Přednáška 8

Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Mikrofluidní bioaplikace
Strana 1
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Mikrofluidní aplikace pro bioanalýzu
• Transport, dávkování, promíchávání
a adresování vzorků, pufrů a dalších
elektrolytů.
• Homogenní a heterogenní biologické
interakce typu ligand-receptor.
• Separace biologických molekul.
• Detekce a kvantifikace biologických složek.
• Zařízení integrující některé nebo všechny
předešlé kroky.
Strana 2
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Typická zařízení pro mikrofluidní
bioaplikace
• Kapilární/mikrokanálkové elektroforetické
a isoelektrické fokusační systémy.
• Dielektroforetické a elektroosmotické třídiče
a koncentrátory.
• Mikrokanálkové struktury pro řízený elektrokinetický
transport vzorků.
• Mikrofluidní čipy pro proteinovou analýzu
s různým stupněm integrace.
• Vysoce integrované mikrofluidní čipy pro analýzu
DNA/RNA.
• Mikrofluidní PCR systémy.
• Kontinuálně pracující biosenzory.
• Průtokové cytometry
Strana 3
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 4
PCR – polymerázová řetězová reakce
• Metoda používaná ke zmnožení molekuly DNA ze vzorku
• Ke zmnožení je dostačující jedna kopie DNA molekuly,
z toho plyne citlivost metody na kontaminaci vzorku biologickým
materiálem
• Metoda je založena na řízeném střídání teplotních cyklů, kdy dochází
ke zmnožování DNA rychlostí 2n, kde n je počet teplotních cyklů
• Cykly se skládají z následujících kroků
– denaturace dvojšroubovice DNA při 92-95°C
– hybridizace primeru na specifické místo ssDNA 62°C
– syntéza komplementárního řetězce termofilní DNA polymerázou
68-80°C
• Řízení teplotního režimu je klíčovým problémem PCR metody
• V mikrofluidice je kvalitní řízení teplotního režimu umožněno vysokým
poměrem teplosměnné plochy vůči reakčnímu objemu
• Aplikace: selektivní výběr DNA, zesílení a kvantifikace, diagnostika
nemocí
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 5
Mikrofluidní čip pro dynamickou PCR
V dynamickém uspořádání protéká roztok
obsahující vzorek DNA, primery, báze a DNA
polymerázu opakovaně různými teplotními
zónami.
Amplifikace molekul DNA (cca 30 cyklů) trvá
obvykle kolem 30 minut.
Transport reakční směsi je obvykle proveden
elektroosmoticky.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 6
Dynamická PCR v zařízení se
segmentovaným tokem
V každé červené kapce probíhá amplifikace DNA. Jednotlivé kapky jsou odděleny
olejovou fází. Kapky proudí v mikrokanálech v různých teplotních zónách – dochází
k amplifikaci. Jedná se o kontinuální sériové uspořádání PCR. IMM Mainz.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Přednáška #12
Strana 7
Digital PCR
https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/pcr/digital-pcr.html
- Quantification (0, 1)
- Real time PCR - (1) non-specific fluorescent dyes that intercalate with any double-stranded DNA,
and (2) sequence-specific DNA probes consisting of oligonucleotides that are labelled with
a fluorescent reporter which permits detection only after hybridization of the probe with its
complementary sequence
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 8
Mikrofluidní čip pro stacionární PCR
Ve stacionárním uspořádání je vzorek a ostatní komponenty umístěn v mikrofluidní
komoře. Pomocí topných tělísek je měněna okolní teplota v požadovaných cyklech.
Běžně je dosahováno rychlosti změn teploty okolo 30 °C s-1. Toto uspořádání je
typické pro klasické PCR systémy, kde je ovšem dosahováno mnohem pomalejších
změn teploty.
Mikrofluidní čipy jsou náchylnější na kontaminaci DNA kvůli vysoké vzájemné afinitě
používaných konstrukčních materiálů a biologických molekul.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 9
Příklady komerčních PCR čipů
Stacionární PCR
Dynamická PCR
Tradiční PCR
http://www.scientificdealers.com/product/PCR-Machine/26
http://www.directindustry.com/prod/eppendorf/product-22548-1479501.html
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 10
Elektroforéza
• Separační metoda založená na různé pohyblivosti iontů ve vloženém
elektrickém poli.
• Obvykle jsou separovány velké molekuly biologického původu –
fragmenty DNA, proteiny atd.
• K separaci dochází, pokud molekuly nesou odlišný efektivní
elektrický náboj nebo se liší jejich molekulové hmotnosti. Nárůst
molekulové hmotnosti koreluje s poklesem difúzního koeficientu
složky.
• Separace je obvykle prováděna na stacionárním médiu (vrstvě gelu)
nebo v mikrokapiláře/mikrokanálku s axiálně vloženým
stejnosměrným elektrickým napětím
• Molekuly s odlišnou pohyblivostí se rozdělí do separovaných zón.
• Velikost a poloha zón vypovídají o kvantitativním a kvalitativním
složení separované směsi.
• K elektroforetickému systému je připojen detektor.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 11
Princip kapilární elektroforézy
v mikrofluidních systémech
Odpadní rezervoár
W
Rezervoár mobilní
fáze - pufru
Odpadní rezervoár
Směr toku separovaných částic
B
Detektor
Separační kanál
Dávkování vzorku
S
Rezervoár vzorku
Zdroj stejnosměrného
elektrického napětí
W
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 12
Využití elektroforézy – elektroforetické
kapilární pole
Radiální matice
separačních kanálků
96 kanálové mikrozařízení určené pro
elektroforetickou separaci molekul
DNA. Zařízení je opatřeno
fluorescenčním detektorem. Separační
kanál má průměr 200 mm. Kanálky
dávkovacích zařízení mají šíři 110 mm
a hloubku 50 mm. Délka separačních
kanálů je 33 mm.
Dávkovací zařízení
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 13
Využití elektroforézy – automatizované
96-kapilárové zařízení pro separaci DNA
Zdroj vysokého
napětí
96 jamkové destička
se vzorky DNA
Separační kapiláry
Fluorescenční
detektor
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Přednáška #12
Strana 14
Lidský genom obsahuje cca 3 bilióny bází
- přibližně 25000 genů
- Human genome project: completed in 2003 (trval 13 let, stál okolo
- $2,7 bilionů - náročný)
- Nyní orientace na zlepšení forenzních technik a ke zlepšení lidských
podmínek (predikce zdravotních rizik, personalized medicine,
jak gen ovlivňuje kódovaný protein a jeho funkčnost)
NIH (National Institute of Health) =
cena sekvenování jednoho genomu okolo 1000USD
Místo, kde může mikrofluidika významě pomoci
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Přednáška #12
Sekvenování DNA: Sangerova metoda
http://www.techcouncil.org/the-sanger-dna-sequencing-methods-1
Strana 15
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 16
384-kanálová kapilární zařízení pro
sekvenování DNA
Zařízení slouží k detekci
různě velkých fragmentů DNA
vzniklých syntézou
komplementárního řetězce
DNA při sekvenování. Každá
báze je označena specifickou
značkou (jednou ze čtyř), jejíž
přítomnost je možno
detekovat pomocí laserem
indukované fluorescence.
Z pořadí detekovaných zón
a barvy lze určit sekvenci
bazí.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 17
Příklad komerčních sekvenovacích
zařízení s integrovanou kapilární
elektroforézou
MegaBACE 4000
Capillary Array (jedno
pole obsahuje 64
kapilár). Přístroj lze dále
rozšířit.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 18
Využití elektroforézy – příprava
koncentrovaného analytu
Polopropustná
vrstva
DF
Zvýšení
koncentrace
vzorku
Schéma
koncentrátoru
Přivedení
vzorku
DF
Odvedení koncentrátu
na separaci
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Přednáška #12
Strana 19
Next generation sequencing technology
Prepare Genomic
DNA Sample
Complete
amplification
Determine
first base
Attach DNA
to the surface
Image
first base
Bridge
amplication
Fragments become
double stranded
Determine
second base
Denature the doublestranded molecules
Image
second base
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Sequencing over
multiple chemistries
Align data
Přednáška #12
Strana 20
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 21
Isoelektrická fokusace
Separační metoda využívající odlišnosti hodnoty isoelektrického bodu
různých biomolekul.
Isoelektrický bod odpovídá hodnotě pH, kdy daná molekula nese celkově
nulový elektrický náboj.
Pokud je hodnota pH nižší, biomolekula získává celkově kladný elektrický
náboj.
Pro hodnoty pH vyšší je náboj biomolekuly celkově záporný.
Fokusační metoda je založena na faktu, že biologická molekula migruje
v elektrickém poli pouze tehdy, pokud je její celkový elektrický náboj
nenulový. Jestliže je molekula transportována do oblasti, kde hodnota pH je
rovna isoelektrickému bodu, její migrace se zastaví. V tomto místě může
být poté detekována.
Obvykle je používáno sériové uspořádání (viz dále).
Mikrofluidní systémy umožňují také paralelní uspořádání.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 22
Isoelektrická fokusace
Klasické sériové uspořádání
s imobilizovaným gradientem pH
V klasickém uspořádání je
vytvořen sendvič skládající se
z gelových komůrek oddělených
membránami. V každé komůrce je
pomocí pufru nastavena určitá
hodnota pH. Komůrky jsou řazeny
v sérii tak, aby hodnota pH
monotónně klesala nebo rostla. Na
systém je vloženo elektrické pole
a do některé komory je vložen
vzorek obsahující biologické
molekuly. Ty se poté migrují do
komor, kde je hodnota pH blízká
jejich isoelektrickému bodu.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Strana 23
Isoelektrická fokusace
Paralelní uspořádání komor
s různou hodnotou pH
V paralelním uspořádání jsou komůrky
s rozdílně nastavenými hodnotami pH
odděleny nepropustnou přepážkou.
V mikrofluidice je možno vytvořit velké
pole komůrek s velmi malým
charakteristickým rozměrem. Kolmo
k tomuto komůrkovému poli je vložen
gradient elektrického potenciálu
a vzorek obsahující biologické
molekuly je umístěn nad a/nebo pod
komorami. Biomolekuly jsou poté
separovány podle svého
isoelektrického bodu v odpovídajících
komůrkách. Uvedené řešení výrazně
urychluje fokusaci vzhledem ke
krátkým transportním vzdálenostem
v laterálním směru. Je možno také
využít automatických detektorů.
Vícefunkční chemické a biochemické mikrosystémy
Přednáška #12
Strana 24
SDS-PAGE
Western blot
Nterminus antibody
T
Sch
250
150
100
75
50
25
10