2010 - Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:
POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ
BIOLOGII
Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost
Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046
Praktický kurz pokročilých metod experimentální biologie
konaný
na Katedře biologie a ekologie Přírodovědecké fakulty Ostravské univerzity v
Ostravě
v termínu 13. – 17. 9. 2010
Program praktického kurzu
9 - 10
dopoledne
odpoledne
Pondělí
Úterý
Středa
Čtvrtek
Pátek
přednáška
přednáška
přednáška
přednáška
přednáška
PCR kolonií,
specifická detekce
plasmidu v buňce.
Agarosová gelová elfo.
.
Detekce
jednořetězcových
úseků v plasmidové
DNA.
Interakce s látkami
reagujícími s cukrfosfátovou páteří, s
bázemi.
Využití reparačních
enzymů k detekci
poškození DNA.
Fluorescenční
Elektronová
mikroskopie,
mikroskopie,
konfokální mikroskopie fluorescenční
– Olympus.
mikroskopie, AFM,
konfokální
mikroskopie.
PCR kolonií,
specifická detekce
plasmidu v buňce.
Agarosová gelová elfo
– pokračování.
Detekce
jednořetězcových
úseků v plasmidové
DNA - pokračování.
Interakce s látkami
reagujícími s cukrfosfátovou páteří, s
bázemi.
Využití reparačních
enzymů k detekci
poškození DNA –
pokačování.
Gelová elektroforéza.
Vyhodnocení
Fluorescenční
výsledků, hodnocení
mikroskopie,
konfokální mikroskopie kurzu účastníky.
– Olympus.
PCR kolonií
Princip:
Polymerázová řetězová reakce je metoda, která umožňuje namnožit požadovanou a
specifickou sekvenci genomové DNA bez jejího předchozího klonování ve vektorech.
Princip metody je založen na replikaci nukleových kyselin.
Podstatou je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků DNA
prostřednictvím termostabilní DNA-polymerázy.
Požadovaný úsek DNA je vymezen dvěma oligodeoxyribonukleotidy (primery) o délce cca
18-25 nt. Tyto primery jsou navrženy tak, aby se po denaturaci dsDNA vázaly na protilehlé
řetězce a vytvořily startovací místa pro syntézu DNA.
Po přidání DNA-polymerázy a dNTP probíhá syntéza nových vláken na obou templátových
řetězcích protisměrně.
K syntéze DNA se používají termostabilní DNA-polymerázy izolované z termostabilních
mikroorganismů. Tyto enzymy zůstávají v nativním stavu i za teplot, při nichž DNA
denaturuje. To umožňuje, aby se syntéza DNA cyklicky opakovala.
Průběh PCR lze rozdělit na tři cyklicky se opakující děje s odlišnými nároky na teplotu:
a) Denaturace dvouřetězcových molekul DNA (94°C)
b) Připojení primerů k odděleným řetězcům DNA (30-65°C)
c) Syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA-polymerázy (65-75°C)
Polymerázová řetězová reakce probíhá v zařízení nazývaném termocykler. V něm se
automaticky podle předem zvoleného programu mění teplota v daných časových intervalech.
Postupným opakováním jednotlivých cyklů dochází k amplifikaci zvoleného úseku DNA.
Počet molekul roste vzhledem k počtu cyklů exponenciálně (2n; n = počet cyklů), výsledkem
může být až miliarda kopií vybraného úseku DNA.
Použití polymerázové řetězové reakce není omezeno na izolovanou DNA, byly vyvinuty
techniky, které umožňují amplifikovat zvolený úsek bez předchozí separace nukleových
kyselin. Toho se využívá například při tvorbě rekombinantních plasmidů při detekci
jednotlivých klonů. Další využití této techniky spočívá v přímé identifikaci bakteriálních
kmenů pomocí specifických primerů.
Při PCR kolonií z agarové plotny sterilní špičkou odebereme dobře narostlou a oddělenou
kolonie, rozsuspendujeme ji v destilované vodě a přeneseme do sterilní PCR zkumavky do
směsi pro PCR včetně termostabilní DNA-polymerázy. První denaturační krok při PCR
vyvolá lýzi bakterií a uvolněná DNA může být amplifikována. Výtěžek je nižší než při použití
izolované DNA, ale dostatečný pro detekci jednotlivých klonů.
Materiál a chemikálie:
- Plasmidová DNA (pBS, pPGM1)
- 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
- Taq DNA polymeráza + pufr
- Primery
- Termocykler
- Pipety, špičky
- Ledová lázeň
- Termostat
- Rukavice
- Agarosový gel, pufr
- Elektroforetická aparatura
- Zdroj napětí
- Dokumentační systém
Pracovní postup:
1 Z agarové plotny setřeme sterilní špičkou dobře narostlou kolonii a suspendujeme v 10
µl destilované vody. Ze suspenze odebereme 1 µl, který přidáme ke směsi PCR.
Složení směsi a množství jednotlivých komponent uvádí tabulka.
2 Zkumavky vložíme do termocykleru.
3 Termocykler naprogramujeme na následující hodnoty:
a. Krok 1:
i. denaturace
94°C 120 sec
ii. počet cyklů
1
b. Krok 2:
i. Denaturace DNA
94°C 30 sec
ii. Hybridizační primerů s templářovou DNA 65°C 30 sec
iii. Syntéza nových řetězců
72°C 60 sec
iv. Počet cyklů
30
Spustíme start.
4 Po skončení amplifikace zkontrolujeme výtěžek namnoženého úseku pomocí gelové
elektroforézy. Na agarosový gel naneseme po 5 µl reakční směsi vzorků. Délku
získaných fragmentů určíme porovnáním polohy signálů s polohou fragmentů
markerové DNA o známé velikosti. Výtěžek odhadneme z intenzity fluorescence
srovnáním s fluorescencí známého množství DNA.
5 Z délky získaných fragmentů
Pozn.:
1) V případě odlišných koncentrací výchozích komponent je třeba příslušné objemy
přepočítat. Pokud produkty PCR použijeme pouze jako kontrolní vzorky pro gelovou
elektroforézu a naším cílem není dosáhnout vysokého výtěžku, můžeme snížit objemy všech
látek 5-10 x, tj. PCR provádíme v 10-20 µl. Snížení spotřeby primerů, templátové DNA i
enzymu vede k finančním úsporám. Abychom mohli pracovat v tak malých objemech, je
nezbytné mít modernější přístroj s vyhřívaným víkem. U cyklerů první generace, u kterých
vyhřívané víko není běžnou součástí, hrozí při příliš malých objemech vypaření vzorků a
jejich kondenzace na víčku mikrozkumavky.
Nedoporučuje se provádět PCR v objemech větších než 100 µl, protože u velkých objemů je
potřeba delších inkubačních časů, aby bylo dosaženo stejné teploty ve všech částech vzorku.
Protože i termostabilní DNA-polymeráza v průběhu opakovaných cyklů PCR postupně ztrácí
svou aktivitu, při prodloužení inkubačních časů bychom museli do reakční směsi přidat více
enzymu.
2) PCR je velmi citlivá metoda, pomocí které dokážeme mnohonásobně zmnožit vybraný
úsek DNA, nacházející se ve vzorku ve velmi malém množství. Odvrácenou tváří obrovské
citlivosti této metody je možnost vzniku falešně-pozitivních výsledků nebo nespecifických
produktů v případě sebemenší kontaminace ať už přímo vzorku nebo prostřednictvím pipet,
špiček, přidávaných roztoků apod. Z tohoto důvodu musíme při PCR dbát zvýšené opatrnosti,
veškeré roztoky pipetujeme sterilními špičkami, pracovní plochu předem důkladně vyčistíme
a při manipulaci se vzorky nikdy nepracujeme bez rukavic.
Tabulka PCR:
Vzorek č.:
Plasmid pBS (100
µg/ml)
(Kolonie A)
Plasmid pPGM1
(100µg/ml)
(Kolonie B)
Plasmid c-myc
(100µg/ml)
(Kolonie C)
10 x cc pufr pro Taq
DNA-pol.
Primer B500for (10 µM)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
-
-
1
1
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
-
-
-
1
1
1
1
-
-
-
-
-
-
1
-
-
-
-
-
-
-
-
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
-
1
-
-
-
1
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
13,8
Primer B900 (10 µM)
Primer PU27 (10 µM)
Primer PY27 (10 µM)
Primer p53-CON (10
µM)
Primer p53-CON-com
(10 µM)
Směs dNTP (10 mM)
voda
Detekce jednořetězcových úseků v plasmidové DNA pomocí nukleázy S1
Princip:
Některé sekvence DNA mohou za určitých podmínek vytvářet struktury, které jsou
odlišné od běžné Watsonovy-Crickovy pravotočivé dvoušroubovice. Mezi tyto tzv. lokální
otevřené struktury patří levotočivá DNA, křížová forma DNA, triplex, tetraplex. Předpokládá
se, že tyto struktury hrají důležitou roli při regulaci buněčných procesů a expresi genů. Aby
lokální otevřené struktury DNA vznikly, musí být v molekule DNA vhodná sekvence [např.
levotočivá DNA vzniká v sekvencích v nichž se střídá purinová báze s bází pyrimidinovou
(dA-dC) n.(dG-dT) n, triplex vyžaduje polypurin.polypyrimidinové úseky (dGn.dCn nebo
dAn.dTn), křížová struktura se tvoří v palindromatických sekvencích (sekvence, které se čtou
stejně na jednom i druhém řetězci), apod.] a dostatečně vysoké superhelikální napětí. Také
okolní prostředí musí splňovat podmínky, které jsou vyžadovány pro vznik jednotlivých
struktur: křížová forma často vyžaduje přítomnost hořečnatých iontů, triplex snadněji vzniká
v mírně kyselém (pH 5) prostředí nebo v přítomnosti hořečnatých nebo zinečnatých iontů,
tetraplex potřebuje draselné ionty…
Všechny lokální otevřené struktury, jakkoliv se od sebe navzájem liší, mají společné
to, že aspoň malá jejich část, nebo úsek k lokální otevřené struktuře přilehlý,
obsahuje jednořetězcovou formu. Této vlastnosti se využívá při detekci otevřených struktur.
Jedna z metod využívá strukturně selektivní nukleázu S1, která štěpí jednořetězcové úseky,
zatímco dvoušroubovici nechává netknutou. Štěpením DNA nukleázou S1 dostaneme
z původní superhelikální molekuly molekulu lineární nebo otevřenou. Vhodným výběrem
restrikční endonukleázy, kterou necháme štěpit vzniklou lineární nebo otevřenou DNA, a
následným elektroforetickým rozdělením získaných fragmentů můžeme určit vzdálenost, ve
které se lokální struktura nacházela vůči použité restrikční endonukleáze.
1
2
3
4
5
A
6
B
Obr.: (A) Štěpení superhelikálního plasmidu obsahujícího křížovou strukturu nukleázou S1.
V dráhách 1, 5 a 6 jsou produkty štěpení nukleázou S1 a restrikční endonukleázou ScaI u plasmidů
pPGM2 (dráha 1), pBluescript SK- (dráha 5) a pPGM1 (dráha 6). Plasmid pBluescript SK- (pBSK-)
neobsahuje sekvenci schopnou vytvořit lokální otevřenou strukturu a slouží jako kontrola. Plasmid
pPGM1 vytváří křížovou strukturu méně ochotně v porovnání s plasmidem pPGM2, což se na gelu
projeví menším množstvím štěpené DNA. Specifické produkty štěpení jsou na obrázku označeny
šipkou. Proužky v dráze 3 vznikly společným štěpením plasmidu pBluescript SK- restrikčními
endonukleázami ScaI a HindIII a slouží jako kontrola detekce specifických fragmentů. Dráha 2 –
linearizovaný pBSK-, dráha 4 – superhelikální pBSK-.
(B) Křížová struktura plasmidu pPGM2, černě jsou zvýrazněny nukleotidy, kterými se plasmidy
pPGM1 a pPGM2 od sebe liší.
Materiál:
- nukleáza S1
- restrikční endonukleáza
- pufry pro S1 nukleázu a restrikční endonukleázu
- plasmidy pPGM1, pPGM2, pPGM3
- srážecí směs (EtOH + 3 M CH3COONa, pH 5.0)
- 80% vychlazený etanol (-20°C)
- 10 mM TE; pH 8.0
- voda pro molekulární biologii
- elektroforetický pufr (TAE, TBE)
- agarosa
- mikrozkumavky 1.5 ml
- pipety
- špičky
- rukavice
- mrazicí box –80°C
- termostat na 37°C
- stolní centrifuga
- vortex
- horizontální elektroforetická aparatura
- zdroj napětí
Postup:
Tab. 1:
Vzorek č.: Pozn. 1
Plasmid
pBS
Štěpící enzym
-
2
pBS
3
pBS
4
pPGM1
5
pPGM2
6
pBS
ScaI
S1/ScaI
S1/ScaI
S1/ScaI
HindIII/ScaI
1. Do 1.5 ml zkumavek napipetujeme 2 µl plasmidové DNA (1 µg), podle tabulky 2
přidáme (vzorky 3-5) 4 µl 5 x koncentrovaného pufru pro nukleázu S1, 1 µl nukleázy
S1 (2U/ µl) a doplníme vodou do 20 µl. Necháme inkubovat 30 minut při 37°C.
Tab. 2:
Vzorek č.:
1
2
3
4
5
6
pBS
2
2
2
-
-
2
pPGM1
-
-
-
2
-
-
pPGM2
Pufr pro S1
(5x konc.)
Pufr pro ScaI
(10x konc.)
Nukleáza S1
(2U/µl)
-
-
-
-
2
-
-
-
4
4
4
-
2
2
-
-
-
2
-
-
2
2
2
-
-
2
-
-
-
2
-
-
-
-
-
2
16
14
12
12
12
12
ScaI (2U/µl)
HindIII
(2U/µl)
Destilovaná
voda
2. Vzorky 3-5 přesrážíme: přidáme 2 µl 3 M octanu sodného, pH 5,0 a 65 µl 100% EtOH
(-20°C). Vložíme vzorky na 10 minut do hlubokomrazícího boxu (-80°C), stočíme je
15 minut při 14 000 x g a odstraníme supernatant. Vysráženou DNA promyjeme 200
µl 80% EtOH (-20°C) a opět centrifugujeme při 14 000 x g (10 minut). Odstraníme
supernatant a vzorky vysušíme za sníženého tlaku.
3. DNA ve vzorcích 3-5 rozpustíme v 17 µl vody, přidáme 2 µl 10 x koncentrovaného
pufru pro restrikční endonukleázu a 1 µl enzymu (2U/ µl). Necháme štěpit 60 minut
při 37°C. Všechny vzorky mají objem 20 µl.
4. Ke vzorkům přidáme 5 µl 6 x koncentrovaného nanášecího pufru, naneseme je na 1%
agarosový gel a provádíme elektroforézu 1 hodinu při 120 V.
5. Po skončení elektroforézy gel vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 µg/ml), po 15
minutách jej vyjmeme, promyjeme a zdokumentujeme pomocí gelového
dokumentačního systému.
Poznámka:
Vzorek 1: kontrola, na gelu indikuje elektroforetickou pohyblivost superhelikální formy plasmidu pPGM1.
Vzorek 2: kontrola, na gelu ukazuje elektroforetickou pohyblivost lineární formy daného plasmidu.
Vzorky 3-5: vzorky, u nichž byla provedena detekce pomocí nukleázy S1. Jednotlivé plasmidy pBS, pPGM1, a
pPGM2 se liší pouze 20 pb dlouhou sekvencí v restrikčním místě HindIII (u pBS sekvence chybí, u pPGM1 a
pPGM2 se vložená sekvence liší ve dvou nukleotidech). Tato sekvence u jednotlivých plasmidů jeví rozdílnou
ochotu vytvářet křížovou strukturu s volnými tyminy, které mohou být modifikovány oxidem osmičelým.
- Vzorek 6: kontrola, štěpení endonukleázami HindIII a ScaI vytváří fragmenty, které se svou velikostí velmi blíží
očekávaným fragmentům u modifikovaných vzorků. Porovnáním polohy fragmentů u modifikovaných vzorků a
kontroly snadno zjistíme, který plasmid byl štěpen nukleázou S1 a tedy pravděpodobně tvořil křížovou strukturu.
Detekce poškození DNA - detekce jednořetězcových zlomů v plasmidové
DNA, detekce modifikace bazí
DNA, jako nositelka genetické informace, je v buňce vystavena častým interakcím
s látkami, které ji mohou negativně ovlivnit. Tyto látky, které mohou pocházet z buněčného
metabolismu nebo z vnějšího prostředí, můžeme zjednodušeně rozdělit do dvou základních
skupin:
1) Látky štěpící cukr-fosfátovou kostru
2) Látky modifikující báze
Do první skupiny látek, řadíme především radikály a také oxidační činidla. Reakce
těchto látek s DNA vede většinou k jedno nebo dvou-řetězcovým zlomům.
Radikály jsou „vedlejším produktem“ metabolismu a jsou v buňce velmi časté. Jsou to velmi
reaktivní sloučeniny a s DNA v buňce reagují poměrně často. Proto je v poslední době často
zmiňována důležitost antioxidantů, které s radikály a jim podobnými látkami v buňce reagují
a chrání tak nejen DNA před často ireverzibilním poškozením.
Zlomy v DNA jsou snadno detekovatelné pomocí gelové elektroforézy. Přerušení řetězce
DNA vede ke změně její elektroforetické mobility. Plasmidová DNA je totiž ve své nativní
formě v tzv. superhelikální – nadšroubovicové konformaci (scDNA). Tato forma se vyznačuje
velkou kompaktností (molekula DNA zaujímá při stejné hmotnosti menší objem oproti tzv.
otevřené kružnicové ocDNA), proto migruje agarozovým gelem rychleji. Při přerušení
jednoho z řetězců dvoušroubovice dojde k přechodu z kompaktní scDNA do rozměrnější
ocDNA.
Změnu si můžeme představit jako rozmotání klubka s bavlnkou a snahu protáhnout
kompaktní klubko, nebo nekompaktní shluk stejně velkým otvorem malých rozměrů.
Do látek poškozujících (modifikujících) báze spadá poměrně velká a různorodá
skupina chemikálií. Nejčastější modifikace vyvolávají látky s oxidačním, případně alkylačním
mechanismem působení. Zvláště v případě methylací mohou být fyziologické důsledky velmi
vážne, protože nativní methylace DNA hraje významnou úlohu v epigenetických regulačních
procesech.
Buňky mají pro opravu poškozené DNA vyvinut poměrně rozsáhlý aparát enzymů.
Proces opravy probíhá zpravidla podle schématu rozpoznání modifikace –> vystřižení
modifikované báze (nukleotidu) -> doplnění chybějící báze (nukleotidu) podle
komplementárního řetězce -> ligace přerušeného řetězce (pokud k přerušení došlo).
Chceme-li využít reparačních enzymů pro detekci poškození DNA, vynecháváme
poslední dva kroky. Vystřižení modifikovaného nukleotidu vede zpravidla k přerušení
cukrfosfátové páteře DNA a tedy k přechodu do ocDNA.
Pro vytvoření volných radikálů v laboratorních podmínkách nejčastěji využíváme tzv.
Fentonovy reakce:
Men+ + H2O2 -> Fen+1 + OH- + OH •
Ve cvičení bude ke štěpení DNA použit roztok manganistanu draselného, jako druhé
štěpící agens použijeme hydroxylové radikály, generované měďnatými ionty (analogie
klasické Fentonovy reakce).
Pro detekci modifikace bází DNA využijeme dimethylsulfát (methylace guaninu) a
reparační enzym Endonukleáza III.
Materiál:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Roztok měďnatých iontů (50mM)
Zásobní roztok KMnO4 (0,1M)
Fosfátový pufr pH 7,4 (0,2M)
Plasmidová DNA (pBluesktript (SK-))
TAE (50x)
Peroxid vodíku (H2O2)
Dimethyl sulfát 1% (DMS)
Endonukleáza III + pufr
3M octan sodný
96%, 70% ethanol
Agaróza
Nanášecí pufr
Minicentrifuga
Termostat
Aparatura pro gelovou elektroforézu
Chemické sklo
Mikrozkumavky
Automatické pipety, špičky
Destilovaná voda
Pracovní postup:
A) Vliv oxidačních činidel
1) Připravíme si koncentrační řadu roztoku manganistanu draselného v koncentracích:
100mM, 50mM a 10mM.
2) Do mikrozkumavek 1-4 napipetujeme dle tabulky
3) Krátce zcentrifugujeme (5 s, pomocí tlačítka „shortspin“)
4) Vše necháme inkubovat na 37˚C po dobu 30 min.
5) Do všech mikrozkumavek napipetujeme 5 µl nanášecího pufru.
6) Celý objem reakční směsi naneseme na připravený agarozový gel.
Tab. 1 – Rozpis pipetování pro KMnO4
Zkumavka 1
Zkumavka 2
Zkumavka 3
Zkumavka 4
(kontrola)
1 µl
DNA (200ng/µl)
1 µl
1 µl
1 µl
Fosfátový pufr
(200 mM)
KMnO4
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
2 µl (100 mM)
2 µl (50 mM)
2 µl (10 mM)
-
12 µl
12 µl
12 µl
14 µl
H2O
B) Vliv volných radikálů
1) Připravený roztok měďnatých iontů zředíme na 10 mM.
2) Roztok peroxidu zředíme na 0.3%
3) V mikrozkumavce smícháme:
Zkumavka 5
Zkumavka 6
Zkumavka 7
1 µl
1 µl
1 µl
2 µl
2 µl
-
H2O2
2 µl
-
2 µl
H2O
15 µl
17µl
17µl
DNA (200ng/µl)
Cu
4)
5)
6)
7)
8)
2+
Krátce zcentrifugujeme (5 s, pomocí tlačítka „shortspin“)
Inkubujeme po dobu 30 minut při 37°C.
Do všech mikrozkumavek napipetujeme 5µl nanášecího pufru
Naneseme na připravený agarozový gel.
Do osmého startu naneseme 3 µl standardu (generuler)
1
2
3
4
5
6
7
8
Obr.1: Poškození plasmidové DNA působením manganistanu draselného. (1) Kontrola DNA, (2) DNA + 12
mM KMnO4, (3) DNA + 6 mM KMnO4, (4) DNA + 3 mM KMnO4, (5) DNA + 2 mM KMnO4, (6) DNA + 1
mM KMnO4, (7) DNA + 0,1 mM KMnO4, (8) DNA + 0,01 mM KMnO4.
C) Detekce modifikace bází
1) V mikrozkumavce smícháme
• 5µl DNA
• 2µl fosfátového pufru
• 2µl 1% DMS
• 11µl H2O
2) Pro negativní kontrolu připravíme stejnou směs, roztok DMS naradíme dest. vodou
3) Směs necháme inkubovat 30min při 37°C
4) Do obou zkumavek přidáme 5µl 3M octanu sodného a 80 µl 96% ethanolu
5) Zkumavky necháme inkubovat 20min na -80°C
6) Centrifugujeme 30min při 14500 x g
7) Odpipetujeme obsah zkumavky a necháme minutu schnout dnem vzhůru na filtračním
papíru (ubrousku)
8) Přidáme 80 µl 70% ethanolu a centrifugujeme 15min při 14500 x g
9) Odpipetujeme obsah zkumavky, necháme minutu schnout dnem vzhůru a vložíme na
5min do exikátoru
10) Do obou zkumavek přidáme 30 µl dest. vody, chvíli protřepeme na vortexu
Body 4-10 slouží k tzv. srážení DNA, pomocí tohoto postupu se DNA v organickém prostředí
usadí jako sraženina na dně zkumavky a zbytek reakční směsi je odstraněn. V tomto případě
provádíme srážení, abychom si byli jisti, že z reakční směsi odstraníme nezreagovaný DMS,
který by mohl inhibovat činnost reparačních enzymů, které použijeme v dalším kroku.
11) Z obou zkumavek odebereme 15 µl směsi a přeneseme do dvou čistých eppendorfek
12) K oběma novým zkumavkám přidáme 2 µl pufru pro Endo III a 3 µl roztoku enzymu
(naředěného na koncentraci 1u/µl)
13) Směs necháme inkubovat 30min při 37°C
14) Připravíme si 1% agarozový gel
15) Ke směsím přidáme vždy 1/6 objemu nanášecího pufru
16) Naneseme tak, aby dvojice vzorků (s enzymem a bez enzymu) byly na gelu vedle
sebe.
1
2
3
4
5
6
Obr.2: Detekce modifikace bazí za využití Endo III – dráhy 1) Kontrolní DNA 2) DNA + 0.1%DMS 3) DNA
+ 0.1%DMS + 1u EndoIII 4) DNA + 0.1%DMS+3u EndoIII 5) DNA + 0.1%DMS + 5u Endo III 6) DNA + 5u
Endo III
Základy světelné mikroskopie
Účel mikroskopu
1)Zvětšení
2)Rozlišení
3)Kontrast
Vývoj mikroskopu
Princip mikroskopu
Zvětšení mikroskopu
Celkové zvětšení mikroskopu =
zvětšení objektivu × zvětšení okuláru
Příklad:
Objektiv 20 ×, okulár 10 × → celkové zvětšení 200 ×
Optický systém korigovaný na nekonečno
Sestava 1
Sestava 2
Anatomie mikroskopu
1) Objektiv
Objektivy
Nejdůležitější optická součást mikroskopu.
Vytváří reálný převrácený obraz preparátu.
Značení objektivů
Zvětšení objektivů
0.5 ×
1.25 ×
2×
Typy imerze
4 ×, 5 ×
(proužek blíže k preparátu)
10 ×
20 ×
Olej
40 ×, 50 ×
Voda
60 ×
100 ×
150 ×, 250 ×
Typy objektivů
Objektiv by měl poskytovat co nejkvalitnější zobrazení.
Kvalita objektivu je určena stupněm korekce optických aberací a
rovinností obrazového pole.
Plan
Ach
Fl
Apo
Základní optické aberace
Chromatická vada
Sférická vada
Korekce objektivů
Achromáty - chromaticky pro modré a červené
- sférická vada pro zelené světlo
- nejlepší obraz pro monochromatické
zobrazení přes zelený filtr
Fluority (semi-apochromáty)
- chromaticky pro modré, zelené a červené
světlo
- sférická vada pro modré a zelené světlo
- vhodné pro barevné zobrazení
Apochromáty - chromaticky pro krátkovlnné modré,
modré, zelené a červené světlo
- sférická vada pro krátkovlnné modré,
modré a zelené světlo
- nejvyšší kvalita barevného zobrazení
Rovinnost obrazového pole
Důležitá zejména pro záznam obrazu.
Rozdíl mezi Ach a Plan Ach
Numerická apertura objektivu
Numerická apertura (N.A.) = n × sinα
α
N.A. ≥ 1 nelze dosáhnout bez imerze.
Se zvětšením roste numerická apertura objektivu.
Hloubka pole
Je maximální axiální interval, uvnitř kterého jsou jednotlivé hladiny
preparátu zároveň zaostřené.
Hloubka pole klesá s rostoucí numerickou aperturou objektivu.
2) Okuláry
Číslo pole (F.N.)
Okuláry dále zvětšují obraz vytvořený objektivem.
Pevná clona je v místě mezilehlého obrazu. Ramsdenův typ
okuláru umožňuje snadnou montáž měřítka – pozor na
prach!
Průměr clony v mm udává číslo pole.
Výpočet průměru zorného pole
v rovině preparátu:
D = F.N. / zvětšení objektivu
Prázdné zvětšení
Celkové zvětšení ≤ 1000 × N.A.
Příklad 1:
Objektiv 40 ×, N.A. = 0,65
Okuláry 15 ×
40 × 15 = 600 ≤ 650
O.K.
Příklad 2:
Objektiv 100 ×, N.A. = 1,3
×
Okuláry 15 ×
100 × 15 = 1500 > 1300
Okuláry 12,5 ×
100 × 12,5 = 1250 ≤ 1300 O.K.
Pozor na další zvětšení při přenosu digitálního obrazu na
monitor!
3) Kondenzor
Funkce kondenzoru
Soustřeďuje světlo ze světelného zdroje do kužele, který:
1) rovnoměrně osvětluje preparát
2) odpovídá numerické apertuře objektivu
Při změně objektivu je vhodné upravit N.A.
kondenzoru aperturní clonou.
N.A. kondenzoru = 80% N.A. objektivu
Typy kondenzorů
Abbeův - nejjednodušší, N.A. = 1,25
- není korigován chromaticky ani sféricky
- vhodný pro jednoduché objektivy
Aplanaticko-achromatický – korigován pro obě vady
Speciální kondenzory
pro různé kontrastní
metody (DF, Ph, DIC,
RC, POL).
Výklopná čočka pro
velmi malá zvětšení (do
4 ×).
Typy mikroskopů
Podle povahy pozorovaných
preparátů se postupně vyvinuly
různé typy mikroskopů:
•
•
•
•
Klasický (Up-right)
Invertovaný
Stereo
Speciální systémy (např. konfokální)
Mikroskopy up-right
• Pro pozorování v procházejícím světle
• Pro pozorování v odraženém světle
Sklíčkové
preparáty
Mikroskopy třídy
CX2, BX2, AX
Invertované mikroskopy
• Pro pozorování
v procházejícím světle
• Pro pozorování
v odraženém světle
Preparáty v kultivačních
miskách, mikrotitrační
destičky
Mikroskopy třídy
CKX2, IX2
Stereomikroskopy
• Pro pozorování
v odraženém světle
• Pro pozorování
v procházejícím světle
3-D preparáty
Mikroskopy třídy
SZ2, SZX
Speciální systémy
Například:
• Konfokální mikroskop FV1000, FV10i
• Laserový mikrodisekční systém MicroBeam
• Laserové cytometry LSC, iCyte, iCys
• Systém Cell-R pro metodu TIRFM
Kontrastní metody
Slouží k zvýšení kontrastu obrazu tak, aby
byl dobře pozorovatelný.
Nejpoužívanější metody:
• Temné pole
• Fázový kontrast
• Polarizované světlo
• Reliéfní kontrast
• Diferenciální interferenční kontrast
• Fluorescence
Fluorescence
Druhy výbojek
Princip konfokální mikroskopie
LASER
Pin Hole
Detector
Objectiv
Above focus plane
Focus plane
Below focus plane
Fluorescence/konfokál
Fluorescenční mikroskopie
Konfokální mikroskopie
Mikroskop = stavebnice
Vybrané informační zdroje
M. Abramowitz, Microscope: Basics and Beyond. Olympus
America, Inc., Melville, New York, Revised 2003.
M. Abramowitz, Fluorescence Microscopy: The Essentials.
Olympus America, Inc., Melville, New York, 1993.
M. Abramowitz, Reflected Light Microscopy: An Overview.
Olympus America, Inc., Melville, New York, 1990.
Olympus Microscopy Resource Center: http://olympusmicro.com
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
1
Vlastnosti
• Jedinečný kompaktní design
• Plně automatizovaný konfokální mikroskop
• Vysoká kvalita obrazu
• Jednoduchá obsluha
• Interaktivní nápověda – rychlé zaškolení
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
2
Vlastnosti
• Objektivy:
UPLSAPO 10× Ph – NA 0.40
UPLSAPO 60× Water Ph – NA 1.20
UPLSAPO 60× Oil Ph – NA 1.35
• Optický zoom: pro objektiv 10× – 1× až 6×, krok 0,1×
• Optický zoom: pro objektiv 60× – 1× až 10×, krok 0,1×
• Rozsah zvětšení: 10× až 600×
• Motorizovaný x-y stolek i ostření
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
3
Vlastnosti
• Lasery: 405 nm (18mW), 473 nm (12,5mW),
559 nm (15mW), 635 nm (10mW)
• Dvoukanálový spektrální detektor
• TD pro fázový kontrast
• Autofokus & automatická expozice
• Mapování
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
4
FV10i
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
5
Schéma FV10i
Skenovací jednotka
Temná
místnost
Mikroskop
Antivibrační deska
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
Lasery
6
Produktová řada – pouze dva modely
• FV10i-O: objektiv UPLSAPO 60× O-Ph
– snímání obrazů s vysokým rozlišením
• FV10i-W: objektiv UPLSAPO 60× W-Ph, inkubátor
(37°C, CO 2)
– snímání živých buněk a časosběrné snímání
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
7
Pracovní prostředí
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
8
Intuitivní ovládání
Vložit vzorek
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
9
Intuitivní ovládání
Vložit vzorek
Zvolit oblast
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
10
Intuitivní ovládání
Vložit vzorek
Zvolit oblast
Nasnímat obraz
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
11
Režimy snímání
• Obrazy jsou průběžně snímány v
předdefinovaných intervalech => časosběrné
snímání
• Obrazy jsou opakovaně snímány v různých
rovinách ostrosti – lze vytvořit 3D obraz
• Kombinace proostřování a časosběrného snímání
• Automatické časosběrné snímání ve více
předdefinovaných oblastech
• Kombinace všech tří předchozích režimů
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
12
Summary
Shrnutí
FV10i
• „All-in-one“ integrovaný systém
• Zabudovaná temná místnost
• Úspora místa
• Mobilita
• Intuitivní ovládací software
• Interaktivní nápověda
• Jednoduchá obsluha – rychlé zaškolení
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
13
Děkuji za pozornost
© OLYMPUS CZECH GROUP – Nový konfokální mikroskop OLYMPUS FluoView FV10i
14
Fluorescenční mikroskopie
v genotoxikologii
Comet assay; Micronucleus test;
Metoda FISH
SCGE
Single Cell Gel Electrophoresis / Comet assay
Charakteristika:
Molekulárně genetická metoda umožňující detekovat poškození DNA
typu:
- jednoretězcových zlomů DNA (SSB ) (zlomy
přímé, ale i zlomy přechodné, které vznikají v důsledku neúplné
excizní opravy),
- alkali-labilní polohy (ALS),
- křížové DNA vazby(Cross-linking)- DNA/DNA
nebo DNA/protein,
- oxidační a alkylační poškození DNA
- poškození DNA související s apoptósou
Analýzu lze provést v buňkách „všech“ organismů - bakteriálních, u
kvasinek, v rostlinných buňkách, živočišných i lidských.
A ve všech typech buněk - v proliferujících i neproliferujících,
ve stabilizovaných buněčných líniích, primokulturách, lymfocytech,
v buňkách z biopsií.
K analýze postačuje relativně malé množství buněk (< 50 000).
Princip SCGE
Molekula DNA má záporný náboj, proto
v elektrickém poli migruje směrem k anodě kladný pól.
Rychlost migrace DNA v elektrickém poli
závisí na velikosti molekuly a tedy na počtu
zlomů.
V Comet assay se využívá při identifikaci
malých fragmentů DNA vzniklých působením
mutagenů v jednotlivých buňkách.
Průběh SCGE testu
Mikroskopování
Buňky
Fixace na agarozový gel
Lyze buněk
Barvení
Neutralizace
V gelu zůstává superhelikální DNA +
zbytky jaderné membrány a matrix
Aklalické rozvolnění
při pH >13.
Zlomy navodí vznik relaxované DNA
ELEKTROFORÉZA
VZNIK KOMETY
VZNIK KOMETY
ELEKTROFORÉZA
ELEKTROFORÉZA
DENATURACE
DENATURACE
IZOLOVANÉ
IZOLOVANÉ
JÁDRO
JÁDRO
JÁDRO
JÁDROS
SRELAXOVANOU
RALAXOVANOU
DNA
DNA
KOMETA
KOMETA
Mikroskopické hodnocení
Velikost a tvar komety závisí na míře poškození DNA
Hodnocení SCGE
Head DNA Tail DNA
(%)
(%)
34
66
Tail Length
(µm)
Tail Moment
(µm)
140
92
Mikroskopická analýza
Hodnocení se provádí fluorescenčním
mikroskopem při zvětšení 25x nebo
40x.
K barvení se používají fluorescenční
barvy s afinitou k DNA. Každý
fluorochrom vyžaduje vlastní excitační
a emisní filtry.
a) Vizuální hodnocení preparátů
Analyzuje se 100 komet na jeden gel (celkově 300 hodnot).
Komety se zařazují do 5 kategorií podle tvaru komety..
Stanovuje se průměrná hodnota poškození (P)
P = Σ (0 x a) + (1 x b) + (2 x c) + (3 x d) + (4 x e) kde:
0 až 4 označení kategorie poškození
a=
b=
c=
d=
e=
počet buněk kategorie 0
počet buněk kategorie 1
počet buněk kategorie 2
počet buněk kategorie 3
počet buněk kategorie 4
Pět kategorií hodnocení
komet
0
1
2
3
Extrémní hodnoty poškození při vizuálním hodnocení jsou :
0 – nebylo zaznamenáno poškození
400 - všechny komety patří do třídy 4.
4
b) Hodnocení obrazovou analýzou
Hodnotí se obvykle menší počet komet
minimálně 25-50 na sklíčko.
Průměrnou hodnotu stanoví program.
Program obvykle stanoví %DNA v kometě,
délku chvostu komety a tzv. tail moment
počítačové
zpracování
In vitro SCGE test
Lze detekovat somatické i gametické mutace
Teoreticky lze využít kterýchkoli buněk
Nejčastěji se využívá buněčných kultur - bakterie, kvasinky
- nebo buněčných linií exp. zvířat – myší lymfocyty, buňky
ovariií, plicní buňky čínského křečka, hepatocyty….
Lze využít i rostlinných buněk – např. Nicotiana tabacum var. xanthi
Lze aplikovat in vitro metabolickou aktivaci
postmitochondriální frakcí S9
Buňky jsou vystavovány koncentrické řadě sledovaného
mutagenu – lze zjistit závislost dávka – efekt
Positivní výsledek indikuje, že v testovaných podmínkách
substance indukuje poškození DNA.
Výhodou testu je, že není zapotřebí znát karyotyp.
In vivo SCGE test
Výhoda – hodnotí se malý počet buněk
z příslušné tkáně – lze stanovit lokální
genotoxickou citlivost.
Lze hodnotit buňky laboratorních
zvířat, ale i zvířat z volného prostředíryby apod., včetně lidských leukocytů
a lymfocytů.
Aplikační možnosti SCGE
(Dusinska et Colins 2008)
Využití SCGE v optimalizaci léčby některých CA
onemocnění
Výsledky hodnocení individualní citlivosti tumoru k radiaci a
chemoterapeutickým látkám s cílem „ ušít efektivní léčbu na míru“
(Fisher et al., 2007, chemo-sensitivity (Smith et al., 2007)
tab. podle McKenna 2008)
( radiosensitivita
Perspektivy využití SCGE v ekotoxikologii
Většina testů je založena na hodnocení genotoxicity v laboratorních
podmínkách na experimentálních organismech – problém s interpretací
výsledků a zevšeobecněním jejich platnosti.
In vivo Comet assay dovoluje hodnotit změny DNA v buňkách různých
Lze hodnotit nejen somatické, ale i gametické změny DNA ve spermatických
buňkách – tím se rozšiřuje využití na hodnocení vlivu genotoxikantů a na
reprodukční schopnosti a fekunditu.
Využití v ekotoxikologii bude však vyžadovat optimalizaci metody pro
přirozenou biotu, validaci a inter-laboratorní harmonizaci testu, výběr
vhodných druhů žijících v různých nikách s různými potravními a
reprodukčními strategiemi.
http://www.cometassay.com/index.htm
organismů ovlivněných mutageny in situ v reálných podmínkách.
Využití SCGE v prevenci – ochraně
zdraví
Hodnocení protektivních effektů různých
potravních faktorů v chemo-preventivních studiích
(Bichler et al., 2007).
V kombinaci s určitými bakteriálními enzymy
(např.formamidopyrimidin glykosylasou,
endonukleasou III, uracil-DNA glykosylasou), které
rozpoznávají oxidační poškození purinových a
pyrimidinových bazí, se využívá SCGE pro
identifikaci oxidativních DNA změn, které mohou
být příčinou různých zdravotních problémů (Collins
et al., 2001, Kruman et al., 2002).
Mikronukleus test (MN)
in vitro krátkodobý test
Charakteristika
MN test je založen na tvorbě mikrojader ve stimulovaných
živočišných nebo lidských periferních lymfocytech.
Vyžaduje, aby se buňky dělily.
Hodnocení se provádí v metafázi/anafázi mitózy.
Mikrojádra vznikají:
- v důsledku chromozómových zlomů a jsou pak
tvořena acentrickým fragmentem,
- poruchou funkce dělícího vřeténka (mikrojádro je
tvořeno celým chromozómem nezačleněným do nově vytvořeného
jádra).
Mikrojádra se analyzují výhradně v těch lymfocytech, které prošly
pouze jedním buněčným dělením.
Analyzuje se frekvence mikrojader ve dvoujaderných buňkách.
Možnosti využití MN-testu
Mikrojádra jsou považována za biomarker efektu a uplatňující se v
risk assessmentu (rakoviny)
Umožňuje identifikaci chromozomových + genomových mutací
Rozlišení jednojaderných a dvoujaderných buněk se provádí tzv.
cyto-B assay po aplikaci cytochalasinu-B
V jednojaderných buňkách jsou změny vzniklé in vivo před kultivací
buněk.
Ve dvoujaderných buňkách jde o změny před kultivací buněk +
změny vytvořené v průběhu kultivace, tj. v průběhu první in vitro
mitozy.
Princip MN
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
Charakteristika
Metoda umožňuje detekci získaných strukturálních
chromozómových přestaveb - aberací v savčích a lidských
buňkách.
Stabilní chromozomální přestavby nezpůsobují ztrátu
chromozomálního materiálu, mohou se při dělení přenášet
z mateřské na dceřiné buňky, kumulují se v organismu a
jejich počet je odrazem dlouhodobé expozice genotoxickými
látkami.
Je nutno znát karyotyp
Metoda FISH je nejčastěji využívána v diagnostice,
prognostice; v hodnocení průběhu a efektu léčby některých
chorob, rakoviny a studiu genetických syndromů.
Princip FISH
Lymfocyty jsou pozorovány v metafázi.
Preparáty jsou hybridizovány s
fluorescenčně značenými
celochromozomovými sondami (tzv.
painting).
Mikroskopická analýza
Chromozómové aberace se hodnotí ve fluorescenčním
mikroskopu při zvětšení 1 000x za použití imerzního oleje.
Vyhodnocuje se 1000 metafázních buněk u každého vzorku
(daného jedince).
Analyzují se jen na první pohled úplné metafáze s dobrým
hybridizačním signálem.
Je velmi vhodné snímat aberantní buňky pomocí CCD kamery
do počítačového programu umožňujícího analýzu obrazu
Přeskupeni na
chromozomech 9 a 22
Hodnocení translokace BCR / ABL
pro chronickou myeloitidu
Značení buněk 4 různými sondami
Kombinace testů
MN a FISH
Baterie testů
Comet assay - MN - FISH
Kombinací lze docílit upřesnění charakteru poškození DNA.
Vzniká-li kometa budou také vznikat mikrojádra ? Kombinace
Comet - MN dovoluje upřesnit charakter poškození DNA (tj. zda
jde o chromozomovou aberaci nebo vznik acentrického chromozomu).
V kombinaci s fluorescenční in situ hybridizací (Comet-FISH),
můžeme determinovat sekvence nebo specifické genetické
změny a reparace (McKenna et al., 2003, Kumaravel and Bristow, 2005)