Dvojí populace erytrocytů 16.10.2012
Transkript
Dvojí populace erytrocytů příčiny – problémy při stanovení – interpretace nálezů Eliška Rýznarová LAB-MED Systems s.r.o. 1 2 3 Dvojí populace erytrocytů • Je termín, se kterým se setkáváme v imunohematologických laboratořích nejčastěji v souvislosti s předtransfuzním vyšetřením a potřebou zajistit pacientovi kompatibilní krev. • Ne všechny laboratorní techniky jsou však schopny rozlišit reakci dvojí populace ery. 4 Laboratorní metody testování a možnost detekce dvojí populace ery • • • • • 5 Reakce dvojí populace ery Srovnání s běžnými výsledky ID-gelový systém • Pouze systém sloupcové gelové aglutinace umožňuje spolehlivě vizuálně rozlišit reakci dvojí populace ery. • Příčinou dvojí populace ery může být: - chybný pracovní postup - přirozený jev • Reakci dvojí populace ery (sediment + aglutinace v gelu) je nutno interpretovat jako pozitivní výsledek. na sklíčku ve zkumavce na mikrotitračních deskách v gelovém systému metodou Capture - soustředěný terčík - méně soustředěný terčík - manuální testování náročné 7 6 sediment + aglutinace v gelu 8 9 1 Správná technika testování Správné a chybné pipetování Předpokladem pro správné vyhodnocení výsledků testování je správné provedení testu. • Správné pipetování ery je v úhlu 45° směrem ke stěně rozšířené části mikrozkumavky - důvodem je nutnost zachování vzduchové bubliny nad gelem • Správné pipetování séra/plazmy je vertikálně bez doteku stěny mikrozkumavky – tím je zajištěno smísení séra/plazmy s ery a průběh reakce mezi antigenem a protilátkou • Chybné pipetování může vést k falešně negativnímu výsledku a způsobit HTR 3. 4. 5. 11 Tenká vrstva ery na povrchu gelu Tenká vrstva ery na povrchu gelu Není pozitivitou, vyvolává obraz dvojí populace ery. Faktory, které způsobují částečné zadržování ery: 2. Vzájemná kontaminace krevních vzorků Po alogenní transfuzi krve Po transplantaci KD, kmenových buněk Po intrauterinní transfuzi Fetomaternální a maternofetální inkluze Slabé podskupiny A, B (zejména A3) Částečná ztráta antigenu jako důsledek leukémie Získaný antigen B u krevní skupiny A1 Polyaglutinabilita ery (T-Tn aktivace ery) Mozaicismus Rh při myeloproliferativních nemocněních 11. Chimérizmus Správné pipetování: ery v úhlu 45° plazmu vertikálně 10 1. Dvojí populace ery - příčiny 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Vlákna fibrinu – u čerstvých vzorků ne zcela řádně odebraných nebo nedostatečně zcentrifugovaných Koagulační faktory - uvolněné do plazmy, zejména u starých vzorků Vysoký počet leukocytů – vytváří bariéru na povrchu gelu Podpovrchové antigeny (kryptoantigeny), odhalené působením bakteriálních enzymů u ne zcela čerstvých diagnostických ery, mohou reagovat s protilátkami v séru vzorků Přítomnost protilátek proti tzv. senescentním (stárnoucím) antigenům Chybný odběr vzorku – fibrinová vlákna Vlákna fibrinu zachycují část ery na povrchu gelu Příklad: vyšetření aglutininů a screening protilátek KS A (β + fibrin), protilátky pozitivní s ery I+, II++ 13 • Část ery je zachycena fibrinovými vlákny • Opakovat z nově odebraného krevního vzorku 14 5% kontaminace vzorků (1 ml + 50µl) 1. Vzájemná kontaminace vzorků • Mezi krevními vzorky pacientů nebo dárců při použití stejné pastérky (typování antigenů na ery, zkouška kompatibility) 12 15 10% kontaminace vzorků (1 ml + 100µl) ještě negativní již i zde pozitivní • Mezi diagnostickými ery při záměně kapátek (vyšetření aglutininů, protilátek) • Testování je nutno opakovat ze správně odebraného vzorku a správnými diagnostiky 16 17 18 2 2. Po alogenní transfuzi krve Transfuze krve 0 Rh- z vitální indikace Reakce dvojí populace ery je „umělá“ a dočasná. Příklad: Pacient 0 Rh+, CcD.ee, K- Po transfuzi AB0/D neshodných ery • cílená transfuze 0 Rh- krve z vitální indikace • způsobená administrativní nebo laboratorní chybou Prověřte historii klinického obrazu a terapii, opakujte vyšetření AB0/D, učiňte potřebná opatření (HTR) ctl negativní 19 pacient ccEe další příklad AB0/Rh krev dárce 0 Rh - Dárce krve 0 Rh -,ccddee K- Po transfuzi neshodných ery v ostatních antigenních systémech • reakce dvojí populace ery je patrná i na ID-Kartách při fenotypizaci. Fenotypizaci lze opakovat po separaci vlastních ery od transfundovaných Transfuze krve Transfuze krve pacient 0 Rh + 20 PAT a autokontrola u pacienta s protilátkou po nedávné transfuzi další příklad fenotypizace Rh krev dárce ccee Separace vlastních ery od transfundovaných Metodou jednoduché centrifugace v zatavených mikrohematokritových trubičkách • Princip: Nově se tvořící autologní ery pacienta – retikulocyty mají nižší hmotnost než ery transfundované. Koncentrují se v horní části trubičky, kterou seřízneme, ery uvolníme a použijeme k typizaci antigenů. Expresivita antigenů na retikulocytech nemusí být tak silná jako na vyzrálých ery. • Separace je úspěšnější: - u pacientů s normální nebo vyšší tvorbou retikulocytů - u pacientů, kteří jsou 3 a více dní po trasfuzi • Vytvořená aloprotilátka se váže pouze na ery transfundované, stále kolující v organismu • Vlastní ery poskytují reakci negativní 22 23 AB0, event. RhD inkompatibilní TKD 3. Po transplantaci KD, kmenových buněk Transplantace KD: • Autologní – převod vlastní KD, odebrané před zahájením přípravného režimu. Lze u pacienta bez infiltrace základním onemocněním nebo v kvalitní remisi. • Syngenní – od jednovaječného dvojčete • Alogenní – příbuzenská nebo nepříbuzenská Transplantace kmenových buněk: • Autologní kmenové buňky z periferní krve – opakovanými cytaferézami před transplantací (zde nemusí maligní b. být) • Placentární krev – po porodu z pupečníkové žíly, obsahuje dostatek kmenových b. a funkčně nezralé lymfocyty s významným velkým podílem naivních lymfocytů T se slabou reaktivitou GVHD (štěpu proti hostiteli). Banky mražených PK. • Fetální jaterní buňky – souhlas ženy po potratu (hematopoéza v játrech od 5. týdne) 25 21 Viz AABB Technical Manual, 11TH edition, 1993, str. 637-638 24 TKD - „Velká neshoda“ - ABO major Z praktického důvodu se obvykle ke shodě AB0 při TKD nepřihlíží, neboť by se vyloučila z dárcovství většina HLA shodných sourozenců nebo HLA vhodných dárců. Řeší předtransplantační příprava pacienta. RhD+ příjemce může být transplantován od dárce RhD-. • DKD přináší „nové“ antigeny (např. dárce A, pac. 0) • U příjemce jsou přítomny přirozené aglutininy anti-A nebo anti-B. Transfuze u transplantovaných pacientů: 1. Přípravky erytrocytové: • shodné s původní AB0 KS příjemce dokud je prokazována a trvá pozitivita PAT • nebo trvá průkaz inkompatibilní AB0 protilátky 2. Přípravky s plazmou: • stejné KS AB0 jako dárce KD, od dne transplantace 26 27 3 TKD - „Malá neshoda“ - ABO minor TKD - „Kombinovaná neshoda“ • DKD přináší „nové“ protilátky (např. dárce 0, pac. A) Transfuze u transplantovaných pacientů: 1. Přípravky erytrocytové: • AB0 KS jako dárce s minimálním obsahem inkompatibilních protilátek anti-A nebo anti-B, dokud jsou detekovány ery s původní KS pacienta 2. Přípravky s plazmou: • AB0 skupina shodná s původní KS příjemce až do vymizení ery původní KS TKD – „RhD+ příjemce a RhD- štěp“ • DKD přináší „nové“ antigeny i „nové“ protilátky (např. dárce A s anti-B, příjemce B s anti-A) Transfuze u transplantovaných pacientů: 1. Přípravky erytrocytové: • Krevní skupiny 0 s minimálním obsahem inkompatibilních protilátek anti-A nebo anti-B, dokud jsou detekovány ery původní KS pacienta RhD+ příjemce může být transplantován RhD- KD (nehrozí tvorba anti-D protilátky) Transfuze u transplantovaných pacientů: Podávat RhD- ery a trombocyty 2. Přípravky s plazmou: • Krevní skupiny AB až do vymizení ery původní KS příjemce 28 29 Stav po transplantaci KD či kmenových b. Dvojí populace ery u orgánové transplantace • Současně s objevováním se antigenů dárcovských mizí vlastní antigeny pacienta. • Prvním průkazem přijetí dřeně je zjištění populace ery antigenně odlišných - tzv. dvojí populace ery. • Imunologické změny lze zachytit 14 dní po transplantaci, obvykle později. • V konečné fázi po přijetí se všechny antigenní systémy mění v dárcovské (př. svoji KS A na 0). • Tento jev je pokládán za příznivý. • U leukémie svědčí o remisi choroby. Není vyloučena. Pokud je transplantace AB0, event. RhD kompatibilní ale nestejnoskupinová a dojde k tvorbě AB0 (nebo D) imunních protilátek u příjemce. Příklad maternofetální inkluze Například: pacient KS B, s aglutininem anti-A štěp KS 0, pokud dojde k reakci štěpu proti hostiteli, pak imunokompetentní buňky štěpu tvoří anti-A a anti-B Od 2. týdne a na konci 3. týdne se sleduje případná tvorba imunních protilátek v AB0 (popř.D) NAT a PAT. Transfuze: do 48 hod po transplantaci se dodržuje KS příjemce následující dny kompatibilní s příjemcem i štěpem. 32 33 6. Slabé podskupiny A, B (A3,Ax) Srovnání výsledků z krve pupečníkové a venózní • Pupečníková krev • Novorozenec O Rh+, matka A Rh + 4. Po intrauterinní transfuzi 5. Fetomaternální a maternofetální inkluze Dvojí populaci ery můžeme v těchto případech sledovat podle situace. • V krvi plodu, novorozence v souvislosti s intrauterinní transfuzi • V krvi matky v případě fetomaternální inkluze • V pupečníkové krvi v případě maternofetální inkluze Jedná se v podstatě o reakci štěpu proti hostiteli. 31 30 Pacient KS Ax Rh+ (s anti-A neg., s anti-AB pos.) po transfuzi 2 krví A1 Rh+ (s anti-A a anti-AB pos.) • tentýž případ maternofetální inkluze z nového venózního vzorku • novorozenec O Rh+ matka A Rh + • venózní krev téměř bez inkluzí mateřské krve, pouze stopy s anti-AB 34 35 36 4 7. Částečná ztráta antigenu jako důsledek leukémie 8. Získaný antigen B u krevní skupiny A1 37 Polyaglutinabilita ery (1) - Transformace T a Tk je způsobena aktivitou bakteriálních enzymů a je přechodného charakteru (staré vzorky, chybný transport) - Transformace Tn bývá spojena s některými hematologickými poruchami a má trvalejší charakter 40 • Vzorek ery, vykazující polyaglutinabilitu při reakci se sérem dospělých osob nemusí vždy poskytnout také falešně pozitivní reakce při vyšetření KS s monoklonálními reagenty lidského původu • Sérum pupečníkové krve obvykle nereaguje aglutinací s polyaglutinabilními ery 41 42 Příklad: polyaglutinabilita ery z důvodu bakteriální kontaminace ID-Diluentu 2 Typy transformace ery Polyaglutinabilita ery (3) • Další faktory, které se podílí na zjišťovaných rozdílech v reakci transformovaných ery: • stárnutí ery stupeň zředění normálního lidského séra přítomnost a působení organických rozpouštědel, která se používají při výrobě diagnostik k určení KS 43 • • • • 39 Polyaglutinabilita ery (2) 1. Je kvantitativně proměnný jev, závisí na stupni transformace 2. Charakteristickým rysem může být tzv. „aglutinace smíšeného pole“ pozorovaná na ID-Kartách jako dvojí populace ery 3. Lze pozorovat rozdílné výsledky 4. Poměr aglutinovaných a neaglutinovaných ery může být proměnlivý při vyšetření téže osoby, ale odebrané v jiném časovém úseku - Může vést k nesprávnému stanovení skupinových systémů na ery Poznámka: pH pod 7 (pH 6,5) zvyšuje reaktivitu anti-M a snižuje reaktivitu pro Rh, Fy, Jk a MNS systémy 38 9. Polyaglutinabilita ery (T-Tn aktivace) - Je stav, kdy jsou ery narušeny takovým způsobem, že jsou aglutinovány velkou většinou liských sér AB0 kompatibilních • • • Získaný antigen B a vliv pH na jeho detekci • Běžně akceptované pH pro reakci antigenu a protilátky je okolo 7 • Při pH monoklonálních diagnostik okolo 7 reaguje „získaný antigen B“ pozitivně a pacient A1 se jeví jako AB • Při pH 6,0 tzv. „získaný antigen B“ nereaguje • Pro detekci antigenu B AB0 systému je nutné používat anti-B, které nedetekuje získaný antigen B • ID-Karty nedetekují získaný antigen B Pacienti A1 se falešně jeví jako AB. Lze pozorovat dvojí populaci ery. Možný výskyt získaného antigenu B je u pacientů: • s CA tlustého střeva • u pacientů s infekcí, kdy se deacetylačním účinkem bakteriálních enzymů mění imunodominantní cukr KS A acetyl-galaktosamin na galaktosamin - základní strukturu galaktosy, která je charakteristická pro KS B Pacient s CML KS B Rh– s částečnou ztrátou antigenu B T – způsobena aktivitou bakteriálních enzymů, je charakteru přechodného. Pozorována snížená reaktivita antigenu H u osob KS 0 a antigenu A u KS A. Enzymy poškozují receptory T na T transformovaných ery. Tk - způsobena aktivitou bakteriálních enzymů, je charakteru přechodného. Enzymy aktivují receptory Tk na Tk transformovaných ery. Tn – spojena s některými poruchami hematologickými a má trvalejší charakter. Cad – je dědičného charakteru. Tyto ery mají současně silně exprimovaný antigen Sda . K silné aglutinaci s většinou normálních lidských sér dochází proto, že ve většině sér je přítomna protilátka anti-Sda která se může uplatnit vždy jen s ery se silnou expresí antigenu Sda. Th transformace VA transformace (může být s depresí antigenu H). 44 • Při práci na analyzátoru Techno byla pozorována dvojí populace ery v denní kontrole kvality při testování kontrolní plazmy s protilátkou: anti-Fya a ery Fy (a-,b+) anti-D a ery D- • • Jako příčina byla zjištěna kontaminace ID-Diluentu 2. Erytrocyty, které byly transformovány působením bakteriálních enzymů vykazovaly pozitivní reakci. Zbývající erytrocyty vytvářely sediment na dně mikrozkumavek. Po dekontaminaci analyzátoru – správné výsledky. Citlivost ery se může lišit (stáří, složení dilučního roztoku atp.). S tímto jevem se můžeme setkat i při manuálním testování. • • • 45 5 před dekontaminací po dekontaminaci 46 analyzátor Techno před a po dekontaminaci 47 PAT před dekontaminací PAT po dekontaminací 49 PAT - analyzátor Techno před a po dekontaminaci 50 10. Mozaicismus Poznámka Při práci na ID-Kartách s polyklonálními diagn. se ery ředí ID-Diluentem 1 (bromelinem). V těchto případech je nutno opakovat typování antigenů na ery na ID-Kartách s monoklonálními diagnostiky, kde se ery ředí ID-Diluentem 2 (LISS). 52 51 Mozaicizmus Somatický: vzniká díky mutaci v somatické (tělesné) buňce a nepřenáší se na potomstvo Mozaicismus představuje dvě nebo více buněčných linií s odlišným genotypem v jednom organismu. V případě polyaglutinability ery nebo výskytu protilátek proti enzymům mohou vznikat nejasné výsledky. 48 Všechny buněčné linie ale pochází z původně jedné zygoty (vzniká splynutím pohlavních buněk při oplození). 53 Germinální: vzniká díky mutaci v germinální (zárodečné) buněčné linii a může se přenášet na potomstvo 54 6 Mozaicizmus Rh při myeloproliferativních onemocněních Mozaicismus pac. S.M. (1) A1 CCDee + B ccddee Mozaicismus Rh . u polycythaemia vera Myoeloproliferativní choroby, mezi které patří především polycytémie se vyznačují poruchou pluripotentní kmenové buňky a abnormální proliferací erytrocytové, granulocytové a megakaryocytové řady. • • • • Primární polycytémie – polycythaemia vera • zvýšený objem cirkulující krve • zvýšená viskozita krve KS B Rh+ fenotyp CcD.ee zvýšená viskozita mozaicizmus: s anti-D s anti-C • Hb nad 170g/l, htk nad 0,55 l/l, počet ery nad 6,0 x 10 na 12/l (normální hodnoty: Hb 120-160 g/l, htk 0,36-0,46 l/l, počet ery 3,8-5,5 x 10 na 12/l) 55 Mozaicismus pac. S.M. (2) A1 CCDee + B ccddee 56 .Mozaicismus 57 11. Chimérismus pac. S.M (3) • Podstatou chimérismu je přítomnost dvou nebo více buněčných linií v jednom organismu, které ale pochází z více původních jedinců A1 CCDee s anti-A1 pozitivní s anti-H negativní + B ccddee s anti-A1 negativní s anti-H negativní 58 59 Chimérismus Rh Chimérismus AB0 Rh Radiační chimérismus pacient KS 0 Rh+ • Představuje přítomnost dvojí populace buněk po TKD a vzniká jako důsledek intenzivní chemoterapie a ozáření před TKD 60 pacient: Cwcee K- dárce KD KS B Rh+ dárce KD: CwcEe, K- • Dlouhodobý chimérismus je provázen nebezpečným „druhotným onemocněním“, vyvolaným reakcí štěpu proti hostiteli (GVHD), kterou zahajují T- lymfocyty KD dárce • Klinicky se rozlišuje reakce štěpu proti hostiteli: - akutní reakce s orgánovým poškozením - chronická reakce s imunitní nedostatečností 61 62 poznámka: polyklonální anti-C reaguje též s antigenem Cw 63 7 Chimérismus arteficiální Závěrem • Pouze metoda sloupcové gelové aglutinace dokáže odhalit a rozlišit reakci dvojí populace ery a umožní snadný výběr kompatibilní krve k transfuzi. KS A Rh+ s β a KS O Rhbez alfa 1 a 2 a zeslabená β Protilátky: NAT negativní 64 65 66 67 68 69 70 71 72 8 Děkuji za pozornost 73 74 9
Podobné dokumenty
Krevní skupiny a komplikace krevního převodu
• Provést odběr krevních vzorků pacienta ze účelem přešetření PR na příslušném TO • V případě úmrtí pacienta v souvislosti s transfuzí nařídit zdravotní pitvu
VíceLaboratorní metody v soudním lékařství
ml protilátky anti-A do zkumavky č. 2, a v dalších krocích odbereme postupně 0,1 ml a přeneseme do dalších zkumavek. Po roztitrování přidáme 0,1 ml příslušných krvinek (v tomto případě A). Zjistili...
VícePrenatal diagnosis of genetic diseases
která způsobila vážné problémy předchozímu dítěti díky zděděné nebalancované formě, je rekurentní riziko pro další potomky mezi 1-2% a 15-20%. Výše rizika závisí na přirozeném rozdělení chromozomů ...
VíceFormát PDF - Doc. MUDr. Marek Ľubušký Ph.D.
K antigen (K1) patří spolu s antigeny v systémech AB0 a Rh k nejvíce imunogenním antigenům [2]. Incidence aloimunizace antigenem K (K1) byla v našem souboru 1,2 ‰ (55/45 435). Předpokládáme-li v Če...
VícePN 2016-1 - Česká nefrologická společnost
zu, doplnění cirkulujícího volumu a substituci krevními derivá‑ ty (erytrocyty, čerstvě zmražená plazma a také trombokoncent‑ ráty při poklesu krevních destiček na hodnotu nižší než 60/nl). Bylo‑...
Vícemastazyme adeno cz
Do každé jamky je přidán TMB substrát a v reakci mezi ním a enzymem peroxidázou vznikne stabilní modrý chromogen. Reakce s následnou tvorbou zabarvení je zastavena po 20-ti minutové inkubaci při po...
VíceRegistrační listy
převážně v příčné pozici vůči jejímu průběhu, se zachycením průměru a lumen žíly jednak v klidu, jednak při kompresi. Pokud je dosaženo plné komprese lumen žíly, je v dané lokalitě floridní žilní t...
Více