Vyuziti prutokove cytometrie v imunologii

VYUŽ
VYUŽITÍ
ITÍ PRŮ
PRŮTOKOVÉ
TOKOVÉ CYTOMETRIE
V IMUNOLOGII
Helena Langhansová
30. listopadu 2011
Projekt Vytvoření a rozvoj týmu zaměřeného na výzkum a výuku v oblasti medicínské biologie,
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0361,
je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky.
Schéma přednášky
I. část: Základní principy průtokové cytometrie
II. část: Aplikace v imunologickém výzkumu
Flow Cytometry Course
Department of Biology, University of York
12th–16th September 2011
Prů
Průtoková
toková cytometrie
Měření a analýza fyzikálních a chemických vlastností jednotlivých buněk
v proudu kapaliny
paprskem
během jejich průchodu laserovým
Přímý rozptyl (forward scatter) → velikost
Boční rozptyl (side scatter) → granularita
Fluorescence
Výhody: velké množství buněk během krátkého času,
subpopulace, třídění (sorting)
Nevýhody: jednotlivé buňky, lokalizace proteinu (x
konfokální mikroskop)
Prů
Průtokový cytometr
Fluidika
Zdroj(e) světla
Optika
Detektory
Zpracování dat
BD FACS CantoII
FLUIDIKA
pohyb buněk cytometrem
hydrodynamická fokusace
low - medium - high (tlak vzorku určuje průměr jádra)
ZDROJ SVĚ
SVĚTLA
Laser - stejná vlnová délka i fáze
(Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation)
488 nm, 633 nm, (405 nm)
OPTIKA
Sběr emitovaného světla
pomocí systému filtrů
Filtry
dichroické, selektivně
propouští 1 vlnovou délku a
odrážejí ostatní
SP, LP, BP
DETEKTORY
sběr světla a konverze na měřitelný signál (analogový, digitální)
Fotodioda (forward scatter), fotonásobič (fluorescence) – „konverze
světla na napětí“
Poměr signálu k šumu – šum biologický, elektronický
Dynamický rozsah – poměr mezi největší a nejmenší měřitelnou
hodnotou
Digitální systémy – zvyšují rychlost a přesnost měření
ZPRACOVÁ
ZPRACOVÁNÍ DAT
komunikace mezi přístrojem a uživatelem
zisk „použitelných“ dat (počet buněk exprimujících daný antigen,
počet buněk v určité fázi cyklu, odpověď populace na stimul, síla
exprese antigenu, absolutní množství buněk, …)
Analytický software
Vyčíslení subpopulace (% pozitivních)
Intenzita fluorescence (medián)
Fluorescence
Emise fotonu při přechodu elektronu z
S1 do S0
Absorpce světla (λA) → excitovaný stav
→ emise světla (λB) → základní stav
Fluorofory – přírodní, syntetické
Použití filtrů
Závislá na prostředí (pH, vazebné
vlastnosti, bleaching)
Proč fluorescence?
Mnoho buněk má stejnou/podobnou morfologii
Značení specifických částic/komponent
Identifikace a charakterizace subpopulací
Kvantifikace znaku
Specifická diskriminace (např. živé/mrtvé buňky, buněčný
cyklus)
II. Prů
Průtoková
toková cytometrie v imunologii
Povrchové značení (fenotypizace)
Intracelulární značení
Buněčný cyklus a proliferace
Apoptóza
Funkční parametry
Plánování experimentu
Účel, hypotézy, literatura, důvod použití průtokové
cytometrie (x mikroskopie, RT-PCR)
Technické specifikace cytometru a fluorochromů (lasery, počet
barev, absorpční a emisní spektra, kompenzace)
Finanční náklady a personální možnosti
Optimalizace experimentu
Silné/slabé fluorochromy
Hustota antigenu
Tandemové fluorochromy
FRET
nestabilní
CD4PE
CD38FITC
Optimalizace vzorků
! dublety, shluky (filtrace, Dnáza), mrtvé buňky
Suspenzní x adherentní buňky, tkáně nebo řezy
Fixace buněk
+ prevence infekce, stabilita vzorku, pohodlí
- vyloučení mrtvých buněk, změna rozptylu, autofluorescence
Titrace protilátek
Použití kontrol
V KAŽDÉM EXPERIMENTU
Nastavení cytometru (nebarvené buňky)
Kompenzační kontroly (jednobarevné)
FMO (gating při mnohobarevné analýze)
Isotypové kontroly (vazba protilátek)
Experimentální (naivní buňky)
POVRCHOVÉ
POVRCHOVÉ ZNAČ
ZNAČENÍ
ENÍ
Fenotypizace
Povrchové molekuly – aktivační molekuly, receptory pro cytokiny a
chemokiny, mediátory zánětu
Monoklonální protilátky, přímé x nepřímé značení
Leukémie, HIV – dg, efekt léčby, zbytková nemoc…
Diwan et al. PNAS 2007, 104: 6794-6799
Pecora et al. JI 2006, 177: 422-429.
Kombinace rozptylu a fluorescence – progrese nádoru
PerCP=CD45, FITC=CD3, APC=NK1.1, Alexa700=CD4, PE-Cy7=CD8
Důležité:
Stimulace (restimulace buněk)
„Receptor shedding“ (inhibitory, 4 °C)
Kvalita protilátek (nespecifická vazba – blok, iso kontroly (FcR))
Citlivost 200-500 mlk/b
Přímé x nepřímé značení
INTRACELULÁ
INTRACELULÁRNÍ
RNÍ ZNAČ
ZNAČENÍ
ENÍ
Cytokiny, transkripční faktory
Inhibice transportu ven z buňky
(brefeldin A)
Fixace a permeabilizace buněk (!
změna scatteru, vyloučení mrtvol
Často v kombinaci s povrchovým
značením
Sadanaga et al. Clin Cancer Res 2001, 7: 2277
APOPTÓ
APOPTÓZA
= programovaná buněčná smrt
fyziologická - normální vývoj a obnova tkání, negativní selekce, CTL
patologická - autoimunitní a neurodegenerativní onemocnění, rakovina
expozice různým podmínkám (léky, jedy…)
rychlý a dynamický proces, kombinace s mikroskopií
Scatter, změny v buněčné membráně, mitochondriích, aktivace
specifických enzymů, rozpad DNA
Změna velikosti a tvaru
Zvýšená propustnost pro DNA barviva (PI, DAPI, Sytox Green atd.)
Depolarizace mitochondriální membrány
akumulace v
aktivních mitochondriích (membránový potenciál zachován) - CMXRos,
LDS-751, JC-1, TMRE
Uvolňování cytochromu c
Nonyl Acridine Orange (NAO), protilátky
Aktivace enzymů – kaspáza 3
FLICA (fluorochrome-labelled inhibitors of caspase activity)
Protilátky proti aktivní formě enzymu
Fixace a permeabilizace – nelze užít live/dead diskriminaci
Změny v buněčné membráně
• expozice fosfatidylserinu na vnější straně
• Annexin V, YO-PRO-1
Degradace DNA
Sub-G1 populace
TUNEL assay – řetězcové zlomy
BUNĚČ
BUNĚČN
ĚČNÁ PROLIFERACE
CFSE, SNARF-1, PKH-26
Carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidal ester
Odpověď na stimulaci mitogenem, superantigenem nebo specifickým
antigenem
Cytostatika
Dělení všech buněk x dělení subpopulace
FUNKČ
FUNKČNÍ PARAMETRY
Buněčné interakce, změny Ca2+, fagocytóza, oxidační
vzplanutí
Indo-1, Fluo-3 – vazba na vápenaté ionty a změna
fluorescence
BUNĚČ
BUNĚČNÝ
ĚČNÝ CYKLUS
G0 na G1- lymfocyt po stimulaci, růst buňky, syntéza
RNA a proteinů, exprese CD69
DNA-vázající látky
BromdeoxyUridin (BrdU) - Analog thyminu
S fáze
Anti-BrdU protilátky
Odlišení aktivně se dělících buněčných frakcí, kinetika
Kombinace s PI, event. povrchovým značením
In vivo – i.p., pitná voda
CFSE
Většina postupů je aplikovatelných i na subcelulární struktury (jádra,
mitochondrie), kuličky a prokaryotní buňky
velikost a tvar)
(s ohledem na
2 populace ?
F4/80
singlety
mrtvé
živé
fagocytující
Užitečné odkazy
www.bdbiosciences.com/immune_function
ISAC - International Society for Advancement of Cytometry
http://www.isac-net.org/
Česká společnost pro analytickou cytologii www.csac.cz
http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/index.htm
Projekt Vytvoření a rozvoj týmu zaměřeného na výzkum a výuku v oblasti medicínské biologie,
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0361,
je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky.
DĚKUJI ZA POZORNOST