviv.
Stejný vzorek extraktu z papriky rozdělte vzestupnou chromatografii na vrstvě silufolu.
Z folie silufolu si odstřihněte pruh asi o šířce 2 cm. Silufol stříhejte v rukavicích, aby jste ho
zbytečně neznečistili. Asi 1 cm od jednoho konce folie nanesete vzorek. Pruh silufolu umístěte do
odměrného válce, na jehož dno nalijete mobilní fázi – benzen. Dbejte na to, aby hladina
rozpouštědla nezasahovala do naneseného vzorku. Válec uzavřete převrácenou kádinkou a
nechejte chromatogram vyvíjet. Jakmile rozpouštědlo vyvzlíná na 1 cm pod horní konec folie,
chromatogram vyjměte a nechejte na vzduchu oschnout.
94
VYHODNOCENÍ
1) Porovnejte účinnost obou provedení tenkovrstevné chromatografie a rozhodněte, které
dělení je lepší.
2) Vyvinutý chromatogram na silufolu překreslete do protokolu a podle barvy jednotlivých pruhů
se pokuste určit, o které karotenoidy jde. V potaz berte i polaritu jejich molekul.
3) Z chromatografie na silufolu vypočtěte retenční faktory pro jednotlivá barviva.
95
ÚKOL č. 25: Gelová chromatografie proteinu s nízkomolekulární látkou
V této úloze budete od sebe oddělovat pomocí gelové filtrace hemoglobin a síran nikelnatý.
Průběh gelové filtrace je možno dobře sledovat díky barevnosti obou látek. Nikelnaté ionty jsou
zelené. Krevní barvivo hemoglobin má červeno-hnědou barvu. Jde o sloučeninu proteinu – globinu a
prostetické skupiny – hemu, na který je vázáno dvojmocné železo. Molekula hemoglobinu je
tetramer, to znamená, že se k sobě vážou čtyři základní jednotky globinu s hemem. Celková
molekulová hmotnost tohoto tetrameru je 67.000 kDa.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE
75 cm dlouhá kolona na chromatografii, nabobtnalý Sephadex G-25, odměrná baňka 1 L, hadička
se zátkou, kádinky, zkumavky, pipety, spektrofotometr Shimadzu UV 1204, konduktometr,
kyvety, injekční stříkačka, směs hemoglobinu a síranu nikelnatého.
POSTUP
75 cm kolonu naplněnou Sephadexem G-25 postavte na židli do těsné blízkosti pracovního
stolu na jehož horní polici umístíte jednolitrovou odměrnou baňku naplněnou destilovanou vodou.
Baňku spojte pomocí gumové hadičky se zátkou s horním ústím kolony a nasajte do ní stříkačkou
vodu tak, aby po otevření kolony voda kontinuálně protékala z odměrné baňky přes kolonu. Pod
kolonu umístěte kádinku, do které bude voda odkapávat. Kolonu nechejte asi 20 minut promývat
vodou.
POZOR:
Nikdy nenechejte kolonu vyschnout!!! Dbejte na to, aby nad sloupcem gelu v koloně bylo vždy
alespoň minimální množství vody.
Během chromatografie hlídejte zásobník s vodou, aby v něm bylo vždy dostatek vody,
vyhnete se tím nechtěnému vyschnutí kolony.
Při každém vyschnutí sloupce gelu je nutno kolonu vždy znova přeplnit.
Když je kolona dostatečně promytá vodou, zavřete kohoutek kolony, tlačkou zastavte
průtok vody v hadičce a oddělejte zátku z kolony. Pak opatrně kohoutkem odpusťte vodu ze
sloupce gelu právě tak, aby se klesající hladina vody zastavila na začátku sloupce gelu.
Napipetujte opatrně 1 mL vzorku na sloupec gelu a nechejte vsáknout. Pod kolonu umístěte 100
mL odměrný válec. Po vsáknutí vzorku na sloupec naneste 1 mL vody a nechejte vsáknout, totéž
ještě jednou s vodou zopakujte a až poté na kolonu opět zapojte hadičku ze zásobníku a nechejte
vodu volně protékat. Sledujte dělící se látky na koloně jako dva barevné pruhy. Po odkapání 50 mL
vody z kolony začněte jímat do předem připravených zkumavek (25) frakce po 3 mL. Pokud
nemáte kalibrované zkumavky, vyznačte si na ně ryskou objem 3 mL. Pokud i po odebrání 25
frakcí stále vytéká z kolony barevný roztok, jímejte do dalších zkumavek až do okamžiku, kdy už
eluát není na první pohled zabarven.
Po ukončení chromatografie nechejte kolonu ještě asi 20 minut promývat vodou. Najímané
frakce analyzujte. Nejprve proměřte pomocí spektrofotometru Shimadzu absorbance
jednotlivých frakcí při 410 nm, což je vlnová délka maximální absorbance hemové skupiny
hemoglobinu.
Koncentraci nízkomolekulární látky – nikelnaté soli budete detekovat na základě zvýšené
vodivosti roztoku. Pomocí konduktometru proměříte vodivost všech frakcí. Do konduktometrické
cely napipetujete vždy přesně 1 mL vzorku a po rysku doplníte destilovanou vodou. Pak do cely
ponoříte čidlo konduktometru a na displeji odečtete hodnotu vodivosti v μS.cm-1. Mezi
jednotlivými měřeními vždy opláchnete čidlo konduktometru destilovanou vodou.
96
VYHODNOCENÍ
1) Sestrojte chromatogram závislosti elučního objemu na absorbanci při 410 nm a vodivosti.
Vyznačte maxima příslušející nejvyššímu výtoku jednotlivých složek. Podařilo se vám od sebe
dokonale oddělit nízko- a vysokomolekulární látky?
2) Na koloně Sephadexu G-200 dělíte směs cytochromu c, riboflavinu a pepsinu. Která látka
bude z kolony vytékat jako první, která jako druhá a třetí?
Doporučená literatura:
Anzenbacher, P. a Kovář, J.: Metody chemického výzkumu pro biochemiky, VN MON Praha, 1986.
Lábler, L. a Schwarz, V.: Chromatografie na tenké vrstvě, Nakladatelství ČAV, 1965.
Voet, D. a Voet, J. G.: Biochemie, Academia Publishing Praha, 1995.
Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.
Mikeš, V.: Základní biochemické praktikum, Vydavatelství MU Brno, 1992.
Karlson, P.: Základy biochemie, Academia Praha, 1965.
97
Laboratorní cvičení č. 12
PRÁCE S MIKROSKOPEM
Světelná mikroskopie je základní metodou pozorování ve všech biologických oborech,
jejichž předmětem je buňka (tkáň, pletivo, mikroorganismus), protože rozlišovací schopnost této
metody odpovídá velikosti buněk a mnohých organel. Světelná mikroskopie využívá k zobrazení
světelných paprsků (elektronová mikroskopie proudu elektronů).
Podle osvětlení objektu rozlišujeme:

mikroskopie v procházejícím světle (světlo prochází pozorovaným objektem).

mikroskopie v dopadajícím světle (světlo dopadá shora na povrch objektu).
Řadíme sem mikroskopii
-
ve světelném poli
-
v temném poli
-
fázově kontrastní
-
interferenční
-
polarizační
-
fluorescenční
-
v neviditelných paprscích (UV, RTG, IČ)
Podle osvětlení okolí objektu rozlišujeme:

mikroskopie ve světelném poli (zobrazený objekt má tmavý obrys a nalézá se ve světelném
zorném poli). Tato metoda je základní a užívá se nejběžněji.

mikroskopie v temném poli (světlý objekt je v černém - temném poli). Užívá se pro zvláštní
případy.
SLOŽENÍ SVĚTELNÉHO MIKROSKOPU (obr.48)
Mechanické díly: stativ, noha stativu, šroub pro hrubé a jemné zaostření, stolek
mikroskopu, vodič preparátu, revolverový měnič objektivů, objímka pro kondenzor, objímka pro
filtr. U starých mikroskopů úchytka pro zrcátko, pružinky pro přidržení preparátu.
Optické díly: objektivy, okuláry, kondenzor s aperturní irisovou clonou. U starých
mikroskopů zrcátko.
Osvětlovací zařízení: lampa v noze stativu s kolektorovou čočkou. Staré mikroskopy
samostatnou mikroskopickou lampu.
Clony: pod kondenzorem aperturní irisová clona, dále polní clona.
Objektiv je základní optický prvek mikroskopu (obr. 49). Vytváří zvětšený převrácený
obraz předmětu v horní ohniskové rovině objektu. Tento obraz zvětšuje okulár. Zvětšený obraz je
registrován oční sítnicí nebo fotografickým filmem.
ČÍSELNÁ APERTURA
Rozlišovací schopnost objektivu je vyjádřena jeho číselnou (numerickou) aperturou A
(apertura = lat. otvor):
A = n . sin ω
kde n = index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem (pro vzduch je n = 1, pro imerzní olej
a sklo n = 1,5), ω je poloviční otvorový úhel. Je to polovina úhlu ω, který svírají protilehlé krajní
98
paprsky vycházející z předmětového bodu (P) na optické ose mikroskopu a vstupující ještě do
objektivu (O). Předmětovým bodem rozumíme kterýkoliv bod či strukturu mikroskopického
objektu (obr. 50).
Číselná apertura objektivu má velký praktický význam:

Určuje rozlišovací schopnosti a hranice užitečného zvětšení.

Ovlivňuje světelnost mikroskopického obrazu: světelnost obrazu je přímo úměrná čtverci A a
nepřímo zvětšení objektivu

Ovlivňuje hloubku ostrosti. Snížením A objektivu se zvětšuje tloušťka zobrazené vrstvy
preparátu. Objektivy s velkou hodnotou A mají malou penetrační (pronikací) schopnost,
zobrazují velmi tenkou vrstvičku. Pro svůj zásadní význam je údaj A uveden na každém
objektivu vedle údaje zvětšení.
Obrázek 48: Binokulární mikroskop.
Složení mikroskopu
port pro kameru
rtuťová výbojka
okuláry
trinokulární
hlavice
nosič „flourescenčních
kostek“
nosič objektivů - revolver
Halogenová žárovka pro
pozorování v
procházejícím světle
objektivy
stolek
kondensor
aperturní clona
polní clona
kolektor osvětlovače
LBD filtr
ND filtr
99
Obrázek 49: Objektivy.
okulár
mechanická
tubusová
délka
objektiv
Parfokalita objektivů
objekt
kondenzor
aperturní clona
Barevný proužek
- zvětšení
Optická
korekce
Mechanická tubusová
délka
polní clona
preparát
Zvětšení
N.A.
Tloušťka
krycího
skla
Pracovní
vzdálenost
stolek
Obrázek 50: Číselná apertura (A) objektivu závisí na velikosti otvorového úhlu (2 ω) a na indexu
lomu (n) media mezi objektem (P) v preparátu (pr) a čelní čočkou objektivu (O). Paprsky
vystupující z bodu P pod úhlem větším než 2 ω by se do objektivu nedostaly.
Poznatky pro subjektivní mikroskopii lze souhrnně vyjádřit pojmem rozlišivost mikroskopu
(dm). Veličina dm informuje o tom, jaké nejmenší rozměry musí mít předmět, abychom jej při
určitém celkovém zvětšení mikroskopu dobře rozlišili svýma očima. Vypočítá se podle vzorce:
327 μm
dm = ------------100
M
kde dm je minimální velikost předmětu v μm, 327 μm je vzdálenost dvou bodů, které průměrně
unavené oko rozliší jako dva body ze vzdálenost 250 mm, M je celkové zvětšení mikroskopu. M =
M objektivu x M okuláru x zvětšovací koeficient tubusu, který se rovná jedné při dodržení
předepsané tubusové délky mikroskopu. Při subjektivním mikroskopování volíme celkové zvětšení
tak, aby hodnota rozlišivosti (dm) odpovídala velikosti objektu.
NEJZÁKLADNĚJŠÍ PRAVIDLA MIKROSKOPOVÁNÍ

Do optické osy mikroskopu nastavíme objektiv o menším zvětšení (4x nebo 10x).

Osvětlíme zorné pole a upravíme rozestup okulárů.

Zkontrolujeme čistotu optiky.

Položíme na stolek preparát a upevníme ho, vyhledáme a zaostříme obraz objektu.
Začátečníkům doporučujeme postupovat tak, aby se dívali ze strany na vrchol objektivu a
takto, pod kontrolou zraku, jej spouštěli makrometrem až do těsné blízkosti povrchu
preparátu. Teprve potom je možno sledovat zorné pole okulárem a současně zvedat tubus až
do okamžiku, kdy se objeví nejostřejší obraz.

Ověříme, zdali vidíme oběma očima (okuláry) stejně dobře.

Makrometrickým šroubem zachycený obraz doostřujeme mikrometrem.

Pohybujeme preparátem a pátráme po nejvhodnějším místě pro pozorování. Toto místo
posuneme doprostřed zorného pole.

Pro vlastní mikroskopování vyměníme objektiv podle potřeby za jiný a zkontrolujeme
nastavení vhodné apertury. K zaostření pak již stačí mikrometrický šroub.

Po nastavení potřebného zvětšení upravíme vhodně intenzitu světla a kontrast ovládáním
clony, případně kondenzoru.

Při vlastním studiu preparátů jemně pohybujeme mikrometrickým šroubem a tak zaostřujeme
různé roviny v preparátu. Pravou rukou můžeme kreslit.
Formy zobrazení mikroskopických objektů jsou v podstatě čtyři: kresba, mikrofotografie,
mikrokinemetografický záznam a videozáznam. Kterákoliv z uvedených forem může být
v černobílém nebo barevném provedení.
ÚDRŽBA MIKROSKOPU
Čistění optických částí se provádí vatovými tampónky nebo papírky na optiku stíráním ze
středu směrem na periferii nebo ze středu po spirále. Lze použít komerčně prodávané prostředky
na čistění optiky nebo směs isopropylalkohol + destilovaná voda (1:1) + kapka 1% roztoku SDS.
Čistící směs se nesmí nikdy aplikovat přímo na optiku, ale pouze zvlhčit čistící materiál. Nikdy
nepoužívejte korosivní látky a rozpouštědla. Prach se odstraňuje ofukováním balónkem.
Z mechanických částí se prach odstraňuje jemným štětečkem.
MIKROSKOPICKÝ PREPARÁT A OBJEKT
Mikroskopický preparát se skládá z podložního skla a krycího skla, mezi skly je medium a
v něm je uložen objekt. Preparát bereme zásadně za hrany. Preparáty typu krevního nátěru se
mohou pozorovat bez krycího skla. Dobře připravený preparát je předpokladem dobrého
zobrazení objektu.
Mikroskopické preparáty dělíme na:

čerstvé – dočasné (nativní)

trvalé (pracuje se s materiálem usmrceným, fixovaným, konzervovaným)
101
Čerstvé preparáty umožňují pozorovat pohyb a činnost celých buněk nebo organel.
Nevýhodou je omezený výběr materiálu a časové omezení. K přípravě čerstvých preparátů jsou
vhodné izolované buňky, části tkání a drobnohlední živočichové. Preparáty prohlížíme ve vodě
nebo ve fyziologickém roztoku. Fyziologická media jsou:

přirozená – krevní sérum, amiová tekutina

umělá – fyziologický roztok, Ringerův roztok aj.
U čerstvých preparátů používáme často vitální barvení. Rozlišujeme:

intravitální barvení – barvení živých, zcela neporušených buněk (př. prvoci)

supravitální barvení – barvení přežívajících buněk vyňatých z těla

postvitální barvení – barvení odumírajících buněk
Příprava čerstvého preparátu. Do středu podložního sklíčka přeneseme kapátkem kapku
vody nebo jiného media, do ní štětečkem, preparační jehlou nebo pinzetou vložíme připravený
vzorek. Byla-li kapka malá proniká vzduch pod krycí sklíčko, odstraníme ho přikápnutím vody
(media) těsně k okraji krycího sklíčka. Naopak, je-li vody pod krycím sklíčkem více a objekt se
pohybuje, musíme přebytečnou vodu odsát filtračním papírem. Dostane-li se voda na svrchní
stranu krycího sklíčka je nutné zhotovit nový preparát.
Krycí sklíčko pokládáme vždy nejdříve šikmo na hranu a pak zvolna spouštíme na objekt.
Trvalý preparát je uzavřen do tzv. uzavíracího média, kterým je nejčastěji kanadský
balzám. Před uzavřením se musí preparát odvodnit a to řadou alkoholů o vzestupné koncentraci.
Trvalé preparáty umožňují nejen lépe rozlišit jednotlivé struktury, ale především slouží jako
dokladový nebo demonstrační materiál.
K přípravě tenkých řezů používáme speciálních mikrotomů (obr. 51). Nejjednodušší ruční
mikrotom je tvořen dutým válcem na horním konci opatřeným černým hladkým stolkem, na
spodním otáčivou hlavicí mikrometrického šroubu, který ve svislém směru pohybuje svorkou
umístěnou uvnitř válce. Do ní se pomocí bočního šroubu upevní v bezové duši objekt, který se
řeže. Objekty se řežou břitvou. Mokrým štětečkem přenášíme řezy do vody (media).
Obrázek 51: Typy mikrotomů.
Ř e z á n í o b je k t ů :
– v o ln o u r u k ou
– s p o m oc í r u č n í h o m ik r o t o m u
– s t r o j n ím m ik r o to m e m
– rotač ní
– sáňkové
– k o n z o lo v é
102
ÚKOL č. 26: Mikrosublimace kofeinu
Hmota má schopnost přecházet ze skupenství pevného do kapalného či plynného a naopak.
Přechod ze stavu pevného do stavu plynného se nazývá sublimací. Této vlastnosti, kterou má
mnoho organických látek nacházejících se v léčivých rostlinách, se využívá ve farmakologických
laboratořích. Se sublimátem lze provádět řadu mikroreakcí.
Farmakologicky je zajímavý metylovaný xantin kofein - 1,3,7-trimethyl xantin, který je
obsažen v kávě i čaji. Kofein je jedním z důležitých léčiv, ovlivňujících krevní oběh.
Kofein lze prokázat tzv. murexidovou reakcí. Jedná se o barevný test na kyselinu močovou
a jiné puriny. Pevný vzorek je oxidován v kyselém prostředí, odpařen a následně po přídavku
amonných iontů vzniká purpurové zbarvení náležející vznikajícímu murexidu (amonná sůl 5, 5´nitrildibarbiturová kyselina).
kofein
murexid
O
H3 C
N
N
O
ONH4
CH3
N
HN
N
N
O
CH3
O
N
H
OO
NH
N
H
O
MATERIÁL
3x hodinové sklíčko o průměru asi 8-10 cm, filtrační papír, stojan, azbestová síťka, lihový vařič,
podložní sklíčka, kapátka, mikroskop, 3 % roztok H2O2, koncentrovanou HCl, čpavek.
POSTUP
Práškový čaj (asi na špičku nože) položte do středu hodinového sklíčka (můžete použít i
kofein izolovaný v lab. cvičení č. 4), přikryjte druhým, na jehož vrcholu je asi 3 x 3 cm velký
navlhčený kus filtračního papíru určeného ke chlazení. Přes azbestovou síťku zahřívejte sklíčko
asi 2 minuty. Horní sklo je možné vyměnit za chladné. Na spodní straně hodinového skla se vytvoří
jehličky kofeinu, které budete pozorovat pomocí mikroskopu. Poté proveďte tzv. murexidovou
reakci k prokázání přítomnosti kofeinu. Kontrolní reakci proveďte rovněž s firemním preparátem
kofeinu. Na hodinové sklo se sublimátem a na sklo s firemním kofeinem kápněte 3 % roztok H2O2
a koncentrovanou HCl. Roztok odpařte a přikápněte roztok čpavku. Purpurové zbarvení vám
prokáže přítomnost kofeinu.
VYHODNOCENÍ
Popište tvar a barvu vysublimovaných krystalů kofeinu. Krystaly zakreslete do protokolu.
Uveďte zda reakce na přítomnost kofeinu byly pozitivní.
ÚKOL č. 27:
plazmoptýza
Stavba
rostlinné
buňky
z pokožky
cibule,
plasmolýza,
deplasmolýza,
MATERIÁL
Cibule se zbarvenými suknicemi (v buněčné šťávě obsahují antokyan), žiletka, pinzeta, podložní a
krycí sklo, mikroskop, kapátka, 1 M roztok sacharózy, mikroskop.
POSTUP
Nařežte si několik čtverečků pokožky (asi 5 x 5 mm) přímo na suknici tak, že ostrou
žiletkou provedete nehluboké zářezy. Pinzetou snadno sloupnete vyříznuté čtverečky pokožky,
103
které rychle přenesete na podložní sklo do kapky vody nebo do kapky roztoku sacharózy.
Pozorovaný objekt překryjte opatrně krycím sklíčkem. Po ukončení pozorování tkáně v roztoku
sacharózy přikápněte na jednu stranu krycího sklíčka kapku vody a k druhé straně přiložte
proužek filtračního papíru, který vysaje z prostoru pod krycím sklem roztok sacharózy. Tento
úkon zopakujte několikrát do úplného odstranění sacharózy z prostředí okolo pozorované tkáně a
jejím nahrazení vodou.
VYHODNOCENÍ
Popište a zakreslete tvar buněk pokožky cibule ve vodném prostředí. Buňky jsou v jednom
směru protáhlé, mají velkou centrální vakuolu. Buněčná stěna je stejnoměrná silná a mezibuněčné
prostory nejsou vyvinuty, což souvisí s krycí funkcí pokožkových buněk. Jádro se nachází při
buněčné stěně a je bochníkovitého tvaru.
Zakreslete a popište vliv roztoku sacharózy na pokožkové buňky. V prostředí sacharózy
dochází k plasmolýze, která je způsobena tím, že buňky se nacházejí v hypertonickém prostředí a
voda z vakuol je odsávána. Vakuola se zmenšuje a cytoplasma se odchlipuje od buněčné stěny. Po
přidání destilované vody dochází k deplasmolýze, buňka se nachází v hypotonickém prostředí.
Voda vniká do vakuoly, která se zvětšuje a cytoplasma se dostává do původní polohy. Po déle
trvajícím pozorování mohou buňky praskat a červenofialový obsah vytéká do okolní vody. Vlivem
velkého osmotického tlaku dochází k prasknutí cytoplazmatické membrány i buněčné stěny.
ÚKOL č. 28: Pozorování fází buněčného cyklu v kořenech cibule
Genetická informace každého organismu je uložena v několika (příp. mnoha) molekulách
DNA (deoxyribonucleic acid – deoxyribonukleová kyselina) neboli chromosomech. Například lidské
buňky obsahují po 46 chromosomech, zatímco buňky cibule po 8 chromosomech. Sled pochodů, při
kterých každá buňka zdvojnásobí svůj obsah, včetně genetického materiálu a rozdělí se na dvě
dceřiné buňky, se nazývá buněčný cyklus. Buněčný cyklus eukaryotních buněk se dělí do čtyř fází:
G1 (gap), S (synthesis), G2 a M (mitosis). Doba mezi dvěma M-fázemi se nazývá interfáze.
Označení pochází z doby, kdy rozlišení pro pozorování buněk nebylo veliké a kromě syntézy DNA
(v S-fázi) a samotného dělení (v M-fázi) nebylo během buněčného cyklu nic vidět. Dnes již víme,
že je buňka metabolicky aktivní během celé interfáze, kdy dochází k syntéze např. nukleotidů a
histonů pro replikaci DNA, stejně jako mnoha dalších proteinů i nízkomolekulárních látek. Trvání
buněčného cyklu i poměr jednotlivých fází závisí na typu buňky a organismu.
Mitosa (M-fáze) má 4 fáze: profázi, metafáze, anafáze a telofáze zakončená cytokinezí
neboli samotným rozdělením buňky.
Během profáze jednotlivá vlákna DNA spiralizují a tzv. kondenzují. Vznikají chromosomy
pozorovatelné pod mikroskopem. Ke konci profáze se rozpouští jaderná membrána a jednotlivé
chromosomy jsou přichyceny na mikrotubuly vřeténka a pohybují se k ekvatoriální rovině buňky.
Tím začíná metafáze, během níž se rozdělí centromery, které spojují obě chromatidy
jednotlivých chromosomů. V okamžiku, kdy je každá chromatida (dceřiný chromosom) tažena na
opačnou stranu, hovoříme o anafázi. Pohyb chromatid se nazývá segregace. V telofázi se tvoří
kolem každé sady chromosomů nová jaderná membrána. Prakticky zároveň probíhá i cytokineze,
kdy se vytvoří přepážka mezi nově vzniklými buňkami. U rostlinných buněk vzniká buněčná
destička (fragmoplast) od středu buňky k obvodu (centrifugálně), zatímco u živočišných buněk se
plasmatická membrána tvoří od obvodu dovnitř (rýhováním, centripetálně).
Chromosomy nejsou v normálním světle viditelné, protože mají stejný lom světla jako
cytoplasma. Je možné je zviditelnit použitím fázového kontrastu nebo barvením. Nejčastěji se
používají acetobarviva (organická barviva v kyselině octové nebo propionové). Před vlastním
barvením se provádí fixace materiálu a macerace, při které se rozruší střední lamela mezi
104
buňkami, takže je pak možné preparát jemným tlakem rozložit do tenké vrstvy a není třeba ho
řezat. Tomu se říká roztlakový preparát.
Je vhodné vybrat materiál, kde dochází k intenzivnímu buněčnému dělení – meristémy,
které se nacházejí na vzrostném vrcholu stonku a v kořenové špičce.
MATERIÁL a CHEMIKÁLIE
nafixované kořenové špičky cibule kuchyňské (Allium cepa), podložní a krycí sklo, pinzeta, žiletka,
Pasteurova pipeta, preparační jehla, Schiffovo reagens, laktopropionový orcein (1g rozpustíme za
chladu v 50 l směsi kyseliny propionové a mléčné 1:1; po týdnu přefiltrujeme a uchováváme
v tmavé lahvi v chladu; zásobní roztok ředíme v poměru 10:3 destilovanou vodou a případně
zfiltrujeme), 5M HCl
POSTUP
Ustřihněte si asi 1 cm dlouhé kořínky cibule a vložte je do mikrozkumavky. Přidejte 5M HCl
a nechte působit asi 10 minut při laboratorní teplotě. Opláchněte kořínky destilovanou vodou a
jeden přeneste na podložní sklíčko a oddělte kořenovou špičku s meristematickým pletivem;
zbytek kořene vyhoďte. Kápněte na kořenovou špičku laktopropionový orcein nebo Schiffovo
reagens. Nechte působit 5 minut, poté přiložte krycí sklíčko a přitlačte plastovým koncem
preparační jehly. Opatrně, abyste sklíčkem neposunuli nebo neotočili!
VYHODNOCENÍ
Pozorujte preparáty pod mikroskopem a zakreslete do protokolu buňky v jednotlivých
fázích.
Porovnejte obě metody barvení.
ÚKOL č. 29: Histochemická reakce na lignin
Lignifikace je proces, při kterém se do celulózní kostry buněčné stěny ukládá lignin.
K nejznámnějším histochemickým reakcím, které umožňují identifikovat lignin, patří reakce
s floroglucinolem a reakce se síranem anilínu. Tyto reakce nejsou pro lignin specifické, nýbrž jsou
reakcemi uvedených činidel s koniferylaldehydem a jinými příbuznými látkami, které jsou
stavebními kameny ligninu.
MATERIÁL
Stonek semenáčků hrachu, kukuřice či fazolu, mikroskop, podložní a krycí sklo, pinzeta, kapátko,
štěteček, ruční mikrotom, žiletky, bezová duše, floroglucinolové činidlo (1g rozpustíme v 50 mL
ethanolu), 75% roztok glycerolu v 10% kyselině sírové, 25% HCl.
POSTUP
Uřízněte asi 3 cm špalíček bezové duše a rozřízněte ho napůl. Rukojetí špachtle do jeho
středu udělejte oboustranně žlábek. Do žlábku vložte 3 cm část stonku (segment) a bezovou duši
se segmentem upněte do ručního mikrotomu. Žiletkou mikrotomu připravte co nejtenčí příčné
řezy, které vložíte do vody. Po ukončení přípravy preparátu přeneste štětečkem jednotlivé řezy
do několika kapek floroglucinolu v Petriho misce. K řezům v misce přikápněte 1 kapku 25% HCl.
Asi po 2-5 minutách přeneste vybarvené řezy do roztoku glycerolu v kyselině sírové na podložním
skle, překryjte krycím sklíčkem a pozorujte mikroskopem. Pro kontrolu si nechejte několik řezu
jen ve vodě a porovnejte s nabarvenými řezy.
105
VYHODNOCENÍ
Zdřevnatělé buněčné stěny obsahující lignin se na řezu zbarví červeně až červenofialově.
Popište a zakreslete svá pozorování. Pomocí anatomického atlasu nebo jiné literatury pojmenujte
buňky, u kterých byla prokázána přítomnost ligninu.
Doporučená literatura:
Nováček, F.: Praktikum z rostlinné cytologie a histologie se základy mikroskopické techniky,
Vydavatelství UP Olomouc, 1982.
Knoz, J. a Opravilová, V.: Základy mikroskopické techniky, Vydavatelství MU Brno 1992.
Ruzin, S. E.: Plant microtechnique and microscopy, Oxford University Press, 1999.
106
Laboratorní cvičení č. 13
PRÁCE S MIKROORGANISMY VE STERILNÍM PROSTŘEDÍ, IZOLACE BAKTERIÁLNÍ DNA
A AGAROSOVÁ ELEKTROFORESA DNA
V současné době se moderní biochemický výzkum neobejde bez základních znalostí
molekulární biologie a metod používaných pro práci s mikroorganismy a rekombinantní DNA.
Pojmem rekombinantní DNA rozumíme takovou molekulu DNA, která se nevyskytuje v přírodě
přirozeně, ale vznikla zásahem člověka, který její primární strukturu (pořadí
deoxyribonukleotidů) upravil tak, aby měla vlastnosti, kterých se dá využít ve výzkumu či při
průmyslových výrobách. Rekombinantní DNA se nejčastěji využívá v genovém inženýrství, kde
např. vhodným zásahem do promotorových sekvencí genů můžeme mnohonásobně zvýšit expresi
genu v umělém expresním systému (baktérie, kvasinka) a získat tak velké množství
rekombinantního proteinu, které nelze získat standardními postupy izolace z rostlinného pletiva
či živočišné tkáně. V současné době je takto vyráběna řada proteinů (umělé hormony, doplňky
výživy atd.). V biochemickém výzkumu si lze molekulárně-biologickými postupy usnadnit práci
např. rekombinantní expresí málo abundantního proteinu (enzymu), který je možné následně
použít k imunizaci a přípravě protilátek proti tomuto proteinu. Nebo pomocí cílených mutací
primární aminokyselinové struktury proteinů můžeme následně sledovat a určovat aminokyselinová
residua, která mají esenciální vliv na funkci proteinu.
Elektroforesa, neboli migrace iontů v elektrickém poli, se velmi často používá pro analytické
dělení biologických látek, hlavně pak proteinů a nukleových kyselin. Elektroforesa většinou
probíhá na vhodném nosiči jako je papír, celulosa nebo polymerní gel.
Papírová elektroforesa
Při papírové elektroforese se vzorek ve formě tečky nanese na pruh filtračního papíru,
jehož konce se namočí do vhodných pufrů (elektrolyt). Po zapojení stejnosměrného proudu putují
ionty vzorku určitou rychlostí (která je závislá na charakteru iontu např. na jeho velikosti)
k opačně nabitým elektrodám. Po určité době působení proudu vznikají zóny odpovídající
jednotlivým složkám vzorku (bandy – proužky), které se vhodnou analytickou reakcí detekují.
Gelová elektroforesa
Gelová elektroforesa patří mezi
nejpraktičtější
a nejvýkonnější metody
používané pro dělení makrokolekul. U běžně
používaných gelů, jako je agarosa nebo
polyakrylamid, je možné ovlivnit velikost
jejích pórů a tím dosáhnout nejen dělení na
základě pohyblivosti v elektrickém poli, ale i
na základě velikosti molekuly. Při gelové
elektroforese se velké molekuly oproti
malým zpožďují, protože na rozdíl od gelové
filtrace (chromatografie) neexistuje při
elektroforese kolem gelu prostor pro volné
rozpouštědlo. Gel
je umístěn přímo
v elektrickém přístroji a pohyb velkých
molekul je proti pohybu malých molekul
zpomalen tím, že obtížněji pronikají gelem.
Obrázek 52: Komůrka pro vertikální
elektroforesu v polyakrylamidovém gelu.
107
Při polyakrylamidové gelové elektroforese (PAGE) je gel vytvořen polymerací akrylamidu a
N,N´-methylenbisakrylamidu. Gel bývá často připraven ve formě tenké obdélníkové vrstvy, ve
které je možno současně analyzovat několik různých vzorků (viz obr. 52). V případě dělení
proteinů bývá pH gelu kolem 9, aby molekuly měly záporný náboj a pohybovaly se k anodě
umístěné ve spodní nádržce. Každý vzorek se rozpustí v minimálním množství relativně hustého
roztoku (nanášecí pufr obsahující glycerol), aby se zabránilo smíchání vzorku s pufrem v horní
nádržce a nanese se na povrch gelu do předem vytvořené jamky. Při napětí asi 300 V prochází
gelem stejnosměrný proud po dobu nutnou k rozdělení makromolekul do řady jednotlivých
proužků. Gel se poté z přístroje vyjme a jednotlivé zóny se vhodně detekují. Nejčastějším typem
PAGE je elektroforesa v prostředí detergentu dodecylsulfátu sodného tzv. SDS-PAGE. SDS
denaturuje proteiny tím, že se na ně pevně váže a mění jejich terciální strukturu do válcovité
podoby. Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru a získává silný záporný náboj, tzn., že
proteiny pokryté SDS mají shodné poměry počtu nábojů na jednotku hmoty a podobný tvar.
Následkem toho se proteiny při elektroforese v prostředí SDS dělí pouze na základě své
molekulové hmotnosti. Vhodně zvolenou koncentrací akrylamidu v gelu lze pak dosáhnout optimální
dělení proteinů o určité velikosti s odchylkou do 5%. Nejčastěji používané koncentrace
akrylamidu jsou mezi 8-12%.
Druhým nejčastějším typem gelové elektroforesy je agarosová elektroforesa, která se
používá hlavně na dělení látek s velkou molekulovou hmotností (DNA, RNA). Aby byla zajištěná
dostatečná pohyblivost takto velkých molekul, musela by se použít velmi nízká koncentrace
akrylamidu (pod 3%) a gel by byl velice měkký a manipulace s ním komplikovaná. Agarosové gely
jsou i v nízkých koncentracích velmi pevné a koncentrace agarosy v nich je závislá na velikosti
dělených nukleových kyselin, od 3% pro fragmenty DNA a RNA mající desítky až stovky párů bází
po 0.8% pro fragmenty velikostí tisíců až desetitisíců párů nukleotidových bází. Chemicky je
agarosa polysacharid skládající se ze D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy, který se izoluje
z červených řas – ruduch. Nejčastější uspořádaní agarosové elektroforesy je horizontální (obr.
53 a 55), přičemž princip dělení je na rozdíl od proteinů vždy závislý pouze na velikosti nukleové
kyseliny, která je sama o sobě negativně nabitá a pohybuje se proto směrem od katody k anodě.
DNA však není v agarosovém ani polyakrylamidovém gelu možno vidět. Je proto nutné ji nějakým
způsobem obarvit nebo označit. Nejpoužívanějším barvivem pro DNA jsou planární aromatické
kationty, jako je např. ethidium nebo akridinová oranž, které se interkalují (vmezeří) do
struktury dvoušroubovice a po ozáření UV světlem následně fluoreskují. Proteiny se nejčastěji po
elektroforetickém dělení detekují na gelu pomocí barviva Coomassie brilliant blue nebo citlivější
metodou založené na redukci stříbra.
Obrázek 53: Schéma nanášení
vzorků
a
princip
agarosové
elektroforesy: 1. ztuhlý agarosový
gel,
2.
nanesení
standardu
molekulových hmotností, 3. nanesení
vzorků, 4. zapojení stejnosměrného
proudu, 5. průběh elektroforesy, 6.
ukončení elektroforesy.
108
Kapilární elektroforesa
Třebaže jsou různé formy elektroforesy v gelech snadné a lehce dostupné, obvykle
probíhají několik hodin a je nesnadné je automatizovat a také kvantitativně vyhodnocovat
výsledky. Tyto nedostatky lze obejít použitím kapilární elektroforesy, při níž se vzorky
makromolekul dělí ve velmi tenkých kapilárách (průměr 1 až 10 µm) zhotovených z křemene, skla
nebo plastu. Tyto tenké kapiláry rychle odvádějí teplo, takže mohou být použita elektrická pole
s vysokým napětím (obvykle 100 – 300 V na cm), což je asi stokrát více než v případě
standardních horizontálních nebo vertikálních elektrofores čas analýzyse tak sníží na několik
minut. Rychlé rozdělení také zamezuje difusnímu rozostření proužků. Kapiláry bývají plněny pouze
pufrem nebo velice málo koncentrovaným SDS-polyakrylamidovým gelem. Metody kapilární
elektroforesy mají velmi vysoký stupeň rozlišení a často bývají zcela automatizovány pro rychlé
analýzy velkého počtu vzorků. V současnosti má kapilární elektroforesa největší využití při
sekvencování nukleových kyselin (čtení pořadí jednotlivých bází v řetězci DNA), kdy je třeba
mezi sebou rozlišovat fragmenty DNA lišící se ve velikosti pouze jedním nukleotidem.
Práce ve sterilním prostředí
Při práci s DNA a mikroorganismy se velice často setkáváme s požadavkem celkově
sterilního prostředí. Znamená to, že veškerý materiál a chemikálie musí být zbaveny jakýchkoli
kontaminujících mikroorganismů a ostatních nečistot. Mikroorganismy (baktérie a kvasinky) jsou
nejčastěji používány k produkci rekombinantních nukleových kyselin či proteinů, kdy je množíme
za specifických podmínek v tzv. živných médiích. Živná média jsou roztoky základních živin –
aminokyselin, sacharidů, vitamínů atd., které umožňují rychlé množení a růst daného
mikroorganismu. Pokud by se dostaly do takto připravovaných médií náhodné mikroorganismy
z ovzduší, vody, či naších rukou, docházelo by také k jejich namnožení a znehodnocení
experimentálního vzorku. Všechny roztoky s kterými pracujeme, je proto třeba autoklávovat, tzn.
sterilizovat vodní parou za zvýšeného tlaku (120°C, 100 kPa). Autoklávovat lze i veškerý materiál
zhotovený z chemického skla či porcelánu a plastové pomůcky zhotovené ze speciálního odolného
plastu. Autoklávování je nejúčinnější, pokud na roztok či materiál působí pouze horká vodní pára
bez vzduchu. Autoklávy jsou proto složité tlakové nádoby, ze kterých je před vlastním zahřátím
vody odsán vzduch a následné natlakování je způsobeno pouze vodní parou. Odolný materiál lze
také sterilizovat v horkovzdušných pecích či sušárnách (1-6 hodin při 180-200°C).
Roztoky chemikálií (oligosacharidy, antibiotika atd.), u kterých hrozí za zvýšené teploty
rozklad, se sterilizují speciálními membránovými filtry. V současné době se nejvíce používají
nitrocelulosové filtry s různou velikostí pórů (20 – 100 µm) a průměru. Nitrocelulosové filtry jsou
většinou jednorázové a roztoky se jimi filtrují buď použitím negativního (vodní či mechanická
vývěva) nebo pozitivního (injekční stříkačka) tlaku. Viry procházejí většinou bakteriálních filtrů.
Rychlé sterilizace lze dosáhnout také UV zářením. Optimální baktericidní účinek má záření
o vlnové délce 254 nm. Malé předměty se takto sterilizují po dobu několika minut ve speciálních
sterilizátorech které jsou osazeny několika UV zářiči. Celé laboratoře, větší prostory a vzduch v
nich se sterilizuje germicidními lampami, které jsou vhodně rozmístěny v prostoru. Vzhledem
k tomu, že účinnost UV záření lineárně klesá se čtvercem vzdálenosti od zdroje záření, pro
sterilizaci větších prostorů se používá delší doby (vzhledem k tomu, že UV záření je pro živé
organismy mutagenní, zapínají se germicidní lampy v laboratořích většinou přes noc, nebo po
skončení práce). Nástroje, které se používají během experimentální práce opakovaně (pinzety,
očkovací kličky), se sterilizují otevřeným plamenem za předchozího opláchnutí v 70% ethanolu.
109
Při běžném provozu v laboratoři se však postupnému kontaminování prostředí nikdy
nevyhneme. Tato kontaminace pak může negativně ovlivňovat některé experimenty citlivé na
znečistění běžně se vyskytujícími bakteriemi či plísněmi. Často k takovéto kontaminaci dochází
při očkování kultur pokusnými bakteriemi či kvasinkami, otevírání zásobních láhví s živnými médií,
roztírání kultur na pokusné plotny či pěstování rostlin a živočišných buněk v in vitro podmínkách.
Tyto operace proto většinou provádíme ve speciálních laminárních boxech (též flow boxy). Jsou
to ze všech stran ohraničené pracovní plochy, ve kterých je řízené proudění vzduchu, který
prochází přes speciální mechanické filtry. Tím se vzduch přítomný v okolí experimentu neustále
zbavuje mikroorganismů a pevných nečistot. Laminární boxy mohou být s vertikálním či
horizontálním prouděním vzduchu a k jejích běžnému vybavení patří vlastní germicidní lampa,
která se zapíná vždy po skončení práce.
Dá se říci, že efektivita práce v molekulárně-biologické laboratoři velmi závisí na
dodržování základních návyků pro práci ve sterilních podmínkách. Je tedy nutné využívat všech
dostupných prostředků jak zabránit nechtěné kontaminaci. Udržovat čistotu a pořádek, pro úklid
využívat jednorázové papírové ubrousky, používat desinfekci na ruce nebo jednorázové
vyšetřovací rukavice, při sebemenším podezření na kontaminaci, roztok či materiál zlikvidovat či
znova sterilizovat, většinu manipulace s mikroorganismy směřovat do laminárních boxů, v rámci
možností používat jednorázový materiál, používat germicidních zářičů po skončení práce.
Izolace nukleových kyselin
Pro izolaci nukleových kyselin z živých organismů byla vyvinuta řada metod, které se od
sebe mohou dosti odlišovat. Pro stručnost tohoto textu budou popsány dvě základní. Prvním
krokem u všech metod je vždy lýze buněk, nebo pevné tkáně. U buněk většinou stačí rozrušit
buněčnou stěnu a membrány, nejčastěji se používají detergenty jako je dodecylsulfát sodný
(SDS) nebo Triton X-100. Pro izolaci DNA nebo RNA z rostlinných pletiv nebo živočišných tkání
je třeba nejdříve mechanického narušení, to provádíme buď mrazem – tekutým dusíkem nebo
různými typy homogenizátorů. Buněčný obsah včetně DNA se z lyzovaných buněk uvolní do
extrakčního pufru, který vždy musí obsahovat chelatační činidlo etylendiaminotetraoctovou
kyselinu (EDTA), která vychytá veškeré vápenaté ionty z extraktu. Vápenaté ionty fungují jako
kofaktory nukleas, enzymů které štěpí nukleové kyseliny, a pokud by tyto enzymy byly během
extrakce aktivní, naštěpily by nám veškeré izolované nukleové kyseliny. Do extrakčního pufru se
někdy přidávají navíc ještě proteinázy, enzymy štěpící proteiny. Většina DNA je totiž obalená
histony a jejich odstranění proteinasou zvýší čistotu izolované DNA.
Jeden typ metod je založen na extrakci směsi fenolu a chloroformu. Fenol se rozpouští ve
vodě i v chloroformu, preferuje ale chloroform. Chloroform se jako organické rozpouštědlo
s vodou nemísí. Přidáme-li tedy směs fenolu a chloroformu k extraktu ze živé tkáně, veškeré tuky
přecházejí do chloroformu, bílkoviny a část polysacharidů se působením organických rozpouštědel
vysráží a nukleové kyseliny zůstanou ve vodné fázi. Po intenzivní extrakci se směs zcentrifuguje a
vzniklé fáze od sebe oddělí. Vysrážené proteiny a sacharidy vytvoří na rozhraní bílou
prstencovitou sraženinu. Pro dokonalé odstranění polysacharidů se někdy používá činidlo
cetyltrimethylamonium bromid (CTAB). Pro vysrážení nukleových kyselin z vodné fáze nakonec
použijeme dvou a půl násobek objemu absolutního etanolu nebo isopropanol s přídavkem soli. Po
intenzivní centrifugaci nám pak nukleová kyselina vytvoří ve zkumavce opaleskující pelet, který
ještě několikrát promyjeme etanolem a nakonec rozpustíme ve vodě nebo vhodném pufru.
Novější metody využívají adsorpce nukleových kyselin na sklo v přítomnosti chaotropních
solí, jako je třeba guanidin thiokyanát. Extrakt nukleových kyselin se smíchá se silikátovými
kuličkami v přítomnosti chaotropní soli. Nukleové kyseliny se naváží na kuličky a ty se pak
110
promývají, tím se zbavujeme nečistot. Nakonec se nukleové kyseliny z kuliček uvolní snížením
iontové síly roztoku. Tato metoda je velice rychlá a efektivní a využívá se ve většině komerčních
sestavách např. v diagnostických laboratořích v nemocnicích.
V bakteriálních buňkách bývá část genetické informace kromě vlastní chromosomální DNA
uložená také v plasmidech. Plasmidy jsou krátké kruhovité úseky DNA nesoucí genetickou
informaci, která není esenciální pro život baktérie, např. geny pro rezistenci k různým typům
antibiotik. Uměle vytvořené plasmidy slouží v molekulární biologii pro různé klonovací a expresní
techniky. Plasmidy z bakteriální kultury nejčastěji izolujeme tzv. alkalickou metodou. Tato
metoda je založena na faktu, že většina chromosomální DNA, bakteriálních proteinů a SDS
precipituje při neutralizaci silně alkalického roztoku pomocí octanu draselného, kdežto
plasmidová DNA zůstává v roztoku. Precipitát odstraníme centrifugací a plasmidovou DNA ze
supernatantu vysrážíme etanolem. Pokud je požadována plasmidová DNA velmi vysoké čistoty, lze
pokračovat po odstranění chromozomální DNA a proteinů preparační centrifugací v gradientu
chloridu cesného. Další možností je precipitace polyetylenglykolem. Izolovanou DNA lze pak
skladovat po dobu několika týdnů v lehce zásaditém pufru o malé iontové síle v lednici, nebo
dlouhodobě zamraženou na -70°C.
Koncentraci izolované DNA nejčastěji měříme pomocí spektrofotometru. Nukleové
kyseliny absorbují nejintenzivněji světlo o vlnové délce 260 nm, takže hodnota absorbance je
přímo úměrná koncentraci DNA. Míru kontaminace proteiny pak můžeme určit z poměru
absorbancí při 260 nm a 280 nm, kde mají absorpční maximum proteiny. Pokud se tento poměr
pohybuje kolem hodnoty 1.8, je izolovaná DNA relativně čistá. Koncentraci DNA pak lze
zjednodušeně vypočítat dle vztahu cDNA = A260 /0.02 za podmínky, že jsme předem ze vzorku
odstranili specificky RNA, která má stejné absorpční maximum. Daleko citlivější stanovení
koncentrace DNA je pomocí fluorimetrie, kdy měříme fluorescenci DNA po smísení se
specifickým interkalačním barvivem.
ÚKOL č.30: Příprava agarových ploten
Mikroorganismy můžeme v laboratoři pěstovat buď na pevném kultivačním médiu nebo
v kapalném médiu. Oba typy médií musí být sterilní a jejich složení musí vyhovovat požadavkům
mikroorganismu na výživu svým pH a osmotickými poměry, musí obsahovat vhodný zdroj dusíku a
uhlíku a případně další látky esenciální pro růst mikroorganismu. Hlavní složky kultivačních médií
jsou získávány po kyselé nebo enzymatické hydrolýze kaseinu, fermentativní hydrolýze masa
(masový výtažek), autolýzou nebo hydrolýzou pekařského droždí (extrakt z kvasinek), působením
žaludečních šťáv na rostlinné a živočišné bílkoviny (pepton). Do pevných kultivačních médií
přidáváme 1-3% agar, který po autoklavování a ochlazení ztuhne.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:
Erlenmayerova baňka z připraveným ztuhlým sterilním LB agarem (složení na 100 mL: 1g
bakteriálního tryptonu, 0.5 g kvasničného autolysátu, 0.5 g NaCl, 1.5 g agaru, pH 7.0), sterilní
Petriho misky, flow box, kahan, mikrovlnná trouba, ampicilin 100 mg/mL sterilizováno přes filtr.
POSTUP:
V mikrovlnné troubě rozpustíme ztuhlý agar v Erlenmayerově baňce a necháme ochladit
zhruba na 50-60 ºC. V zapnutém flow boxu si nachystáme čtyři sterilní Petriho misky. Do dvou
misek sterilně nalijeme zhruba po 25 mL LB agaru. Do zbylých 50 mL agaru napipetujeme
111
ampicilin ze zásobního roztoku tak, aby jeho finální koncentrace byla 100 mg na litr. Zamícháme
krouživým pohybem ruky a rozlijeme do zbylých dvou misek. Při manipulaci s Erlenmayerovou
baňkou vždy opálíme její ústí nad kahanem. Po rozlití agaru do všech misek je necháme stát
v zadní části flow boxu s mírně pootevřeným víkem, aby odvětrala kondenzovaná voda. Víka každé
Petriho misky řádně popíšeme.
ÚKOL č. 31: Kultivace mikroorganismů na agarových plotnách
Prvním krokem každé kultivace (pomnožování) mikroorganismů je jejich přenesení z
uchovávacího média nebo přímo z odebraného vzorku do čerstvého živného prostředí, tomuto
přenesení říkáme očkování. Provádí se různými metodami, vždy je nezbytné zachovat všechna
pravidla sterilní práce tak, aby se do čerstvého média dostal pouze sledovaný mikroorganismus,
nikoliv kontaminace ze vzduchu, rukou, dýchacích cest nebo pracovní plochy. Mikroorganismus
vždy přenášíme pomocí bakteriologické kličky. Sterilizace kličky se provádí žíháním v plameni
kahanu. Celý drátek se vloží do plamene a nechá rozžhavit. Potom se ve svislé poloze nechá
vychladnout. Po naočkování je nutno vždy před odložením kličku sterilizovat žíháním. Kličku
vsuneme do zkumavky a do očka nabereme kulturu. Kličku vytáhneme, ožíháme hrdlo zkumavky a
zátku (kterou stále držíme malíkem pravé ruky) a zkumavku uzavřeme. Mikroorganismus na plotnu
přenášíme tak, že víčko se jen mírně nadzvedne a očkem sterilní kličky se lehce přejede po
povrchu agaru. Při neznámém množství mikroorganismu v tekuté kultuře vytváříme na plotně tzv.
hádka. Plotnu si pomyslně rozdělíme na čtvrtiny a kličkou začneme v jedné čtvrtině od horního
okraje do středu kreslit zúžujícího se hádka (viz obr. 54).
Druhého hádka vytvoříme ve vedlejší čtvrtině, tak že
při jeho kreslení zajedeme kličkou do struktury hádka
předchozího a tím přeneseme část mikroorganismů znovu na
kličku. Stejně tak pokračujeme se zbylými dvěmi čtvrtinami.
Principem je vyředit mikroorganismy tak, aby se v posledních
hádcích od sebe oddělily na jednotlivé buňky, které dají vznik
jednotlivým koloniím. Pokud máme mikroorganismy v kultuře
značně naředěné, nebo selektujeme málo abundantní
mikroorganismy s rezistencí, naneseme celou tekutou kulturu
nebo její alikvot do středu plotny umístěné na kolotoči a
Obrázek 54: Roztírání mikropředem vyžíhanou hokejkou po roztočení kolotoče ji opatrně
organismů na agarovou plotnu, rozetřeme po celém povrchu plotny.
tzv. hádek.
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:
LB agarové plotny s ampicilinem a bez ampicilinu (složení na 100 mL: 1 g bakteriálního tryptonu,
0.5 g kvasničného autolysátu, 0.5 g NaCl, 1.5 g agaru, pH 7.0), flow box, kahan, sterilní očkovací
kličky, hokejka, kolotoč, kultura baktérií Escherichia coli nesoucí plasmid s rezistencí proti
ampicilinu a bez rezistence.
POSTUP:
Na jednu agarovou plotnu s ampicilinem rozetřeme metodou hádka kulturu E. coli nesoucí
plasmid s rezistencí k antibiotiku, na druhou plotnu s antibiotikem rozetřeme pomocí hokejky 50
μL kultury E. coli bez rezistence k antibiotiku. Na jednu misku bez antibiotika rozetřete metodou
hádka kulturu nesoucí plasmid. A na poslední misku bez antibiotika plivněte a sliny rozetřete
112
hokejkou, nebo plotnu pouze otevřete a intenzivně na ní dýchejte a poté zase zavřete. Po
nanesení všech kultur na plotny je dejte kultivovat přes noc do inkubátoru na 37ºC. Plotny
dávejte do inkubátoru obráceně (víkem dolů), to proto, aby voda která se z agaru neustále
vypařuje a kondenzuje na víku, neskapávala zpátky na kulturu mikroorganismu na plotně rostoucí.
ÚKOL č. 32: Izolace plasmidové DNA z E.coli
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:
Kultura E. coli obsahující plasmid s Ampr genem pěstovaná přes noc, Roztok P1 (50 mM Tris/HCl
pH 8.0, 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno 0.1 mg/ml Rnasy A), Roztok P2 (0.2 M NaOH, 1%
SDS, autoklávováno), Roztok P3 (3 M octan draselný pH 5.5, autoklávováno), Isopropanol a 70 %
ethanol vychlazený v mrazničce (-20oC), TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA),
mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky), miska s ledem, stolní centrifuga s rotorem na
mikrozkumavky, automatické pipety a špičky.
POSTUP:
1)
1,5 ml podíl kultury E. coli nesoucí plasmid inkubované přes noc přeneseme do
mikrozkumavek, centrifugujeme při 5.000 g 1 min (separace buněk od média) a médium
odlijeme.
2)
Přidáme 0,3 ml roztoku P1, bakteriální pelet suspendujeme pomocí vortexu.
3)
Přidáme 0,3 ml roztoku P2, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát
5 min při laboratorní teplotě.
4)
Přidáme 0,3 ml roztoku P3, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát
5 min na ledě.
5)
Centrifugujeme při 14.000 g, 10 min, supernatant přelijeme do nových ependorfek.
6)
Přidáme 0,5 ml isopropanolu (laboratorní teplota), centrifugujeme při 14.000 g, 10 min,
supernatant odlijeme.
7)
Sraženinu DNA promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20oC), centrifugujeme při 14.000 g, 5 min,
supernatant odlijeme, jeho zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme. DNA
ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.
8)
Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 0,04 ml TE.
ÚKOL č. 33: Elektroforesa DNA
MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:
1 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA), zásobní elektrodový
pufr 10x TAE (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0), 50 % glycerol, 50 mM EDTA
pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť, 10% Ethidium bromid, λ DNA marker,
mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky), horizontální elektroforetická komůrka, zdroj napětí,
AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů, mikropipety, špičky, pikofuga
113
POSTUP:
Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky si sestavíme v digestoři elektroforetickou
komůrku pro agarosový gel v horizontálním uspořádání. Z termostatu na 60 oC vyjmeme
rozpuštěnou 1% agarosu v 1x TAE a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do elektroforetické komůrky.
Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou
desku (viz obr. 55). Ihned přidáme 40 μl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN, DBÁT
BEZPEČNOSTNÍCH PŘEDPISŮ) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý
kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel ponecháme
ztuhnout asi 30 min.
Po 30 minutách odstraníme postranní plastové desky
a do komůrky nalijeme asi 200 ml elektrodového
pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým
gelem a nakonec pod hladinou odstraníme hřeben.
Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Do tří
mikrozkumavek napipetujeme 20, 10 a 5 l izolované
DNA a přidáme pětinu objemu denaturačního
barviva, promícháme a v pikofuze necháme sednout
na dno mikrozkumavky.
Obrázek 55: Nalévání agarosového gelu
V digestoři
opatrně
pipetou
naneseme
jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforesy.
Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety
vyplachujeme
v elektrodovém
pufru
přímo
v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu
jednotlivých vzorků. Do jedné jamky jako standard
molekulových hmotností DNA naneseme 5 l λ DNA
naštěpenou restrikčním enzymem StyI nebo
současně restrikčními enzymy HindIII a EcoRI
nanesených vzorků (viz obr. 56).
Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120
V po dobu asi 20-30 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze
vzorků. Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a
pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení.
Po celou dobu práce používáme ochranné nitrilové rukavice (fialové) a dbáme předpisů
pro práci s ethidium bromidem, který je obsažen v gelu.
VYHODNOCENÍ:
1)
Následující cvičení si vezměte své agarové plotny, které byly přes noc inkubovány na 37 oC
a popište a zhodnoťte, co na které vyrostlo či nevyrostlo a proč?
2)
Podařilo se vám izolovat plasmidovou DNA? Jak by jste zjistili její množství a čistotu?
3)
Zhodnoťte výsledek elektroforesy, co jste viděli na gelu po obarvení ethidium bromidem?
Pokuste se vysvětlit proč jste viděli při elektroforese plasmidové DNA více než jeden
proužek.
114
Obrázek 56: λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem StyI (vlevo) nebo HindIII a
EcoRI (vpravo).
1% agarosa v TAE
standard vlevo: 11 fragmentů - 19.329, 7.743, 6.223, 4.254, 3.472, 2.690, 1.882, 1.489, 925,
421, 74 bp
standard vpravo: 13 fragmentů - 21.226, 5.148, 4.973, 4.268, 3.530, 2.027, 1.904, 1.584, 1.375,
947, 831, 564, 125 bp
Doporučená literatura:
Ráclavský, V.: Úvod do základních metod molekulární genetiky, Vydavatelství UP Olomouc, 1998.
Ruml, T.: Laboratoře z genového inženýrství, Vydavatelství VŠCHT, 1997
Voet, D.A. a Voet, J.G.: Biochemie, Academia Publishing Praha, 1995
Jandová, B. a Kotoučková, L. : Praktikum z Mikrobiologie, Vydavatelství MU, 1996.