ROZLIŠENÍ PLAZMIDŮ POMOCÍ RESTRIKČNÍCH ENDONUKLEÁZ

ROZLIŠENÍ PLAZMIDŮ POMOCÍ RESTRIKČNÍCH ENDONUKLEÁZ

Moderní biologie na dosah ruky
ROZLIŠENÍ PLAZMIDŮ POMOCÍ RESTRIKČNÍCH
ENDONUKLEÁZ
Lukáš Falteisek (UK v Praze, PřF, Katedra zoologie)
Molekulární biologii dnes obvykle chápeme jako soubor metod dovolujících cíleně
manipulovat s nukleovými kyselinami. Vlastně jde o řemeslo spíše než o vědu. Je
ovšem nutné ji ovládat, pokud se chceme věnovat skoro jakékoliv oblasti biologie.
Molekulární metody nám umožňují zjednodušeně řečeno nakládat s genetickou
informací jako s textem v textovém editoru. Pomocí různých komerčně dostupných
enzymů můžeme s řetězcem písmen zapsaných pomocí bazí v DNA provádět
všechny úkony jako vyjmout, vložit, kopírovat, přepsat, vymazat apod. Takovýmto
způsobem je možné třeba připojit ke genu kódujícímu protein fluorescenční značku
(abychom viděli, kde se protein v buňce nachází), exportní signál (aby buňka protein
sekretovala do média), vazebný motiv (aby bylo možné protein izolovat pomocí
afinitní chromatografie), mutací odstranit třeba aktivní místo enzymu nebo vytvořit
zcela umělý protein třeba sestavením z částí různých známých bílkovin.
Jedněmi ze základních pomůcek při těchto manipulacích jsou plazmidy
a restrikční endonukleázy. Plazmidy jsou malé (to znamená dlouhé jen několik tisíc
párů bazí) kruhové molekuly DNA, které se po vnesení do buňky (bakteriální
i eukaryotické) mohou replikovat a dostávat do dceřinných buněk. Pokud obsahují
geny kódující protein, mohou se přepisovat a překládat stejně jako geny na
chromosomech. Prakticky veškeré genové manipulace se provádějí se sekvencemi
vloženými do nějakého plazmidu nebo jiného vektoru, ve kterém lze sekvenci mezi
jednotlivými kroky namnožit a vybrat správné meziprodukty ze směsi podařených
a nepodařených variant.
Restrikční endonukleázy (restriktázy) jsou enzymy, které dokážou specificky
štěpit vlákno DNA v místě, kde se nachází určitý sekvenční motiv, dlouhý obvykle 4 –
8 bazí. Většina restriktáz rozpoznává palindromy, tady sekvence, které se čtou na
obou komplementárních vláknech stejně (např. GGATCC). Lze také říci, že pro
každý možný 4 – 6bázový palidrom existuje minimálně jedna restriktáza, která jej
štěpí. Existují i nepalindromatické enzymy, je jich ovšem méně a jsou méně
využívány. Většina těchto enzymů se dnes vyrábí průmyslově a existuje pro ně
systém pěti barevně odlišených pufrů (viz rostoucí podobnost vzhledu biologické
laboratoře a mateřské školky), z nichž lze vytvořit reakční podmínky pro téměř
všechny enzymy. Důležité je, že pokud známe sekvenci DNA, na které pracujeme,
můžeme přesně určit, kde bude který enzym štěpit. Díky tomu můžeme například
ověřit, jestli plazmid, který máme ve zkumavece, skutečně obsahuje gen, který má
obsahovat. Kromě mnoha jiných aplikací se restriktázy využívají pro cílené vyjímání
kusů DNA z plazmidu a pro přípravu fragmentů na vložení. K tomu můžeme používat
jak restrikční místa, která se v genu, s nímž pracujeme, náhodou nacházejí
v příhodné pozici, tak (častěji) místa, která jsme do sekvence předtím uměle vložili.
Díky tomu je tato jednoduchá metoda skutečně velmi univerzální nástroj pro různé
genové manipulace.
Podpořeno rozvojovým projektem MŠMT č. CSM 47
Moderní biologie na dosah ruky
Restriktázy původně pocházejí z bakterií. V současnosti je jich známo několik
tisíc. Zajímavé je, že není jasná jejich původní biologická funkce. V bakteriích se
geny pro restriktázy často vyskytují na plazmidech společně s enzymy, které metylují
DNA a tím ji chrání proti účinkům restriktázy. To vedlo k formulaci zdánlivě logické
hypotézy, že restriktáza chrání bakterii před viry. Genom viru totiž není metylovaný
a restriktáza jej tudíž po vniknutí do bakterie okamžitě rozštěpí. Problém je v tom, že
stačí, aby virus tuto ochranu jednou jedinkrát v historii překonal (snadno: náhodou
potká v cytoplazmě metylázu dřív než restriktázu), vznikne metylovaný virus a ten už
bude pro bakterie infekční bez ohledu na restriktázy. Logičtější se zdá být hypotéza,
že plazmid s oběma enzymy je vlastně parazit s téměř mafiánskými způsoby.
Replikuje se s bakterií, čímž jí mírně zatěžuje, a nic dobrého jí nepřináší. Když se ho
bakterie ovšem zbaví, zbytková metyláza přestane fungovat o něco dříve než
restriktáza (takové časování je u proteinů velmi snadné evolučně zařídit) a bakterie
špatně skončí.
Použité plazmidy:
pmCit N3 – klonovací vektor pro tvorbu proteinů spojených se žlutým
fluorescenčním proteinem mCitrin, dovoluje expresi proteinů v eukaryotických
buňkách, obsahuje gen pro rezistenci na kanamycin pro selekci v bakteriích
a rezistenci na geneticin-418 pro selekci v eukaryotických buňkách
LATmCit – plazmid pmCit N3 s vloženým fragmentem signálního proteinu LAT do
místa před N koncem fluorescenčního proteinu
LmCitLAT - plazmid pmCit N3 s vloženým krátkým exportním signálem (L=leader)
před N konec a s fragmentem signálního proteinu LAT vloženým za C konec
fluorescenčního proteinu
pGLO – plazmid umožňující expresi zeleného fluorescenčního proteinu EGFP
(sekvenčně velmi podobného mCitrinu) v bakteriích
Postup
Návrh restrikce:
Rozdělte se do skupin po 2 až 4.
Prostudujte si restrikční mapy čtyř plazmidů (viz Příloha níže) a pokuste se
navrhnout stěpení, kterým byste tyto plazmidy odlišili od sebe. Plazmidy máte
k dispozici ve zkumavkách označených jen čísly jako neznámé vzorky. Je třeba najít
enzym nebo dvojici enzymů, které poskytnou různé fragmenty pro všechny plazmidy.
Mějte na paměti i to, že fragmenty menší než 100 - 150 bp na gelu neuvidíte a tudíž
není možné odlišit fragmenty lišicí se o méně než cca 10 %. V případě, že jste dostali
zadané kombinace enzymů, které máte použít, stačí, když z dodaných restrikčních
map odečtete velikosti předpokládaných fragmentů získaných štěpením.
restrikční endonukleázy + pufry:
štěpená
sekvence
enzym
GCGGCCGC
NotI
ApaI
ApaLI
GGGCCC
GTGCAC
optimální pufry
oranžový
modrý
1x – 2x konc. žlutý,
použitelné pufry
červený, 2x konc.
žlutý
zelený, žlutý
Podpořeno rozvojovým projektem MŠMT č. CSM 47
Moderní biologie na dosah ruky
(Alw44I)
GGATCC
BamHI
BsrGI
(Bsp1407I)
TGTACA
modrý,
zelený, červený
BamHI, zelený, 2x
konc. žlutý
1x – 2x konc. žlutý
oranžový
zelený, červený
Míchání reakcí:
Každá skupina si označí 4 mikrozkumavky stejně jako jsou označené neznámé
vzorky a napipetuje reakce o složení:
1 µl (při použití 2x konc. žlutého 2 µl)
pufr
2 µl
plazmid
0,5 µl
enzym 1
0,5 µl
enzym 2
dopočítat do 10 µl
voda
Doporučujeme míchat tzv. premix, tedy smíchat v jedné zkumavce vodu, pufr a
enzymy pro všechny 4 reakce, pak směs rozdělit do 4 zkumavek a přidat plazmidy.
Přidávat nejdříve vodu a pufr, poté plazmid, nakonec vedoucí úlohy přidá enzymy
(hrozí poměrně značná finanční škoda při jejich kontaminaci). Enzymy uchovávat na
ledu (podle zkušenosti však vydrží až několik dní v pokojové teplotě). Při každém
pipetování kontrolujte vizuálně, zda máte ve špičce očekávané množství vzorku,
malé objemy vždy vypouštějte pod hladinu kapaliny ve zkumavce. Mezi vzorky je
třeba měnit špičky, nikdy neotáčejte pipetmany špičkou vzhůru, hrozí zatečení
roztoku do mechanismu pipety!
Restrikci inkubovat 45 – 60 min. (překročení času nevadí) při teplotě co
nejbližší 37°C. Tento čas je vhodné využít na nalití gelu (cca 15 min., provést
nejdříve) a podrobnější vysvětlení významu technologie plazmidů a restriktáz.
Rozštěpené vzorky lze po přidání vzorkového pufru uchovat zmrazené do příštího
praktika.
Elektroforéza
Příprava gelu: navážit agarózu na výslednou koncentraci 1 % a rozvařit v pufru
TBE do zmizení jakýchkoliv viditelných částic. Při vaření v mikrovlnné troubě použít
opakovaný krátký var, aby nedošlo k větší změně objemu roztoku, na vařiči použít
vodní lázeň. Gel nechat zchladnout na cca 40 °C (lze udržet v ruce), přidat ethidium
bromid v ředění 1:1000 a nalít do připravené vany s hřebenem. Je třeba počítat
4 jamky na skupinu, minimálně 1 standard v každém gelu a pokud možno několik
jamek jako zálohu.
Nanášení - dostatečně ztuhlý gel (při běžné teplotě spolehlivě asi 15 min. po
nalití, gel má mírný mléčný zákal) přenést do vany, zalít pufrem TBE do mírného
převrstvení gelu (nadbytek pufru komplikuje nanášení a zvyšuje proudové zatížení
zdroje) a připojit kabely (tak, aby byl + na straně dál od jamek). Nanášení je vhodné
demonstrovat např. na standardu, který naneseme jako první. Studenti přidají ke
svým reakcím po 2 µl vzorkového pufru, zamíchají (kontrolovat) a střídají se
u nanášení. Je třeba je instruovat, aby si při trefování jamek pomáhali druhou rukou
a hlídat, aby nepustili píst pipety dokud ji nevyndají nad hladinu. Často je třeba
opakovaně ukázat, kde přesně se jamky nacházejí.
Podpořeno rozvojovým projektem MŠMT č. CSM 47
Moderní biologie na dosah ruky
Po nanesení pustit elektroforézu při napětí optimálně okolo 17 V/cm délky
gelu, ukončit, když se bromfenolová modř dostane cca 1,5 cm před konec gelu.
Vyhodnocení výsledků
Gel na transiluminátoru je nutné nejdříve vyfotografovat (nebo výstižně nakreslit)
a až poté prohlížet. V UV záření dochází k rychlé fotodegradaci ethidium bromidu.
Odečítání velikostí proužků je proto vhodné provádět z fotografie. Kromě fragmentů
očekávané velikosti se mohou objevit i jiné. V takovém případě může jít
o nedokončené štěpení, fragment pak má délku odpovídající součtu délek dvou
očekávaných fragmentů. Neštěpený plazmid migruje jako 3 neostré proužky obvykle
o zdánlivé velikosti 3000 bp nebo více. Tyto proužky odpovídají různým formám
existence plazmidu: neporušený plazmid, který je sbalený do kompaktní
nadšroubovice a migruje proto většinou rychleji než by odpovídalo jeho velikosti (ale
může migrovat i pomaleji), plazmid s jednořetězcovým zlomem, který má podobu
relaxovaného kruhu a lineární plazmid. Proužek neporušeného kompaktního
plazmidu je zpravidla nejsilnější.
Může dojít k tomu, že některá skupina bude mít na gelu pouze neštěpený
plazmid nebo bude v některém vzorku úplně chybět DNA. Příčinou je obvykle chybné
nebo nepřesné pipetování nebo úplné vynechání některé složky reakční směsi.
Podpořeno rozvojovým projektem MŠMT č. CSM 47
Moderní biologie na dosah ruky
PŘÍLOHA:
Restrikční mapy plazmidů
Čárky označují počet bazí (nejmenší dílek = 100 bp), silnými šipkami uvnitř
plazmidů jsou označeny sekvence, které mohou být přeloženy do proteinu (otevřené
čtecí rámce).
pmCitN3
LATmCit
mCitrin
LmCitLAT
pGLO
EGFP
leader
+ mCitrin
LAT
Podpořeno rozvojovým projektem MŠMT č. CSM 47
Moderní biologie na dosah ruky
Standard DNA framentů GeneRuler DNA ladder mix (MBI Fermentas)
Podpořeno rozvojovým projektem MŠMT č. CSM 47