Manual_SBT_CZ

Návod k použití
Obsah
Testovací kity Protrans HLA SBT
1.0
Strategie Protrans sekvenování
2.0
PROTRANS HLA Sekvenační systém
2.0
PROTRANS Sekvenačníí kity (S4, S3, Domino Stones, S2, S1)
3.0
Procedura Protrans sekvenování
4.0
Materiály dodávané v HLA sekvenačních kitech
5.0
Skladování a trvanlivost testovacích činidel
6.0
Opatření a varování
6.1
Materiály a vybavení nedodávané s PRE PCR kitem
6.2
Materiály a vybavení nedodávané s POST PCR kitem
7.0
Příprava a zpracování vzorků
7.1
Extrakce DNA a koncentrace DNA
8.0
Program Thermocycleru Protrans SBT
9.0
Specifikace amplifikačních primerů
10.0 PROTRANS S4 sekvenační kity
10.1 PROTRANS S4 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.2 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S4 sekvenační kity
10.3 PROTRANS S3 sekvenační kity
10.4 PROTRANS S3 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.5 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S3 sekvenační kity
10.6 PROTRANS Domino Stones sekvenační kity
10.7 Nastavení amplifikace pro PROTRANS Domino Stones sekvenační kity
10.8 PROTRANS S2 Sekvenační kit
10.9 PROTRANS S2 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.10 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S2 sekvenační kity
10.11 PROTRANS S1 sekvenační kit
10.12 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S1 sekvenační kity
11.0 Analýza výsledků PCR amplifikace. Stanovení Haplotypů
12.0 Dokumentace pozitivních reakčních stanovení Haplotypů
13.0 PROTRANS příloha
32
14.0 Čištění haplotypů (pozitivní PCR produkty)
14.1 PROTRANS AmpliPur-Fast
14.2 ExoSAP-IT® čištění
14.3 „Beads fishing“ metoda
15.0 Výběr sekvenačních primerů
34
15.1 Nastavení sekvenační reakce 2 haplotypy
15.2 Nastavení sekvenační reakce pouze 1 haplotyp nebo lokus-specifická
amplifikace (LSA)
16.0 Nastavení sekvenační reakce
17.0 Čištění sekvenační reakce
17.1 PROTRANS DyePUR
17.2 Precipitace v ethanolu
17.3 Altrenativní purifikační metody
18.0 Přípravné sekvenační reakce pro elektroforézu
19.0 Spuštění přístroje
20.0 Identifikování HLA alel PROTRANS Alely identifikující software
21.0 Zásady popisů vzorků
22.0 Provedení identifikace alel
23.0 Průvodce nejčastějšími problémy
Strana
1
3
4
4
8
9
17
17
18
19
20
20
21
22
22
23
24
25
26
26
27
27
28
28
28
29
29
30
30
33
33
33
34
35
35
36
37
37
38
39
39
40
40
41
42
42
1
2
1.0 Strategie PROTRANS sekvenování
Protrans kity by měly být používány v souladu s aktuálními pokyny pro zajištění kvality
schválenými Evropskou federací pro imunogenetiku (EFI) nebo Americkou společností pro
histokompatibilitu a imunogenetiku (ASHI).
Sekvenování dává nejspolehlivější a nejpřesnější informaci o sekvenci DNA genu a proto je
v popředí zájmu celková charakterizace genetické komplexnosti a odlišností alel HLA genů
v lidském hlavním histokompatibilním komplexu (MHC). Plná komplexnost diversity alel
v HLA třídě I a třídě II činí z PCR-SBT metodu volby při typizaci HLA. Typizace HLA
sekvenováním by měla být uvážena vždy, když je zapotřebí u jedince určení HLA typu.
Současný vývoj učinil sekvenování zároveň jednoduchým i výkonným, což jej činí vynikajícím
pro diagnózu pacientů a typizace registru kostní dřeně. S Protrans sekvenačním systémem
je snadné typizovat v nízkých i vysokých výkonnostních formátech na každém požadovaném
stupni automatizace a rozlišení. Sekvenování může být provedeno ručně nebo plně
automaticky v závislosti na individuálních požadavcích laboratoře.
Sekvenování genu podá nejspolehlivější a nejpřesnější informaci o DNA.
Počet známých a stále nově identifikovaných HLA genů v lidském hlavním
histokompatibilním komplexu (MHC) vyžaduje vysoké rozlišení, jednoznašnou a přesnou
typizační metodu pro HLA alelovou třídu I a třídu II.
Protrans sekvenační systém je praktická, spolehlivá a nastavitelná typizační metoda.
S Protrans sekvenačním systémem je snadné typizovat všechna HLA místa v rutinních
nízkých nebo vysokých výkonnostních formátech ručně nebo při jakémkoli požadovaném
stupni automatizace a rozlišení.
Protrans sekvenační systém lze snadno využít nejen v registru kostní dřeně, ale také jako
diagnostický nástroj pro charakterizaci pacientů v denní rutině.
Se softwarem SEQUENCE PILOT© je snadné provést analýzu sekvenačních souborů
Protrans sekvenačního systému pro HLA třídu I a třídu II.
Strategie Protrans sekvenování
1 PROTRANS S4
Odděluje haplotypy
Amplifikace a sekvenování specifické pro jednu alelu a lokus
Bez ambiquit
2 PROTRANS S3
Odděluje haplotypy
Amplifikace a sekvenování specifické pro jednu alelu a lokus
Bez ambiquit
PROTRANS
Domino Stones
Sekvenování specifické pro haplotyp. Bez ambiquit
Domino Stones vám dá vysoké výsledky LCT, SSP, SSO
3
4 PROTRANS S2
Odděluje haplotypy
Amplifikace a sekvenování specifické pro HLA slupinu
5 PROTRANS S1
Amplifikace a sekvenování specifické pro HLA-lokus (LSA)
3
2.0 PROTRANS HLA Sekvenační systém
Protrans sekvenační systém je navržen tak, aby dosáhnul maximálního stupně alelaspecifického sekvenování a naopak nejnižšího počtu ambiquit. Se separací DNA se
specifickými mixy primerů ve dvou oddělených Haplotypech je zajištěno rozeznání obou alel
skoro ve všech případech.
Protrans sekvenační systém dovoluje
u HLA třídy I sekvenování od Exonu 1 po Exon 4.
u HLA třídy II sekvenování od Exonu 2 po kodon 86TG.
Zvláštní důraz byl kladen na kompletní pokrytí exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení téměř všech
ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3, stejně jako na umístění sekvenčních
primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech.
Zamýšlené použití
Protrans sekvenační systém lze snadno využít nejen v registru kostní dřeně, ale také jako
diagnostický nástroj pro charakterizaci pacientů v denní rutině.
Protrans S4 Sekvenační kity
Protrans S4 HLA SBT typizační kity jsou navrženy tak, aby dosáhly maximálního stupně
alela-specifického sekvenování a zároveň nejnižšího počtu ambiquit.
Toto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu zvlášť.
U HLA třídy I bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi (GSA) a
navíc lokus specifickou amplifikací (LSA) paralelně při pokrytí Exonů 1, Exonu 2, Exonu 3 a
Exonu 4.
Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR
stripech.
U HLA třídy I byl kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení
téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3.
U HLA třídy II bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi
(GSA) paralelně při pokrytí kompletního lokusu Exonu 2.
Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR
stripech.
V téměř všech případech bude dosaženo analýzy sekvence obou alel zvlášť.
U HLA-DRB1 byl kladen zvláštní důraz na separaci DR52-asociovaných HLA-DRB1 alel
k zajištění jednoznačných výsledků téměř u všech vzorků.
Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních
sekvencí Exonů v obou směrech.
K usnadnění použití
•
•
•
•
•
Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech.
Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
4
Protrans S3 Sekvenační kity
Protrans S3 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splnily požadavky vysokého výkonu
vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit.
Tohoto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu zvlášť.
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-A, B, C bude DNA amplifikována 7 Group-Specific
PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc Locus specific Amplification Mixem (LSA).
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DQB1 bude DNA amplifikována 6 Group-Specific
PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc 2 Locus specific Amplification Mixy (LSA).
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DRB1 bude DNA amplifikována 8 Group-Specific PCR
Amplification Mixy (GSA).
Pokud GSA reakce neindikují dvě oddělené alely, musí být LSA reakce sekvenována. Toto
zajistí ve všech případech rozpoznání obou alel.
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída I jsou pokryty Exony 1, Exon 2, Exon 3 a Exon 4
a u Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída II jsou pokryty Exon 2 (DRB1, DQB1) a Exon 3
(DQB1).
Amplification Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech a každý HLAlokus má jinou barvu.
Ve většině případů bude dosaženo sekvenční analýzy oddělených obou alel.
U HLA třídy I je kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení
téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3.
Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních
sekvencí Exonů v obou směrech.
K usnadnění použití
•
•
•
•
•
Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech.
Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
Protrans Domino Stones HLA SBT
Jsou navrženy pro maximální flexibilitu při splňování individuálních požadavků HLA
laboratoře. Domino Stones Locus- a různé Group-Specific PCR Amplification Mixy (Domino
Stones) jsou dodávány odděleně pro umožnění individuálního nastavení podle individuálních
požadavků.
Při použití Protrans Domino Stones je pro všechna HLA místa možné změnit typizovaný
výsledek s nízkým rozlišením z ostatních technik (SSP nebo SSO) na 4-digitální výsledek
s vysokým rozlišením.
Locus- a Group-Specific PCR Amplifications pokrývají nejméně Exony 2 a 3 u HLA míst třídy
I a Exon 2 u HLA místa třídy II.
5
Protrans S2 Sekvenační Kit
Protrans S2 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké
výkonnosti vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit.
Tohoto je dosaženo aplikací 4 Group-Specific PCR Amplications (GSA) paralelně pokrytím
nejméně exonů 2 a 3 u HLA míst třídy I a exonu 2 u HLA míst třídy II, což dovoluje v mnoha
případech sekvenční analýzu obou alel odděleně.
K usnadnění použití
•
•
•
•
•
Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech.
Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
Protrans S1 Sekvenační kit
Protrans S1 sekvenační kity jsou narženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké
výkonnosti vzorku.
Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím
HLA třídy I Exon 1, Exon 2, Exon 3 a Exon 4 a
HLA třídy II Exon 2, umožňující sekvenční analýzu obou alel najednou.
Zvláštní důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí
Exonů v obou směrech.
Protrans Sekvenační Kity Protrans S1 swift REF 2101 a 2102 jsou variantami Protrans S1
Kitů.
Tyto kity jsou narženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku. Tohoto
je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím Exonů 2 a 3 u HLA místa
třídy I bez vyřešení ambiquit kvůli variací vně Exon 2 a 3. Zvláštní důraz byl kladen na
vytváření krátkých PCR produktů ke zvýšení výkonu v případě nižší kvality DNA.
K usnadnění použití
•
•
•
•
•
Group-Specific Primer Mix je v jediné zkumavce.
Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
6
Specifikace Primer Mixu a Specifikační tabulky
Protrans HLA Sekvenační Kity jsou neustále aktualizovány. Aby byla uživateli dodávána
nejaktuálnější verze kitu, Specifikace Primer Mixu jsou uvedeny jako příloha u Primer Mix
Specifikačních tabulek. Prosím ujistěte se, že verze kitu je shodná s verzí Primer Mix
Specifikační tabulky.
PCR Amplifikace
Metoda je založena na PCR amplifikacích začínajících genomovou DNA. PCR amplifikační
reakce zahrnují nejméně Exony 2 a 3 u HLA míst třídy I a Exon 2 u HLA míst třídy II a byly
navrženy, aby byly specifické pouze pro jednu skupinu alel. Každá PCR formulace byla
validována oproti panelu dobře charakterizovaných buněčných linií k zamezení nespecifické
amplifikace a preferenční amplifikace jedné alely před druhou u heterozygotních kombinací.
Sekvenování
Po PCR vyčištění jsou pozitivní Group-SPecific Amplifikační reakce použity jako templáty
k přímému sekvenování nejméně Exonů 2 a 3 u HLA míst třídy I a Exonu 2 u HLA míst třídy
II. PCR templáty byly optimalizovány pro použití u cyklického sekvenování terminovaného
chemickými barvivy pro vytvoření informace o typizaci alely.
Stanovení alely
Konečný krok v sekvenační analýze se skládá ze stanovení alely za použití SEQUENCE
PILOT© alely identifikujícího softwaru. Tento program provádí identifikaci alel, dovoluje
manuální sledování nebo úpravu sekvenčních dat stejně jako vyhodnocování, exportování a
archivování sekvencí nebo výsledků. SEQUENCE PILOT© alely identifikující software
dovoluje rychlé a snadné stanovení alely.
Software umožňuje manuální sledování nebo úpravu sekvenčních dat Exonu 1 až Exonu 8.
Heterozygotní pozice stejně jako neshody jsou detekovány a hlášeny. Výsledky typizace a
sekvenační elektroferogramy mohou být vytištěny, exportovány a archivovány.
Software je dostupný jako Windows™ single-user-verze nebo jako Windows™ nebo Linux™
server-client-verze pro práci v síti s několika pracovními stanicemi.
HLA databáze je neustále aktualizována podle nejnovějších vědeckých výzkumů oficiální
IMGT/HLA databáze.
Program přístroje
PCR a sekvenační profil uváděné v tomto návodu byly použity s Thermal Cyclery od Applied
Biosystems GeneAmp PCR Systémy 2700, 9600 a 9700. Měly by také fungovat
s kompatibilními přístroji, ale mohou vyžadovat nastavení profilu nebo napodobení výše
uvedených přístrojů.
Sekvenační kity stejně jako SEQUENCE PILOT© alely identifikující software jsou
kompatibilní se všemi dostupnými čtyřbarevnými kapilárními sekvenátory.
7
3.0 Procedura Protrans sekvenačního systému
8
4.0 Materiály dodávané s HLA sekvenačními kity
9
10
11
12
13
14
15
16
Poznámka Podívejte se na Primer Mix Specifikační tabulky (Příloha) dodávané s kity,
abyste vybrali vhodné PCR produkty a Sekvenační primery. Ujistěte se, že verze kitu a verze
Primer Mix Specifikačních tabulek jsou shodné.
Poznámka Všechna činidla dodávaná s Protrans HLA Sekvenačními kity by měla být
použita
Pro Amplification Primer stejná verze a
Pro Sequencing Primer stejná šarže
Amplification Primer nemůže být smíchán ze dvou různých verzí, podle přílohy každého
kitu
Sequencing Primer nemůže být smíchán ze dvou různých šarží, podle přílohy každého kitu
Poznámka V případě poškozených zkumavek nebo krabic nemohou být vyloučeny
závady. Takovéto kity nesmí být použity.
17
5.0 Skladování a trvanlivost
Při skladování za vhodných podmínek mohou být komponenty kitu použity do data expirace
vyznačeného na Pre PCR boxu a Post PCR boxu kitu.
Otevřené balení a zkumavky musí být uzavřeny a skladovány za stejných podmínek jako
uzavřené balení a zkumavky a mohou být použity do data expirace.
Pouze komponenty ze stejné verze kitu mohou být použity dohromady a pouze do
vyznačeného data expirace.
6.0 Opatření a varování:
IVD Činidla pouze pro in vitro diagnostické použití
V USA pouze pro výzkum (RUO)
Protrans testkity musí být používány dobře školenými a autorizovanými laboratorními
pracovníky.
Se všemi činidly by mělo být zacházeno podle správné laboratorní praxe a vhodných
opatřeních.
Dále zacházejte se všemi vzorky pacientů jako s potenciálně infekčními. Nepipetujte ústy.
Se všemi použitými PCR-Cyclerplaty by mělo být zacházeno jako s potenciálně infekčními a
měly by být zlikvidovány podle platných národních nařázení.
Nepoužívejte činidla po uplynutí doby expirace. Viz datum expirace na etiketě.
Pre-PCR a Post-PCR oblasti musí být přísně odděleny.
Používejte jiné pipety v Pre-PCR oblasti a v Post-PCR oblasti.
Ethidium bromid použitý k barvení DNA je potenciální karcinogen. Noste vždy ochranné
rukavice při manipulaci s barvícím gelem. Zlikvidujte podle národních nařízení.
Noste UV-blokující ochranu očí a vyvarujte se přímému UV světlu při pozorování nebo
fotografování gelů.
Viz bezpečnostní list (MSDS) pro více informací. Dostupné u Protrans.
18
6.1 Materiály a vybavení nedodávané s kitem
Poznámka PCR a sekvenační profil uváděné v tomto návodu byly použity s Thermal
Cyclery od Applied Biosystems GeneAmp PCR Systémy 2700, 9600 a 9700. Měly by také
fungovat s kompatibilními přístroji, ale mohou vyžadovat nastavení profilu nebo napodobení
výše uvedených přístrojů. Viz Příloha A, nejčastější problémy.
19
6.2 Materiály a vybavení nedodávané s kitem
20
1
Poznámka Činidla a přístroje uvedené jako 1 byly validovány pro Protrans HLA
sekvenační kity. Protrans nepřebírá žádnou zodpovědnost, pokud jsou použity jiné materiály
nebo zařízení. Uživatel musí validovat činidla a přístroje, které nejsou označeny jako 1.
2
Poznámka Činidla a přístroje uvedené jako 2 byly validovány pro Protrans HLA
sekvenační kity. Protrans nepřebírá žádnou zodpovědnost, pokud jsou použity jiné materiály
nebo zařízení. Uživatel musí validovat činidla a přístroje, které nejsou označeny jako 2.
7.0 Příprava a zpracování vzorků
7.1 Extrakce DNA a koncentrace DNA
Genomová DNA může být získána ze všech jaderných buněk. Nejjednodušší metodou je
izolovat DNA z buněčných suspenzí (krev, buffy coat=leukocyty a destičky, nebo kultivované
buňky), k níž je dostupných mnoho protokolů a kitů. Pro DNA sekvenování by měly být
použity jen ty metody, které vytěžují DNA vysoké kvality a kvantity.
PROTRANS DNA Box 500
PROTRANS DNA extraktion-kit PROTRANS DNA Box 500 poskytuje vysoce kvalitní DNA,
optimalizovanou pro PROTRANS HLA sekvenační kity. Ostatní extrakční metody musí být
před rutinním sekvenováním validovány.
Poznámka Používejte buď EDTA nebo ACD krev. Krev antikoagulovaná heparinem by
neměla být použita, jelikož bylo dokázáno, že heparin závažně inhibuje PCR.
Koncentrace DNA musí být 50 – 100 ng/µl.
Práce se vzorky lidské krve má potenciál přenosu infekčních nemocí a měla by
být vykonávána opatrně. Vždy noste vhodné ochranné brýle, oblečení a rukavice.
21
8.0 Program Thermocycleru Protrans SBT
Všechny Protrans HLA Sekvenační Kity (Protrans S4, S3, S2, S1 a Domino Stones) fungují
se stejným teplotním profilem pro PCR amplifikaci a sekvenování.
Tento program je standardizován pro všechna HLA místa (Důležitá poznámka: Ramp Rate
1°C/s).
Poznámka PCR a sekvenační profil uváděné v tomto návodu byly použity s Thermal
Cyclery od Applied Biosystems GeneAmp PCR Systémy 2700, 9600 a 9700. Měly by také
fungovat s kompatibilními přístroji, ale mohou vyžadovat nastavení profilu nebo napodobení
výše uvedených přístrojů. Viz Příloha A, nejčastější problémy.
22
9.0 Specifikace amplifikačních primerů
Metoda je založená na PCR amplifikaci začínající genomovou DNA. PCR amplifikační
reakce zahrnují nejméně Exony 2 a 3 u HLA třídy I a Exon 2 u HLA třídy II a byly navrženy,
aby byly specifické pouze pro jednu skupinu HLA alel a jedno HLA místo. Každá PCR
rerakce byla validována oproti panelu dobře charakterizovaných buněčných linií k zamezení
nespecifické amplifikace a preferenční amplifikace jedné alely před druhou u heterozygotních
kombinací.
Protrans SBT Kity jsou neustále aktualizované.
Přílohou každého kitu je specifikace šarže a verze. Pro interpretaci výsledků amplifikace a
výběr sekvenačních primerů musí být výhradně použitá příloha se specifikací verze a
databáze dodávaná s kitem.
Protrans HLA sekvenační kity jsou neustále aktualizované.
Aby byly uživateli dodávány nejnovější verze kitu, je specifikace primer mixu uvedena
v příloze v Primer Mix Specifikační tabulce dodávané s každým kitem.
Prosím ujistěte se, že verze kitu je shodná s verzí PŘÍLOHY v Primer Mix Specifikační
tabulce v testkitu.
10.0 PROTRANS S4 Sekvenační kity
Protrans S4 HLA SBT Typizační kity jsou navrženy tak, aby dosáhly maximálního stupně
alela-specifického sekvenování při nejnižším počtu ambiquit.
Tohoto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu odděleně.
U HLA třídy I bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi (GSA) a
navíc lokus specifickou amplifikací (LSA) paralelně při pokrytí Exonů 1, Exonu 2, Exonu 3 a
Exonu 4.
Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR
stripech.
U téměř všech případů bude dosaženo sekvenační analýzy obou oddělených alel.
U HLA třídy I byl kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení
téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3.
U HLA třídy II bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi
(GSA) paralelně při pokrytí kompletního lokusu Exonu 2.
Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR
stripech.
V téměř všech případech bude dosaženo analýzy sekvence obou alel zvlášť.
U HLA-DRB1 byl kladen zvláštní důraz na separaci DR52-asociovaných HLA-DRB1 alel
k zajištění jednoznačných výsledků téměř u všech vzorků.
Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenačních primerů k zajištění kompletních
sekvencí Exonů v obou směrech.
K usnadnění použití
Allele- a Allele-Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR
stripech. Barva stripu je pro každé HLA místo jiná.
Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení
sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná.
Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa
Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně. Je vždy možné
zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování.
23
10.1 PROTRANS S4 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
24
10.2 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S4 sekvenační kity
25
10.3 Protrans S3 Sekvenační Kity
Protrans S3 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splnily požadavky vysokého výkonu
vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit.
Tohoto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu zvlášť.
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-A, B, C bude DNA amplifikována 7 Group-Specific
PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc Locus specific Amplification Mixem (LSA).
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DQB1 bude DNA amplifikována 6 Group-Specific
PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc 2 Locus specific Amplification Mixy (LSA).
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DRB1 bude DNA amplifikována 8 Group-Specific PCR
Amplification Mixy (GSA).
Pokud GSA reakce neindikují dvě oddělené alely, musí být LSA reakce sekvenována. Toto
zajistí ve všech případech rozpoznání obou alel.
U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída I jsou pokryty Exony 1, Exon 2, Exon 3 a Exon 4
a u Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída II jsou pokryty Exon 2 (DRB1, DQB1) a Exon 3
(DQB1).
Amplification Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech a každý HLAlokus má jinou barvu.
Ve většině případů bude dosaženo sekvenační analýzy oddělených obou alel.
U HLA třídy I je kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení
téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3.
Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních
sekvencí Exonů v obou směrech.
K usnadnění použití
• Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech.
• Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
• Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
• Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
• Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
26
10.4 PROTRANS S3 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.5 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S3 sekvenační kity
27
10.6 PROTRANS Domino Stones HLA SBT Sekvenační Kity
Protrans Domino Stones jsou navrženy pro maximální flexibilitu při splňování individuálních
požadavků HLA laboratoře.
Domino Stones Locus- a různé Group-Specific PCR Amplification Mixy (Domino Stones) jsou
dodávány odděleně pro umožnění individuálního nastavení podle individuálních požadavků.
Při použití Protrans Domino Stones je pro všechna HLA místa možné změnit typizační
výsledek s nízkým rozlišením z ostatních technik (SSP nebo SSO) na 4-digitální
výsledek s vysokým rozlišením.
Locus- a Group-Specific PCR Amplifications pokrývají nejméně Exony 2 a 3 u HLA třídy I a
Exon 2 u HLA třídy II.
K usnadnění použití
• Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
• Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
• Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
• Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
10.7 Nastavení amplifikace pro PROTRANS Domino Stones
sekvenační kity
28
10.8 PROTRANS S2 Sekvenační kity
Protrans S2 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké
výkonnosti vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit.
Tohoto je dosaženo aplikací 4 Group-Specific PCR Amplications (GSA) paralelně pokrytím
nejméně exonů 2 a 3 u HLA třídy I a exonu 2 u HLA třídy II, což dovoluje v mnoha případech
sekvenční analýzu obou alel odděleně.
K usnadnění použití
• 4 Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány dvakrát v 8-jamkových PCR
stripech.
• Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a
nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna
HLA místa stejná
• Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA
místa
• Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně
• Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích
Protrans sekvenování
10.9 Protrans S2 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.10 Nastavení amplifikace pro Protrans S2 sekvenační kity
29
10.11 Protrans S1 Sekvenační Kity
Protrans S1 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké
výkonnosti vzorku stejně tak jako prodlouženého sekvenování u HLA třídy I k vyřazení všech
ambiquit způsobených vně exonů 2a 3. Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR
Amplification (LSA) s pokrytím Exonu 1, 2, 3 a 4 u HLA třídy I a Exonu 2 u HLA třídy II,
umožňující sekvenční analýzu obou alel najednou. Zvláštní důraz byl kladen na umístění
sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech. Pro
usnadnění použití je Locus-Specific Amplification Mix připraven k použití.
Variantou designu Protrans S1 kitu je Protrans S1 swift Sekvenační kit. Protrans S1swift
sekvenační kit je navržen tak, aby splňoval požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku.
Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím Exonů 2 a 3 u HLA
míst třídy I bez vyřešení ambiquit kvůli variacem vně Exon 2 a 3. Zvláštní důraz byl kladen
na vytváření krátkých PCR produktů ke zvýšení výkonu v případě nižší kvality DNA. Pro
usnadnění použití je Locus-specific Amplification Mix připraven k použití.
Nastavení PCR amplifikace je shodné pro Protrans S1 i Protrans S1swift.
10.12 Nastavení amplifikace pro Protrans S1 sekvenační kity
30
11.0 Analýza výsledků PCR amplifikace.
Stanovení Haplotypů
PCR produkty jsou identifikovány elektroforézou na fluorescenčním agarózním gelu pomocí
UV detekce PCR pruhů.
12.0 Dokumentace pozitivních reakčních stanovení haplotypů
Vyfotografujte záznam PCR amplifikace a nahrajte výsledky na kopii Protrans přílohy, Primer
Mix Specifikačních tabulek dodávaných s každým kitem, a stanovte PCR produkty
k sekvenování. Amplifikační reakce je považována za pozitivní, pokud se objeví intenzivní
PCR fragment.
Protrans S1 a Protrans Domino Stones PCR produkty mohou být přímo čištěny a
sekvenovány bez analýzy na agaru.
U Protrans S4, S3 a S2 HLA Sekvenačních Kitů mohou být v závislosti na zkoumaných
alelách přítomných ve vzorku DNA pozitivní jedna, dvě, tři nebo čtyři PCR. Amplifikační
záznam by měl být stejný se specifikacemi uvedenými v Protrans příloze (Primer Mix
Specifikační tabulky).
Poznámka Je doporučeno vybrat pro sekvenování takové produkty PCR, které nebyly
vytvořeny překrytím primer mixů. Pokud není dosaženo PCR separace alel, je velmi
doporučeno sekvenovat v obou směrech.
Poznámka Záznam PCR amplifikace by měl být ve shodě se specifikační tabulkou a měl
by dávat přesvědčivý výsledek. Pokud je záznam PCR amplifikace nepřesvědčivý, např.
pokud ukazuje na přítomnost více než dvou alel, potom se mohla vyskytnout kontaminace,
nebo variatní alela. Pokud negativní kontrola vylučuje kontaminaci, může být provedeno
sekvenování dvou PCR produktů. Pokud výsledky sekvenování ukazují identické sekvence,
měly by být sekvenovány další group-specific PCR produkty.
Poznámka Přídružená pozitivní amplifikační kontrola by měla být pozitivní a přidružená
negativní amplifikační kontrola musí být negativní k vyloučení kontaminace.
31
2 PCR jsou pozitivní (2 Haplotypy)
Pokud jsou pozitivní dvě PCR, musí být sekvenovány oba PCR produkty, každý v jednom
směru, přímo nebo zpět.
Pokud jsou pozitivní více než dvě PCR, musí být sekvenovány PCR produkty s nejmenším
překryvem specifikace, každý v jednom směru, přímo nebo zpět.
Pokud se záznam PCR amplifikace neshoduje s Primer Mix Specifikačními tabulkami, např.
pokud ukazuje na přítomnost více než dvou alel, potom se mohla vyskytnout kontaminace,
nebo variatní alela. Pokud negativní kontrola vylučuje kontaminaci, musí být provedeno
sekvenování PCR produktů s nejmenším překryvem specifikace v jednom směru. Pokud
výsledky sekvenování ukazují identické sekvence těchto PCR produktů, musí být
sekvenovány další group-specific PCR produkty k vyloučení homyzygosity.
Pouze jedna PCR je pozitivní
Pokud je pozitivní pouze jedna PCR, musí být LSA PCR produkt nebo GSA PCR produkt u
HLA-DRB1 sekvenován v obou směrech, přímo i zpět.
Poznámka
HLA-DRB1 sekvenační kity jsou založeny na group-specifické odlišnosti
sekvencí vně exonu 2. Pro několik HLA-DRB1 alel nejsou tyto sekvence ještě dostupné.
Ukázalo se, že vně exonu 2 jsou HLA-DRB1 alely uloženy v alelových skupinách a jsou tudíž
amplifikovány určeným primer mixem. Nicméně nemůže být úplně vyloučeno, že některé
alely s neznámým motivem vně exonu 2 nejsou kryty HLA-DRB1 primer mixy. Je důležité
toto možné omezení vzít na vědomí a je velmi doporučováno provést nízkorozlišovací
typizace PCR metodami, pokud byla identifikována pouze jedna alela.
Označte pozitivní PCR primer mixy v Protrans příloze.
Vyberte Haplotypy, které budou sekvenovány.
Vneste výsledek do Protrans Pipetting Assistant nebo pipetovacího návrhu
Vytvořte purifikační plate a sekvenční plate podle PROTRANS Pipetting Assistant
32
13.0 Protrans příloha
33
14.0 Čištění Haplotypů
Čištění pozitivních PCR produktů
PCR produkty musí být před jejich použitím jako sekvenční templáty přečištěny, protože
zbytky PCR primerů a nukleotid trifosfátů (dNTPs) mohou interferovat s chemií sekvenování,
což by znamenalo nižší kvalitu dat.
14.1 PROTRANS AmpliPur-Fast
PROTRANS AmpliPUR-Fast PCR purifikační kit nabízí vhodný nástroj pro rychlé a efektivní
přečištění PCR produktů.
Návod
1) 150 µl Binding Buffer vortexujte a napipetujte do PCR produktů, které mají být vyčištěny
2) umístěte Protrans Spin filter do označených Protrans Receiver Tubes 2,0 ml
3) PCR produkt s Binding Buffer napipetujte do středu spin column
4) Protrans Receiver Tubes centrifugujte při 10000 rpm 3 min
5) umístěte Protrans Spin filter do nově označených Protrans Receiver Tubes 1,5 ml
6) 30 µl Elution Buffer (EB) napipetujte do středu Protrans spin column
7) inkubujte při pokojové teplotě 1 min
8) centrifugujte při 6000 rpm 1 min
14.2 ExoSAP-IT® Purifikace
Purifikace PCR produktů směsí Exonukleasy I a alkalické fosfatázy (z garnátů) ExoSAP-IT®.
Degradace nenavázaných primerů a dNTPs.
Návod
1) 3 µl ExoSAP-IT® před použitím vortexujte. Předpipetujte na PCR stripy nebo PCR platu
2) 10 µl PCR Produktu (Haplotypu), který má být přečištěn, napipetujte na definované místo
na PCR plate
3) Uzavřete PCR stripy nebo PCR platy, odstřeďte a umístěte do thermocycleru
34
14.3 Beads Fishing Metoda
Alternativou k purifikaci pomocí ExoSAP-IT® je použití Agencourt AMPure technologie
založené na kuličkách (Beckman Coulter, 2.3), která zachycuje PCR produkty připoutáním je
ke kuličkám a umožňuje odmýt zbytky primerů a dNTPs. Tato technika nepotřebuje
thermocycler a může být snadno zautomatizována. Purifikace kuličkami je kompatibilní
s nízkým i vysokým výkonnostním formátem při použití jednotlivých zkumavek, 96 nebo 384
jamkovými mikroplaty.
15.0 Výběr sekvenačních primerů
Protrans S4, S3, S2 a
Protrans Domino Stones HLA Sekvenační Kity
jsou navrženy k amplifikaci a sekvenování obou alel zvlášť.
Protrans S1 HLA Sekvenační Kity
jsou navrženy k amplifikaci a sekvenování obou alel zároveň.
Poznámka Podívejte se do Protrans Přílohy (Primer Mix Specifikační tabulky) pro výběr
sekvenčního primeru.
U HLA třídy I
by měly být sekvenovány nejméně Exony 2 a 3 k získání 4-digitálního HLA typizačního
výsledku.
U HLA třídy II
by měl být sekvenován nejméně Exon 2 k získání 4-digitálního HLA typizačního výsledku.
Pro HLA typizační výsledky s nižším rozlišením může být dostačující méně sekvenačních
informací.
Pokud je separace alel úspěšná (2 Haplotypy),
je dostačující sekvenovat každý z dvou vybraných PCR produktů v jednom směru.
U HLA třídy I
Pro získání kompletních sekvencí Exonu je doporučeno použít
Reverse Sequencing Primers Exon 2 (E2R) a Exon 3 (E3R).
U HLA třídy II
Pro získání kompletních sekvencí Exonu je doporučeno použít
Forward sequencing primers Exon 2 (E2F)
Pokud není dosáhnuto PCR separace alel,
je požadováno sekvenování v obou směrech. Abyste se vyhli ambiquitám i u
heterozygotního sekvenování kvůli nedefinovaným cis spojům, použití Sequence-Specific
Sequencing Primerů dovolí selektivní sekvenování pouze jedné ze dvou alel. Spolu
s výsledky heterozygotního sekvenování může být potom získána jednoznačná definice cis
spojů u obou alel.
Sequence-specific Sequencing Primer HLA-DRB1 (DR-86TG)
je momentálně dostupný pro selektivní sekvenování kodonu 86.
35
15.1 Nastavení sekvenační reakce
DNA je rozdělena na 2 Haplotypy
Je možné sekvenovat každý Haplotyp pouze v jednom směru.
15.2 Nastavení sekvenační reakce
Pouze 1 alela nebo pouze jeden Locus specific Amplification
Produkt (LSA)
Ve většině případů může být sekvenování exonů 2 a 3 dostatečné i pro 4-digitální typizace a
je vždy dostatečné, pokud je požadována pouze 2-digitální typizační informace.
Sekvence exonů 1 a 4 modou být požadovány k vyloučení jistých ambiquit stejně
neexprimovaných (nulových) alel.
Příloha (viz uvnitř kitu)
Ukazuje Specifikace Amplifikačního primeru a další možnosti k využití Sekvenčních primerů
pro Exon 1 nebo Exon 4.
Exon 1 reversní sekvenování může být také umožněno prodloužení sekvenčního runu Exonu
2 reverse.
Exon 2 forward sekvenování může být také umožněno prodloužení sekvenčního runu Exonu
2 forward.
Nicméně, toto vyžaduje delší a kvalitnější podmínky a specifické nastavení sekvenátoru.
Navíc v jistých kombinacích alel způsobuje delece na intronu 1 posun chromatogramu
inhibující sekvenční analýzu Exonu 1 a/nebo 2.
36
16.0 Nastavení sekvenační reakce (3-dot-metoda)
1) Vytvořte sekvenační plate pomocí Protrans Pipetting Assistant (Protrans SEQ 1) nebo
Pipetting Scheme vzoru
2) Protrans PCR Workstation -20°C
- PCR plate nebo MicroAmp optický plate
- Big DyeTerminators
- Sekvenační primery
3) Vortexujte Big DyeTerminators
4) 2 µl Big Dyes naneste na levou stranu jamek na MicroAmp optický plate (RAININ
Multistepper)
5) Odstřeďte sekvenační primery na mini-centrifuze.
6) 6 µl Sekvenačních primerů naneste na levou stranu jamek na MicroAmp optický plate
(RAININ Multistepper)
7) 2 µl Přečištěných PCR Produktů napipetujte do středu jamek na MicroAmp optický plate
(RAININ Multistepper)
8) Uzavřete důkladně plate a umístěte plate na thermocycler.
Poznámka Pokud sekvenční reakce dává silné signály, může být vhodné naředění BDT
RR Mixu, začínejte s ředěním 1:2.
Zřeďte Bid Dye Terminators 1.1 pětinásobným množstvím Sequencing Buffer 1:2.
Poznámka Pokud sekvenční reakce dává vzestup signálu pozadí nebo větší snížení
signálu, může být vhodné naředění PCR produktu, začínejte s ředěním 1:2.
37
17.0 Purifikační Sekvenační reakce
17.1 PROTRANS DyePUR
Sekvenční produkty musí být přečištěny k odstranění nezabudovaných dye terminators.
PROTRANS DyePUR purifikační kit pro purifikaci sekvenačních reakcí je založen na
odstředivé filtraci pomocí Sephadexu G-50 a PROTRANS DyePUR kolon. Metoda dává
vysokou kvalitu sekvenčních dat.
Příprava gelu Sephadex pro 20 kolon.
1)
2)
3)
4)
50 ml Falcon zkumavka.
1 g Sephadex™ G-50 DNA Grade F
12 ml HPLC voda (Merck)
Inkubace při pokojové teplotě 30 min. Promíchejte nebo vortexujte několikrát během
inkubace.
Označte Protrans Receiver Zkumavky (2ml).
5) Několik minut před ukončením programu thermocycleru pro sekvenační reakci
naplňte kolony suspenzí gelu Sephadex do asi ¾ zkumavky. Použijte plastovou
Pasteurovu pipetu. Odstřeďte Protrans Receiver Zkumavky s filtračními kolonami při
2000 g po dobu 90 sekund. Odstřeďovací čas a g musí být přísně dodrženy.
6) Označte Protrans Receiver Tubes 1,5 ml reakční zkumavky podle počtu sekvenčních
reakcí, které musí být přečištěny, a umístěte PROTRANS filtrační kolony se suspenzí
gelu Sephadex do Protrans Receiver zkumavek 1,5 ml.
Čištění sekvenačních produktů
1) Vyndejte jednu odstřeďovací kolonu ven z Protrans Receiver Zkumavek 1,5 ml a
podržte ji v ruce.
2) Opatrně napipetujte 10 µl Sekvenčního produktu do středu nakloněného povrchu
odstředěných Sephadex kolon. Dávejte pozor, aby se špička nedotkla gelu
Sephadex. Pro dobrou separaci je hlavní důkladné nanesení vzorku do středu. Dejte
pozor, aby vzorek netekl po stranách Sephadex kolon.
3) Umístěte odstřeďovací filtr zpátky do označené 1,5 ml zkumavky.
4) Odstřeďte Protrans kolonu při přesně 2000 g po dobu 1 min.
Odstřeďovací čas a g musí být přesně dodrženy.
5) Do nanášení by měly být označené sekvenční produkty skladovány při 4-8°C nebo
pro delší období při -20°C chráněné před světlem.
Nastavení sekvenování
1) 18 µl HPLC vody napipetujte na MicroAmp Optický plate.
2) 2 µl Přečištěného sekvenčního produktu napipetujte na MicroAmp Optický plate,
vždy použijte nové filtr-špičky.
3) Sekvenční produkty jsou připraveny pro nanesení do sekvenátoru. Do nanesení by
měly být platy skladovány při 4-8°C chráněné před světlem.
38
17.2 Precipitace ethanolem
1) 80% Ethanol: 8 částí Ethanolu 100% a 2 části HPLC vody.
2) Krátce odstřeďte 96-jamkový MicroAmp Optický plate se sekvenčními produkty
3) Vezměte EDTA/NaOAc pufr a trochu vortexujte/odstřeďte před otevřením vialky,
uchovávejte na ledu (Protrans PCR-Workstation).
4) 2 µl NaOAc/EDTA pufru (Teknova, cat.no. S2080) napipetujte do každé sekvenční
reakce. Přidejte kapku na stěnu každé jamky pomocí 8-kanálové multipipety.
Poznámka: Ve špičce může zůstat kapka, ujistěte se, že tam nebude.
5) Odstřeďte krátce MicroAmp Optický plate.
6) 25 µl 100% Ethanolu napipetujte do každé jamky za použití 8-kanálové multipipety.
7) Důkladně vortexujte plate 30 sekund.
Používejte plochý poklop na plate k předejití vylití (např. hliníkový plate).
Poznámka: Nedokonalé promíchání se odrazí ve slabé kvalitě dat.
8) Odstřeďte MicroAmp Optický plate při 2000 g po dobu 30 min.
9) Ihned odstraňte supernatant otočením a jemně osušte poklepáním papírovou
utěrkou. Umístěte obrácený nosič s papírovou utěrkou do centrifugy.
10) Odstřeďte MicroAmp Optický plate k odstranění supernatantu při 180 g po dobu 20
sekund.
Poznámka: Odstředění je nezbytné k zajištění kompletního odstranění
degradovaných produktů.
11) 50 µl 80% Ethanolu napipetujte do každé jamky za použití 8-kanálové multipipety.
12) Odstřeďte MicroAmp Optický plate při 2000 g po dobu 5 min.
13) Ihned odstraňte supernatant otočením a jemně osušte poklepáním papírovou
utěrkou. Umístěte obrácený nosič s papírovou utěrkou do centrifugy.
14) Odstřeďte MicroAmp Optický plate k odstranění supernatantu při 180 g po dobu 20
sekund.
Poznámka: Odstředění je nezbytné k zajištění kompletního odstranění
degradovaných produktů.
15) Usušte nosič v temnu (reakce jsou citlivé na světlo) 15 minut.
16) 10 µl HPLC vody do každé jamky, pomocí 8-kanálové multipipety. Resuspendujte
sekvenční produkty pipetováním třikrát tam a zpátky.
17) 90 µl HPLC vody do každé jamkym, pomocí 8-kanálové multipipety. Uzavřete plate a
vortexujte!
18) Odstřeďte krátce MicroAmp Optický plate a umístěte na ABI Support Base®.
19) Umístěte Full Plate Septa® mat na nosič, následně 96-jamkový Plate Retainer a
umístěte kompletní nosič do ABI Sekvenátoru.
Alternativní kroky
Připravte 125mM EDTA sodný (pH 7,0): 1 část 0,5M EDTA a 3 části HPLC-H20.
4) 2 µl 125mM EDTA (pH 7,0) přidejte k sekvenčním reakcím (jednoduchá nebo 8kanálová multipipeta). Použijte špičky s filtrem.
2 µl 3M octan sodný (pH 5,2) přidejte k sekvenčním reakcím (jednoduchá nebo 8kanálová multipipeta). Použijte špičky s filtrem.
16) 15 µl Hi Di Formamidu do každé jamky, pomocí 8-kanálové multipipety. Uzavřete
plate.
17.1) Inkubujte při 95°C (thermocycler) 2 min.
17.2) Uchovávejte na ledu (Protrans PCR-Workstation) 2 min.
39
17.3 Alternativní purifikační metody
Zahrnují mimo jiné Agencourt CleanSEQ beads purifikační technologii, precipitaci ethanolem
nebo Millipore Montage filtrační technologii, u kterých bylo prokázáno získání dat o vysoké
kvalitě. Tyto techniky mohou být také použity na 96-jamkovém formátu pro požadavky
vysoké výkonnosti. Navíc Agencourt a Millipore technologie mají dobrý potenciál
k automatizaci. Spousta dalších metod je doskutpných k purifikaci sekvenačních reakcí a po
zvalidování mohou být používány v laboratoři.
18.0 Přípravné sekvenační reakce pro elektroforézu
Různé sekvenátory mohou vyžadovat různé přípravy vzorků před jejich nanesením na gel
nebo kapiláru. Následující kapitoly popisují přípravu vzorků pro kapilární sekvenátory 310,
3100, 3130, 3700 a 3730 a destičkovém gelovém sekvenátoru 377 (Applied Biosystems).
Pro ostatní sekvenátory DNA mohou být tyto přípravy také vhodné. Pro detailnější informace
se odkažte na doporučení výrobce.
Pro přípravu přečištěných sekvenačních reakcí pro kapilární elektroforézu může být možné
resuspendování ve formamidu nebo vodě. Pro usnadnění použití, vyšší opakovatelnost a
vyšší kvalitu dat je doporučen vodní protokol Protrans HLA Sekvenačních Kitů.
Přípravné sekvenační reakce pro kapilární elektroforézu
Jak je popsáno v 22.1 a 22.2, nařeďte přečištěnou sekvenční reakci
10 µl přečištěné sekvenční reakce s
90 µl HPLC vody
Uzavřete důkladně plate nebo zkumavky a umístěte je do autosampleru.
Poznámka Různé sekvenátory mohou mít různé citlivosti fluorescenční detekce a mohou
proto vyžadovat různá ředění.
Poznámka Pokud je použito méně nebo více DyeTerminators v sekvenační reakci, jak je
uvedeno v 17, musí být tomu přizpůsobeno ředění přečištěné sekvenční reakce.
Poznámka Zbylá sekvenační reakce může být skladována pro zálohu při -4°C po několik
dnů v temnu.
Přípravné sekvenační reakce pro destičkovou gelovou
elektroforézu
Vysušte přečištěné sekvenované vzorky ve vakuové centrifuze nebo na tepelném bloku při
70°C po dobu 45 minut.
4 µl Loading pufru (roztok rekrystalizovaného formamidu a modrého dextranu, 5:1; vždy
připravte čerstvé pro každé použití), resuspendujte vysušený sekvenovaný vzorek.
Pokud byla použita odstřeďovací filtrace (18.1 přeskočte 5), neřeďte a přidejte 4 µl Loading
pufru.
Pokud byla použita precipitace ethanolem (18.2 krok 15), neřeďte a přidejte 4 µl Loading
pufru.
Poznámka Různé sekvenátory mohou mít různé citlivosti fluorescenční detekce a mohou
proto vyžadovat různá ředění.
Poznámka Pokud je použito méně nebo více DyeTerminators v sekvenační reakci, jak je
uvedeno v 3.4.1, musí být tomu přizpůsobeno ředění přečištěné sekvenční reakce.
Denaturujte resuspendované vzorky při 90°C po dobu 2 minut a před nanesením na gel
uchovávejte na ledu.
40
19.0 Spuštění přístroje
Vlastnosti přístroje
Protrans HLA Sekvenační kity jsou kompatibilní se všemi dostupnými čtyřbarevnými
sekvenátory. Řiďte se návody pro standardní spuštění podle výrobce. Čtecí délka 350 bazí je
dostačující.
Pro podrobnější informace o těchto přístrojích a pro informace o ostatních čtyřbarevných
DNA sekvenátorech se odkažte na návody k použití výrobců.
Poznámka Protrans HLA Sekvenační kity byly validovány pro Applied Biosystems DNA
Sekvenátory 3100 Genetic Analyzer a 3730 DNA Analyzer. Ostatní čtyřbarevné sekvenátory
by měly být před rutinním použitím validovány.
20.0 Identifikování HLA alel Protrans Alely identifikující software
Finální krok v sekvenční analýze se skládá z určení alel pomocí Protrans Software
Sequence Pilot© Alely identifikujícího softwaru (JSI medical system, www.jsi-medisys.de).
Tento program provádí identifikaci alel na základě cDNA sekvenční databáze všech
sekvencí exonů HLA třídy I a II, detekuje heterozygotní pozice stejně jako neshody se
sekvenční databází, umožňuje manuální sledování nebo úpravu sekvenčních dat stejně jako
vyhodnocování, exportování, tisk a archivování sekvencí a výsledků. HLA cDNA sekvenční
knihovna je aktualizovaná s každým novým uvedením Sekvenční databáze HLA informační
skupiny (www.anthonynolan.com/HIG) a může být spuštěna z www.jsi-medisys.de.
Software je dostupný jako Windows™ single-user verze nebo jako Windows™ nebo Linux™
server-client verze.
Tato kapitola je určena k rychlému odkazu na pomoc při základních krocích zahrnutých
v provedení analýzy softwarem Sequence Pilot©. Pro více detailů se odkažte na návod
k použití Sequence Pilot©.
Sequence Pilot© Alely identifikující software je kompatibilní nebo přízpůsobitelný ke všem
dostupným čtyřbarevným sekvenátorům.
41
21.0 Zásady popisů vzorků
Návod
Sequence Pilot© Software automaticky pozná sekvenovaný lokus a exon, stejně jako směr
sekvenování. Aby bylo umožněno softwaru automaticky spojovat nebo párovat sekvenční
výsledky, které k sobě patří (např. přímý nebo zpětný směr sekvenování stejného PCR
produktu), musí být dodržována jistá pravidla popisu vzorků. I když nepoužíváte automaticky
spojující funkci softwaru Sequence Pilot©, mělo by být dodržováno popisování vzorků
k zjednodušení manuálního procesu.
Vložte následující typ informací v závorce:
(ID vzorku_Amplification Mix_Sequencing Primer)_jakákoli další informace
Oddělené alely
Sekvenční reakce DNA vzorku, které byly amplifikovány Group-Specific Mixy S4R2
(DRB1*15, *16) a S4R4 (DRB1*04), mají následující názvy souborů.
Příklad
(ID vzorku_S4R2_DR-E2F)_...
(ID vzorku_S4R4_DR-E2F)_...
koresponduje s Haplotyp 1 forward
koresponduje s Haplotyp 2 forward
Neoddělené alely
Sekvenční reakce DNA vzorku, které byly amplifikovány Group-Specific Mixy S4R2
(DRB1*15, *16), mají následující názvy souborů.
Příklad
(ID vzorku_S4R2_DR-E2F)_...
(ID vzorku_S4R2_DR-E2R)_...
koresponduje s Haplotyp 1+2 forward
koresponduje s Haplotyp 1+2 reverse
Díky tomuto označování vzorků software Sequence Pilot© automaticky rozpozná, že tyto
sekvenční výsledky k sobě patří a provede určení alel založené na obou výsledcích.
42
22.0 Provedení identifikace alel
Menu Result Files
1) Označte výsledný soubor(y) patřící ke stejnému Haplotypu vzorku DNA. Vyberte
„save“ k jejich přenesení jako spojených nebo zpárovaných výsledných souborů do
tabulky „joined result files“.
Process
- Vybírá, páruje (přímo nebo zpět) nebo spojuje (různé exony) výsledné
soubory, které patří dohromady a musí být dohromady analyzovány
- Poznámka Toto je provedeno automaticky, pokud byly dodrženy zásady
popisu vzorků.
- Vytváří zkombinovanou sekvenci pro zpárované přímé a zpětné sekvence.
Začíná identifikaci alel u zpárovaných nebo spojených výsledných souborů
tím, že porovná výsledky sekvence s knihovnou HLA sekvencí.
Menu Analysis
2) Označte spojené výsledné soubory ve „Worklist“ a vyberte „Sequence“ v okně
analýzy.
Process
- Zobrazí elektoferogramy a výsledek určení alely v okně „Data Analyzer“.
3) Zkontrolujte výsledky pomocí voleb elektroferogramu.
Process
- upravuje a re-analyzuje výsledné sekvence, pokud je potřeba.
4) Schvalte konečnou analýzu.
Process
- validuje identifikaci alel, ukládá data v databázi výsledků, přesunuje výsledky
do místní LIS (na požadavek) a tiskne konečnou zprávu k dokumentaci.
23.0 Průvodce nejčastějšími problémy
PCR problémy
PCR je extrémně citlivá metoda, která umí efektivně amplifikovat i
nejmenší množství DNA. Z toho vyplývá, že i stopy kontaminující DNA
ve vzorku mohou být amplifikovány v PCR reakci a zfalšovat výsledek
testu. Jeden zvláštní zdroj kontaminace je amplifikovaná DNA, která
přijde do kontaktu se vzorky, které musí být stále amplifikovány.
K zamezení kontaminace s amplifikovaným materiálem je doporučeno
rozdělení pracovního místa následovně:
Předchozí opatření Pre-PCR oblast:
Všechna činnost vykonávaná před PCR (příprava a skladování vzorku
DNA, příprava PCR amplifikačních reakcí, nastavení a skladování
činidel a roztoků k izolaci DNA a PCR).
Post-PCR oblast:
Všechna činnost vykonávaná po PCR (průběh thermocyclerů a DNA
sekvenátorů, provedení elektroforézy na agarózním gelu, přípravné a
purifikační sekvenační reakce, skladování amplifikované DNA nebo
sekvenčních reakcí).
Materiály a vybavení z post-PCR oblasti nesmí být převzaty do prePCR oblasti. Při pipetování v pre-PCR oblasti a pro nastavení
sekvenačních reakcí by měly být použity špičky s aerosolovou bariérou
(s filtrem). Je doporučeno pro každý amplifikovaný vzorek DNA
provedení negativní kontroly jako indikace kontaminace cizí DNA.
43
Následující tabulka zahrnuje možné příčiny a řešení PCR problémů.
Problém
Možná příčina
Žádný PCR Žádný ethidium
produkt nebo bromid v gelu
slabý PCR
produkt
Nedokonalé
promísení AmpliTaq
Gold™ a PCR
reakční směsi
Degradovaná DNA
Řešení
Druhotné barvení gelu v barvicí lázni
(1X TBE s 0,5 µg/ml ethidium
bromidu); nezapomeňte přidat
ethidium bromid před nalitím gelu
Zopakujte PCR s kladením důrazu
na promíchání
Zhodnoťte na agarózním gelu a
reextraktujte DNA, pokud je to
nezbytné
DNA nezměřena
Změřte DNA znovu a upravte na 50
správně
– 100 ng/µl
PCR inhibitory
Reextraktuje genomovou DNA
v genomové DNA
pomocí jedné z doporučených
metod (viz „Příprava vzorku DNA“);
vyhněte se použití krve s heparinem
Nevhodné
Zkontrolujte profil cyklu a případně
parametry cyklu
upravte
Problémy
Cyklické profily uváděné v tomto
s thermocyclerem
návodu jsou optimalizovány pro
GeneAmp PCR Systems 2400,
2700, 9600 a 9700 (Applied
Biosystems) a také pro PTC-100,
PTC-200, Dyad a Tetrad (MJ
Research). Použití jiných
thermocyclerů může vyžadovat
přenastavení cyklického profilu.
2 PCR pásy Nevhodné podmínky Vytvořte agarózní gel podle
na agarózním gelu
vhodných podmínek
Nespecifické Nevhodné
Zkontrolujte profil cyklu a případně
PCR pásy
parametry cyklu
upravte
Thermocycler
Cyklické profily uváděné v tomto
problémy
návodu jsou optimalizovány pro
GeneAmp PCR Systems 2400,
2700, 9600 a 9700 (Applied
Biosystems) a také pro PTC-100,
PTC-200, Dyad a Tetrad (MJ
Research). Použití jiných
thermocyclerů může vyžadovat
přenastavení cyklického profilu.
Nevhodná DNA Taq Opakujte PCR s AmpliTaq Gold™
polymerasa
DNA Taq polymerasou
Kontaminace PCR
Zkontrolujte PCR negativní kontrolu
činidel
k vyloučení kontaminace PCR
činidel. Používejte špičky s filtry.
Kontaminace PCR
K vyloučení kontaminace DNA
vzorku
vzorku reextraktujte DNA z nového
zdroje vzorku. Používejte špičky
s filtry.
44
Problémy
se sekvenováním
Problémy se sekvenováním mohou být spojeny se sekvencemi jako
takovými nebo pouze s heterozygotními sekvencemi. Problémy
s heterozygotními sekvencemi mohou být shifty peaků nebo slabé
heterozygotní signály. Většina těchto anomálií se vyskytuje pouze
v jednom sekvenovacím směru pro některou pozici bazí a může být
vyřešena pozorováním dat v jiném směru.
Následující tabulka zahrnuje možné příčiny a řešení hlavních
sekvenovacích problémů.
Problém
Slabá síla
signálu
Příliš silný
signál
Rušená
baseline
Rušená
baseline
Řešení
Kvůli variacím mezi přístroji,
přenastavení času nástřiku
a/nebo objemu nástřiku múže být
požadováno k získání signálu
mezi 100 – 2000 relativními
fluorescenčními jednotkami
Příliš málo použité Kapilární DNA sekvenátor:
sekvenční reakce Zvyšte čas nástřiku, objem
nástřiku nebo koncentraci
sekvenční reakce. Destičkový
gelový DNA sekvenátor: Zvyšte
nanesený objem nebo
koncentraci sekvenční reakce.
Nevhodný čas
Kvůli variacím mezi přístroji,
nástřiku nebo
přenastavení času nástřiku
objem nástřiku
a/nebo objemu nástřiku múže být
požadováno k získání signálu
mezi 100 – 2000 relativními
fluorescenčními jednotkami
Finálně připravená Zvyšte zředění v posledním
sekvenční reakce kroku přípravy sekvenčních
byla příliš
reakcí pro elektroforézu (36 µl
koncentrovaná
místo 18 µl HPLC vody).
Nevhodné
Viz „Přečištění PCR produktů pro
přečištění PCR
sekvenování“.
produktu nebo
opomenuté
přečištění před
sekvenováním
Nevhodné
Znovu přečistěte sekvenční
přečištění
reakci (viz „Přečištění sekvenční
sekvenční reakce reakce“). Nezapomeňte
napipetovat celou sekvenční
reakci opatrně do středu
nakloněného povrchu Sephadex
bez dotyku. Napipetování na
střed je nezbytné pro vysoce
kvalitní přečištění. Nenechte
vzorek stékat po stěnách.
Kontaminace PCR Zkontrolujte PCR negativní
produktu
kontrolu k vyloučení
kontaminace PCR činidel. K
vyloučení kontaminace DNA
vzorku reextraktujte DNA
Možná příčina
Nevhodný čas
nástřiku nebo
objem nástřiku
45
z nového zdroje vzorku.
Používejte špičky s filtry.
Kontaminace
Opakujte sekvenování s čerstvou
sekvenčního
zkumavkou sekvenčního
primeru
primeru. Používejte špičky
s filtry.
Kontaminace dye Opakujte sekvenování s čerstvou
terminator činidel
zkumavkou dye terminators.
Používejte špičky s filtry.
Široké artefakty Nevhodné
Znovu přečistěte sekvenční
fluorescenčních přečištění
reakci. Nezapomeňte
terminátorů
sekvenčního
napipetovat celou sekvenční
(fleky barviv)
produktu
reakci opatrně do středu
nakloněného povrchu Sephadex
bez dotyku. Napipetování na
střed je nezbytné pro vysoce
kvalitní přečištění. Nenechte
vzorek stékat po stěnách.
Vysoké
Vzduchové bubliny Kapilární DNA sekvenátor:
fluorescenční
v kapiláře nebo
Znovu naplňte kapiláry. Zvažte
peaky
polyakrylamidovém možnou výměnu sady kapiláry
gelu
nebo kontaktujte služby výrobce
vašeho sekvenátoru.
Destičkový gelový DNA
sekvenátor: Nalijte gely pečlivě a
použijte na strany gelu skleněné
destičky k zamezení
vzduchových bublin. Kontaktujte
služby výrobce vašeho
sekvenátoru.
46