Biochemici - USA_Kanada_2

OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Historie biochemie
KBC/HIBC
prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D.
LS 2014/2015
Biochemie v USA a Kanadě
II
James Watson
(*6. 4. 1928)
Watson je americký molekulární
biolog, genetik a zoolog známý jako
spoluobjevitel
struktury
DNA
(1953) spolu s Francisem Crickem.
Watson, Crick a Maurice Wilkins
dostali v roce 1962 v souvislosti se
strukturou DNA Nobelovu cenu za
fyziologii a medicínu.
Studoval na univerzitách v Chicagu (B.S., 1947) a Indianě (Ph.D., 1950),
absolvoval postdok pobyt u H. Kalckara (1908-1991) v Kodani a pak
pracoval v Cavendishově laboratoři na univerzitě v Cambridge, kde se
potkal s F. Crickem. V l. 1956-1976 působil na Harvardově univerzitě
(katedra biologie). Od r. 1968 byl ředitelem Cold Spring Harbor
Laboratory (CSHL) v NYC, kde se zabýval molekulární biologií v
souvislosti s rakovinou. V r. 1994 se stal prezidentem a po deseti
letech kancléřem CSHL, rezignoval 2007. V l. 1988-1992 ve spojení s
NIH organizoval projekt sekvencování lidského genomu.
Rodiče byly potomky imigrantů ze Skotska a Irska, otec byl obchodník.
Studoval na veřejných středních školách a zajímal se o ornitologii. Na
univerzitu v Chicagu se zapsal v 15ti letech. K zájmu o genetiku byl přiveden
přečtením knihy Erwina Schrödingera „What is Life?“ v r. 1946. Po
absolvování bakářského studia zoologie (1947) Na Indianské univerzitě v r.
1950 získal Ph.D., školitelem byl Salvador Luria. V Bloomingtonu působil
Hermann Joseph Muller, americký genetik (studie mutageneze na drosofile).
S. Luria a Max Delbrück pracovali s bakteriofágy. V té době se věřilo, že
geny jsou proteiny, o DNA se soudilo, že jde o tetranukleotid se strukturální
úlohou. Avery-MacLeod-McCartyův experiment ale ukázal, že nositelkou
dědičné informace je právě DNA.
Na ročním posdoktorandském pobytu v Kodani u H. Kalckara, který se zajímal
o enzymy syntetizující DNA. Watson ale dával přednost studiu struktury
DNA. Na konferenci v Itálii se seznámil s výsledky Maurice Wilkinse.
Watsonův pobyt v Cambridge domluvil Luria s Johnem Kendrewem. Na
základě dat Rosalind Franklinové a M. Wilkinse odvodili v březnu 1953
Watson s Crickem dvojšroubovici DNA (pracovali v Cavendishově laboratoři v
Cambridge). Publikováno to bylo v časopise Nature ve stejném roce. Byl
zkonstruován model struktury DNA (nyní v Muzeu vědy v Londýně). Široké
vědecké veřejnosti byl model představen v červnu 1953 na sympoziu v Cold
Spring Harboru.
zdroj: Wiki
Nobelovu cenu za objev struktury DNA získali v r. 1962 Watson, Crick a
Wilkins, bohužel ne R. Franklinová, která zemřela v r. 1958. Objev
dvojšroubovice je považován za nejdůležitější vědecký objev ve 20. století
a zlomový okamžik v přírodních vědách.
Od r. 1956 pracoval Watson na Harvardu. Na katedře biologie se zabýval rolí
RNA v přenosu genetické informace, postupně se vypracoval na profesora
biologie. Napsal zde několik učebnic Zůstal na Harvardu do r. 1976, přestože
od r. 1968 řediteloval v CSHL.
V r. 1968 napsal knihu „The Double Helix“ která představuje příběh objevu
struktury DNA včetně osobností, vztahů, konfliktů a polemických pasáží. Mezi
mnoha se ohradili i Crick a Wilkins.
Od r. 1974 žil s rodinou v Cold Spring Harboru. Jako ředitel, posléze
prezident a kancléř směroval molekulárně biologický výzkum k boji s nemocemi
jako je rakovina nebo neurologické choroby. Prostředí vytvořené na CSHL
nemělo ve světě paralelu.
Pokud jde o projekt sekvencování lidského genomu na NIH, byl jeho hlavou v l.
1990-1992. Projekt opustil po konfliktech s vedením NIH kvůli patentování
genových sekvencí. Jeho osobní genom byl publikován v r. 2007.
Jane Shelby Richardson
(*25.1. 1941)
Richardsonová je americká biochemička, která zavedla „stužkový“
(ribbon) diagram pro znázornění
prostorové struktury proteinů. Je
profesorkou biochemike na Dukeově
univerzitě
v
Durhamu
(Severní
Karolína, USA).
V době kdy chodila na střední školu
(Teaneck High School, NJ), umístila se
na 3. místě soutěže vědeckých talentů
za výpočty oběžné dráhy Sputniku
(1958). Ve vzdělání pokračovala na
Swarthmorské koleji v Pennsylvánii
(matematika, astronomie a fyzika),
magisterský titul získala v roce 1966
na Harvardu.
Zdroj: Wiki
Spolu s manželem Davidem C. Richardsonem, který dělal Ph.D. ma
MIT (pracovala v téže laboratoři jako laborantka), začala studovat
3-D strukturu nukleasy ze stafylokoka, což byla první z mnoha
krystalových struktur, které od té doby vyřešila. Tehdy začala s
generalizováním grafického zobrazení proteinových struktur.
Od r. 1970 působí na Dukeově univerzitě, kde vyřešila krystalovou
strukturu hovězí superoxiddismutasy (1975). V r. 1977 publikovala v
časopise Nature práci o topologii β-skládaných listů v proteinech
(„β-Sheet topology and the relatedness of proteins“, Nature 268,
495 - 500 ). Stužkové schéma („ribbon diagram“ ) se poprvé objevilo
v přehledném článku v časopise Advances of Protein Chemistry v r.
1981 (34: 167–339) jako jeden ze začátků strukturní bioinformatiky.
Později se dále věnovala krystalografii a taxonomii proteinů na
základě rysů terciární struktury, výpočetní biologii a de novo designu
proteinů. Spolu s maželem vyvinuli software pro molekulovou grafiku
(Mage; 90. léta). V současné době studuje struktury RNA a proteinů.
V l. 2012-2013 byla prezidentkou americké biofyzikální společnosti,
je členkou NAS a dalších společností.
zdroj: Wiki
Struktura triosafosfátisomerasy kreslená vlastnoručně Richardsonovou. Původně se struktury kreslily perem přes transparentní papír
přes výtisk spojených Cα-koordinát.
zdroj: Wiki
První software byl zaveden v r.
1982 (Arthur M. Lesk, Karl D.
Hardman): Computer-generated
schematic diagrams of protein
structures, Science 216 (4545)
pp. 539-540, 1982.
DOI: 10.1126/science.7071602
Tento program vkládá kubické
polynomové křivky do rovin
peptidových vazeb.
V současné době jsou k dispozici programy Molscript (Arthur M. Lesk
et al.), Jmol, DeepView, MolMol, KiNG, UCSF Chimera nebo PyMOL
(Warren F. DeLano).
Walter Gilbert
(*21. 3. 1941)
Gilbert je americký fyzik,
biofyzik, biochemik, podnikatel,
a průkopník molekulární biologie.
V r. 1980 získal Nobelovu
cenu za chemii spolu s F.
Sangerem a P. Bergem za svůj
příspěvek k metodice sekvenční
analýzy DNA.
Narodil se v Bostonu, matka byla
psycholožka,
otec
ekonom.
Studoval na Harvardu, bakalář
chemie a fyziky, magisterské
studium absolvoval v oboru
fyzika v r. 1954. Doktorát
(fyzika) obdržel na univerzitě v
Cambridge (1957).
Zdroj: Wiki
Působil na Harvardově univerzitě, 1956 jako asistent, od 1964
docent biofyziky, od r. 1968 profesor biochemie. V r. 1972 se stal
profesorem molekulární biologie (American Cancer Society
Professor).
Mimo akademickou sféru zakládal firmy Biogen a Myriad Genetics.
S Allanem Maxamem vyvinul Gilbert metodu sekvenční analýzy
nukleových kyselin, práce byla publikována v roce 1977:
Jako první předpověděl existenci intronů a exonů a vysvětlil evoluci
intonů (časopis Nature, 1978).
V r. 1986 navrhl hypotézu „Světa RNA“ (Origin of life: The RNA
world. Nature 319: 618–618).
RNA dle této hypotéza měla být prvním systémem schopným
replikace. Dnes DNA/RNA/protein: DNA a RNA – informace, protein
– katalytické funkce (enzymy).
Na počátku ale mohla být informační i katalytická aktivita v jedné
molekule – RNA. Na počátku 80. let 20. století přišel objev
„enzymové“ aktivity RNA – ribozymy.
Pokud RNA katalyzuje syntézu nové RNA molekuly z prekurzorů a
RNA templátu, dá se předpokládat, že v počátcích života proteiny
nebyly nutné. Samosestřihové („selfsplicing“) introny – dva introny,
oddělené exonem se mohou kombinovat, exon se po vystřižení z jedné
molekuly může takto dostat do molekuly druhé (transpozony).
Možnost kombinování genu = evoluce.
Vztah mezi informací a funkcí – skladování informace musí být
jednorozměrné z důvodu nutnosti kopírování; funkčnost enzymů je
vázána na trojrozměrnou strukturu.
V RNA světě by struktura podléhající replikaci obsahovala introny,
naopak ribozym by byla kompaktní struktura bez intronů.
Fáze vývoje RNA světa:
1. nukleotidová polévka
2. malé RNA molekuĺy vzniklé z nukleotidů s katalytickými
schopnostmi - ribozymy
3. mutace a rekombinace, nové funkce adaptace
4. RNA kofaktory (NAD, FMN) – vývoj enzymových aktivit
5. Tvorba proteinů – adaptérové RNA molekuly schopné nést
aminokyseliny (podle RNA templátu)
6. Enzymy jsou schopné efektivnější katalýzy, byly pravděpodobně
kódovány RNA exony a rekombinací se pak postupně skládaly různé
strukturní elementy
7. Tvorba DNA reverzní transkripcí; stabilnější – opravy chyb díky
dvojšroubovici; introny jsou relikty přepsané do DNA z RNA
Roger David Kornberg
(*24. 4. 1947)
R. D. Kornberg je americký biochemik
(1918-2007) a profesor na Lékařské
fakultě Stanfordovy univerzity.
V r. 2006 získal Nobelovu cenu za
studia procesů transkripce.
Narodil se v St. Louis, Missouri, jako nejstarší ze tří synů manželů
Arthura a Sylvy Ruth Kornbergových, jeho mladší bratr Thomas Bill
Kornberg (*1948) je také biochemik, purifikoval DNA polymerasu II
a III. Druhý bratr Kenneth Andrew je architektem.
Studoval chemii na Harvardově univerzitě, Ph.D. v oboru chemická
fyzika získal na Stanfordu v r. 1972. Postdoktorandský pobyt
absolvoval v Cambridge a v r. 1976 se stal odborným asistentem
biochemie na Lékařské fakultě Harvardovy univerzity.
V r. 1978 získal profesuru v oboru strukturní biologie na Stanfordu,
kde působí dodnes. Už jako student v 60. letech přispěl k objevu
překlápění a laterální difúze fosfolipidů v buněčných membránách.
Jako postdoktorand u Aarona Kluga (*1926) a Francise Cricka
(1916-2004) objevil nukleosom jako základní proteinový komplex pro
sbalení chromosomální DNA v jádře buňky. Název „chromatin“ je
odvozen od vázání barviv, což usnadňuje mikroskopickou visualizaci.
Jeho vědecký přínos spočívá ve studiu molekulové podstaty a
mechanismů procesu transkripce u eukaryot. Geny uchovávané v
DNA jsou přepisovány do RNA a následně procesem translace
probíhá na základě genové informace biosyntéza proteinů.
Genová sekvence v jádře buňky přechází do struktury mRNA, která
je transportována ven z jádra na ribosomy, kde probíhá
proteosyntéza. Pro průběh transkripce je třeba enzym RNA
polymerasa II a mnoho dalších proteinů. Tuto skupinu proteinů
stduoval Kornberg u kvasinek a provedl analýzu trojrozměrné
struktury, publikováno bylo v časopisu Science v l. 2001-2004.
Kornberg objevil, že zhruba 200 bp nukleové kyseliny je sbaleno
okolo oktameru tvořeného bazickými proteiny - histony.
http://www.studiumbiochemie.cz
Na Stanfordu měl Kornberg k dispozici kvasinkový expresní systém,
s jehož pomocí bylo možné připravit desítky proteinů účastnících se
procesu transkripce. Zjistilo se, že tyto proteiny jsou konzervovány
v širokém spektru eukaryot – od kvasinek po člověka.
Velký význam měl objev dalšího proteinového komplexu nazvaného
Mediátor, zhruba 20 proteinů, který zprostředkovává regulaci RNA
polymerasové mašinérie (90. léta 20. stol.).
Dlouhé období se věnovalo metodice strukturní analýzy
multipodjednotkové RNA polymerasy II a dalších proteinů s rolí v
procesu transkripce (mj. Mediátor). K výsledkům se dospělo
kombinací elektronové mikroskopie (s 2D krystaly na lipidové
dvouvrstvě) a rentgenostrukturní analýzy. Později byla RNA
polymerasa II sériově krystalována i v průběhu fází transkripčního
procesu, kokrystalována s transkripčními faktory.
Největší podjednotky Rpb1 a Rpb2 vytvářejí „puklinu“ pro vazbu DNA
a aktivní centrum enzymu, ostatní podjednotky se pak organizují na
povrchu heterodimeru.
Structural differences between S. pombe and S. cerevisiae pol II in the vicinity of the DNAbinding cleft.
Spåhr H et al. PNAS 2009;106:9185-9190
©2009 by National Academy of Sciences
Harold Clayton Urey
(*29. 4. 1893 – †5. 1. 1981)
Urey byl americký fyzikální chemik, který významně přispěl k znalostem o
izotopech. V roce 1934 získal Nobelovu cenu za objev deuteria. Podílel
se rovněž na vývoji americké atomové bomby. Z pohledu biochemie byly
důležité jeho teorie a experimenty v otázkách vzniku života na Zemi.
Narodil se v Indianě, byl ze tří dětí, jeho otec byl duchovní v
protestantské církvi a zemřel, když bylo synovi šest let. Urey studoval na
Amishské základní škole, po absolvování střední školy krátce učil. V r.
1914 nastoupil Montanskou univerzitu v Missoule, kde v r. 1917 získal
bakalářský titul (biologie a chemie).
Po skončení 1. sv. války, kdy pracoval v chemické továrně, se vrátil
jako asistent na univerzitu v Montaně. V r. 1921 ze zapsal na
doktorandské studium na Kalifornské univerzitě v Berkeley,
školitelem v oboru termodynamika byl Gilbert Newton Lewis (18751946) známý pro objev kovalentní vazby a svoji koncepci
elektronových párů a kyselin/bází. Zabýval se ionizací plynů.
V r. 1923 získal titul Ph.D . a absolvoval stáž u Nielse Bohra (18851962) v Kodani, kde se osobně setkal s vědci jako Werner
Heisenberg (1901-1976) nebo Wolfgang Pauli (1900-1958). Osobně
se setkal i s Albertem Einsteinem (1879-1955).
Po návratu do Ameriky se stal výzkumným pracovníkem na Univerzitě
Johnse Hopkinse. V r. 1930 tam napsal spolu s Arthurem Edwardem
Ruarkem (1899-1979) jednu z prvních anglicky psaných učebnic
kvantové mechaniky a jejích aplikací. Od r. 1929 byl docentem chemie
na Kolumbijské univerzitě, věnoval se spektroskopii a začal též s
isotopy, a to v době před objevem neutronu (1932, James Chadwick,
1891-1974). V r. 1929 dva chemici z Berkeley, W. F. Giauque a H. L.
Johnston objevili stabilní izotopy kyslíku (17O a 18O).
Chemická stupnice atomových hmotnostní prvků byla v té době
založena na předpokladu, že kyslík má Ar=16. Odtud bylo pro vodík
vypočítáno Ar=1,00778, po započítání objevených izotopů kyslíku byla
hodnota z fyzikálních měření upravena na Ar=1,00756. Z toho se
vyvozovalo zastoupení 2H 1:4500 (Birge a Menzel).
To bylo inspirací pro výzkum. Urey v r. 1931 s asistentem Georgem
Murphym zvolili pro detekci citlivý spektrograf (6,4 m dlouhý) a čáry
v atomovém spektru vodíku. Vzhledem k zastoupení byly stopy
deuteria velmi slabé a izotop ve vzorku bylo nutné obohatit. K tomu
posloužila destilace kapalného vodíku při 20 K (bod varu), z 5 litrů
byl získán 1 ml, kde měl být obsah 2H až 200x větší. První vzorek z
Národního úřadu pro standardy (NBS) ve Washingtonu neposkytl
intenzivnější linie. Nový vzorek získaný odpařováním při 14 K (poblíž
trojného bodu) již poskytl jistotu identifikace deuteria.
Později se přišlo na to, že to bylo kvůli přípravě vodíku pro zkapalnění
elektrolýzou vody, který byl ochuzen o deuterium.
Práce o výsledcích byla publikována v r. 1932. Nobelova cena za
chemii přišla v r. 1934.
Washburn a Urey se následně pokusili získat čistou těžkou vodu, ale
byli předstižení Ureyovým učitelem Lewisem v r. 1933.
Se spolupracovníky Urey spočítal rozdíly ve stupni disociace plynů
obsahujících H a D např. HCl/DCl, HI/DI. Na základě chemické
výměny izotopů ve dvoufázovém systému plyn-kapalina vypracovali ve
30. letech metody pro obohacení 15N, 13C a 34S. Destilací vody byl
obohacen izotop 18O, vše jako přínos pro studium biochem. reakcí.
V dalších studiích dokázal, že kyseliny a alkoholy nevyměňují kyslík s
vodou jako rozpouštědlem a vysvětlili mechanismus tvorby esterů.
V r. 1939 N. Bohr na konferenci teoretické fyziky ve Washingtonu
postuloval, že 235U je štěpitelný izotop. Pro využití štěpné reakce tak
vyvstal problém jeho obohacení. Ve svých pracích z té doby Urey
navrhl využití centrifugy s protiproudovým uspořádáním, kdy by
probíhalo kontinuální odpařování kapaliny (UF6) ze spodní části
rotoru, nahoře by pak páry kondenzovaly a kapalina by byla nucena
stékat po stěnách zpět dolů.
Separace 235U byla od r. 1940 financována ze státních prostředků
(prezidentský výbor F. D. Roosevelta). Dalšími možnostmi přípravy
obohaceného izotopu byly difúze v plynné fázi a termální difúze.
Urey koordinoval celé úsilí včetně produkce těžké vody jako
mediátoru pro jaderný reaktor. Byly zainteresovány Kolumbijská
univerzita, Virginská univerzita a Harvard.
V r. 1941 byla zkonstruována nová centrifuga s průtokovým
uspořádáním (Westinghouse). Zjistilo se také, že je štěpitelné
plutonium. S protiproudovými centrifugami bylo dosahováno jen malé
efektivity, i když pozdější výsledky ukázaly, že se jedná o správnou
cestu a centrifugy se používají i dnes. Pozornost se postupně obracela
k difúzní separační metodě. V květnu 1942 se objevily úvahy o
atomových zbraních. Program zahrnoval stavbu zařízení pro obohacení
uranu a výrobu těžké vody s cílem vyrobit bombu do července 1944.
Většina 235U pro bombu v Hirošimě byla vyrobena v továrně procesem
elektromagnetické separace.
Když se po válce přesunul z Kolumbijské univerzity na univerzitu v
Chicagu (zde profesorem chemie od r. 1952), nepokračoval už ve
výzkumu separace izotopů.
Věnoval se zdokonalení výpočtů rovnovážných konstant izotopových
výměn a určení jejich teplotních koeficientů. Takto zjistil, že pro
uhličitan a vodu je faktor frakcionace 18O/16O roven 1,04. Uvědomil
si přitom potenciál tohoto jevu pro určení průměrných teplot v
dávných dobách („paleotemperatures“). K tomu bylo nutné vyvinout
metodiku stanovení obsahu izotopů s velkou přesností. Takto např. se
spolupracovníky analyzoval vápencové nerosty.
Byl zakladatelem oboru kosmochemie. Studoval chemické složení
meteoritů, zjišťoval v nich izotopové zastoupení. Zastoupení vodíku u
hvězd a methanu u vnějších planet vedlo Ureye k závěru, že raná
zemská atmosféra byla redukující s obsahem CH4 a NH3 spíše než
CO2 a N2. Termodynamické podmínky pak měly být příznivé pro vznik
organických sloučenin. Student Stanley Miller se nabídl, že teorii
experimentálně v laboratoři ověří. Pokusem s elektrickým výbojem a
důkazem aminokyselin ukázal, že by to bývalo bylo možné.
Harold Urey byl aktivní v pomoci vědcům odcházejícím z Evropy po
nástupu fašismu, třeba v případě Enrica Fermiho (1901-1954). Po
válce byl aktivní ve veřejném vystupování proti jaderným zbraním,
vyjadřoval pochybnosti ve věci manželů Rosenbergových.
Když odešel do důchodu, byl pozván na novou Kalifornskou univerzitu
v San Diegu, kde zahájil výzkum s izotopovým měřením a vedl posléze
katedru organické chemie. Byl v té době poradcem NASA, pravidelně
létal do Washingtonu. Byl zainteresovaný v bezpilotních letech na
měsíc, věnoval se měsíčnímu výzkumu, studoval vzorky, které přivezlo
Apollo 11. Poslední vědecké články napsal ve věku 84 let.
Stanley Lloyd Miller
(*7. 12. 1930 – †20. 5. 2007)
Miller je považován za zakladatele
prebiotické chemie (syntetická
organická chemie zaměřená na
tvorbu látek za přirozených
podmínek v geokosmochemickém
prostředí. K tomu dospěl díky
pokusu s H. Ureyem – důkaz
prebiotické tvorby aminokyselin
za podmínek simulace primitivní
zemské atmosféry.
Pionýrská práce byla publikována v časopisu Science v roce 1953.
Miller se narodil v Oaklandu v Kalifornii, jeho židovští rodiče měli
předky z východní Evropy. Oba studovali na Kalifornské univerzitě,
kde se potkali. Otec byl úspěšný právník, matka byla učitelka. Po
střední škole studoval na UCB chemii stejně jako jeho bratr. V
magisterském studiu pokračoval od r. 1951 v Chicagu.
Při příchodu do Chicaga se zajímal o možnost pracovat na nějakém
projektu. Edward Teller mu nabídl téma vzniku prvků ve hvězdách.
Navštívil však seminář nobelisty Harolda C. Ureye (1893-1981), který
prezentoval myšlenku redukující atmosféry (CH4, NH3, H2S a H2) a
prebiotické syntézy organických sloučenin, o kterém mluvil už Alexandr
I. Oparin (1894-1980) v r. 1924.
U Tellera pracoval na projektu bez zajímavých výsledků rok, školitel
navíc měl odejít z Chicaga. V září 1952 navrhl Ureyovi experimenty
prebiotické syntézy, Urey však byl skeptický s tím, že to není
vhodné téma pro diplomanta.
Nakonec Urey, který mu nejřív nabízel analýzy obsahu thalia v
meteoritech, souhlasil, vymínil si však výsledky během roku, jinak
chtěl experimenty ukončit.
Začalo se konstrukcí aparatury, kde měly být plyny a voda. Jako
zdroj energie byl zvolen elektrický výboj po vzoru např. lorda
Henryho Cavendishe (1731-1810), který v r. 1788 díky výboji
vytvořil kyselinu dusitou. Uvědomil si výskyt blesků v rané atmosféře
a koronární výboje případně vulkanické erupce.
Aparatura se skládala ze dvou baněk spojených skleněnými
trubicemi. V jedné baňce byla voda (zahřívaná), v druhé byly
elektrody a směs redukující atmosféry (methan, amoniak, vodík).
Jedna z trubic šla přes chladič do U-trubice, odkud se kondenzát
páry z baňky s plyny vracel do baňky s vodou.
Tak bylo simulováno odpařování oceánů a přítomnost vodní páry v
atmosféře, stejně jako déšť a tok řek do oceánu. Celkem byly
konstruovány ještě další dvě aparatury, jedna měla trysku, která
simulovala vulkanické erupce vháněním oblaku páry do výboje.
Třetí aparatura využívala tichého výboje
namísto jisker.
Na podzim 1952 S. Miller prokázal s
jednoduchými
metodami
přítomnost
glycinu v kondenzátu (po dvou dnech
jiskření). Po týdnu výbojů měla voda žlutou
barvu a výbojová baňka byla pokryta
tmavým olejovým materiálem. Kromě
glycinu bylo prokázáno několik dalších
aminokyselin.
Byl sepsán rukopis, kde Urey odmítl
spoluautorství a který nakonec vyšel v
časopisu Science.
Ve stejné době byl posuzován i článek Wilde et al., který také vyšel v
r. 1953, autoři zkoušeli syntézu s CO2, obloukovým výbojem a vodou,
ale nenašli ve výsledku zajímavé sloučeniny jako např. formaldehyd.
S. Miller pokračoval v analýzách identifikace aminokyselin, např.
měření teploty tání, bylo potvrzeno 9 různých látek (Gly, Glu, Ala, βAla). Byly také nalezeny hydroxykyseliny např. glykolová k., mléčná k.
(1955). Uvažoval proto Streckerovu syntézu z HCN a aldehysů nebo
ketonů v přítomnosti amoniaku – tvoří se nitrily hydrolyzované
konečně na AK. Tvorbu HCN a aldehydů dokázal (1957).
Millerovy výsledky potvrdil anglický tým a další laboratoře s jiným
uspořádáním pokusu, ale ukazující nutnost redukující atmosféry.
V r. 1954 získal Miller Ph.D. v oboru chemie a odešel na Caltech, kde
měl rok stipendium. Poté byl do r. 1960 na katedře biochemie
Lékařské fakulty Kolumbijské univerzity odkud přešel na Kalifornskou
univerzitu v San Diegu. V době studené války byl v r. 1957 pozván A.
I. Oparinem do SSSR na první vědecké setkání o původu života. Po
návratu byl vyslýchán agenty tajné služby.
Na počátku 70. let byl Miller-Ureyův experiment opakován ve spojení s
analyzátorem aminokyselin a bylo nalezeno 33 různých aminokyselin, z
toho 10 proteinogenních.
Podobné složení aminokyselin se záhy našlo v jistém meteoritu (1972)
potvrzující význam Streckerovy reakce.
Miller pokračoval ve výzkumech prebiotické syntézy po zbytek aktivního
života. Věnoval se stabilitě vytvořených látek se zřetelem k nalezení
přechodu mezi jednoduchými abiotickými látkami a biochemickými
strukturami, což mělo vést k nalezení látky s možností soběstačné
replikace.
Po Millerově smrti byly nalezeny vialky s vysušeným materiálem z
původních experimentů v l. 1952-54 a 1958. Šlo o neanalyzované výsledky
z „vulkanické“ aparatury a z pokusů, kde byl v redukující atmosféře
přítomen H2S. Následné moderní analýzy prokázaly, že z „vulkanické“
aparatury byla petřejší kolekce AK, ale i aminů. V přítomnosti sulfanu se
tvořily organosirné sloučeniny včetně AK.
Podílel se i na konstrukci přístrojů pro důkaz AK na Marsu.
Nathan Oram Kaplan
(*25. 6. 1917 – †15. 4. 1986)
Kaplan byl americký biochemik,
který
se
věnoval
především
enzymologii, ale také chemoterapii.
Narodil se v NYC, rodina se brzy
přestěhovala do Kalifornie, kde
potom studoval bakalářskou chemii
na
UCLA
(ukončil
1939).
Magisterské studium absolvoval na
UCB, kde pracoval u Davida M.
Greenberga. V experimentech zde
využíval radioaktivní fosfor ke
studiu metabolismu sacharidů.
Izotop byl získáván na cyklotronu
kolegou
Martinem
Davidem
Kamenem (1913-2002).
Zkušenosti s radioaktivním izotopem mu umožnili spolupráci s
bakteriology Michaelem Doudoroffem (1911-1975) a W. Z. Hassidem,
kteří se zabývali degradací sacharosy u Pseudomonas saccharophila. Šlo o
objev enzymu, který štěpí sacharosu na fruktosu a glukosa-1-fosfát,
nutná byla přítomnost fosfátu. V období 1942-1945 se N. Kaplan podílel
na projektu Manhattan, kde pracoval ve výzkumu jako chemik.
V době, kdy pracoval na projektu Manhattan, potkal v Detroitu Dr.
Frankse, asistenta na Wayne State Medical School, který se zajímal o
diabetes. Experimentovali se psy, kde byla vyvolána diabetes alloxanem.
V důsledku toho poklesla hladina ATP v játrech a vzrostla koncentrace
fosfátu. Komatičtí pacienti z detroitské nemocnice měli nízkou hladinu
fosfátu v séru, ale naopak zvýšenou úroveň vylučování fosfátu. Ke
stabilizaci došlo dávkami fosfátu v přítomnosti inzulinu.
Po válce pracoval u Fritze Lipmanna (1899-1986) ve Všeobecné
massachusettské nemocnici v Bostonu. Zde se podílel na izolaci
koenzymu A včetně určení jeho struktury (obsah panthotenátu a
fosfoadenylátu) a funkce v metabolismu. Lipmann totiž objevil, že pro
acetylaci sulfanilamidu extraktem holubích jater je třeba faktor, který
během stání extraktu podléhal autolýze.
Od r. 1950 byl odborným asistentem na Lékařské fakultě Illinoiské
univerzity v Chicagu kam šel zejména z důvodu přítomnosti Sidneye P.
Collowicka (1916-1985), který tam přešel z Washingtonovy univerzity v
St. Louis. Byli tam však nespokojeni, takže využili příležitosti na Ústavu
McColluma a Pratta při katedře biologie na Univerzitě J. Hopkinse. Zde
spolu vytvořili úspěšnou dvojici pro oblast chemie pyridinových
nukleotidů a enzymů, které je využívají jako koenzymy.
Na UJH byl jejich nadřízeným šéf ústavu William D. McElroy (19171999), který se zapsal do povědomí tím, že objevil klíčovou roli ATP v
enzymové reakci luciferasy. Biochemickou osobností na UJH byl tehdy
Elmer V. McCollum (1879-1967). Od r. 1955 se s Collowickem podílel na
vydávání knižní série Methods in Enzymology (nakladatelství Academic
Press), která vychází dodnes.
V rámci výzkumu se studovaly stopové prvky, byl objeven výskyt
molybdenu v nitrátreduktase. Při studiu role CoASH v oxidaci pyruvátu
inhiboval Kaplan respiraci kyanidem. S Collowickem posléze prokázali, že
kyanid se váže na NAD a tvoří se adukt, který má UV spektrum
podobné redukované formě NADH. Tak se zrodila metoda pro měření
obsahu oxidovaných pyridinových nukleotidů.
Byl také objeven enzym DNPasa (NAD glykohydrolasa) štěpící koenzym
NAD na nikotinamid a ADP-ribosu, a to v Zn-deficientní plísně Neurospora
(nízká glykolytická aktivita a eliminovaná alkohol-dehydrogenasa), kde se
díky tomu rychle hydrolyzoval volný koenzym. Objevili také, že enzym je
neúčinný vůči α-isomeru NAD.
Jiný enzym přenášel navázanou ADP-ribosu na nikotinamidová analoga např.
acetylpyridin. Nabízelo se tak využití analogů NAD (např. s acetylpyridinem
namísto nikotinamidu) pro měření rozdílů mezi dehydrogenasami např. u
různých druhů a různých orgánů (zájem o molekulární evoluci).
Jinou prací bylo studium NADP-dep. isocitrátdehydrogenasy z extraktu
Pseudomonas aeruginosa, v reakční směsi dochaázelo v přítomnosti NADPH
a NAD k přenosu vodíku na NAD, což vedlo k objevu transhydrogenasy,
prokázán byl přímý hydridový přenos. Zkoušena byla i různá analoga včetně
thionikotinamidového.
V r. 1957 odešel Kaplan na židovskou Brandeisovu univerzitu v
Massachusetts (otevřena v r. 1948), kde se stal vedoucím katedry
biochemie pro magisterské studium. Spolu s M. A. Kamenem přizvali
vybrané mladé docenty a vytvořili podmínky pro rozvoj výzkumu.
Kaplan se věnoval strukturně funkční charakterizaci dehydrogenas, což
vedlo ke studiu evoluce isoenzymů. Rozpoznal význam isoenzymové
analýzy v klinické diagnostice (laktátdehydrogenasa v lidském séru).
Odtud také vyplynul jeho zájem o tzv. biochemickou antropologii.
Kaplan se spolupracovníky zjistil, že srdeční a svalový isoenzym LDH se
chovaly odlišně ve spojení s analogy NAD. Také zjistil, že srdeční
isoenzymy více druhů mají k sobě blíže než srdeční a svalový isoenzym
stejného druhu. To vedlo ke studiu LDH během vývoje kuřat. V prsním
svalu embrya kuřete byla potvrzena výhradně srdeční LDH, která se
nahrazuje svalovým typem při vylíhnutí. Došlo se k tetramerní struktuře
LDH a jejím variantám od H4 po M4.
Konečně byla v případě ryby platýze nalezena souvislost mezi anaerobním
a aerobním typem LDH a fyziologickým stavem. Vylíhnutá rybka má H typ,
po přesunutí druhého oka na jednu stranu a zahájení života v anaerobním
prostředí se H-typ nahrazuje M-typem.
U humrů a krabů byly objeveny zvláštní LDH, oxidace laktátu s NAD byla
pomalá avšak s acetylpyridinovým analogem se měřila vysoká aktivita. U
kraba Limulus („horseshoe“) bylo z analýzy aktivity LDH potvrzeno, že jde
o členovce nikoli korýše. Metodikou bylo možné rozlišit i falešnou tresku.
Limulus polyphemus
Od LDH se dostal k dalším enzymům kreatinkinase, malátdehydrogenase,
transaminasám, glycerolfosfátdehydrogenase.
V r. 1968 ho Martin Kamen přesvědčil odejít na Kalifornskou univerzitu
do San Diega kde pak působil na Lékařské fakultě.
Se svými studenty řešil pomocí NMR konformace pyridinových koenzymů
a dalších nukleotidů. Jeho tématem bylo také použití NAD analogů pro
interferenci s metabolismem nádorových buněk. Bylo sice zjištěno, že
látky jsou účinné na myších, ukázalo se však, že jsou toxické. Postupně se
dostal do oblastí imunologie, virologie, elektronové mikroskopie a
buněčné biologie.
Dále to byl vývoj materiálů pro afinitní chromatografii enzymů a
imobilizace ligandů pro membránové receptory.
Pracoval také s kolonií athymických laboratorních myší v rámci výzkumu
rakoviny (protinádorové látky). Myši bez brzlíku neodmítaly
prostřednictvím svého imunitního systému štěpy lidských nádorů, což
umožnilo studovat metabolismus lidských nádorových buněk.
Sidney P. Collowick
(*1916 – †1985)
Collowick byl americký biochemik,
enzymolog, který přispěl ke
studiu struktury koenzymu NAD,
zejména jeho redukované formy
NADH.
Narodil se v St. Louis, MO.
Studoval tady na Washingtonově
univerzitě chemické inženýrství,
studium ukončil v r. 1936.
Zdroj: NIH
Pracoval pak u manželů Coriových na Lékařské fakultě, kde strávil
10 let. V r. 1937 publikoval první vědeckou práci. Šlo o izolaci
glukosa-1-fosfátu, následně pak izoloval i galaktosa-1-fosfát a
mannosa-1-fosfát. Stal se prvním Coriho magisterským studentem a
v r. 1942 získal doktorát.
Během kontraktu v laboratoři Coriových pracoval s Hermanem Kalckarem
(1908-1991). Objevili např. myokinasu (adenylkinasu), což byl mezník pro
pochopení transfosforylačních reakcí.
Collowick pak přešel k přeměně glukosy na polysacharidy. Spolu s Earlem
Sutherlandem (1915-1974; později objevitel cyklického AMP, nositel
Nobelovy ceny za chemii v r. 1971) a C. F. Corim popsali biosyntézu
glykogenu z glukosy s použitím purifikovaných enzymů (1941), připravil
také hexokinasu v krystalové formě (1961).
V l. 1946-1948 působil v NYC na Výzkumném ústavu veřejného zdraví, pak
byl docentem na Illinoiské univerzitě v Chicagu a nakonec docentem na
univerzitě J. Hopkinse. Ve spolupráci s M. Pullmanem a A. San Pietrem
zde určil správnou strukturu NADH. S použitím deuteria, ukázali, že k
redukci dochází v para pozici.
V roce 1951 Collowick spolu s N. O. Kaplanem (1917-1986) dostali
nabídku z nakladatelství Academic Press na vydávání série Methods in
Enzymology, která od r. 1955 vychází dodnes. Byl editorem série až do
své smrti v r. 1985. Od r. 1959 působil jako profesor na Vanderbiltově
univerzitě v Tennessee. Zde se věnoval hexokinase a transportu hexos.
Paul Berg
(*30. 6. 1926)
Paul Berg je americký biochemik ze
Stanfordovy univerzity. V r. 1980
získal Nobelovu cenu za chemii spolu
s Walterem Gilbertem (*1941) a
Frederickem Sangerem (1918-2013),
všichni za výzkumnou práci na
nukleových kyselinách.
Narodil se v Brooklynu, NY jako syn v
rodině výrobce oděvů. Studoval obor
biochemie na Pennsylvánské státní
univerzitě, (1948) doktorát obhájil
na Univerzitě Západní rezervy v
Clevelandu, Ohio (1952). Jeho
školitelem na WRU byl Harland O.
Wood.
Jako doktorand se zabýval použitím radioizotopů (uhlík, dusík) pro studium
metabolických dějů. Popsal přeměnu kyseliny mravenčí, formaldehydu a
methanolu na methylovou skupinu methioninu. Demonstroval přitom roli
kyseliny listové a vitamínu B12.
Po studiích působil Berg dva roky jako postdok při Americké společnosti
pro rakovinu, pracoval na Ústavu buněčné fyziologie (u Hermanna
Kalckara, výzkum spojený s ATP) v Kodani a na Lékařské fakultě
Washingtonovy univerzity. V St. Louis spolupracoval s Arthurem
Kornbergem (syntéza acetyl-CoA). Byl určitý čas profesorem na Lékařské
fakultě Washingtonské univerzity v St. Louis (1955-59), studoval
aminoacyl-tRNA, než přešel na Stanford, kde učil biochemii v l. 1959 –
2000 a v l. 1985-2000 působil jako ředitel Beckmanova centra pro
molekulární a genetickou medicínu.
Nejznámnější jsou jeho pozdější práce, které se věnovaly rekombinantní
DNA a procesu inzerce cizorodé DNA, což byl počátek moderního
genového inženýrství. Technologii rekombinantní DNA pak využil pro
studium virových chromozómů. Po roce 2000 se po ukončení aktivní kariéry
zabýval otázkou etiky a regulace práce s rekombinantní DNA a kmenovými
buňkami. Už v pol. 70. let inicioval dobrovolné moratorium vědců na určité
typy rekombinantní DNA, než se vyjasní případná rizika.