Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D.
Transkript
Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D.
Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. Prokaryontní/eukaryontní geny VýbČr a identifikace genu pro pĜípravu Ĝí rekombinantního p proteinu PĜíprava mRNA plné délky RACE • Pokud je znám pouze fragment cDNA, mRNA • U eukaryontních mRNA • Na 5’ konci mRNA se nachází metylaþní þepiþka • Na 3’konci polyA • systém té gene RACE • kyselá pyrofosfatáza (TAP) • Prokaryontní geny jsou bez intronu • Pro klonování není nutné pracovat s mRNA • Pokud je známa sekvence požadovaného genu možná PCR amplifikace genomické DNA g • Eukaryontní geny jsou mnohem složitČjší • Genomická DNA obsahuje introny a dlouhé 5’ a 3’ nepĜekládané oblasti • PĜi izolaci genu se nejþastČji pracuje s cDNA • PĜipravena reverzní transkripcí mRNA izolované z bunČk • Odpadá komplikované hledání a eliminace intronĤ • NetGene2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/). PĜíprava mRNA plné délky RACE Optimalizace kodonĤ Optimalizace kodonĤ Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. • Exprese cizorodých (virových) proteinĤ neþekanČ nízká • Transgenem kódovaná mRNA využívá tRNA s jinou frekvencí než hostitelská buĖka • DĤsledek - buĖka nemá dostatek nČkterých ý tRNA p pro translaci p proteinu • možnost optimalizace kodonĤ (codon optimization) • analýza pomoví www aplikací (in silico analýza) • k aa sekvenci se pĜiĜadí nová cDNA , aby pomČrné zastoupení tRNA odpovídalo hostitelské buĖce • cDNA lze pĜipravit • cílenou mutagenzou • pĜipravit sunteticky buć celou nebo þást • VýtČžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho Ĝádu • Kodonová K d á optimalizace ti li mĤže Ĥž zefektivnit f kti it napĜíklad Ĝíkl d i DNA vakcinaci k i i Optimalizace kodonĤ Izolace RNA Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. PĜíprava p a a na a izolaci o ac RNA RNase free podmínky - RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buĖkami roztoky (DEPC, ( C certifikované f chemikálie od dodavatelĤ) Ĥ) laboratorní materiál plast l t ((chloroform hl f -2h hod; d 0 0,1 1 – 0,02 0 02 % DEPC ddH2O – 2 h hod) d) (0.1 M NaOH, 1 mM EDTA - 2 hod; DEPC ddH2O – 2 hod) (certifikovaný plast plast, novČ otevĜené balení standardního plastu) sklo (mytí jako pro tkánČ, žíhání horkovzdušný sterilizátor 180°C, 8 h Guanidinová Gua d o á metoda e oda izolace o ace totRNA o RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno jje denaturovat v p prvním kroku manipulace p s buĖkami Resuspendovat bb. v denaturaþním roztoku (10 ml/1g bunČk) guanidin thiocyanate 4M (efektivní denaturace proteinĤ, RNA solubilní) citrát sodný 25 mM pH7 N-lauroylsarcosine 0.5 % 2- ME 0.1 M tČsnČ pĜed použitím (1.8 ml) pĜidat CH3COONa na finální 100 mM pĜidat vodou saturovaný fenol (objem ekvivalentní objemu denat. roztoku) pĜidat CH-IAA (0,2 objemu fenolu) homogenizovat a inkubovat 15 min 0°C Kyselý F-Ch-IAA = DNA a proteiny v organické fázi laboratorní pĜístroje (þistota (þistota, RNAzap, RNAzap chloroform) centrifugace a pĜenos vodní fáze do nové zkumavky a další reextrakce laboratorní pracovník (þistota, organizace práce, rukavice) precipitace ekvivalentním objemem isopropanolu rozpuštČní pelety v DEPC DEPC-ddH ddH2O Guanidinová Gua d o á metoda e oda izolace o ace totRNA o RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno jje denaturovat v p prvním kroku manipulace p s buĖkami SmČs všech komponent (kromČ chloroform-IAA) v jednom roztoku je základem mnoha komerþnČ dostupných kitĤ Isogen soge ((Nippon ppo Ge Gene) e) RNA-Stat 60 (Tel-Test) RNAzol B ((Cinna Scientific)) Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) TRI Reagent (Molecular Research Center) TRIzol Reagent (Life Technologies) SDS S S+p proteináza o e á a K - izolace o ace RNA Izolace cytoplasmatické RNA z tkáĖových kultur BuĖky v PBS centrifugovat Peletu resuspendovat v lyzaþním pufru , 0°C 50 mM Tris-Cl, pH 8.0 100 mM NaCl 5 mM MgCl2 0.5% (v/v) Nonidet P-40 (rozpouští bunČþnou membránu) pĜipravit pomocí DEPC-H2O Centrifugace a supernatant do nové zkumavky PĜid t SDS na fifinálních PĜidat ál í h 0 0,2 2 % ((w/v) / ) a zamíchat í h t (denaturace proteinĤ) PĜidat proteinázu K na fin. 0,1 mg/ml, 37°C, 15 min (digesce proteinĤ) PĜidat ekvivalentní objem P-Ch-IAA, P Ch IAA protĜepat, protĜepat centrifugace centrifugace, Když je interfáze objemná nahradit organ fázi Ch-IAA, protĜepat, centrifugovat Precipitace RNA z vodní fáze doplnČním na 0,3M 0 3M CH3COONa + 70% EtOH Resuspendovat RNA v DEPC-ddH2O uložit -70°C LiCl C izolace o ace totRNA o z rostlinné os é tkánČ á Č Izolace RNA pomocí anexové kolony RNeasy Aktivované silikagelové kolony umožĖují purifikaci RNA pomocí guanidinových pufrĤ s promČnnou koncentrací solí (Qiagen) Izolace RNA z tkání s vysokým obsahem polysacharidĤ TkáĖ rozdrtit v tekutém dusíku Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. PĜidat lyzaþní pufr, (pH 8.2 pomocí HCl) 0°C 0 18 M Tris 0.18 0.09 M LiCl 4.5 mM EDTA 1% SDS PĜidat 1/3 objemu fenolu (ekvilibrovaného lyzaþním pufrem pĜed pĜidáním SDS) Homogenizovat, pĜidat ¼ objemu chloroformu, homogenizovat, 20 min, 50°C Centrifugace a pĜenos vodní fáze (obsahující RNA) do nové zkumavky Reextrakce F-Ch (až do vymizení interfáze) (3x), naposledy jen Ch (odstraní fenolu) PĜidat LiCl na finálních 2M a precipitovat RNA 12 hod, 4°C Promytí 2M LiCl, resuspendace v DEPC-H2O a reprecipitace v 2M LiCl Resuspendovat finální RNA peletu v DEPC-ddH2O Izolace o ace NK po pomocí oc výmČnné ý Č é chromatografie c o a og a e na a anexu DEAE RNA Purifikace NK iontovČ výmČnnou chromatografií na anexu DEAE aktivovaný silikagel - vazba DNA ovlivnČna pH a koncentrace solí vazba promývání eluce Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. Purifikace NK iontovČ výmČnnou chromatografií na anexu Izolace RNA savþí þí RNA (Qiagen) (Qi ) Izolace RNA pomocí silika silika-kolony kolony RNeasy VýtČžek totRNA (ȝg) max 100 ȝg Zdroj Bb. kultura ((1 x 106 bb.)) NIH/3T3 HeLa COS-7 LMH Huh 10 15 35 12 15 Myš/potkan tkáĖ (10 mg) Embryo b yo ((13 3d dní)) Ledviny Játra Slezina Th Thymus Plíce Kvasinkovité houby (1 x S cerevisiae S. 25 5 20–30 40–60 30–40 40 50 40–50 10–20 107 bb.) 25 f fungální ál í RNA Uložení U o e RNA a p protekce o e ce p pĜi e enzymatické y a c é manipulaci Po izolaci je RNA rozpouštČna ve H2O pĜi -20°C mĤže dojít k degradaci bČhem nČkolika hodin formamid vhodné pro dlouhodobé uložení (- 80°C) pĜed reakcemi s enzymy nutno formamid Ĝedit na max. koncentraci 5%, jinak zvyšuje stringenci, (jakoby reakce probíhala pĜi vyšší teplotČ z pohledu hybridizaþních podmínek) EtOH precipitát pĜi -20 20°C C až -80 80° pĜed použitím pĜidat CH3COONa (pH5,2) na finální koncentraci 0.3M, precipitovat peletu zpracovat jako obvykleykle Rostliny (100 mg listĤ) Arabidopsis Maize Tomato Tobacco 35 25 65 60 Využití inhibitorĤ RNáz Placentarní inhibitor RNáz – pracovní koncentrace (25 ( to 50 U/ml) / ) PCR C metoda e oda izolace o ace a a amplifikace p ace DNA úseku Výchozí materiál Amplifikaþní techniky Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. pĜi izolaci DNA p 1. mRNA - reverzní transkripce 2. genomická DNA PCR amplifikace 1. pĜesná polymeráza proof reading 2 podmínky 2. d í k PCR reakce k se liší tteplotou l t extenze t a teplotou t l t hybridizace h b idi 3. celkovČ þasovČ nároþnČjší 4 pro další manipulaci je tĜeba vnést PCR produkt do vektoru 4. PCR C návrh á p primerĤ eĤ PCR návrh primerĤ http://www ncbi nlm nih gov/tools/primer-blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. PCR návrh primerĤ http://www ncbi nlm nih gov/tools/primer-blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast PCR C metoda e oda izolace o ace a a amplifikace p ace DNA Základní á í vlastnosti DNA polymeráz á použitých ž ý pro amplifikaci f MDA (multiple displacement amplification) DNA 1. genomická DNA pomocí fágové I29 DNA polymerázy 2. 1 z 106í107 chyb ve srovnání s Tag, 3’- 5’proofreading aktivita MDA a amplifikace p ace DNA úse úseku u multiple displacement amplification 3. amplifikace úsekĤ 7 – 10 kb Výchozí materiál 4. primery hexamery modifikované thiofosfátem na 3’konci 1. genomická DNA 2. randomizované primery MDA - multiple displacement amplification DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed PCR Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e Práce s g genovými ý a Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. proteinovými databázemi Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e Transformace prokaryontních p y bunČk Chemická transformace E. coli Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. • velmi efektivní • standardnČ používaná ve vČtšinČ laboratoĜí • nízké náklady na provedení • vyhĜívaná lázeĖ nebo kádínka s 42°C vodou je jediný pĜístroj •p pĜíprava p chemicky y kompetentních p bunČk •CaCl2 •RbCl •CCMB80 ((KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl g 2) • vlastní transformace spoþívá v pĜidání DNA ke kompetentním buĖkám • krátká inkubace - dochází k adhezi DNA na povrch bunČk • tepelný šok (42°C, 30-90 min) (DNA vstupuje do buĖky) • preinkubace bunČk v LB médiu (37°C, 1 hod) • vyoþkování na tuhé selekþní pĤdy Elektroporace p E. coli • doþasná destabilizaci bunČþné membrány navozené elektrickým pulsem • možnost pĜipravit kompetentní bakterie pĜedem • bakteriální b kt iál í suspenze ve sterilní t il í vodČ dČ pĜi Ĝi teplotČ tání ledu p bakterií v 10% • uchování kompetentních vodném roztoku glycerolu pĜi -80°C. • podmínky elektroporace • elektrický puls pĜes elektroporaþní kyvetu s kompetentními buĖky a DNA Peleta z 25 ml bakteriální kultury O.D:600 = 0,3; 10 pg DNA; pĜedchlazené elektroporaþní kyvety 0,1 cm štČrbina; 25 PF; 1800 V; 200 . Transfekþní úþinnost dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli na 1 Pg DNA. • koncentrace bunČk • množství DNA • velikost lik t elektroporaþní l kt þ í kyvety k t • elektrické napČtí •kapacita •pĜípadnČ odpor a prĤbČh pulsu Metody transfekce savþích bunČk Chemické metody Transfekce eukaryontních bunČk •DEAE-dextran DEAE dextran •CaPO4 •Elektroporace •Nukleofekce •Liposomální transfekce •Gene G gun •Virové vektory Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. DEAE-dextran transfekce • • • • • • • • • • • kultivace bb. na Petriho miskách nasadit bb. na koncentr. 2.104bb/cm2 a kultivovat v kult. mediu tak, aby zaplnily 75% plochy misky pĜipravit transfekþní médium DDD (na 1 cm2 ~ 100ml DDD) DDD transfekþní médium: DMEM obsahující 2.5% FCSI 100 mM Chloroquine ( zásobní roztok 100mM) 1mg / ml DNA (rozpuštČná v TE objem maximálnČ 1% DDD) 100mg / ml DEAE-dextran (zásobní roztok 10 mg/ml v 1xPBS) zahĜát na 37°C složky pĜidávat za trvalého míchání v uvedeném poĜadí odsát médium z kultivaþních misek (jamek) okamžitČ nahradit DDD médiem a inkubovat 4 hod hod. a co 5 min míchat krouživým pohybem stanovit bunČþnost zahĜát 10% DMSO/PBS na 37°C odsát transfekþní médium pĜidat 2-3 objemy zahĜátého 10% DMSO/PBS inkubovat 2 – 10 min odsát DMSO/PBS a promýt 1xPBS (stejný objem jako 10% DMSO/PBS ) odsát a nahradit standardním množstvím complete medium obsahujícího10% FCSI kultivovat dle potĜeby Elektroporace savþích bunČk • buĖky se pĜipravují bezprostĜednČ pĜed elektroporací • promýváním v elektroporaþním pufru 1. RPMI 1640 2. RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM dithiothreitol 3. 1 x PBS S 4. 15 mM HEPES pufr 5. elektroporaþní pufr 272 mM sacharóza, 7 mM fosfát sodný, pH H 7,4, 7 4 1 mM M MgCl M Cl2 6. pufr o složení 50 mM K2HPO4, 20 mM CH3CO2K, 20 mM KOH, pH 7,4 7 hypoosmolární elektroporaþní pufr 7. CaPO4 transfekce savþích bunČk precipitát CaPO4 a DNA vzniká za pomalého míchání HEPES pufru s roztokem CaPO4 a DNA den pĜedem nasadit bb v exponenciální fázi rĤstu do 10 cm Petriho misek precipitace DNA EtOH a resuspendování pelety v ddH2O a pĜidat CaPO4 na finální 0.25mM • 500 P Pl 2xHeBS do 15 konické zkumavky y a ppĜidat DNA/CaPO4 ((10-50Pg) Pg) po p kapkách p • • HEPES-buffered saline (HeBS) roztok 16.4 g NaCl (0.28 M final) 11 9 g HEPES (0.05 11.9 (0 05 M final) 0.21 g Na2HPO4 (1.5 mM final) 800 ml H2O Titrovat na pH 7.05 pomocí 5 N NaOH PĜidat H2O do 1 litru Sterilizovat filtrací 0.45-um nitrocellulózový filtr Test transfekþní úþinnost Uložit -20 20°C C v 50-ml 50 ml aliquots • • • • • zamíchat na vortexu precipitace 20 min za laboratorní teploty opatrnČ po kapkách pĜidat na kultury bunČk v Petriho miskách Inkubace 4 -16 hodin CO2 inkubátor odsát médium a pĜidat þerstvé médium Nukleofekce bunČk Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Nukleofekce bunČk Nukleofekce bunČk Lipoplexy p p y Polyethyleniminy y y y Liang et al, 2006; PNAS Zanta et al, 1997; Bioconjugate Chemistry Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. Nanopartikule p lipidové p Virové transfekþní systémy y y pro p produkci transgenu Efektivní infekce / transfekce pro urþité typy bunČk receptorový mechanismus infekce cílové buĖky • vakcínie • EBV • lentiviry • adenoviry • adenoasociované viry • SV40 Zuber et al, 2003; Angew. Chem. Int. Ed. Virové transfekþní systémy y y pro p produkci transgenu Efektivita transfekce bunČk daná limitací velikosti inzertu – p sbalení DNA do virového ggenomu a omezení dáno schopností nikleokapsidy • SV40 6 kb • retroviry 2,5 kb integrace do genomu buĖky (Int) • adenoviry adeno ir vstup st p do b buĖky Ėk prostĜednict prostĜednictvím ím C/AR (Non-Int) (Non Int) • ssAAV 5 kb doba pro syntézu dsDNA nČkolik týdnĤ (Int) • dsAAV 2.5 kb (1.2 kb) okamžitý nástup exprese (Int) • alfaviry nejintenzivnČjší transientní exprese (Non-Int) • vakcínie 20 kb (extranukleární) Stabilita plasmidu a transgenu v buĖkách Homologní g rekombinace,, episom, ATB selekce Episom - DNA element, který se mĤže replikovat nezávisle na replikaci chromozomu (stejnČ jako plasmid), nebo se mĤže integrovat do chromozomu a p spoleþnČ p s chromozomální DNA. Po opČtném p vystĜižení y zde se replikovat z chromozomu existuje jako cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i geny pocházející z chromozomu. Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. F faktor - fertility (nebo sex) faktor umožĖuje pĜenos genetického materiálu z jedné E. coli, která F faktor obsahuje (F+, samþí, dárcovská) do druhé, která F faktor neobsahuje (F-, samiþí, samiþí pĜíjemcovská) pĜi procesu zvaném konjugace konjugace. plasmid episom souþást bakteriálního chromosomu (Hfr - High freq. of recombination). F plasmid tak jak byl pĤvodnČ popsán má délku témČĜ 105 párĤ bází. Antibiotická b o c á se selekce e ce p prokaryot o a yo Název Ampicillin Pracovní ( / l) (mg/ml) 50 - 100 Chloramfenikol v metanolu 20 Gentamycin 15 Kanamycin 30 Tetracyklin v 70% etanolu 12 Mechanismus pĤsobení Mechanismus rezistence Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli, inhibuje syntézu stČny potlaþením tvorby pĜíþných p ý vazeb mezi ppeptidoglykany p gy y Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu interakcí s 50S podjednotkou ribozomu a inhibuje reakci peptidyltransferázy E-laktamáza hydrolyzuje ampicillin dĜíve než se dostane do buĖky Chloramphenikol acetyltransferáza inaktivuje chloramphenikol Baktericidní; inhibuje proteosyntézu Aminoglykosid acetyltransferáza a interakcí s L6 proteinem 50S podjednotky aminoglykosid nukleotydil transferáza rybozomu inaktivuje gentamicin; mutace v rplF brání vazbČ gentamicinu Baktericidní, inhibuje proteosyntézu, Aminoglykosid (neomycin) inhibuje translokaci a vyvolává poruchy fosfotransferáza, aminoglykosid þtení tripletĤ acetyltransferáza a aminoglykosid nukleotydil transferáza inaktivuje gentamicin a kanamycin Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu Aktivní eflux tetracyklinu z buĖky brání ve vazbČ aminoacyl tRNA na místo A ribozomu F faktor, a o,Fp plasmid as d V praxi minimalizovaná verze geny zámČrnČ vnesené do F plasmidu (nebo F episomu) ori místo pro zahájení replikace rep gen kódující replikázu par segregaþní geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerázy IV a ccd (ccd stands for coupled cell division) geny vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí nČjž je plasmid udržován v následujících j g generacích a dále napĜíklad p g gen kódující j Ȧ fragment g EE galaktozidázy umožĖující D komplementaci. XL-1 Blue F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq ǻ(lacZ)M15]. F' = bakterie, potomek kmene, v nČmž do chromozomu integrovaný F faktor uvolnil i s nČkolika chromozomovými geny a dále je ve formČ episomu. [Geny získané z chromozomální DNA] þást transpozonu Tn10 - gen rezistence na tetracyklin proAB - Ȗ-glutamyl fosfát reduktáza a kináza - metabolismus prolinu represor laktózového l któ éh operonu lacI, l I gen kódující Ȧ fragment E-galaktozidázy ǻ(lacZ)M15. Satelitní Sa e kolonie oo ep pĜi se selekci e c a ampicilinem pc e Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. Transientní/permanentní p transfekce bunČþná linie / efektivita transfekce / množství proteinu / kvalita proteinu Systémy s transientní expresí transgenu • plazmidové vektory • att technologie klonování a pĜenosu DNA • virové vektory (vakcínie životnost bunČk jen 1-2 dny) Systémy y y s permanentní p expresí p transgenu g • plazmidové vektory • linearizované i i é vektory / cirkulární i á í vektory • S/MAR elementy Transientní expresní p systémy y y Efektivita e v sys systémĤ é Ĥ je ovlivnČna ov v Č • dosažitelnou úþinností transfekce • poþtem kopií genu na buĖku • intenzitou exprese a proteosyntézy • screening expresních vektorĤ pĜed selekcí stabilnČ transfekovaných ý klonĤ • rychlý screening efektu mutací na funkci proteinu • izolace genu z cDNA knihovny - monitorováním aktivity produkovaného proteinu • retrovirové vektory Transientní expresní p systémy y y Stabilní - p permanentní expresní p systémy COS b buĖky Ėk z lledvin d i Af African i green monkey. k • selekce bunČk s integrací plazmidové DNA do genomu • získány tranformací origin-defektivním SV40. • COS exprimují p j SV40 velký ý tumor ((T)) antigen g nezbytný y ýk zahájení replikace virové DNA na SV40 ori. • replikace mediovaná SV40 T antigenem mĤže amplifikovat plasmidy obsahující SV40 ori >100,000 v buĖce • vysoká úroveĖ exprese z transfekované DNA. • nehomologní h l í rekombinace k bi • kotransfekce dvČma nezávislými plasmidy v buĖce ligovány a následnČ integrovány • když y kotransfekce nízká nutno ligovat g in vitro • þetnost integrace je u jednotlivých bb. linií individuální Selekþní markery používané pro kultury savþích bb. linií - Bicistronické p plasmidy y permanentní expresní systémy dominantní selekce • G418 – Tn5 neomycin fosfotransferáza Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. • selekce 3 – 4 týdny • hygromycin - hygromycin fosfotransferáza • blasticidin – bls gen puromycin – puromycin fosfotransferáza • selekce bČhem nČkolika dnĤ recesivní selekce • eenzymy y y purinové pu ové a py pyrimidinové d ové b biosyntetické osy tet c é kaskády as ády • využitelné pro amplifikaci DNA transgenĤ Amplifikace p transfekované DNA Selekþní marker gen Recesivní selekþní markry y pro permanentní expresní systémy DHFR, dihydrofolate reductase; CAD, carbamoyl-phosphate synthetase, aspartate transcarbamoylase, a dihydroorotase; Adenosine, alanosine, and 2'deoxycoformycin Adenosine deaminase Adenine azaserine, Adenine, azaserine and coformycin Adenylate deaminase b-aspartyl hydroxamate or albizzin Asparagine synthetase PALA Aspartate transcarbamolyase Methotrexate Dihydrofolate reductase TK, thymidine kinase; Methionine sulfoximine Glutamine synthetase ADA, adenosine deaminase; Cadmium Metallothionein PNP, purine nucleoside kinase; a-difluoromethylornithine Ornithine decarboxylase AK, adenosine kinase; M lti l drugs Multiple d P l P-glycoprotein t i 170 APRT adenosine APRT, d i phosphoribosyltransferae; h h ib l f 6-azauridine or pyrazofuran UMP synthetase Mycophenolic acid Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase HGPRT, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase; Biosyntetická dráha purinĤ SHMT, serine hydroxymethyl transferase; TS, thymidylate synthetase; methotrexát IMPDH, inosine-monophosphate dehydrogenase. Abbreviations used for enzymes involved in salvage pathways: XGPT, E. XGPT E coli li xanthine-guanine thi i phosphoribosyltransferase. Other abbreviations: FH, tetrahydrofolate; xyl A, 9-b-D-xylofuranosyl adenine Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. Recesivní selekþní markery yp pro permanentní expresní systémy Recesivní selekþní markeryy p pro permanentní expresní systémy hostitelská buĖka musí být deficientní v selekþní vlastnosti recesivní selekce • enzymy purinové a pyrimidinové biosyntetické kaskády • využitelné pro amplifikaci DNA transgenĤ • deficientní bb. linie vČtšinou jde o purinovou a pyrimidinovou biosynthetickou dráhu když je de novo syntéza purinĤ a pyrimidinĤ inhibována buĖky využívají alternativní dráhy (thymidin kináza, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferáza, adenine phosphoribosyltransferáza, adenosine kináza) ke pĜemČnČ nukleotidových prekurzorĤ buĖky deficientní v enzymech alternativních drah pĜežívají když za normálních podmínek = de novo syntéza kde je nezbytná dihydrofolate reduktáza a aspartát transkarbamyláza 1. když je de novo syntéza inhibována (methotrexate) buĖky deficientní v alternativní d. hynou; pokud chybČjící enzym alternativní dráhy je dodán spoleþnČ s transgenem = možná selekce 2. buĖky deficientní v de novo syntetické dráze mohou být selektovány za souþasného odedbrání nukleosidĤ = inhibice alternativní dráhy, pokud chybČjící enzym de novo dodán s transgenem Amplifikace p transfekované DNA Selekce methotrexátem se používá k amplifikaci kotransfekovaného genu pro dihydrofolát reduktázu u CHO linie deficientní v DHFR (DG44) Selekce nízkou koncentrací inhibitoru DHFR - metotrexátem po nČkolik mČsícĤ 9 - 12 OvČĜení exprese transgenu OvČĜéní transkripce p transgenu g Screenin exprese p 96 jjamkovýý formát Bio Dot Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. RT-PCR RT PCR Pozitivita reakce není jednoznaþnČ prĤkazem pĜítomnosti proteinu Screeningg exprese p mnohojamkový j ý formát Dot Blot MBL + Env Skrínování supernatantĤ Dot Blot Stem MASP collectins TM Signal CRD 63 aa secreted trimeric protein t i 470 aa gp41 gp120 Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D. OvČĜení identityy p proteinu p pomocí Western blotování 10% SDS PAGE native / reducing Supernatants Non-reducing L S L S transfected Reducing L S L of liver gp120+MBL+His and serum were separated on 10% SDS-PAGE, blotted S and probed with sera of the HIV-positive patients p kD kDa and visualized by y chemiluminiscence of HRP-labeled anti human Ig Fc mAb. Predicted weight of amino-acid backbone of gp120+MBL is 250 64 6 kDa; pI=8,13. 64,6 pI=8 13 150 100 50 37 Reducing gp120 + MBL Mock gp120 +MBL Mock / nonreducing buffers differences possible oligomerization. ~ Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Základní pojmy p j y Vybrané pojmy pro molekulární klonování kl á í Operon - skupina genĤ nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripþní jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genĤ, které jsou transkribovány do polycistronické mRNA. Gen - základní, fyzická a funkþní jednotka dČdiþnosti. S k Strukturní í gen - úsek ú k DNA zapojený j ýd do produkce d k polypeptidového l id éh ĜĜetČzce. Č Urþuje strukturu proteinu a RNA molekuly ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. Ne-regulaþní gen. Operátor - oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor), bránící iniciaci transkripce z pĜilehlého promotoru. Promotor - oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a transkripþní faktory zahajující transkripci mRNA. Základní p pojmy j y Cis trans test Cis-trans Cis-trans komplementaþní test - párovací test sloužící k urþení zda dvČ rĤzné recesivní i í mutace t na opaþných þ ý h chromosomech h h di diploidního l id íh organismu i ((pozice i in i trans) se vzájemnČ kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují rĤzné geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se oznaþuje i jako test alelismu Cistron – (Benzer) nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci dvou trans mutací ve výše zmínČném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom chromosomu (v poloze in cis). Cistron je tedy sluþitelný s pojmem kódující þástí jednoho genu. Cis regulace - odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycystronická mRNA - mRNA kódující více než jeden protein. VnitĜní místo nasedání ribozomĤ – místo mezi dvČma úsekyy mRNA kde mĤže dojít k sestavení ribozomu a iniciaci translace mimo 5’nepĜekládanou oblast dvČ recesivní mutace ((a1,, a2)) pro diploidní, nebo þásteþnČ diploidní urþuje zda dvČ mutace jsou lokalizovány do stejní funkþní jednotky nebo genu Základní p pojmy j y Kohezivní a tupé p konce dsDNA ýtecí rámec - transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA v pĜesnČ urþených pozicích podle principu komplementarity bází a pĜinášejí aminokyseliny k tvorbČ polypeptidového ĜetČzce ĜetČzce. Komplementarita bází - báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodržet pĜi navrhování pĜekryvných míst a kohezivních koncĤ DNA bČhem klonování. Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. GMO - geneticky modifikovaný organismus organismus. Vnesením cizorodé DNA jinou než pĜirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem þi virem, konjugací pĜirozených plasmidĤ a td.) Manipulace je definována zákony y a vyhláškami y ýeské republiky p y ((zákon 178/2001;; 185/2001;; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a naĜízeními Evropského parlamentu a Rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). Roþní hlášení Základní p pojmy j y Nonsense suppression - potlaþení efektu STOP kodonĤ v dĤsledku pĜítomnosti abnormálních tRNA - vážou se na STOP triplet a pĜinášejí aminokyselinu - umožĖují další prĤbČh translace. - geny jsou uvedeny v genotypu bakterie (SupD, SupE) - vČtšina supresorových tRNA nasedá na STOP Amber (UAG) (UAG), Orche (UAA) (UAA). Į komplementace p Į komplementace - je fenomén, kdy exprese dvou genĤ, z nichž jeden kóduje N’ terminální úsek E-galaktozidázy ( ܤfragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek E-galaktozidázy E galaktozidázy (Ȧ fragment), fragment) vede k vytvoĜení funkþního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich nezávislé translaci Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Základní charakteristika E. coli E coli v E. molekulárním kl klonování á í Základní charakteristika rĤstu E. coli • Gram negativní tyþka • Cirkulární chromozomem 3.106 párĤ bází • Roste na minimálním médiu obsahujícím • zdroj uhlíku (glukóza) • soli jako zdroj dusíku, fosforu f f a stopových kovĤ Ĥ • Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidĤ, vitamíny atd. roste mnohem rychleji • Po P naoþkování þk á í iinokula k l d do obohacených b h ý h médií édií • úvodní lag fáze • exponenciální fáze log (zdvojovací þas 20 - 30 minut) • V log fázi setrvává dokud • nespotĜebuje veškeré živiny • nespotĜebuje kyslík • zplodiny metabolismu (kyseliny) nepĜesáhnou hranici inhibice rĤstu • nepatogenní linie E. coli K-12 je prekurzorem pro vČtšinu laboratorních kmenĤ • pĤvodnČ izolovaná v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii Kalifornii. Základní charakteristika E. coli • Jsou popsány plasmidy dobĜe se replikující v E. coli • Plasmidy jsou schopny nést DNA inzerty od stovek po statisíce párĤ bází (bacmidy) • V E. coli probíhá Į komplementace • Je známa Ĝada antibiotik použitelných pro selekci E. coli (Ampicillin, ( Kanamycin, Chloramfenikol, Tetracyklin, Neomycin Zeocine) • DobĜe popsány metody transformace E. coli •chemická h i ká C CaCl Cl2, RbCl, RbCl CCMB80 (KOA (KOAc+CaCl +C Cl2+MnCl +M Cl2+MgCl +M Cl2) •elektroporace • Vyvinuty kity na izolaci plasmidové DNA z E. coli • Kultivace E. coli •Minimální média •A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g KH2PO4; 10,5 g K2HPO4; 0,5 0 5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4·7H2O; 0,2% 0 2% glycerol (nebo cukr). •Bohatá média •Luria nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g kvasniþného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH). •H H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl •Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2.5 g NaCl Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. •Obohacení nČkterými ý nutrienty y mĤže napĜíklad p usnadnit purifikci p nČkterých ý kontaminujících proteinĤ Aseptické podmínky manipulace s živými organismy i Desinfekce sterilizace Desinfekce, • Sterilizace laboratorního materiálu • horkovzdušná sterilizace 160°C, 2 hod • autoklávování t klá á í 120 – 136°C, 136°C 20 - 30 min i • chemická (70% alkohol, ostatní) a UV sterilizace povrchĤ • Sterilizace médií – filtrace 0,22 nebo 0,1 Pm • Manipulace s kultivaþními nádobami • uspoĜádání pracovní plochy • postup otevírání a zavírání kultivaþních nádob • zpĤsob pipetování • po doteku okolních povrchĤ pĜedpokládat pĜenos kontaminace Expresní systémy Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Vhodnost expresního p systému y podle velikosti rek. proteinu Velikost proteinu Povaha proteinu E. coli < 8 kDa Fúzní +++ > 8 kDa Intracelulární t ace u á +++ 8-50 kDa Sekretované ++ kvasinky hmyzí buĖky savþí buĖky Vhodnost expresního p systému y podle velikosti rek. proteinu Expresní systém +++ ++ - - - + + + + - Jednoduchá, Hmyzí buĖky bez sializace + + + + - Savþí buĖky + + + + + +++ +++ +++ > 50 kDa Sekretované a povrchové VýtČžek expresních systémĤ Chybí Vysoce manosilované glykany g y y Komplexní Expresní systémy Produkt Koagulaþní faktory (VII, VIII, IX) Protein sekretovaný [g/l biomasy] intracelulární rozpustný [g/l biomasy] intracelulární inkluze [g/l biomasy] E. coli < 0,5 kvasinky P. pastoris S.cerevisiae 0,2 ¹ 4 0,25 hmyzí buĖky savþí buĖky 0,001 ¹ 0,5 0,001 ¹ 0,1 Calcitonin 05¹5 0,5 1¹4 0,001 Spoleþnost Systém Novo-Nordisk/Bayer/Centeon BHK buĖky Genetics Baxter/Centeon/Wyeth CHO buĖky Unigene E. coli CHO buĖky DNáza ((cystická y fobróza)) Roche Erythropoetin Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer CHO buĖky Darbepoetin Amgen CHO buĖky Folikuly stimulující hormon 0,5 ¹ 5 0,2 ¹ 12 Acetylace Acylace Ȗ-karboxylace - Kvasinky y +++ Fosforylace - E. coli +++ Posttranslaþní modifikace N-glykozylace O-glykozylace Serono/Organon CHO buĖky y CHO buĖky Luteinizaþní hormon Serono CHO buĖky Gonadotropin Serono CHO buĖky Glukagon Novo Nordisk Novo-Nordisk S cerevisiae S. Glukocerebrosidáza (Gaucher nemoc) Genzyme RĤstové hormony (somatotropiny) Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring E. coli S Serono M ší linie Myší li i 1¹4 CHO buĖky Serono/Bio-Technology Gener. Corp CHO buĖky Eutropin LG Chemical S. cerevisiae Growth factors (GCSF, GMCSF) Novartis/Essex/Amgen/Roche E. coli Platelet derived growth factor (PDGF) Chugai Pharmaceuticals CHO buĖky Janssen-Cilag S. cerevisiae Expresní systémy Produkt Spoleþnost Systém PDGF-agonista ZymoGenetics S cerevisiae S. Hepatitis B vakcína GlaxoSmithKline S. cerevisiae Rhein-Biotech H. polymorpha Hirudin Aventis/Novartis S cerevisiae S. Insulin a muteiny Aventis/Lilly/Berlin-Chemie E. coli Insulin Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Bio-Technology General Corp E. coli N Novo-Nordisk N di k S cerevisiae S. ii Interferon alpha a muteins Roche/Essex/Yamanouchi E. coli Interferon beta Schering E. coli Biogen/Serono CHO buĖky Interferon gamma (mutein) Amgen/Boehringer E. coli Interleukin 2 Chiron E. coli Oprelvekin (agonista IL-11) Wyeth ROMI 8866 OP-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt) Curis/Striker E. coli TkáĖový aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer CHO buĖky Aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer E. coli Faktor kmenových bunČk (SCF) Amgen CHO buĖky Tumor nekrosis faktor (TNF) Boehringer E. coli Výhody E. E coli 1 používány pro klonování DNA i pro expresi 1. Prokaryontní expresníí systémy té E coli E. Nevýhody E. coli 1. rekombinantní proteiny nejsou dostateþnČ posttranslaþnČ modifikovány 2. dobrá znalost o jejich chování a kultivaþních podmínkách 1. N-glykosylace 3. krátký zdvojovací þas E. coli desítky minut 2. O-glykosylace 4. efektivní metody transformace ý mĤstkĤ 3. tvorba disulfidických 5. rostou v tekutých i na tuhých pĤdách 4. štČpení prekurzorových proteinĤ specifickými proteázami 6. v normální atmosféĜe pĜi teplotách od 23°C do 37°C 7. nižší teplotyy umožĖujíj expresi toxických ý rekombinantních proteinĤ 8. výtČžek ý až 5 g proteinu p na 1 litr biomasy y 5 skládání proteinu 5. 2. þasto dochází ke shlukování do inkluzních tČlísek 3. nutno nČkdy použít denaturaþní podmínky izolace p y 4. nutno þasto refoldovat izolované proteiny 5. rekombinantní protein kontaminován endotoxinem Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Endotoxin Inkluzní tČlíska E. coli 1. V cytoplasmatickém nebo periplasmatickém prostoru 2. V savþích buĖkách vznikají z virových kapsidových proteinĤ 3. Nejsou ohraniþena membránou, velikost od 0,2 do 0,6 Pm P 4. TvoĜena nerozpustnými agregáty nesprávnČ složeného proteinu,, bez biologické p g aktivity y ((nČkdy y možno zvrátit)) 5. Ve fázovém kontrastu jako temná tČlíska 6. ýastým ý problémem pĜi expresi 1. transmembránových proteinĤ obratlovcĤ (ve 30% pĜípadĤ) 2. multiproteinových komplexĤ 3 i pĜi 3. Ĝi pouhé hé nadprodukci d d k i jijinak k rozpustných t ý h rek. k proteinĤ t i Ĥ 7. Možno využít pro efektivnČjší purifikaci proteinu 6 drah sekrece proteinĤ z E. coli • typ yp I závisí na ABC transporterech p ((ATP-binding g cassette)) • sekrece typu I je efektivní pro proteiny pod 200 aa • navozena signálem i ál (Hl (HlyA) A) pĜipojeným Ĝi j ý k C’ konci k i rek. k prot. t • typ II je závisí na SEC (SecB), SRP (signal recognition particle), nebo TAT (twin-arginin translocatioon) • zodpovČdná za kumulaci mnoha rekombinantních proteinĤ v periplasmatickém prostoru • zde þasto tvoĜí inkluzní tČlíska • v periplasm. prostoru jsou disulfid-izomerázy a foldázy • v periplasm. prostoru je ménČ proteáz, než v cytoplasmČ Sekrece typ II v E. coli Zvýšení ý výtČžku ý a þistoty y rekombinantního proteinu suplementací média GlcNAc Zvýšení ý výtČžku ý a þistoty y rekombinantního proteinu suplementací GlcNAc GFAT = L-glutamine-D-fructoseg 6-phosphate aminotransferase Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Výhody ý y kvasinkvých ý expresních p systémĤ Kvasinkové expresníí systémy té 1. Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris 2 levné 2. l é oproti ti savþím þí expresním í systémĤm té Ĥ 3. dobrá znalost o jejich chování a kultivaþních podmínkách 4. oproti savþím systémĤm krátký zdvojovací þas 5 možno kultivovat do vysokých denzit suspenze 5. 6. známy efektivní sekretorní signály 7. rostou v tekutých pĤdách 8. v normální atmosféĜe pĜi teplotách od 23°C 23 C do 37°C 37 C 9. výtČžek až 4 - 12 g proteinu na 1 litr biomasy Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Nevýhody kvasinkových expresních systémĤ Struktura N-glykanĤ gy 1. proteiny obsahují pouze vysoce manozylované N-glykany • rekombinované linie p produkující j manosidázyy ((MI a MIIx)) a glykosidázy 2 N 2. N-oligosacharidy oligosacharidy neobsahují fukózu 3. oproti E. coli mnohem delší pĜíprava expresního systému 4. nutno selektovat a charakterizovat nČkolik expresních klonĤ pro výrazné rozdíly v expresi rekombinantního proteinu 5. variabilní podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinĤ syntetizovaných buĖkou • S. cerevisiae max 1%, P. pastoris až 10% Struktura O-glykanĤ gy •Kvasinky zahajují O-glykosylaci v endoplasmatickém retikulu •pĜenos Ĝ manózových ó ý h zbytkĤ b tkĤ z dolichyl d li h l ffosfát fát D D-manózy ó na specifický ifi ký serin i nebo treonin •V této chvíli je již protein složen a lokální pomČry rozhodují o prĤbČhu Oglykosylace •IGF a IL-2 zásadní rozdíly v O-glykosylaci, hGM-CSF O-glykosylován jako savþí Manosidázy pĜi tvorbČ N-glykanĤ N glykanĤ Hmyzí bunČþné kultury pro bakulovirové ba u ov ové eexpresní p es systé systémy y Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Bakulovirové expresníí systémy té • TkáĖové kultury hmyzích bb. infikovaných rekombinantním bakulovirem s cílem exprese rekombinantního proteinu • Velmi výkonný ý ý expresní p systém y sp posttranslaþní modifikací exprimovaných proteinĤ blízkou savþím systémĤm • Snadný pĜenos DNA do nové kultury infekce • Snadný pĜevod adherentní kultury do suspenzních podmínek kultivace • NepĜítomnost endotoxinu, bezsérová média Nevýhody hmyzích expresních systémĤ 1. Oproti E. coli mnohem delší pĜíprava expresního systému 2. NČkolikafázová p pĜíprava p rekombinantního bakuloviru 3. Nutnost titrovat rekombinantní bakulovirus, plakový esej 4 Kultivace 4. K li h hmyzích í hb bunČk Čk vyžaduje ž d j pravidelnou id l péþi éþi 5. Zavedení bakulovirového expresního systému je pro experimentální laboratoĜ finanþnČ nároþné 6. Do nedávna nedostupné p techniky y stabilní exprese p p proteinu , dne již vyĜešeno Bakulovirové systémy y y Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Schéma p pĜípravy p y rekombinantní bakulovirové DNA BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y Základní pravidla pro kultivaci hmyzích bb bb. linií shodná s pravidly pro TK R díl Rozdíly: t l t 27 – 28°C teplota normální atmosféra kultivace v suspenzi za trvalého míchání (stĜižné ý minimalizoványy použitím p FBS, sílyy mohou být Pluronic, specielní média Sf-900 SFM) striktní p požadavek vysoké y životnosti >95% % maximální ĜedČní pĜi pasáži 1:3 PĜípravy rekombinantního bakuloviru ba u ov u BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y Izolace rekombinantního bakuloviru - virionu Rekombinantní bakulovirová DNA je transfekována do hmyzích bunČk a ty produkují plnČ infekþní viriony Produkce rekombinantních proteinĤ ST6GalNAcI ST6GalNAcII GalNAcT2 GalNAcT14 Plakový essej pro stanovení titru viru nutný pro úspČšnou infekci Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y Stabilní bakulovirový expresní systém pĜístup zcela odlišný od klasického bakulovirového systému BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Volba expresního systému Savþí expresní systémy té 1. prĤkaz zapojení produktu transgenu a charakterizování produktu – transientní transfekce je dostateþná 2. produkce velkého množství preoteinu – vhodná stabilní koamplifikace p 3. produkce toxického proteinu virové expresní vektory vakcínie, alfaviry nebo inducibilní promotor (hsp, interferon ȕ, ionty tČžkých kovĤ, steroidy) VýtČžnost ý jednotlivých j ý savþích expresních systémĤ Využití rekombinantních proteinĤ v savþ savþích c expresních e p es c systé systémech ec CV1 SV40 • identifikace genu pro urþitý protein po skríningu cílových bunČk COS transfekce 1 Pg/ml • produkce d k velkého lkéh množství ž t í normálnČ ál Č dostupného d t éh v omezeném é množství 3T3 retrovirus CHO transfekce 0.01-10 Pg/ml • hledání á í fyziologických f i i ý následkĤ á Ĥ exprese urþitého þi é proteinu i primáti i áti vakcínie k í i studium enzymatických drah 293T transfekce Pg/ml studium aktivaþních drah In vitro Pg/ml studium regulace exprese Baculo Pg/ml E. Coli Pg/ml • potvrzení efektu specifických mutací na funkci proteinu 1-10 Pg/ml 0 1 - 0.5 0.1 0 5 Pg/ml 1 Pg/ml / l Exprese standard. a mutant. proteinĤ cDNA kihovny, mutantní proteiny PĜenos g genu do zvíĜat Permanentní a intenzivní exprese P d k ttoxických Produkce i ký h proteinĤ t i Ĥ Produkce lidských proteinĤ Volba promotoru Vektoryy pro p savþí expresní p systémy y y Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Zheng et al, 2005; Molecular Therapy 12(3) Vektoryy p pro savþí expresní p systémy y y Vektory yp pro savþí expresní p systémy y y Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Minicirklyy Purifikace minicirklĤ In vivo o místnČ st Č spec specifická c á rekombinace e o b ace Když y exprese p nefunguje g j Regulace exprese v buĖce tTA tetracyklinový transaktivátor – fúzní produkt d kt E. E coli li tetracyklinového t t kli éh represoru a 1. ovČĜení struktury vektoru restrikþní analýzou, sekvenování 2. ovČĜení transfekþní úþinnosti – stejný vektor jiný transgen - reporter 3. ovČĜení transkripce – Northern hybridizace 4. použití vektoru jiného typu konstrukce VP16 HSV TetP - tetracyklinový promotor Tn10 pĜed minimalizovaným promotorem CMV (' +) PĜítomnost tetracyklinu inhibuje vazbu tTA na TetP a tím inhibuje expresi 5 nutno zvážit 5. áži aberantní b í sestĜih Ĝih RNA 6 hledání neomutací 6. transgenu z rekombinovaného pTet-Splice vektoru Nukleární lokalizaþní signál SV40 Scaffold/matrix associated replicons Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Dean et al. 1999 Biotech. Bioing. Vlastnost 366 bp dlouhého úseku SV40 obsahujícího zaþátek replikace a þasný promotor (podobný efekt fragment obsahující 72 bp repeats) 1000 x množství DNA plasmidĤ v jádru Scaffold/matrix associated replicons Nezbytné vybavení TK laboratoĜe 1 OddČlená pracovní plocha - laminární box 1. 2. Humidifikovaný CO2 inkubátor 3. Kultivaþní a manipulaþní média 4. Vhodné kultivaþní a manipulaþní nádoby (jednopoužiĢový plast) 5 Vhodná kultivaþní média 5. 6. Inverzní mikroskop 7. Lednice, mrazící box (-20°C), hlubokomrazící box, tekutý dusík 8. Desinfekþní a sterilizaþní prostĜedky Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Udržování TK bb. bb linie v kultuĜe Aseptické podmínky TK 1 Aseptiþnost 1. A tiþ t práce á • Ochrana O h bb bb. k kultury lt pĜed Ĝ d infekcí i f k í z prostĜedí tĜ dí a pracovníkĤ íkĤ 2. Vhodné kultivaþní médium • Ochrana laboratorních pracovníkĤ pĜed infekcí z TK 3. Stanovení koncentrace a životnosti bb. v kultuĜe • kontaminace inhibuje rĤst, zabíjí bb., zpĤsobuje inkonzistenci experimentálních výsledkĤ, • tkáĖové kultury suspenzních bb. bb (konfluence) • tkáĖové kultury adherentních bb. (poþítání bb. v jednotkovém objemu) 4. Záznam údajĤ o kultuĜe datum pasáží, koncentrace bb, životnost ži 5. Uchování živých bb. pro další experimenty (zamražování) • kontaminující mikroorganismy spotĜebovávají živiny z média,, p produkují j toxiny y 1. Separace TK laboratoĜe od ostatních laboratoĜí, boxy s laminárním proudČním (validace), pĜetlak, filtrace vzduchu 2. Ochranné pomĤcky: rukavice, plášĢ, štít 3. JednopoužiĢový plast, pipety, sterilizace médií, ošetĜení lab. skla pro TK Prevence kontaminace TK • Hl Hlavníí zpĤsob Ĥ b prevence kontaminace k t i jje pravidelná id l á kontrola k t l kultur zamČĜená na • náhlé á é zmČny Č barvy média é i • pokles životnosti bunČk • zákal kultivaþního média Prevence kontaminace TK ATB • Antibiotika A tibi tik brání b á í rĤstu Ĥ t kontaminujících k t i jí í h mikroorganismĤ ik i Ĥ • penicillin, streptomycin, amfotericin B Pracovní koncentrace antibiotik a antimykotik u savþích tkáĖových kultur ATB Penicillin • kontrola pod mikoroskopem St t Streptomycin i sulfate lf t • analýza typu kontaminace Kanamycin • likvidace kontaminovaných kultur radČji než „léþba“ Fi ál í koncentrace Finální k 50-100 U/ml 50 100 mg/ml 50-100 / l 100 mg/ml Gentam cin Gentamycin 50 mg/ml Mycostatin 20 mg/ml Amphotericin B 0 25 mg/ml 0.25 PĜi potĜebČ možno konzultovat s ATB centrem Kultivaþní média pro TK Kultivaþní média pro TK • Používat ou v ovČ ovČĜená e média éd nebo ebo p pĜedem ede nové ové typy ypy ovČĜit ovČ Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. 1. 5%, 10%, nebo 20% (v/v) FBS, tepelnČ inaktivované (rĤstové faktory faktory, hormony hormony, MK) 2. 1% (v/v) nonesenciální aminokyseliny 3. 2 mM L-glutamin (zdroj dusíku, v Krebs. cyklu, syntéza NK, proteinĤ, aminocukrĤ) 4. 100 U/ml penicilin 5 100 ug/ml 5. / l streptomycin t t i sulfate lf t • Použití médií je individuální • Definovaná média dostupná jako prášek, koncentrát, pracovní roztok • Obecná formulace kompletního média záleží na použitém základním médiu skladovat v temnu , +4°C +4 C max 1 mČsíc uložit malý alikvot do CO2 inkubátoru - kontrola tepelná inaktivace komplementu 56°C, 30 min Základní média pro TK • BME (Basal medium Eagle`s) Originální Eaglovo médium pro HeLa buĖky v kultuĜe obsahuje Earleyho balansovaný solný roztok • MEM,, E-MEM ((Minimum essential medium)) Eaglem modifikované eho BME. Vyšší koncentrace AMK. Obsahují Earleyho balancovaný solný roztok, nebo Hanksúv solný roztok, obohacena o Ne-AMK. Ob h j 2 mM Obsahuje M L-Glutamin. L Gl t i • DMEM (Dulbeccos modified Eagle`s medium) Dulbekova modifikace bazálního Eaglova média. Obsahuje 4x koncentraci aminokyselin a vitamínĤ. DvČ modifikace: high (4.5 g/l glukózy) a low (1.0 g/l glukózy). Dále obsahuje 4mM L-glutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného. • RPMI 1640 (Rosswell Park Memorial institute) 1966 Moor, je modifikací McCoy-ova basálního 5A média. PĜi pH>8 rĤžová barva a zákal - obsahuje fenolovou þerveĖ. Je to zpĤsobeno volnými bazickými AMK, které jsou ménČ rozpustné pĜi basickém pH. PĜi neutrálním pH je þiré a má barvu jako ostatní média (lotosový kvČt). Obsahuje 2mM L-Glutamin. Základní média pro TK Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. OvČĜení identityy p proteinu p pomocí Western blotování 10% SDS PAGE native / reducing Supernatants Non-reducing L S L S transfected Reducing L S L of liver gp120+MBL+His and serum were separated on 10% SDS-PAGE, blotted S and probed with sera of the HIV-positive patients p kD kDa and visualized by y chemiluminiscence of HRP-labeled anti human Ig Fc mAb. Predicted weight of amino-acid backbone of gp120+MBL is 250 64 6 kDa; pI=8,13. 64,6 pI=8 13 150 100 50 37 Reducing gp120 + MBL Mock gp120 +MBL Mock / nonreducing buffers differences possible oligomerization. ~