Standardizace měření v průtokové cytometrii

Standardizace měření
v průtokové cytometrii
Martin Špryngar
Exbio Praha a. s.
Standardizace v průtokové cytometrii
1.
Obecně - standardizace měření na průtokovém
cytometru
2.
Definice Cílových hodnot fluorescence
3. Udržení cílových hodnot fluorescence
4. Postup standardizace měření pro daný experiment
5. Baseline a linearita měření
6. Standardizace měření mezi cytometry
7. Standardizace – schéma testování v čase
Standardizace v průtokové cytometrii
Zpracování vzorku
Vzorek
Měření vzorku
Analýza dat
Interpretace dat
Závěr
Standardizace měření
OPAKOVATELNÉ výsledky vs. NEOPAKOVATELNÁ výsledky
1.
naměřená na jednom cytometru
2.
naměřená na různých cytometrech
3.
naměřená na různých cytometrech v různých
laboratořích
Visací Zámek 1982 – 2007, Jan Houbert:
„Jsme tenkrát nevěděli, že kytary se mají ladit...někdo
nám pak řekl, že se mají ladit, ale to jsme zase netušili,
že i nějak jako vzájemně. Takže všechny ty písničky
byly takový originály.“
Proč je pro průtokovou cytometrii důležitá
standartizace?
1. Jak dochází k průběžné změně kvality měření na
průtokovém cytometru?
2. Jaké jsou nejcitlivější aplikace, kde dojde ke zkreslení
výsledků?
Nástroje standardizace měření na
průtokovém cytometru
1. Definice cílových hodnot
fluorescence
2. Udržení cílových hodnot
fluorescence změnou PMTV
Definice Cílových hodnot MFI
s použitím 7. populace
SPHERO RainBow Calibration Particles
32941
35895
Udržení cílových hodnot MFI
403V
403V
564 V
Den 1
396 V
564 V
Den 2
554V
Den x
Udržení cílových hodnot MFI
Zajištění reprodukovatelnosti měřených dat změnou PMTV
1. Automaticky - Platformy výrobců
(CS&T, FlowCheck+FlowSet)
2. Manuálně – „monitoring“ (EuroFlow)
Data změřená dnes stejně jako za týden, měsíc, rok…
= porovnatelná data v dlouhodobém horizontu
Platforma
Beckman Coulter
Platforma
BD Biosciences
Cytometer Set-up &
Tracking (CS&T)
System
CS&T modul v Diva + Application Settings
Baseline = charakterizace cytometru
Performance Check = Denní kontrola kvality
= ∆PMTV nutná k zachování Cílových MFI
Application settings = Standardizace konkrétní aplikace
= set hodnot PMTV (Instrument settings), při kterých jsou
dosaženy požadované fluorescence,
= modifikace pro danou aplikaci
Charakterizace
cytometru
Postup
standardizace
měření pro daný
experiment
Optimalizace na
měřený vzorek
Změření a zaznamenání
cílových hodnot
fluorescence
Hodnoty fluorescence
převedeny na PMTV
(instrument settings)
Změření
kompenzačních
kontrol
Akvizice
experimentu
CS&T modul: Baseline a linearita měření
Baseline - zobrazení jako funkce PMTV
CS&T modul: Baseline
= min PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu
Baseline definuje okno pro optimalizaci
PMTV pro konkrétní aplikaci (setup)
CS&T modul: Baseline
= min PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu
Baseline definuje okno pro optimalizaci
PMTV pro konkrétní aplikaci (setup)
Výkon laseru a linearita měření
Medián bright bead populace byl
umístěn do stejného FL kanálu =
Cílová hodnota MFI
Linearita - zobrazení jako funkce PMTV
Po instalaci
cytometru
X
X
X
X
Kontrola gates (FMO)
X
X
X
X
X
Kompenzace
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Denně
Denní kontrola cytometru
Baseline
X
Změna optiky
X
Měsíčně
Změna reagencií
(tandemy)
Servis, alignment
Standardizace – schéma testování v čase
Standardizace měření mezi cytometry
1. Definice cílových hodnot MFI
2. Udržení cílových hodnot MFI
CD4 PE
BD FACS CANTO
CD3 FITC
BC NAVIOS
CANTO + NAVIOS
Synchronizace cytometrů
Canto a Navios
FITC
PE
APC
APC-Cy7
PerCP-Cy5.5
CANTO
NAVIOS
PE-Cy7
Děkuji za pozornost
Leitz MPV1 equipped with both “photometric-capability” in transmitted light
and the “micro-fluorometry” in incident illumination (1969).