Přednáška 6: Neuropřenašeče: neuropeptidy a

Přednáška 6: Neuropřenašeče: neuropeptidy a puriny
V této přednášce se zastavíme u dvou tříd signálních molekul, které byly objeveny až
po neurotransmiterech „standardních“. Podobně jako např. acetylcholin, u neuropeptidy mají
v CNS spíše modulační úlohu. I když víme, že fungují jako neuropřenašeče, mnoho jejich
dalších funkcí, popsaných u jiných neurotransmiterů, zatím zůstává neobjasněno. Jakkoliv to
jsou především látky centrálně zapojené do intermediátního metabolismu, jsou koncentrovány
na určitých typech synapsí a po patřičném stimulu se z ní uvolňují, aby vyvolaly patřičnou
odpověď. Výrazně modulují účinky různých látek, např. kofeinu.
CHARAKTERISTIKA NEUROPEPTIDŮ
Poté, co vědci objevili, že i neuropeptidy mohou sloužit jako signální molekuly,
nastala v neurofamakologii menší revoluce. Farmaceutický průmysl v nich a v jejich
receptorech viděl nové cíle různých látek, které by mohly ovlivnit celou řadu neuronálních
funkcí. Objev neuropeptidů vedl také k získání nových poznatků o normálním fungování
synapse. Přes to, že o signální roli neuropeptidů se ví až asi 30 let, jejich farmakologie je však
stále poměrně omezená.
Peptidy jsou malé molekuly složené z aminokyselin navzájem kovalentně propojených
peptidickou vazbou. Termín neuropeptidy je rezervován pro malé proteiny, které mají
neurotransmiterům podobnou funkci v rámci nervového systému. Jiné signální molekuly jako
růstové faktory nebo cytokiny jsou od neuropeptidů tradičně odlišovány, jakkoliv se jejich
funkce mohou částečně překrývat. Některé neuropeptidy zprostředkovávají signalizaci jen
v rámci CNS, jiné jsou využívány i na periferii. Kromě jejich neurotransmiterové funkce jsou
některé neuropeptidy neurony uvolňovány přímo do krevního řečiště a slouží jako hormony.
Jiné jsou jako hormony uvolňovány endokrinními žlázami. Neuropeptidů je popsána zatím asi
stovka a mnoho jich ještě jistě bude objeveno. Oproti „klasickým“ neuropřenašečů, jsou
syntetizovány jiným způsobem a vykazují i další odlišné charakteristiky.
Peptidy se tradičně dělí do skupin podle oblastí, ve kterých byla jejich funkce poprvé
popsaná, nebo podle svého účinku. Tato klasifikace je ovšem lehce nepřesná, např. ACTH a
α-MSH se nachází nejen v neurohypofýze, ale i non-neuroendokrinních neuronech a mají i
non-neuroendokrinní funkce. Stejně tak CRF účinkuje v mnoha oblastech mozku. Příklady
jednotlivých skupin neuropeptidů a jejich koexistence s „klasickými“ neuropřenašeči máte
uvedeny v tabulkách. Berte ovšem prosím tyto tabulky spíš jako „návod ke třídění“, než jako
striktní klasifikaci neuropeptidů.
Noradrenalin
galanin
enkephalin
neuropeptid Y
GABA
somatostatin
cholecystokinin
neuropeptid Y
ACh
VIP
substance P
Dopamin
cholecystokinin
neurotensin
Adrenalin
neuropeptid Y
neurotensin
Serotonin
TRH
substance P
enkephalin
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
α, β, γ - endorphin, dynorphin, enkephaliny
vasopresin, oxytocin, neurophysiny, thyrotropin
(TSH), prolaktin, luteinizační hormon (LH), FSH,
ACTH, růstový hormon (GH), α-melanocyty
stimulující hormon (α-MSH)
kortikotropin-relaeasing faktor (CRF),
gonadotropin-releasing hormon (GnRH), hormon
uvolňující růstový hormon (GHRH), somatostatin,
thyrotropn-releasing hormon (TRH)
substance P, neurokinin A (NKA, = substance K,
SK), neurokinin B (NKB, = substance P, SP),
kassinin, eledosin
gastrin, cholecystokininy (CCKs), galanin, gastrinuvolňující protein (GRP), neurotensin
opioidní peptidy
neurohypofysální peptidy
hypothalamické peptidy
tachykininy
gastriny (gut-brain peptidy)
od glukagonu odvozené
od pankreatických polypeptidů odvozené
jiné
VIP (vasoactive intestinal polypeptide), glukagon
neuropeptid Y (NPY), insuln
bombesin, bradykinin, angiotensin, CGRP
(calcitonin gene-related peptide), neuromedin K
Prekurzorové proteiny
Mnoho klasických nízkomolekulárních neuropřenašečů vzniká krokovou
enzymatickou reakcí z nějakého aminokyselinového prekurzoru, který je do mozku často
dopraven přes hematoencefalickou bariéru z cirkulace. Oproti tomu syntéza neuropeptidu
vyžaduje transkripci DNA, její přepis do mRNA a tvorbu proteinu. Proteinový produkt
uvolněný z ribosomu pak není ještě přímo signální molekulou, ale velkým prekurzorovým
polypeptidem vyžadujícím posttranslační úpravy. Typickým příkladem je vznik a zpracování
prepropeptidu proopiomelanokortinu (POMC). POMC je prekurzorem mnoha aktivních
peptidů a jeho produkty zahrnují např. adrenokortikotropní hormon (ACTH), α-melanocytystimulující hormon nebo β-endorfin. Prepropeptid obsahuje N-koncovou signální sekvenci,
která nasměruje nově vzniklý protein z ribosomů do lumen endoplasmatického retikula (ER).
Po transportu do ER je signální sekvence odštěpena signální peptidasou a vzniká propeptid.
Propeptid je následně přenesen do Golgiho aparátu a uskladněn do velkých denzních váčků,
ve kterých podléhá dalšímu zpracování. V nich je z těla buňky transportován na synapsi.
Proteolytické zpracování
Propeptidové prekurzory jsou konvertovány na aktivní neuropeptidy sérií kroků
zahrnujících štěpení konvertasami a modifikaci na specifických aminokyselinových zbytcích.
Během tohoto procesu endoproteasy rozpoznávají a štěpí dibasické aminokyselinové páry
(Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg nebo Arg-Lys). Vzniklé peptidy jsou dále zpracovány
exopeptidasami a různými modifikujícími enzymy. Fenomén zpracování prohormonů
konvertasami byl popsán roku 1967 Donaldem F. Steinerem během studia vzniku insulinu.
Dva klíčové enzymy, účastnící se zpracování POMC a dalších prekurzoruů, jsou
konvertasa prohormonů 1 a 2 (PC1 a PC2). PC1 a PC2 náleží do velké rodiny
prohormonových konvertas, která zahrnuje (zatím) devět členů. Bývají také označovány
PCSK1-9, přičemž PSK1 = PC1 a PCSK2 = PC2. Tyto enzymy postupují krokově, nejprve
rozštěpí v závislosti na typu tkáně patřičný dibasický pár a následně pokračují v dalších
štěpeních. PC1 a PC2 štěpí různými způsoby POMC a stejnou proteolytickou aktivitu
vykazují na proinsulinu a proglukagonu v pankreatu. PC2 hraje menší roli než PC1 v případě
2
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
proinsulinu než proglukagonu, PC1 je
naopak pro štěpení glukagonu důležitější a
méně využívaná pro štěpení proinsulinu než
PC2. Výsledkem proteolytické aktivity PC1
i PC2 na POMC jsou malé peptidy, jejichž C
nebo N konce obsahují lysinové nebo
argininové
zbytky.
Jiný
enzym,
karboxypeptidasa E, pak odstraňuje Ckoncové zbytky. Zatím neidentifikovaná
aminopeptidasa odstraňuje zbytky Nkoncové.
Mnoho neuropeptidů je po štěpení
konvertasami a peptidasami dále ve dvou
krocích upravováno. Může docházet k Nkoncové acetylaci, které často reguluje
aktivitu neuropeptidu – příkladem je zesílení
biologické aktivity α-MSH jeho acetylací.
Naopak, pokud je acetylován β-endorfin,
jeho aktivita výrazně klesá. Peptidy
obsahující C-terminální glycin procházejí αamidací pomocí enzymu peptidglycin αamidující monooxygenasy (PAM). Tento
amidační krok podstupuje např. α-MSH.
Vícekrokový mechanismus, kterým z prepropeptidů vznikají propeptidy, z těch
peptidy a jejich aktivita je dále modifikována, může být zajímavě farmakologicky ovlivněn.
Konvertasy prohormonů antagonisticky ovlivňují mnohé malé peptidy. Inhibitory angiotensin
konvertujícího enzymu (ACE), jako např. captopril, jsou klinicky využívány v léčbě
hypertenze (angiotenzin fyziologicky zvyšuje cévní tonus) nebo diabetické nefropatie.
Diversita neuropeptidů
Jediný propeptid, jakým je např. POMC, může dát vzniknout několika bioaktivním
neuropeptidům. Jednotlivé kroky proteolytického štěpení jsou tkáňově specifické: např.
v předním laloku podvěsku mozkového je POMC typicky konvertován na ACTH.
V intermediátním laloku této žlázy a v neuronech produkujících POMC jsou hlavními
koncovými produkty α-MSH a β-endorfin. Produkty typické pro tu kterou tkáň podmiňuje
tkáňově specifická exprese různých konvertas prohormonů. Značná část úprav neuropeptidů
se navíc děje ve váčcích, a protože konvertasy jsou vysoce citlivé na pH a Ca2+, závisí jejich
aktivita i na změnách těchto parametrů uvnitř váčků.
K diversitě neuropeptidů přispívá i jejich alternativní sestřih. Prvními neuropeptidy, u
kterých se zjistilo, že jsou produkovány alternativním sestřihem, byly kalcitonin a
kalcitoninovému genu příbuzný peptid (calcitonin gene-related peptide, CGRP). Tachykininy
také produkují několik zástupců své rodiny alternativním sestřihem dvou
preprotachykininových genů. Jeden z genů je alternativně sestřižen nejméně ve tři
prepropeptidy, které dále posttranslačně produkuji pět rozdílných bioaktivních peptidů včetně
neurokininu A a substance P.
Skladování a výlev
3
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
Synaptický výlev neuropeptidů se od výlevu nízkomolekulárních přenašečů poněkud
liší. Oproti např.
acetylcholinu
neuropeptidy
vznikají
transkripcí,
translací a dále
jsou upravovány
posttranslačně.
Tyto
procesy
probíhají
v
somatu i axonu.
Další odlišností
je velikost a typ
váčků,
ve
kterých
jsou
skladovány:
neuropeptidy
jsou obsaženy ve
velkých
denzních
vesikulech
skládaných
v Golgiho
komplexu
a
transportovanýc
h na synapsi,
zatímco
jiné
(nízkomolekulár
ní)
přenašeče
jsou skladovány
v malých
světlých váčcích
sestavovaných
v terminále.
Mnoho neuronů
obsahuje
v synaptickém
zakončení OBA typy váčků. Neuropeptidy jsou poměrně typicky kolokalizovány s
„klasickými“ neuropřenašeči; např. v podstatě každý serotoninergní nebo katecholaminergní
neuron obsahuje ve váčcích jeden či více detekovatelných neuropeptidů.
Ačkoliv tyto dva odlišné typy váčků se mohou společně nacházet v jednom nervovém
zakončení, uvolňovány jsou odlišným mechanismem a často za jiných fyziologických
podmínek a potřeb. Malé denzní váčky (ACh a spol.) jsou sdruženy do klastrů v aktivních
zónách a uvolňovány po rychlém a přechodném depolarizací navozenémvzestupu hladiny
Ca2+. K výlevu neuropeptidů je potřeba delšího a většího zvýšení hladiny Ca2+ v nervovém
zakončení, aby vápník mohl dodifundovat v dostatečné koncentraci až k jejich váčkům.
Jinými slovy, k výlevu non-peptidového neuropřenašeče typu katecholaminů stačí i jediný
akční potenciál, zatímco k výlevu neuropeptidů je potřeba salva akčních potenciálů. Typický
4
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
vzorec vzruchové aktivity může tedy vést k preferenčnímu výlevu jednoho nebo druhého typu
neurotransmiteru, případně za sebou . mohou následovat.
Funkční význam kolokalizace klasických neuropřenašečů s neuropeptidy není zatím
zcela uspokojivě objasněn. Podle některých prací neuropeptidy modulují postsynaptický
účinek klasických neuropřenašečů, a to buď stimulačně nebo inhibičně. Vzhledem k tomu, že
k výlevu neuropeptidů je potřeba delší vzruchová aktivita, mohou pozitivní i negativní
zpětnou vazbou regulovat aktivitu silně stimulovaných zakončení.
Neuropeptidová signalizace „na dálku“
Jednou z nejzajímavějších položek, ve kterých se neuropeptidy liší od klasických
neuropřenašečů, je jejich osud po výlevu do synaptické štěrbiny. Zatímco například dopamin
je velice rychle zpětně vychytáván do terminály a podobným způsobem je ze synaptické
štěrbiny odstraněna s výjimkou acetylcholinu většina
klasických neuropřenašečů,
neuropeptidy tak rychle ze synaptické štěrbiny odstraňovány nejsou. Jejich deaktivace probíhá
štěpením endoproteasami a exoproteasami lokalizovanými na extracelulárních membránách
(nezaměňovat s konvertasami!)
Peptidy také mohou urazit značnou vzdálenost, než doputují ke svým receptorům;
proto také ostatně lokalizace mnoha neuropeptidů neodpovídá lokalizaci jejich receptorů.
Např. substance P je vysoce koncentrována v substantia nigra, ale její receptory v této
struktuře téměř chybí, zatímco v jiných částech mozku jsou detekovány hojně.
Většina receptorů pro neuropeptidy je spřažena s G-proteiny. Stejně jako receptory pro
klasické neuropřenašeče, i receptory pro neuropeptidy vykazují různé subtypy, nicméně tyto
receptory mají pro své ligandy podstatně větší afinitu než receptory pro neuropřenašeče
„klasické“. Např. acetylcholinový receptor váže acetylcholin s afinitou 100 µM – 1 mM,
zatímco neuropeptidové receptory mají afinitu ke svým ligandům v řádu nanomolů.
Interakce mezi neuropeptidy a jejich receptory je poměrně komplexní. Představte si
třeba molekulu noradrenalinu – jen těch několik atomů, které obsahuje, může iontově nebo
stericky interagovat s patřičným vazebným místem na odpovídajících receptoru, a modelování
této interakce není extrémně obtížné. Teď si zkuste představit interakci neuropeptidu Y
(NPY) o délce 36 aminokyselin – jak se takové molekula vůbec „vejde“ do vazebného místa
receptoru spřaženého s G-proteinem? Která konformace bude mít nejvyšší afinitu pro vazbu,
který aminokyselinový zbytek je pro vazbu kritický? A z kterého farmakologického pohledu
mohou být připravovány nové látky, které budou dané vazebné místo antagonizovat nebo na
něj budou působit agonisticky? Tyto otázky není lehké zodpovědět a v praxi se zatím
pohybujeme hlavně v rovině modfikovaných peptidových analogů. Syntetické peptidy jsou
degradovány různými peptidasami a nemohou procházet skrze hematoencefalickou bariéru,
takže jsou užitečné v podpůrné léčbě poruch zasahujících CNS.
Receptorové typy a subtypy
Neuropeptidové receptory jsou příliš početné na to, abychom se jim věnovali
individuálně, takže si je rozdělíme do jednotlivých rodin. Jejich přehled máte v následující
tabulce. Některé neuropeptidy (TRH) se sice váží jen na jediný receptor, ale mnoho jiných
(např. somatostatin) obsazuje až pět receptorových typů.
V rámci každé receptorové rodiny vykazují jednotlivé subtypy receptorů své vlastní
vzorce exprese v CNS i PNS. Např. dva receptory pro kortikotropin-uvolňující faktor
(corticotropin-releasin factor, CRF), označované jako CRF1R a CRF2R, svou expresí alterují:
tam, kde se vyskytuje jeden, není téměř detekovatelný ten druhý. Vzhledem k tomu, že se liší
i afinitou k ligandům (CRF1R stejně silně váže CRF i příbuzný peptid urocortin, zatímco
5
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
CRF2R má vyšší afinitu k urocortinu než CRF), má tato rozdílná distribuce fyziologický
význam.
Tak jako CRF receptor, i další neuropeptidergní receptory mohou vázat víc než jeden
peptid. Tato vlastnost je typická zejména pro receptory melanokortinové rodiny – MC1-5
receptory. Každý z těchto receptorů může s různou potencí aktivovat ACTH, α-MCH a γMCH. MC4 receptor může být antagonizován také vzdáleně příbuzných endogenním
peptidem nazvaným agouti-related peptid. Tento receptor byl prvním receptorem, u kterého
byl v mozku nalezen endogenní agonista i antagonista.
Poměrně dlouho panovalo přesvědčení, že specifita receptoru pro ten který peptid je
dána výhradně vnitřními vlastnostmi receptoru – mnohé domény na extracelulárních i
transmembránových doménách byly známy jako specifická vazebná místa pro určité ligandy.
Toto přesvědčení vzalo za své až s objevem proteinů modifikujících aktivitu receptoru
(receptor activity modifying proteins, RAMPs), které např. ovlivňují transport CGRP
receptoru do membrány a jeho glykosylaci. RAMP také podmiňují afinitu GRPR receptoru
k příbuznému proteinu adrenomedullinu. Zda RAMPs regulují funkce většího počtu receptorů
spřažených s G-proteinem zatím není známo.
Peptidergní receptory se nacházejí nejen na synapsi, ale v menší míře i na plasmatické
membráně axonů, těl neuronů i dendritů. U některých subtypů je možná jejich extrasynaptická
lokalizace primární. Po delší vazbě ligandu na tyto receptory spřažené s G-proteiny jsou
receptory internalizovány a následně buď recyklovány, nebo degradovány. Existují ovšem i
peptidergní výjimky: receptor pro neurotensin je i s navázaným ligandem transportován do
těla neuronu a byl prokázán poblíž jádra. Jakkoliv zatím tato hypotéza není potvrzena, zdá se
tedy, že peptidergní receptory by mohly hrát i roli v kontrole genové transkripce.
Funkce neuropeptidů
Funkce většiny malých neuropřenašečů byla popsána poměrně záhy, neboť existovalo
množství agonistů a antagonistů, kteří mohli mimikovat jejich působení, nebo naopak
simulovat jejich nedostatek. V případě neuropeptidů je ovšem množství těchto
farmakologických nástrojů poněkud limitované a navíc jen někteří z peptidergních agonistů a
antagonistů procházejí přes hematoencefalickou bariéru.
Podobně nesnadné je stanovit tkáňovou koncentraci neuroppetidů. Například, pokud je
neuronální aktivita inhibována, může koncentrace neuropeptidů v tkáni růst, protože
neuropeptidy se v „tichých“ buňkách akumulují. A naopak, vyšší aktivita neuronů může vést
až ke tkáňovému vyčerpání neuropeptidů. Jakkoliv je tedy nesnadné přesně určit, zda vybraný
typ zásahu vyvolá vzrůst nebo pokles hladiny neuropeptidů, mikrodialýza alespoň umožňuje
přesně a přímo změřit extracelulární koncentrace neuropeptidů ve vybraných mozkových
oblastech.
Vzhledem k problémům s měřením hladin neuropeptidů je většina psrací zabývajících
se funkcí neuropeptidů postavena na přímé injikaci neuropeptidů do specifických oblastí
mozku či míchy a na pozorování fyziologických a behaviorálních změn tímto podáním
vyvolaným. Injikované dávky jsou často miligramové, což je vzhledem k nannomolové afinitě
neuopeptidergních receptorů nefyziologické, nicméně takto byly popsány první účinky
neuropeptidů. Pozorování zpřesnila až molekulární biologie a „vypínání“ genů pro jednotlivé
neuropeptidy – objasnila nová fakta a naštěstí potvrdila ta stará :)
6
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
Vybrané peptiderdní receptorové typy a sybtypy
7
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
JEDNOTLIVÉ SYSTÉMY NEUROPEPTIDŮ
Opioidní peptidy
Opiodní peptidy jsou farmakologicky jedny z nejdůkladněji studovaných látek –
primárně kvůli svým silným analgestickým vlastnostem, ale také kvůli svému působení proti
kašli (antitussika) a průjmu (antidiarhoetika). Např. morfin byl užíván už v 19. století. Velká
spotřeba opiátových analgetik spolu s rizikem vzniku závislosti na nich vedla k vývoji
opiátových farmak, která by závislost nezpůsobovala. Ani dnes sice nelze oddělit nejúčinnější
analgetické vlastnosti opiátů od těch, které navozují závislost, výsledkem studia nicméně bylo
přinejmenším objevení malých, lipofilních molekul jako naloxon a naloxetron. Naloxon se
užívá v léčbě předávkování opiáty a nalotrexon, jehož působení je déledobější, se využívá při
léčbě závislostí na opitátech a při léčbě alkoholismu.
Termín opioidní je spojen s endogenními peptidy, které vykazují podobnou
farmakologii jako opiáty, zatímco termín opiáty odkazuje na morfin a jemu příbuzná
nonpeptidová analoga.
Všechny známé opiodní peptidy jsou produkty tří velkých prekurzorových proteinů.
Každý z nich je kódován vlastním genem. Tyto prekurzory jsou
•
•
•
POMC, z něhož jsou odvozeny, β-endorfin a několik nonopiodních petidů,
proenkefalin, z něhož pochází met-enkefalin a leu-enkefalin a
prodynorfyn, který je prekurzorem dynorfinu a jemu příbuzných proteinů.
Ačkoliv jsou syntetizovány z různých prekurzorů, sdílejí opioidní peptidy určité stejné
aminokyselinové sekvence. Velmi často obsahují např. sekvenci čtyřech aminokyselin TyrGly-Gly-Phe na svém N-konci, která bývá následována buď Met nebo leucinem. Morfinu
podobné opiátové alkaloidy z opia pravděpodobně mimikují konformaci N-koncového
tyrosinu endogenních peptidů.
Molekulární klonování potvrdilo existenci tří typů opiodních receptorů: µ, κ a δ. Je
pravděpodobné, že vznikají i jejich podtypy a že µ a δ receptory jsou schopny formovat
heterodimery. Všechny tyto receptory jsou spřaženy s G-proteiny, konkrétně s Gi/o rodinou.
Morfinu podobné opiáty se preferenčně váží na µ receptory, které jsou spojeny se
sestupnými drahami bolesti (periakaveduktální šedá hmota, rostroventrální medulla, thalamus
či zadní kořeny míšní). Vyskytují se i v jiných oblastech mozku (ventrální tegmentum, ncl.
accumbens), kde jsou zodpovědné za zesílený efekt opiátů. µ receptory se také vyskytují ve
striatu (motorická kontrola) a locus coeruleus, ve kterém mohou vyvolávat mnohé somatické
projevy závislosti na opiátech a opiátové abstinence. µ receptory také hrají z opioidních
receptorů nejdůležitější roli v supraspinální analgesii. Vykazují vyskou afinitu
k benzomorfanové třídě opiodních látek, jako je pentazocin.
δ receptory jsou hlavními vzabnými partnery enkefalinů. Tyto receptory se vyskytují
nejen z zadních kořenech míšních, ale i v oblastech mozku, které nejspíše nehrají v nocicepci
žádnou úlohu. Klinické využití agonistů δ receptorů zatím není známo.
Z endogenních opioidních peptidů se β-endorfiny preferenčně váží na µ receptory,
enkefaliny na δ receptory a dynorfin vykazuje nejvyšší afinitu ke κ receptorům. Nicméně tyto
peptidy se neváží jen na receptor, ke kterému vykazují nejvyšší afinitu, ale ke všem
receptorovým subtypům opioidních receptorů.
Zajímavé antiopioidní efekty vykazují látky označované jako nociceptiny nebo
orphaniny. Váží se na receptory spřaženéné s G-porteiny, které vykazují vysokou míru
homologie s receptory opioidními. Zvyšují vnímavost k bolestivým stimulům.
8
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
Kortikotropin uvolňující faktor
Corticotropin-releasing factor (CRF) je peptid o délce 41 aminokyselin, který byl
prvně izolován jako hypothalalmický faktor napomáhající podobně jako vasopressin sekreci
ACTH.Je syntetizován populací neuronů paraventrikulárního jádra hypothalamu, odkud je
uvolňován do portálního spojení s hypofýzou. CRF ale není secernován jen do této portální
cirkulace - neurony paraventrikulárního jádra hypothalamu projkují do různých mozkových
struktur. CRF je syntetizován také mimo hypothalamus, např. v centrálním jádře amygdaly.
CRF uvolňovaný z amygadaly hraje kritickou roli v odpovědi mozku na stres a zřejmě
přispívá i ke vniku pocitů strachu a úzkosti. Částečně je zodpovědný za negativní projevy
odvykacího syndromu závislých jedinců. Může být také zapojen do long-term deprese
v mozečku.
Byly naklonovány dva subtypy CRF receptorů. CRF1 R je široce exprimován v celém
mozku. Jeho antagonisté mohou sloužit jako látky v terapii úzkosti a deprese. CRF2 R je
koncentrován v bočních jádrech septa. Laterální septum je spojeno s emocemi, strachem a
kognitivními funkcemi. Endogenním ligandem CRF2 R je urocortin (a urocortin II, jemu
příbuzný).
Substance P
Substance P, neurokinin A (NKA, dříve označovaný jako substance K) a neurokinin B
(NKB) patří do rodiny tachykininů. Všichni členové této rodiny sdílejí stejnou C-koncovou
sekvenci Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. Substance p a NKA jsou kódovány genem pro
preprotachykinin A a vznikají alternativním sestřihem. NKB je kódován genem pro
preprotachykinin B. Všechny známé tachykininové receptory (s G-proteinem spřažené) jsou
označovány jako NK1, NK2 a NK3 receptory. Substance P vykazuje nejvyšší afinitu k NK1
receptoru, NKA preferenčně váže NK2 receptor a NKB zejména NK3 receptory.
Substance P je předmětem výzkumu už dlouho. V 70. letech se věřilo, že by mohla být
hlavním transmiterem nocicepce. Synapse primárních aferentních noiceptorů zadních kořenů
míšních obsahují značné množství neuropeptidů, z nichž nejhojnější jsou calcitonin generelated peptid (CGRP), substance P a NKA. Substance P je v nocicepčních C vláknech
kolokalizována s glutamátem. Její výlev z velkých denzních váčků vyžaduje silnější stimulus,
než který by stačil pro klasický výlev glutamátu. Substance P se uvolňuje i retrográdně
z volných nervových zakončení nocicepčních neuronů a přispívá k fenoménu neurogenního
zánětu, při kterém interaguje s peptidem bradykininem.
Při studiu myší knock-outovaných pro NK1 receptor nebo gen pro preprotachykinin A
došlo k mnoha překvapením. Tyto myši sice nevykazovaly projevy neurogenního zánětu, ale
jejich nocicepce byla omezena jen v určitých nocicepčních drahách. Žádnou změnu oproti
přirozenému fenotypu např. nevykazovaly v mechanické hypersenzitivitě navozené zánětem.
Deficity v nocicpci vykazovaly jen při aplikaci nocicepčních stimulů se vzrůstající intenzitou.
Roli substance P v nocicepci tedy evidentně mohou přebírat i jiné nocicepční neuropřenašeče.
Substance P a NK1 Rs se nacházejí v amygdale. Antagonista NK1 Rs v pokusech
prováděných na mládětech morčat izolovaných od matky snižoval zvukové projevy jejich
stresu. Na základě tohoto typu preklinických studií začali být antagonisté NK1 Rs testováni
jako antidepresiva a anxiolytika. Zdají se být slibní i v léčbě chemotarapií navozené nausey,
kdy oproti antagonistům 5-HT3 receptorů (odasetron) blokují nejen časnou, ale i pozdní fázi
tohoto fenoménu.
9
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
Neurotensin
Neurotensin (NT) je peptid o délce 13 aminokyselin, vznikající z prekurozru
obsahujícího také peptid neurotensinu podobný, velký 6 aminokyselin. NT je exprimován
v mozku, nadledvinách a střevu, a to v mírně odlišných formách podle své tkáňové distribuce:
jeho C-konce obsahuje alternativně jednu ze tří Lys-Arg sekvencí, které jsou podle typu tkáně
rozdílně štěpeny. V mozku z prekurzoru vzniká NT a neuromedin N, zatímco v nadledvinách
vzniká delší forma neuromedinu N, neurotensin a jeho o něco delší štěpný produkt. Ve střevu
vzniká NT a delší forma neuromedinu N.
Jsou známy dva typy receptorů pro neurotensin : NTS1 a NTS2 receptory. NTS1
mRNA je produkována v substantia nigra, ale ne ve striatu. Kupodivu, vlastní protein NTS1
receptorů se na dopaminergních terminálách striata nachází. NT tak zřejmě moduluje
dopaminergní transmisi. Exprese mRNA pro neurotensin je ve striatu vyvolaná antaginisty D2
receptorů, z nichž mnohé souží jako antipsychotika a nebo psychostimulační drogy (kokain,
amfetamin).
Byl naklonován i NTS2 receptor, ale jeho úloha zatím zůstává nejasná.
Neuropeptid Y
Neuropeptid Y (NPY) je jedním z řady navzájem příbuzných peptidů, které tvoří
rodinu pankretaických polypetidů. Jejími dalšími členy jsou pankreatický polypeptid (PP) a
polypeptid YY (PYY). NPY je nejhojnějším neuropeptidem mozkové kůry. Koncentrován je
i zadních kořenech míšních a v hypothalamu. V symaptiku i v CNS bývá kolokalizován
s noradrenalinem.
NPY a jemu příbuzné peptidy se váží na receptory označované Y1 až Y6, které
vykazují různou afnitu pro NPY, PP i PYY. Tyto receptory se nacházejí persynapticky i
postsynapticky v různých oblastech mozku. Aktivace Y1 receptoru zřejmě souvisí s poklesem
úzkostného chování, asi na úrovni amygdaly a kůry mozkové. Agonisté Y1 receptoru by
mohla být slibná anxiolytika, a vykazují i určitý antinocicepční efekt. Naproti tomu aktivace
Y5 receptoru vede ke zvýšení příjmu potravy (nejspíše na úrovni hypothalamu). Antagonisté
Y5 receptorů by tedy mohli být úspěšní v léčbě obezity.
PURINY
Puriny nejsou jen stavebními kameny RNA a DNA, metabolickými kofaktory nebo
druhými posly jako cAMP nebo cGMP. Hrají také důležitou roli v signalizaci mezi neurony.
Biochemie
Puriny jsou dusíkaté heterocykly tvořené kondenzovaným pyrimidinovým a imidazolovým
kruhem. V purinergní transmisi jsou využívány nukleosidové a nukleotidové deriváty
samotného purinu. V nukleových kyselinách jsou využívány dva purinové deriváty, adenin a
guanin. V rámci signalizace mezi neurony jsou využívány hlavně adenosin a ATP. Jim
příbuzný je adenindinukleotid (ApnA), což je molekula sestávající ze dvou adenosinů
kovalentně spojených řetězcem dvou až šesti fosfátů.
Zdá se, že na neurotransmisi se do určité míry mohou podílet i nukleotidové deriváty
pyrimidinového typu.
10
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
adenin
purin
Skladování a výlev
Navzdory strukturní podobnosti, adenosin a ATP vykazují i odlišné vlastnosti.
ATP a ApnA jsou skladovány v malých synaptických váčcích a uvolňovány
exocytosou navozenou depolarizací a vtokem Ca2+ do zakončení podobně jako jiné
neuropřenašeče. Často jsou také detekovány ve stejných synaptických váčcích na stejné
synapsi.
Oproti nim je adenosin uvolňován z nonvesikulárních cytoplasmatických zásob. Mimo
cytoplasmu jej mohou uvolňovat obousměrné nukleosidové transportéry. Případně může
vznikat rovnou v synaptické štěrbině, kam je uvolňován ve formě ATP a během sekundy
metabolizován: na membráně navázaná ectodiphosphohydrolasa konvertuje ATP na ADP a
AMP. AMP je rozpustnou či s membránou asociovanou ecto-5´-nukleotidasou konvertován
na adenosin. Výlev ATP tedy rovněž může být vydatným zdrojem extracelulárního adenosinu.
ApnA je hydrolyzován pomaleji a zůstává v synaptické štěrbině delší dobu.
Purinové transportéry
Nukleosidové transportéry jsou k membráně vázané proteiny sloužící k přenosu
purinových a pyrimidinových nukleosidů dovnitř a ven z mnoha typů buněk. Liší se svou
substrátovou specifitou (jsou purin- nebo pyrimidinselektivní) a termodynamickými
vlastnostmi. Některé koncentrují nukleosidy v buňce v závislosti na Na+. Jiné transportují
nukleosidy ve směru jejich koncentračního gradientu. Farmakologicky bylo odlišeno nejméně
sedm nukleosidových transportérů, z nichž čtyři byli klonováni. Jejich struktura funkce příliš
známa není, ale jejich farmakologie zahrnuje některé terapeuticky využitelné látky. Patří
mezi ně několik chemoterapeutik nádorového bujení (gemcitabin) a silná antivirotika jako
zidovudin (AZT) užívaný v léčbě AIDS. Jsou to obvykle nukleosidové analogy. Potenciálně
by se mezi nimi mohla najít i farmaka užitečná v léčbě neuropsychiatrických poruch.
Purinové receptory
Purinové receptory tvoří relativně velkou a různorodou skupinu proteinů, dělenou do
dvou hlavních podskupin, označovaných jako P1 a P2 receptory.
P1 receptory jsou také známy jako adenosinové receptory A1, A2 a A3. Váží adenosin a
jeho analoga a jsou spřaženy s G-proteiny. Byly vyklonovány čtyři subtypy. A1 subtyp je
nejrozšířenější v mozku a v páteřní míše a vykazuje nejvyšší afinitu k adenosinu. Za jeho
aktivací stojí pravděpodobně anxiolytické, antikonvulsační, analgestické a sedační účinky
adenosinu. Antagonisté A1 receptoru vyvolávají stimulační efekty. V nižších dávkách např.
zvyšují pozornost (kofein), ve vyšších dávkách vyvolávají pocity úzkosti a podráždění.
11
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
A2 receptorů byly vyklonovány dva podtypy, A2A a A2B, které mají k adenosinu
poněkud nižší afinitu než A1 receptor. A2B receptory jsou široce rozšířené v celém lidském
těle, ale jejich exprese v mozku a páteřní míše je nízká. Oproti nim jsou A2A receptory vysoce
koncentrovány v zadním striatu, ncl. accumbens a čichovém laloku - třemi mozkvými
oblastmi s dopaminergní inervací. Interakce dopaminu a adenosinu jsou v těchto oblastech
popsány. Ve striatu agonisté A2A receptorů inhibují odpovědi navozené D2 receptory a naopak
antagonisté je mimikují – i to přispívá se stimulačním účinkům kofeinu a jiných
methylxanthinů. Inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné v terapii
Parkinsonovy choroby.
A3 receptor je v nízkých hladinách exprimován v mozku a jeho funkce zatím není
dobře popsána. Ze všech adenosinových receptorů vykazuje k adenosinu nejnižší afinitu.
Zatímco A1 a A2 receptory váží adenosin s nanomolární afinitou, A3 receptor potřebuje
mikromolární koncentrace.
P2 receptory zahrnují dvě rodiny zástupců: P2Y receptory spřažené s G-proteiny a P2X
receptory, které jsou ligandem ovládané iontové kanály.
Bylo vyklonováno 14 P2Y receptorů. Váží difosfáty i trifosfáty purinových i
pyrimidinových nukleotidů, stejně jako ApnA. Jejich afinita k různým ligandům se liší. Např.
P2Y1 receptor váže ATP a ADP, ale ne UTP nebo UDP. Naopak, P2Y2 receptor je aktivován
ATP i UTP se stejnou potencí. Oba P2Y1 i P2Y2 receptory byly detekovány v mozku.
Nomenklatura P2Y receptorů je poněkud zmatečná, protože některé subtypy, u kterých
se mělo za to, že jsou nakolonovány, naklonovány vlastně nebyly :) Jejich přehled máte
v následující tabulce.
Protein
P2RY1
P2RY2
P2RY4
P2RY5 / LPA6
P2RY6
P2RY8
P2RY9 / LPAR4 / GPR23
P2RY10
P2RY11
P2RY12
P2RY13
P2RY14
Gen
Spřežení
Nukleotid
P2RY1
Gq/11
ADP
P2RY2
Gq/11
ATP, UTP
P2RY4 Gi a Gq/11
UTP
LPAR6
lysofosfatidová kyselina
P2RY6
Gq/11
UDP
P2RY8
orphan receptor
LPAR4
lysofosfatidová kyselina
P2RY10
orphan receptor
P2RY11 Gs a Gq/11
ATP
P2RY12
Gi
ADP
P2RY13
Gi
ADP
P2RY14
Gq/11
UDP-glukosa
Všimněte si, že P2Y3, P2Y5, P2Y7, P2Y8 a P2Y9 , receptory vlastně nejsou ;)
P2X receptorů bylo charakterizováno 7 subtypů, u člověka
se nacházejí zejména na chromosemoech 12 a 17. Jsou to
kationtové kanály aktivované ATP nebo ApnA, sestávající z více
podjednotek. Jejich přesná stechiometrie sice není známa, ale in
vitro formují homomerní receptory. Aktivace P2X receptorů vede
k rychlým tokům Na+, K+ a Ca2+ a tím k depolarizaci buňky.
Vyskytují se na periferii, na nervosvalovém spojení, v míše i
mnoha oblastech mozku. Ovlivňují srdeční rytmus, svalový
tonus, kontrakci vas deferens při ejakulaci nebo nocicepci –
overexprese P2X4 Rs v míše vede k hypersensitizaci. Tyto
12
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
receptory jsou citlivé na makrocyklický lakton ivermectin, který zvyšuje jejich vodivost a
zvyšuje pravděpodobnost otevření kanálu.
Přehled charakteristik některých purinergních receptorů je v následující tabulce.
Funkce purinů
Purinům je připisovaná celá řada funkcí, ale jen některé byly s určitostí potvrzeny.
Adenosin má anxiolytické a hypnotické vlastnosti, což potvrdilo i podávání
antagonistů adenosinových receptorů. kofein a jiné methylxanthinové sloučeniny zvyšují
bdělost a kognici, jak už jsme se zmiňovali výše. Antagonisté purinergních receptorů by
mohli být využívání jako podpůrná léčba symptomů u deficitů spojených a Alzheimerovou
chorobou a jinými formami demence.
Byly studovány rovněž neuroprotekční účinky adenosinu, např. po mozkové mrtvici.
Mrtvici doprovází ischemie spojená se zvýšením koncentrace glutamátu, a tím navozeným
masivním vtokem Ca2+ do buněk a jejich excitotoxickou smrtí. Ideální neuroprotektivum by
tedy za ischemických podmínek inhibovalo presynaptický výlev glutamátu a zabraňovalo
depolarizaci postsynaptické membrány a vtoku Ca2+ do postsynaptické buňky. Adenosin
vyhovuje oběma parametrům. Aktivace presynaptických A1 receptorů adenosinem blokuje
výlev glutamátu a jiných neuropřenašečů. Aktivace postynaptických A1 receptorů otevírá
draslíkové a chloridové kanály a vede k hyperpolarizaci membrány. Celkovým výsledkem
pak je snížený vtok vápníku a nižší úmrtnost neuronů. Pokusy na zvířecích modelech tuto
hypotézu potvrzují. Podání selektivníh agonistů A1 receptorů bezprostředně před ischemickou
atakou nebo v jejím průběhuu zvířat významně snižuje ztráty neuronů a chrání před
následnými deficity paměti. A naopak, podávání selektivních antagonistů ischemické
poškození mozku zhoršuje.
Je ale důležité si uvědomit, že množství adenosinu se v mozku během ischemie
dramaticky zvyšuje. Ačkoliv aktivace A1 receptorů může být do určité míry neuroprotekční,
13
[email protected]
Neurochemie (MB150P35), přednáška 6
na jiných subtypech purinergních receptorů vyvolává opačný efekt. Aktivace A2 receptorů
měla na zvířecích modely mozkové mrtvice výrazně negativní dopad, zatímco podávání
selektivní antagonistů A1 receptorů působilo neuroprotekčně. Stejně tak bezprostřední
aktivace A3 receptorů výrazně zvyšovala u pokusných zvířat poškození mozku a úmrtnost.
Kupodivu, dlouhodobé podávání tohoto farmaka mělo efekt naprosto opačný. Na různorodosti
těchto pozorování se zřejmě podílí vliv adenosinu na cévní tonus a agregaci krevních
destiček.
Adenosinová signalizace by se mohla uplatnit i v léčbě Parkinsonovy nemoci. Ve
striatu jsou poměrně hojně exprimovány A2A receptory. Inhibují odpovědi navozené D2
receptory a naopak antagonisté je mimikují – aktivace A2A receptorů navozuje pokles
motorické aktivity. Inverzní působení A2A a D2 receptorů by snad mohlo být užitečné
v pomocné terapii alespoň těchto projevů. Bylo popsáno několik látek, které při perorálním
podání selektivně blokují A2A receptory. Při současném podávání s L-dopa snižují její vedlejší
účinky. U některých parkinsonických pacientů může zmírňovat dyskinesii i theofylin.
Co si pamatovat z dnešní přednášky:
⇒ neuropeptidy: klasifikace
⇒ neuropeptidy: vznik a aproteolytické štěpení
⇒ neuropeptidy: rozdíly v signalizaci oproti „klasice“
⇒ neuropeptidy: funkce
⇒ puriny: skladování a výlev
⇒ puriny: receptorové třídy
⇒ puriny: příklad farmakologie receptorů
14
[email protected]