Synopse přednášek ANC I. LS2005/06

Synopse přednášek z analytické chemie I. (LS2005/06)
1. Analytická chemie, její funkce a aplikace
Definice
•
•
•
•
Analytical chemistry is a scientific discipline used to study the chemical composition,
structure and behavior of matter. (Kealey, Haines)
– (volný překlad) - vědecká disciplina věnovaná studiu chemického složení, struktury a
chování (vlastnostem) hmoty.
Analytical chemistry is a scientific discipline that develops and applies methods, instruments
and strategies to obtain information on the composition and nature of matter in space and
time, as well as on the value of these measurements, i.e., their uncertainty, validation, and/or
traceability to fundamental standards. (IUPAC)
– (volný překlad) - vědecká disciplina, která vyvíjí a aplikuje metody, instrumentaci a
strategie pro získání informací o složení a podstatě hmoty v daném místě a čase, stejně
jako se zabývá hodnotou (hodnověrností) těchto měření, tj. jejich nejistotou, validací a
návazností na základní standardy.
Analytical chemistry seeks ever improved means of measuring the chemical composition of
natural and artificial materials. The techniques of this science are used to identify the
substances which may be present in a material and to determine the exact amounts of the
identified substances. Analytical chemists work to improve the reliability of existing
techniques to meet the demands for better chemical measurements which arise constantly in
our society. They adapt proven methodologies to new kinds of materials or to answer new
questions about their composition. They carry out research to discover completely new
principles of measurement and are at the forefront of the utilization of major discoveries
such as lasers and microchip devices for practical purposes. They make important
contributions to many other fields as diverse as forensic chemistry, archaeology, and space
science. (American Chemical Society, Division of Analytical Chemistry)
– (volný překlad) - analytická chemie se stále snaží o vylepšení nástrojů pro měření
chemického složení přírodních i umělých materiálů. Techniky této disciplíny jsou užívány
k identifikaci látek, které mohou být přítomné v materiálu, a ke stanovení jejich přesných
množství. Analytičtí chemici (analytici) pracují na vylepšení spolehlivosti existujících
metod, tak aby vyhověly požadavkům společnosti na kvalitnější chemická měření. Dále
pak upravují osvědčené metodologie na nové typy materiálů s cílem zodpovědět nové
otázky, týkající se jejich složení. Provádějí výzkum zcela nových principů měření a jsou
v popředí při využívání velkých objevů jako jsou lasery či mikročipy pro praktické účely.
Celkově analytici přispívají k rozvoji mnoha jiných oborů v takové pestrosti jak naznačují
aplikace ve forenzní chemii, archeologii či výzkumu vesmíru. – viz logo Divize analytické
chemie Americké chemické společnosti
KLÍČOVÁ SLOVA – složení, struktury, vlastnosti materiálu, identifikace,
stanovení, měření
• CO ?
- KVALITATIVNÍ ANALÝZA – DŮKAZ, IDENTIFIKACE
• KOLIK ?
- KVANTITATIVNÍ ANALÝZA - (semikvantitativní) - STANOVENÍ
• V JAKÉ FORMĚ ?
- STRUKTURNÍ ANALÝZA (chemická struktura analytu)
- SPECIAČNÍ ANALÝZA – zjištění a kvantifikace více forem analytu ve vzorku
http://www.iupac.org/goldbook/ST06848.pdf
1
VZOREK – „analyzovaný materiál“ (detaily později)
ANALYT – PRVEK, FORMA, SLOUČENINA – PŘEDMĚT ANALÝZY
MATRICE – zbytek vzorku kromě analytu
APLIKACE analytické chemie
• sledování kvality surovin, meziproduktů a výrobků - QC – quality control
o nejen chemický průmysl, ale i jiná průmyslová odvětví – od výroby
automobilů, přes textil, potraviny až ke spotřební elektronice (např. aktuální
problém – stanovení obsahu bromovaných látek, používaných ke snížení
hořlavosti spotřební elektroniky)
• sledování toxických látek v životním a pracovním prostředí
o těžké kovy, organické látky, výfukové plyny atd.
o klinické studie – analýza tělních tekutin
• sledování přírodních procesů – biologické studie, geologie
• základní i aplikovaný výzkum
o nové materiály, nová léčiva, kombinatoriální chemie – velké počty látek pro
identifikaci a popis struktury
Analytický experiment
• princip - fyzikální a/nebo chemický základ – např. absorpce fotonů, chemická
reakce – z toho se odvozují analytické techniky
• metoda (technika) - přístrojová technika poskytující analytické informace – např.
FTIR spektrometrie
• postup - použití metody pro konkrétní materiál – např. stanovení ropných látek v
pitné vodě
• návod - sled pokynů pro konkrétní realizaci postupu – např. podniková norma,
návod ve skriptech
• SOP - standardní operační postupy (Standard Operation Procedures) – viz např.
http://www.fao.org/docrep/W7295E/w7295e04.htm
Analytické úkoly
Výběr, vývoj a validace analytické metody pro získání žádaných, spolehlivých dat o
analyzovaném materiálu.
Řešené kroky:
1. zadání (definice) úkolu – typ analytických informací, akceptovaná míra nejistoty
výsledků, cena, časové nároky, nároky na laboratorní a přístrojové vybavení.
2. výběr metody a postupu
3. návrh vzorkování – vzorkovací plán
4. úprava vzorku – převedení vzorku na formu vhodnou k analýze
5. kvalitativní/kvantitativní analýza (včetně kalibrace)
6. výpočet výsledků včetně statistického vyhodnocení
7. příprava protokolu (certifikátu, zprávy) o analýze
8. porovnání výsledků se zadáním analýzy
2
Analytické metody (techniky)
Metoda
Měřená vlastnost
Gravimetrie
Odměrná analýza
Atomová a molekulová
spektrometrie
Hmotnostní
spektrometrie
Chromatografie
Elektrochemické metody
Radiochemická
analýza
Hmotnost čistého analytu či
sloučeniny s definovanou
stechiometrií
Objem odměrného roztoku
Použití
Kvantitativní analýza – hlavní a vedlejší
makrosložky
Kvantitativní analýza – hlavní a
vedlejší makrosložky
Kvalitativní, kvantitativní a strukturní analýza
– od hlavních makrosložek až po mikrosložky
Zářivý tok emitovaný či
absorbovaný při dané vlnové
délce
Hmotnost vztažená na
jednotkový náboj pro ion
analytu či jeho fragmentové ionty
Různé fyzikálně chemické
vlastnosti analytů
Kvalitativní, kvantitativní a strukturní analýza
– od hlavních makrosložek až po mikrosložky
Elektrické vlastnosti analytů
v roztoku
Charakteristické ionizující
záření emitované analytem
Kvalitativní a kvantitativní analýza – od
hlavních makrosložek až po mikrosložky
Kvalitativní a kvantitativní analýza – od
hlavních makrosložek až po mikrosložky
Separace směsí - od hlavních
makrosložek až po mikrosložky
Pozn. 1: Spojené techniky – „hyphenation“ – propojení chromatografie se spektrometrickou detekcí
Pozn. 2: Elektromigrační metody – elektroforéza a izotachoforéza – separace nabitých částic
Analytické návody (postupy)
•
•
•
sled pokynů pro konkrétní realizaci postupu od odběru vzorku až po zpracování
naměřených dat
přehled použitých chemikálií, laboratorního nádobí a přístrojů
o čistota a zdroj chemikálií
o výkonnostní a technické parametry přístrojů
specifikace formy protokolu o analýze
Spolehlivé analytické výsledky
•
validace celého postupu, tj. všech kroků
o test robustnosti – odolnost vůči změnám experimentálních podmínek (např.
vnější teplota, tlak, změna přístrojových parametrů)
o výkonnostní charakteristiky detekčního systému
rozsah použitelnosti
průběh odezvy – linearita ?
citlivost
stabilita
opakovatelnost
o reprodukovatelnost - zkoušky ve více laboratořích
Vzorkování a manipulace se vzorkem
•
•
•
zkoušený materiál – vzorkovaná jednotka – celkový vzorek – laboratorní vzorek
– testovací vzorek – analytický vzorek – reprezentativnost vzorku
vzorkovací plán – požadavky vycházející z obecně závazných předpisů (zákonná
úprava, normy)
Homogenní materiály x heterogenní materiály
o Zmenšení objemu
o Homogenizace pro informace o průměrném složení
3
•
•
•
•
•
o Selektivní vzorkování určitých částí materiálu – volba odběrových míst
(problém nerovnoměrné distribuce – půda, vodní toky, sedimenty atp.)
o „Náhodná“ odběrová místa
Kvartace
Označení vzorků
Obal vzorku – ochrana před kontaminanty z okolí, rizika kontaminace z materiálu
obalu
Vhodné podmínky skladování
o vzrůst teploty – rizika – ztráta těkavých látek, zvýšená reaktivita, riziko
degradace materiálu obzvláště biologického
o pokles teploty – tvorba sraženin a depozitů z málo rozpustných složek,
vymrazování, narušení fyzikálních vlastností materiálu
o změny vlhkosti prostředí – riziko pro hygroskopické materiály, indukce
hydrolytických reakcí
o světlo, UV – záření – fotochemické reakce, foto-rozklad
o obsah kyslíku v atmosféře – oxidační reakce, degradace, koroze
- zvláštní režim – stopová a ultrastopová analýza
Úpravy vzorků
o převedení do roztoku – s rozkladem x bez rozkladu
o zkoncentrování (předkoncentrování - prekoncentrace) analytu
o sušení vzorků při proměnném obsahu vlhkosti
o odstranění či potlačení složek matrice, které mohou působit interference
o extrakce
Kalibrace a standardy
Kalibrace
a) určení průběhu odezvy detekčního (měřicího) systému na známá množství
(koncentrace) analytu za specifikovaných podmínek (nalezení vztahu mezi měřenou
fyzikálně chemickou veličinou a množstvím (obsahem, koncentrací) analytu) – viz
http://www.vscht.cz/lam/new/barekterminologie2000_07_01.pdf
b) srovnání naměřené hodnoty měřicím systémem s hodnotou referenční
- nutná pro většinu analytických metod (výjimkou jsou definitní metody:
gravimetrie, odměrná analýza, coulometrie a izotopové zřeďování)
- nutno brát v potaz vliv matrice na měřený signál (simulace složení matrice při
přípravě kalibračních standardů)
Metody kalibrace
•
•
•
kalibrační graf – kalibrační křivka (kalibrační přímka) – „external standards“ –
sada kalibračních standardů připravena nezávisle z laboratorních chemikálií,
provedení slepého pokusu – „blank“
metoda standardního přídavku (standardních přídavků) – eliminace vlivu
matrice (pokud možno malé objemy přídavku standardu, metoda je mnohem
náročnější na množství práce, vhodná pro ověření vlivu matrice)
metoda vnitřního standardu - do všech analyzovaných vzorků i kalibračních
(validačních) roztoků je přidáno stejné množství vhodné čisté látky odlišné od analytu,
možnost normalizace (kolísajícího) signálu (odezvy) na tento vnitřní standard –
některé spektrální metody, chromatografie
4
Chemický standard
– materiál či látka o velmi vysoké čistotě a známém složení. Užití - standardizace činidel,
kalibrace přístrojů. Komerčně dostupné – např. značené AnalaR.
• primární standardy – primární etalony - Etalon, který je určen, nebo všeobecně
považován za etalon s nejvyššími metrologickými vlastnostmi a jehož hodnota je
uznávána bez navázání na jiné etalony téže veličiny.
• sekundární standardy – pracovní standardy – standardizované pomocí primárních
standardů. Sekundární etalon - jeho hodnota je stanovena na základě porovnání s
primárním etalonem téže veličiny.
Referenční materiál
– materiál či látka, jejíž jedna nebo více hodnot vlastností je dostatečně homogenní a dobře
stanovená, aby mohl(a) být použit(a) ke kalibraci přístroje, posouzení měřicí metody nebo k
přiřazení hodnot (dalším) materiálům. (překlad anglického textu v knize – souhlasí s Chem.
Listy 99, 119 − 124 (2005).
Referenční materiály jsou materiály nebo látky přesně stanoveného složení nebo vlastností,
používané zejména pro ověřování nebo kalibraci přístrojů, vyhodnocování měřicích metod a
kvantitativní určování vlastností materiálů. – citace ze zákona č. 119/2000 Sb. o metrologii.
Certifikovaný (standardní) referenční materiál (CRM či SRM)
– referenční materiál doprovázený certifikátem, jeho jedna nebo více hodnot vlastností je
certifikována postupem, který vytváří návaznost na správnou realizaci jednotky, v níž jsou
hodnoty vlastností vyjádřeny, a jehož každá certifikovaná hodnota je doprovázena nejistotou
při uvedené úrovni spolehlivosti. Dokumentace vydaná certifikační institucí (autoritou) (Úřad
pro analytické standardy). CRM či SRM jsou dostupné v různých formách a pro různé účely.
• demonstrace přesnosti, správnosti a spolehlivosti a přenositelnosti analytických
výsledků
• validace nových analytických postupů
• standardizace jiných referenčních materiálů
• nutné pro zabezpečení a řízení jakosti v analytických laboratořích
Jakost v analytických laboratořích
QC (quality control) – řízení jakosti
• sled kontrolních činností (v analytické laboratoři)
• návaznost, přesnost, správnost, využití regulačních diagramů
QA (quality assurance) – zabezpečení (zabezpečování) jakosti
• kombinace plánovaných a systematických činností, zabezpečující, že řízení jakosti
splňuje specifikované požadavky
• ČSN EN ISO 9000:2001 používá namísto pojmu „zabezpečování jakosti“ pojem
„prokazování jakosti“
Akreditace – akreditační systém
• zajištění standardů jakosti v jednotlivých laboratořích
• mezinárodní organizace – OECD, ISO, CEN, specifické oborové požadavky – např.
farmaceutický průmysl
5
2. Rovnováhy v roztocích, pH
Rozpouštědlo – hlavní složka roztoku
Rozpouštědla
• anorganická x organická
• důležité vlastnosti - bod varu, hustota, dielektrická konstanta
• polární x nepolární („podobné se rozpouští dobře v podobném“)
polární – vysoká hodnota permitivity – voda (78,6), methanol (33,6) ethanol (24,3),
dimethylsulfoxid (48),
nepolární – hexan (1,9), benzene (2,3), diethylether (4,33)
Rozpuštěná látka
• změněné chování oproti jejím jiným stavům (závislé na volbě rozpouštědla) (rozp.
látka ovlivňuje však i chování rozpouštědla)
• plyn, kapalina, pevná látka
• solvatace – molekuly rozpuštěné látky jsou obklopeny molekulami rozpouštědla
• reakce látek v roztocích
• disociace látek iontové povahy – ionty v roztoku
Rozpustnost
– množství látky, které lze rozpustit v rozpouštědle při dané teplotě a tlaku
• rozpustnost plynů – Henryho zákon
• rozpustnost kapalin – Raoultův zákon
• rozpustnost pevných látek
pX notace
– pro proměnné (především koncentrace) či rovnovážné konstanty (a konstanty z nich
odvozené), jejichž hodnoty nabývají hodnot v rozmezí mnoha (dekadických) řádů
pX = -log(X),
kde X je proměnná (mnohdy koncentrace sledované specie) či
specifikovaná konstanta (rovnovážná, disociační, součin rozpustnosti atp.)
Rovnováhy v roztocích
– rovnovážné a z nich odvozené konstanty - termodynamika
– rovnovážné aktivity, aktivitní koeficienty, rovnovážné koncentrace, problém aktivitních
koeficientů u iontů.
Disociace látek v roztocích - ionty v roztocích
• silné elektrolyty – plně disociované
• slabé elektrolyty – částečně disociované – disociační konstanta
• vznik iontových párů – koncentrované roztoky, solvatován celý iontový pár
• tvorba micel – látky s polární (iontovou částí) a s nepolární částí molekuly –
povrchově aktivní látky, iontová část směřuje do polárního prostředí
• nekonečné zředění – plně separované ionty rozpouštědlem, vzájemné interakce
molekul rozpuštěné látky nehrají roli
• iontová atmosféra – kompenzace náboje daného iontu ionty opačného náboje v jeho
okolí (Coulombické interakce) - Debye-Hückelova teorie – aproximativní, výpočet
středního aktivitního koeficientu, souvislost s iontovou sílou (roztoku)
o definice iontové síly I = 0,5 ( [A] zA2 + [B] zB2 + …)
6
Typy rovnováh resp. reakcí v roztocích (elektrolytů)
•
acidobazické – kyselina, báze – přenos protonu – konjugovaný pár
– otázka volby rozpouštědla a jeho protolytických vlastností (možnost
autoprotolýzy ?)
aprotická vs. protická
aprotogenní (příklad – pyridin)
amfiprotní – vyrovnaná (voda), protofilní (aminy), protogenní
(bezvodá kyselina octová)
– disociační konstanta (malá čísla – uvádí se pKHA)
– význam pro kvalitativní analýzu, acidobazické titrace, úpravu prostředí pro
jiné typy titrací, gravimetrii, fotometrii, rozklady látek, separace polárních
látek (extrakce, chromatografie), příklad – kyselina octová ve vodě, amoniak
ve vodě, pyridin ve vodě, kyselina chloristá v bezvodé kyselině octové
•
komplexotvorné – kov („centrální atom“, obecněji akceptor ligandu – jednojaderný x
vícejaderný komplex), ligand (vaznost ligandu), vícevazné ligandy - cyklické
komplexy – cheláty, náboj komplexů, zabarvení x bezbarvé
– konstanta stability – dílčí a celková (stupňovitá tvorba komplexů), POZOR –
velká čísla, uvádí ve formě „+log“ (příklad pro komplexy iontů kovů s EDTA
- +logK(PbY2-) = 18, +logK(BiY-) = 27,9)
otázka vedlejších reakcí – kovu (přesněji akceptoru ligandu) i ligandu, s tím
související pojmy – podmíněná koncentrace kovu a podmíněná koncentrace
ligandu, mnohé ionty kovů tvoří akvakomplexy, u ligandů je třeba počítat např.
s jejich protolytickými rovnováhami – např. EDTA – vícesytná kyselina,
bipyridin – slabá báze, atd.)
– příklady využití - kvalitativní analýza, titrace, gravimetrie, fotometrie (barevné
vs. bezbarvé komplexy), separace, příklady – např. aminkomplexy (různé
počty ligandů v komplexu), komplexy iontů kovů s EDTA (tam vždy
stechiometrie 1:1)
•
srážecí – málorozpustný produkt
– součin rozpustnosti – (malá čísla) souvislost s rozpustností čistých látek, vliv
přítomnosti vlastních iontů, vliv přítomnosti cizích iontů
– příklady využití – kvalitativní analýza, srážecí titrace, gravimetrie, separace
– příklady – AgCl, Ag2CrO4, Ag3PO4 – porovnání hodnot pKs a rovnovážné
koncentrace stříbrných iontů v roztoku (pKs(AgCl) = 9,75; pKs(Ag2CrO4) =
11,95; pKs(Ag3PO4) = 15,84
•
oxidačně redukční (redox) rovnováhy
– redukce, oxidace – přenos elektronu – zápis reakce a zápis poloreakcí
– pojem – standardní elektrodový potenciál
– příklady využití – kvalitativní analýza, rozklady, redox
elektrochemické metody, příklad - systém Fe2+/Fe3+ a Ce3+/Ce4+
titrace,
Pro výpočty
- stechiometrie – sepsat všechny dílčí reakce včetně rozpouštědla, zvážit celkové i dílčí
(látkové) bilance, rovnovážné či z nich odvozené konstanty pro všechny zapsané reakce,
podmínka elektroneutrality – užitečná u iontových rovnováh pro doplnění počtu rovnic
vzhledem k počtu neznámých
7
pH
– důležité pro všechny typy rovnováh v roztocích elektrolytů, nejen pro acidobazické
rovnováhy
Definice pH – dánský biochemik Sorensen 1909, aktivita jednotlivého typu iontů je
neměřitelná, proto praktická (pracovní) „definice“ či spíš zavedení hodnoty (stupnice) pH
(International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) a National Bureau of Standards
(NBS) jako hodnoty odečtené pomocí pH-metru kalibrovaného pomocí standardních roztoků
pufrů), tabelované roztoky, 7 roztoků podle IUPAC,
viz http://www.iupac.org/publications/pac/2002/pdf/7411x2169.pdf.
Stupnice pH
– souvislost s autoprotolýzou vody – typy prostředí - neutrální pH – 7, nižší hodnoty pH –
kyselé prostředí – otázka – co znamená hodnota pH – nula, minus jedna ?, vyšší hodnoty pH –
alkalické prostředí (související pOH), pH 14, 16 ?
– voda – jaké má pH ?, vliv rozpuštěného CO2
Měření či odhad hodnoty pH
– odhad – vizuální posouzení zabarvení indikátoru – indikátorové papírky – indikátory –
slabé kyseliny či báze – konjugované formy mají odlišné zabarvení – význam pro odměrnou
analýzu, lakmusový papírek
– měření - pH-metr – velmi rozšířená - skleněná elektroda (další elektrody viz
potenciometrie)
Nastavení a regulace pH (nutno znát výpočty pH)
– složení roztoku – kyseliny, báze, amfolyty, stabilizace pH - tlumivé roztoky – pufry –
příprava (např. kyselina a její sůl, lze připravit i částečnou neutralizací kyseliny), výpočet pH
– Henderson-Hasselbalchova rovnice, příklady praktických pufrů – viz dále
Význam nastavení a stabilizace pH - příklady
• fotometrie – zajištění stability dané „barevné“ formy analytu
• komplexometrické titrace – stabilita komplexů závisí na pH
• vliv pH na fluoridovou elektrodu
• vliv pH na rozpustnost málorozpustnostných solí – gravimetrie
• vliv pH na (chromatografické, extrakční) separace polárních látek
Výpočty pH
– vycházejí ze stechiometrie, látkových bilancí, hodnot disociačních konstant a podmínky
elektroneutrality, různá míra obtížnosti výpočtu podle typu protolytů, důležitá je volba
akceptovatelných aproximativních vztahů
silné protolyty - úplná disociace
pH roztoku kyseliny HA – cHA = 1.10-2 mol.l-1 ?
pH roztoku kyseliny HA – cHA = 1.10-9 mol.l-1 ?
pH roztoku kyseliny HA – cHA = 1.101 mol.l-1 ?
• NEZAPOMÍNAT NA AUTOPROTOLÝZU VODY
je třeba provést látkové bilance, zvážit zastoupení jednotlivých iontů, resp. použít
podmínku elektroneutrality a zvážit zanedbání koncentrací některých iontů
8
slabé protolyty - částečná disociace
•
•
•
korektní výpočet [H3O+] - KUBICKÁ rovnice – látková bilance, vztah pro disociační
konstantu, iontový součin vody, podmínka elektroneutrality
aproximativní výpočty
o zanedbání [OH-] vůči [A-] (lze pokud koncentrace kyseliny je vyšší než cca
10-6 mol.l-1) – kvadratická rovnice
o zanedbání [A-] vůči [HA] – limitně nízký stupeň disociace – pouze u
koncentrovaných roztoků slabých kyselin (nutno posoudit vztah koncentrace
kyseliny a hodnoty její disociační konstanty, resp. tzv. stupeň disociace)
aproximace u vícesytných kyselin – otázka řádových rozdílů mezi hodnotami
disociačních konstant do jednotlivých stupňů – výpočet 1. stupně + „opravy“ (pozor,
řada organických látek jsou vícesytné protolyty, např. u EDTA lze uvažovat až šest
forem – čtyři skupiny –COOH a dva protonizovatelné atomy dusíku, odvození
korektních vztahů pro výpočet pH je poměrně komplikované)
soli slabých jednosytných kyselin a bazí
•
příklady octan sodný, pyridinium chlorid (do bilancí a podmínky elektroneutrality je
třeba započítat koncentraci příslušných protiontů, které se pak neúčastní
protolytických rovnováh – u příkladů – sodné kationty, resp. chloridové anionty)
pufry – tlumivé roztoky
•
Henderson-Hasselbalchova rovnice, tlumivá (pufrační) kapacita β
amfolyty
•
schopnost se chovat jako kyselina i jako báze
3. Odměrná analýza, vážková analýza
Odměrná analýza - titrace
Definice - měření objemu roztoku činidla (odměrného roztoku), které je potřebné ke
stechiometrickému zreagování s analytem, tj. k dosažení BODU EKVIVALENCE
Požadavky na průběh reakcí
• jednoznačný průběh
• kvantitativní průběh
• rychlý průběh
• dobře indikovatelná změna vlastnosti systému v oblasti bodu ekvivalence
Odměrný roztok – roztok titračního činidla – je třeba znát jeho přesnou koncentraci – tzv.
TITR
Základní látka – umožňuje precizní určení koncentrace odměrného roztoku (stanovení titru)
9
Požadavky na základní látku
• snadno dostupná ve vysoké čistotě (nečistoty pod 0,1 %)
• stabilní během skladování (vůči vlhkosti, kyslíku, oxidu uhličitému, běžnému kolísání
teploty)
• odpovídající chování během titrace - splnění požadavků na průběh titrace
• dobře rozpustná (obvykle ve vodě)
• co největší možná molární hmotnost (omezení vlivu nejistot při navažování)
Bod ekvivalence a jeho indikace – prakticky zjistíme KONEC TITRACE
• subjektivní pozorování – VIZUÁLNÍ
o barevné změny, změny luminiscence
o INDIKÁTOROVÉ, BEZINDIKÁTOROVÉ
Indikátory vnější a vnitřní, nízké koncentrace indikátoru,
funkční oblast indikátoru a hodnota pT
•
měření vlastnosti roztoku – INSTRUMENTÁLNÍ
o elektrochemické - potenciometrie, konduktometrie, amperometrie
o optické - fotometrie, turbidimetrie, nefelometrie
Titrační křivky - matematické či grafické vyjádření funkční závislosti veličiny sledované
během titrace na objemu přidaného odměrného roztoku, nebo na VYTITROVANÉM
PODÍLU STANOVOVANÉ SLOŽKY (X).
Veličiny sledované během titrace - vztah k obsahu stanovované látky (X), činidla (T
„titrandu“) anebo produktu (P) titrační reakce – dle typu veličiny různé typy titračních křivek
• fotometrie, konduktometrie, amperometrie (obvykle lineární větve)
• biamperometrie (složitější průběh)
• potenciometrie – (obvykle sigmoidální křivky) - výhodné například při popisu
průběhu pH při acidobazických titracích (viz princip měření pH)
Přímé titrace – titrace roztoku analytu odměrným roztokem
Zpětné titrace - přídavek definovaného nadbytku odměrného roztoku, následně titrován
přebytek odměrného roztoku (např. rozpuštění ve vodě málorozpustných uhličitanů
v přebytku odměrného roztoku kyseliny a následné stanovení přebytku kyseliny odměrným
roztokem louhu, či rozpuštění šťavelanu vápenatého v nadbytku chelatonu, nadbytek
chelatonu stanoven odměrným roztokem Mg2+ či Zn2+, u chelatometrie pak i vytěsňovací
titrace)
Titrační automaty – rychlé, vhodné pro komerční laboratoře
Acidobazické titrace
Obvyklá titrační křivka - závislost pH na vytitrovaném podílu
• prudká změna pH v oblasti bodu ekvivalence – problém u velmi slabých protolytů,
derivační výnos
Odměrné roztoky - vždy buď silné kyseliny nebo silné báze o vhodné koncentraci
Stanovení – kyselin a zásad
• acidimetrie - stanovení celkové alkality, stanovení uhličitanů, stanovení dusíku –
Kjeldahl
10
•
•
o odměrné roztoky kyselin (HCl, H2SO4)
o příklad základní látky KHCO3
alkalimetrie - stanovení kyseliny fosforečné a fosforečnanů, stanovení kyseliny borité
(po přídavku glycerolu)
o odměrné roztoky zásad – NaOH, KOH prosté uhličitanů
o příklad základních látek – hydrogenftalan draselný, dihydrát kyseliny
šťavelové
indikace bodu ekvivalence (určení konce titrace)
o acidobazické indikátory (fenolftalein, methyloranž, methylčerveň)
o potenciometrie, konduktometrie
Možnost titrací v nevodném prostředí – stanovení velmi slabých protolytů, stanovení ve vodě
málorozpustných protolytů – prostředí – bezvodá kyselina octová (odměrný roztok pak
kyselina chloristá rozpuštěná v kyselině octové), bezvodý pyridin, aminy, alkoholy
Komplexometrie
Obvyklá titrační křivka - závislost pM na vytitrovaném podílu
Tvorba komplexů – postupná tvorba – dílčí konstanty stability – celková konstanta stability
Chelatace – stabilnější komplexy, pro komplexometrii žádoucí, aby (podmíněná) konstanta
stability byla vyšší než 103, někde se uvádí 106 (i více).
Stanovení – především ionty kovů, které vytvářejí komplexy
• chelatometrie
o odměrný roztok EDTA – vystačíme se zápisem H4Y, činidlo Na2H2Y
o základní látky – PbCl2, CaCO3, thiokyanatan dipyridinozinečnatý
o zásadní otázkou – volba pH – stabilita komplexů závisí na pH, volbou pH lze
titrovat různé ionty kovů vedle sebe – např. stanovení bismutu a olova,
v alkalickém prostředí problém tvorby málorozpustných hydroxidů kovů
(přídavek sekundárního komplexačního činidla pro udržení iontů v roztoku),
otázka maskovacích činidel vytvářejících silné komplexy s daným kovem
o indikace
komplexometrické indikátory, tzv. metalochromní indikátory–
eriochromová čerň T (Mg2+), xylenolová oranž (Bi3+, Pb2+),
murexid (Cu2+, Ni2+, Ca2+ ), tvorba slabších barevných komplexů
s ionty kovů, stabilita i zabarvení těchto komplexů závisí na pH !
potenciometrická indikace
o stanovení iontů kovů ve vodě, v potravinách, v průmyslových vzorcích
Redox titrace
Oxidačně-redukční - redox potenciál
Stanovení - kovy se dvěma dobře definovanými oxidačními stavy, stanovení oxidovatelných
organických látek
• Oxidimetrie a reduktometrie
o indikace
redox indikátory – odlišná barva Ox a Red formy, často ovšem jiná,
ireverzibilní redox indikátory, využití barevnosti odměrného roztoku
(manganometrie) atd.
potenciometrická indikace
11
•
Manganometrie
o odměrný roztok KMnO4 (0,002 - 0,1 mol.l-1) (fialový roztok)
o v kyselém prostředí redukce na Mn2+
o v neutrálním a slabě zásaditém na MnO2
o základní látky - dihydrát kyseliny šťavelové, šťavelan sodný, oxid arsenitý,
Mohrova sůl (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O
o stanovení železa, cínu, antimonu, arsenu, stanovení peroxidů, řada nepřímých
stanovení založených finálně na oxidaci kyseliny šťavelové
•
Jodometrie –indikátor - škrobový maz – s jodem modré zabarvení
o redukce jodu na jodid, resp. oxidace jodidu na jod - VRATNÁ REAKCE
o jod ve vodě málo rozpustný, lépe rozpustný v jodidu - trijodidový anion I3o odměrný roztok - trijodidový anion I3- (0,01 - 0,1 mol.l-1)
o základní látky - přesublimovaný jod, oxid arsenitý, thiosíran sodný (odměrný
roztok)
o stanovení – stanovení siřičitanů, stanovení sulfidů, stanovení jodového čísla,
stanovení vody metodou Fischerovou
Srážecí titrace
Součin rozpustnosti (viz výše) – vliv společných iontů na rozpustnost, stechiometrické
složení málorozpustných solí
• Argentometrie
o odměrný roztok AgNO3
o základní látka NaCl
o stanovení halogenidů a pseudohalogenidů
o Různé způsoby indikace
Mohrova metoda - stanovení chloridů, - stanovení bromidů
indikátor - chroman draselný, žlutý roztok, hnědo-červená
sraženina Ag2CrO4
Volhardova metoda - titrace Ag+ thiokyanatanem v kyselém prostředí
indikátor - roztok železité soli, bílá sraženina AgSCN, v bodě
ekvivalence - červené zabarvení komplexu [Fe(SCN)]2+
adsorpční indikátory (např. fluorescein) – adsorpce na sraženinu
v závislosti na jejím povrchovém náboji – otázka přebytku Ag+, resp.
Clpotenciometrická indikace – možnost stanovení chloridů a bromidů ve
směsi
Gravimetrie
•
•
•
získání vážitelné stabilní látky se známým definovaným stechiometrickým složením,
ze zvážení vážitelného produktu lze stanovit množství analytu
dílčí kroky – srážení, čištění sraženiny, sušení (vakuové sušení) či žíhání, vážení
srážení – zpracování analytického vzorku obvykle v roztoku (jeho úplné rozpuštění),
kvantitativní vyloučení málorozpustné látky z roztoku – získání vylučovací formy
(otázka teploty roztoků při srážení, volba srážecího činidla, otázka vztahu hmotnosti
finálního vážitelného produktu k hmotnosti analytu – anorganická x organická
srážedla, podmínky srážení – míchání, koncentrace roztoků, rychlost přidávání
srážedla, srážení z homogenního prostředí – generování srážedla „in situ“), zrání
12
•
•
•
•
•
•
sraženin – otázka čistoty sraženin a jejich filtrovatelnosti, hrubé disperze vs. koloidní
disperze
čištění sraženiny – promývání sraženiny, příp. znovu rozpuštění sraženiny a
přesrážení (příčiny znečištění – adsorpce, okluze, inkluze, indukované srážení, velký
problém – tvorba směsných krystalů)
sušení (skleněná frita, porcelánový filtrační kelímek) či žíhání (včetně spálení
papírového filtru) do konstantní hmotnosti – odstranění rozpouštědla, případně
převedení srážecí formy na vážitelnou formu (při žíhání) – kvantitativní získání
produktu s definovanou stechiometrií
vážení – získání hodnoty hmotnosti vážitelného produktu – znalost hmotnosti použité
nádobky – např. kelímku
používána jako referenční metoda
vhodná pro stanovení makrosložek (např. analýza ocelí, minerálů, půdních vzorků)
sledování procesů se změnou teploty – termogravimetrie (viz dále)
Vážení – kritická může být teplota vzorku při vážení
Příklady
• srážení kationtů kovů jako sulfidů sulfanem
• srážení kationtů kovů amoniakem, pyridinem atp. jako hydroxidů, hydratovaných
oxidů
• použití ORGANICKÝCH činidel – vyšší selektivita, velká molární hmotnost
organické složky, 8-chinolinol – Al3+, diacetyldioxim – Ni2+
PŘÍMÁ NÁVAZNOST na SI - hmotnost- DEFINITNÍ METODA
• možnost validace nových analytických metod
• analýza standardů
VYSOCE SPOLEHLIVÁ METODA při vyšších obsazích analytu (obvykle alespoň ~ 1 %)
4. Elektrochemické metody
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
elektrochemické reakce – reakce za účasti iontů (nabitých částic) v roztocích
elektrochemický článek – alespoň dvě elektrody
definice elektrody
zápis elektrochemického článku – fázová rozhraní
galvanický článek (baterie) – samovolný děj – bezproudý stav – potenciometrie,
proudová zátěž – zdroj stejnosměrného napětí
elektrolyzér – probíhající chemická reakce „vnucena“ vloženým napětím, článkem
prochází proud – voltametrie, amperometrie, coulometrie, elektrogravimetrie
(elektrochemický) potenciál – Nernstova rovnice
měrné (indikační) elektrody, referentní elektrody, pomocné elektrody
katody a anody
- standardní vodíková elektroda – primární reference – „srovnávací nulový bod“
konstrukce vodíkové elektrody
praktické referentní elektrody – (nasycená) kalomelová elektroda, (nasycená)
argentchloridová elektroda
13
•
•
solný můstek, kapalinový potenciál
pohyb částic v článcích – migrace, difuse, konvekce
Potenciometrie
•
•
měření napětí (potenciálů) (za bezproudého stavu) – elektromotorické napětí
o kompenzační metoda
o voltmetry s velkým vnitřním odporem – procházející proud je zanedbatelný
o dvě různé elektrody
obvykle měrná a referentní
měrná – její potenciál závisí na koncentraci analytu
referentní – stabilní potenciál
vztah potenciálu a koncentrace analytu (Nernstova rovnice)
o elektrody 1. druhu – kov a jeho ionty v roztoku – potenciál závisí na
koncentraci iontů v roztoku – použitelné jako indikační
příklad – stříbro, ionty stříbrné
jiný příklad – měď, ionty měďnaté
o elektrody 2. druhu – kov, jeho málorozpustná sůl, anionty soli v roztoku –
odezva na koncentraci příslušných aniontů v roztoku,
např. Ag, AgCl, KCl - pokud roztok KCl nasycený (plus krystaly KCl)
– pak stabilní potenciál – stabilní koncentrace Cl- , uplatňuje se součin
rozpustnosti (AgCl)
nasycená argentchloridová a nasycená kalomelová – typické praktické
referentní elektrody
o redoxní elektrody – redox pár v roztoku, inertní kov (obvykle platina) jako
elektrický kontakt
příklad – ionty železnaté a železité
jiný příklad – ionty cerité a ceričité
o membránové – vnitřní ref. elektroda, membrána, roztok analytu, vnější ref.
elektroda
příklad – skleněná elektroda – měření pH
krystalické membránové elektrody – krystal – odezva na vybraný typ
iontů - např. LaF3 – fluoridová elektroda
kapalná membrána s polymerním nosičem (polymer – např. PVC,
smícháno s iontoměničem – fixován v pórech polymeru) – např.
elektroda s odezvou na vápenaté ionty
o ISFET – iontově selektivní transistor řízený polem – např. odezva na pH (není
tak křehký jako skleněná elektroda)
o Senzory plynů – plyny, které při rozpouštění ve vodném prostředí mění
hodnotu pH – CO2, NH3
o Selektivita elektrod – Nikolského-Eisenmannova rovnice – koeficient
selektivity
•
•
přímá potenciometrie – např. měření pH, či měření koncentrace fluoridů, nutná
kalibrace měřidla pomocí roztoků o definovaném složení – otázka selektivity,
koncentračního průběhu odezvy pro studovaný analyt, otázka vlivu celkové iontové
síly roztoku – koncentrace vs. aktivita v koncentrovaných roztocích
potenciometrické titrace – potenciometrická indikace bodu ekvivalence
14
Voltametrie a amperometrie a příbuzné dynamické metody
•
(článkem prochází proud)
Voltametrie
•
•
měření proudu v závislosti na vkládaném napětí (nastavitelné hodnoty v závislosti na
čase) – probíhá elektrolýza, rychlost (elektrodové) reakce je řízena difusí
(elektroaktivní) látky, proud je úměrný koncentraci elektroaktivní látky - analytu
elektrody – pracovní (mikroelektroda), referentní a často též pomocná
Důležité pojmy
• rozkladné napětí – napětí nutné k tomu, aby začal protékat proud (pro výpočet –
Nernstovské potenciály plus přepětí na jednotlivých elektrodách)
• přepětí – míra polarizace elektrod
• polarizace elektrod – článkem protéká menší proud než odpovídá vloženému napětí
(čím menší plocha elektrod, tím větší schopnost polarizace)
o koncentrační – limitním dějem – transport látky k elektrodě
o přenosová (aktivační) – limitním dějem – reakce přenosu náboje
• polarizační křivka – závislost proudu na potenciálu
• depolarizátor – elektroaktivní látka – schopna oxidace či redukce na pracovní
elektrodě
o analyt musí být depolarizátorem – rozpuštěn v roztoku základního elektrolytu
– zbaveném rozpuštěného vzdušného kyslíku – riziko jeho redukce ve dvou
krocích – vlny by mohly překrýt odezvu od analytu
o probíhající elektrodová reakce závisí na vloženém potenciálu
redukce na katodě, oxidace na anodě
• kvantitativní průběh elektrolýzy – množství vyloučené látky – elektrogravimetrie –
přímo vážení elektrod před a po elektrolýze
• kvantitativní průběh elektrolýzy – množství vyloučené látky – úměrné prošlému
náboji – coulometrie – Faradayovy zákony
• kvantitativní průběh elektrolýzy – množství vytvořené látky v roztoku – činidla pro
titraci – úměrné prošlému náboji – coulometrické titrace
Polarografické metody – polarizovatelná elektroda – běžně rtuťová kapková elektroda
• Klasická elektroda – odkapávající rtuťová kapka – pravidelně narůstající a
odkapávající kapky rtuti z ústí kapiláry (obvykle díky gravitační síle, příp. působícím
tlakem)
o stále se obnovující povrch, malá plocha povrchu kapky, nedochází k akumulaci
analytu, resp. produktu elektrolýzy
o pro rtuť je extrémně vysoká hodnota přepětí vodíku, takže nedochází snadno
k jeho redukci – lze tak sledovat redukci řady látek
o lineárně (rovnoměrně) v čase narůstající vkládané napětí
o polarografická křivka – vlny jednotlivých depolarizátorů – inflexní bod –
půlvlnový potenciál, plateau – výška vlny – limitní difusní proud – limitující je
difuse analytu k elektrodě – (koncentrační gradient mezi oblastí u povrchu
elektrody a roztokem)
•
Jiné elektrody – statická, visící rtuťová kapka, pevné mikroelektrody (platina, skelný
uhlík), rotující diskové elektrody.
15
•
Jiné režimy závislosti vloženého napětí na čase – pulzní techniky – např. diferenční
pulzní.
Rozpouštěcí voltametrie – anodická, katodická
• anodická – měření stopových množství depolarizátorů – deponovaných
(zakoncentrovaných) na povrchu vhodné elektrody
o 1. krok – depozice analytu na elektrodě – např. na visící kapce (vznik
amalgamy)
o 2. krok – anodické rozpouštění deponovaného analytu – obvykle kovu
• katodická – tvorba málo rozpustných solí na povrchu vhodné elektrody
Využití – kvalitativní i kvantitativní analýza pro elektroaktivní látky (depolarizátory)
• charakteristická hodnota půlvlnového potenciálu
• charakteristická výška vlny (příp. píku)
• anorganické i organické analyty
• vodné i nevodné prostředí
Amperometrie – měření limitního difusního proudu (v závislosti na čase) – průtočné
systémy – proudící kapaliny – např. kapalinová chromatografie, senzory či biosenzory (v
tenké vrstvě. „wall-jet“ uspořádání)
Clarkův senzor – stanovení kyslíku v kapalinách i plynech – voltametrický princip
Amperometrické titrace – měření limitního difusního proudu během přidávání odměrného
činidla k roztoku analytu – varianty – depolarizátorem je analyt, depolarizátorem je odměrné
činidlo, depolarizátorem je produkt titrační reakce
Konduktometrie
•
•
•
vodivé roztoky elektrolytů, (taveniny iontových sloučenin)
měření vodivosti, zabránit polarizaci elektrod – použit střídavý proud
o Pohyb iontů v elektrickém poli
Gradient potenciálu – potenciálový spád ∆φ / b
Náboj iontu
Efektivní velikost iontu v roztoku
Viskosita rozpouštědla
Pohyblivost iontů
Ohmův zákon - ∆φ = R I, vodivost – převrácená hodnota odporu
R = 1/G = (ρ b) / A
∆φ / b = ρ I / A
γ = 1/ρ je měrná vodivost
Čím větší počet iontů, tím větší vodivost – vztah celkové vodivosti i
měrné vodivosti ke koncentraci
měření vodivosti – konduktometrická cela – plocha elektrod (A), jejich vzájemná
vzdálenost – b, inertní Pt elektrody, možnost průtočného uspořádání –
konduktometrický detektor
o Vliv teploty na vodivost
16
o Molární vodivost – měrná vodivost vydělená aktuální koncentrací, stále závisí
na koncentraci – vyjadřuje se pak molární vodivost při nekonečném zředění –
pak platí Kohlrauschův zákon o nezávislé migraci iontů
Pro silné elektrolyty – Onsagerova rovnice – závislost molární
vodivosti na koncentraci
Pro slabé elektrolyty – otázka neúplné disociace – Ostwaldův
zřeďovací vztah – ze závislosti molární vodivosti na koncentraci
(zředění) – určení hodnoty disociační konstanty
o Přímá konduktometrie – neselektivní metoda
kontrola „kvality“ deionizované či destilované vody
kontrola kvality technologické vody, pitné či mořské
stanovení některých fyzikálně-chemických konstant
detekce v některých separačních metodách (iontová chromatografie,
kapilární elektroforéza)
o Konduktometrické titrace
Změna vodivosti během titrace roztoků obsahujících ionty
• Neutralizační titrace H+ + OH- = H2O
Pokles vodivosti před bodem ekvivalence, nárůst za B.E.
• Srážecí titrace
• Titrace v nevodném polárním prostředí fenoly v kapalném
amoniaku, titrace amoniakálním roztokem KOH
5. Separační metody
Základní princip: rozdělení vícesložkového vzorku do více podílů (≥2) odlišného složení,
ideálně: 1 podíl = 1 složka.
Frakcionační kapacita: max. počet složek, který lze rozdělit v jedné operaci – od dvou
(extrakce) do několika set (plynová chromatografie)
Přehled metod
distribuce mezi dvě fáze: využívají se rozdíly v rozpustnosti, bodu varu nebo tání, velikosti a
tvaru složek a (fyzi)sorpce nebo chemisorpce složek
plyn-kapalina
plyn-tuhá fáze
kapalina-kapalina
kapalina-tuhá fáze
destilace
pěnové dělení
sublimace
molekulová síta
srážení
frakční krystalizace
plynová rozdělovací
chromatografie
plynová adsorpční
chromatografie
extrakce
kapalinová rozdělovací
chromatografie
gelová permeační
chromatografie
kapalinová adsorpční
chromatografie
iontoměničová
chromatografie
zonální tavení
molekulová síta
17
dělení na základě různé migrace složek
migrace přes polopropustnou membránu
migrace v silovém poli
ultrafiltrace
reverzní osmóza
dialýza
elektrodialýza
elektroforéza
termodifuze
ultracentrifugace
hmotnostní spektrometrie
Extrakce
Princip: selektivní přechod složky mezi dvěmi nemísitelnými kapalinami (většinou přechod
z vodné do organické fáze) nebo kapalnou a tuhou fází (využívají se oba směry přechodu)
Důvody provádění: izolace složky (analytu) od matrice vzorku nebo rušivých složek pro další
stanovení (např. extrakce tuků ze vzorku potravin, extrakce komplexů kovů pro následné
fotometrické stanovení), zkoncentrování složek (extrakce drahých kovů pro AAS stanovení),
odstranění interferujících složek (extrakce komplexů těžkých kovů při chelatometrickém
stanovení Ca a Mg).
Základní vztahy (řada z nich je společná i pro chromatografii):
Distribuční (rozdělovací) koeficient – poměr rovnovážných koncentrací (lépe aktivit)
extrahované specie (např. dithizonátu olova) v obou fázích K D = [ S ]org [ S ] aq
Distribuční (rozdělovací) poměr – poměr celkových koncentrací extrahované složky (např.
olova) v obou fázích
D = (C S ) org (C S ) aq , pro kvantitativní jednostupňovou extrakci -
D>104.
Účinnost
extrakce
(procentický
podíl
vyextrahovaného
množství
složky):
E = 100 ⋅ D ( D + Vaqua Vorg . ) .
Účinnost extrakce lze zvýšit jejím opakováním: zbytková koncentrace ve vodné fázi po n
n
krocích je: c( A) aqua ,n = c( A) aqua ⋅ (Vaqua ( D ⋅ Vorg . + Vaqua ) .
Vzájemné oddělování různých složek: nutné rozdílné hodnoty D, separační faktor (faktor
selektivity)
β = D A DB >104.
Extrakce pevná látka – kapalina:
Soxhletův aparát – diskontinuální násobná extrakce, rozpouštědlo se regeneruje destilací.
Extrakce superkritickou tekutinou (SFE): plyn stlačený vysoko nad kritický tlak při teplotě
nízko nad kritickou teplotou (často CO2, směs CO2 + methanol), uspořádání: kontinuální
extrakce, výhody: extrakční schopnost lze ovlivňovat tlakem (u skutečné kapaliny je
konstantní), extrakce je rychlá, činidlo lze snadno odstranit odpařením.
Extrakce kapalina–kapalina: dávkové uspořádání-dělící nálevka.
Extrakce slabých kyselin a zásad do polárních rozpouštědel: extrahuje se pouze
elektroneutrální částice – distribuční poměr je ovlivněn hodnotou pH, např.: pro kyselinu HA
platí D = K D (1 + K HA [H + ]) . Volbou pH lze dělit různé kyseliny či zásady.
Extrakce kovů: samotné ionty kovů se neextrahují: nutno převést na elektroneutrální částice.
Elektroneutrální komplex - činidla např. diethyldithiokarbamát sodný (kupral), 8hydroxychinolin (oxin), dithizon. Ligandy jsou většinou slabé kyseliny (HL): extrakce je
ovlivněna hodnotou pH: Mn+ + nHL → MRn + nH+. Asociát iontu kovu nebo iontového
komplexu s vhodným protiontem (kladně nebo záporně nabitý, hydrofóbní charakter zaručí
vysokou rozpustnost asociátu v organické fázi). Vhodné protiionty: oxoniové ionty
18
kyslíkatých látek (ketony, ethery, estery, alkoholy), používají se přímo jako extrahovadla
(př.: [(C2H5)2O]3H+ FeCl4– ); organické dusíkaté báze, estery kys. fosforečné apod.
Maskování: převedení rušícího kovu na neextrahovatelnou formu.
Extrakce na tuhou fázi (SPE): většinou z vodného prostředí, slouží k přečišťování vzorků.
Sorbenty a interakce se složkou: podobné jako v kapalinové chromatografii, větší zrnitost.
Polární sorbenty: SiO2, Al2O3, florisil – adsorpce, případně H-vazby – izolace polárních
látek. Chemicky modifikovaný silikagel: uhlovodíky – nepolární sorbent, nitrilové skupiny
nebo primární aminy – mírně polární sorbent, sulfoskupiny nebo terc. aminy – iontově
výměnný sorbent.
Uspořádání: často pro jednorázové použití – cartridge podobné injekčním stříkačkám, disky,
naplněné špičky k pneumatickým dávkovačům (tips). Možná automatizace – deskové
uspořádání kontejnerů s SPE (well plates) ve spojení s dávkovačem vzorků. Mikroextrakce
na tuhou fázi (SPME): tenká vrstva sorbentu na křemenném vlákně umístěném v injekční
mikrostříkačce. Sorpce z kapalného nebo plynného prostředí, po sorpci se vlákno aplikuje
přímo do vstupního systému chromatografu.
Průběh SPE: kondiciování sorbentu, nanesení vzorku a retence složek, promytí, eluce.
Chromatografie - úvod
Základní princip: dělení mezi dvě fáze – mobilní (pohyblivou) (m.f.) a stacionární
(nepohyblivou) (s.f.)
Historie – Michail Semjovič Cvět – 1903 – dělení rostlinných barviv (χροµα - barva,
γραφειν - psát) na sloupci mleté křídy.
Dělení
•
•
podle skupenství stacionární fáze:
podle uložení stacionární fáze: kolonová (sloupcová),
vrstvě (planární)
chromatografie na tenké
fáze mobilní
fáze stacionární
technika
symbol
Plyn (plynová
chromatografie)
kapalina na nosiči
plynová rozdělovací chromatografie
GLC
tuhá látka
kapalina (polymer) vázaná
na nosiči
kapalina v pórech sorbentu
tuhá látka
plynová adsorpční chromatografie
kapalinová rozdělovací chromatografie
GSC
LLC
gelová permeační chromatografie
kapalinová adsorpční chromatografie
iontová chromatografie
chromatografie s mobilní fází v nadkritickém
stavu
GPC (SEC)
LSC
IEC
SFC
Kapalina (kapalinová
chromatografie)
Tekutina v nadkritickém
stavu
kapalina (polymer) vázaná
na nosiči
Průběh chromatografického dělení: dnes výhradně eluční uspořádání – a) malý objem
vzorku (směs složek) se nastříkne do proudu m.f.; b) složky se váží na s.f. – ustaví se
rovnováha mezi složkami v m.f a s.f.; c) m.f. je unášena dál, rovnováha se poruší a složky se
uvolní z s.f. do m.f.; proces b – c se neustále opakuje a pohyb složek kolonou se oproti m.f.
zpožďuje. Složky vázané pevněji na s.f. – jsou zadržovány (retardovány) déle – dojde
k rozdělení složek podle stupně jejich interakce se s.f. Následuje detekce složek. Protože se
zóny jednotlivých složek během své cesty kolonou rozšiřují (viz dále), záznam má tvar píků.
19
Základní mechanismy retence (podrobnosti viz dále u příslušných typů chromatografie):
fyzikální sorpce nebo chemisorpce na pevném povrchu, rozdělení mezi dvě kapaliny na
základě různé rozpustnosti, iontová výměna (heterogenní iontová rovnováha), průnik
molekul do pórů gelu (dělení na základě velikosti molekul).
Důležité veličiny:
Distribuční (rozdělovací ) poměr – poměr koncentrací dělené složky v s.f a m.f.:
D A = (C A ) S (C A ) M ;
Retenční faktor (kapacitní poměr) – poměr látkových množství k A = (n A ) S (n A ) M , jeli
kA=0, složka není vůbec zadržována a pohybuje se stejnou rychlostí jako m.f., je-li kA>20,
složka je zadržována nadměrně a nehodí se pro praktickou analýzu; separační poměr dvou
složek – viz výše.
Profil chromatografických píků.
Ideální tvar – symetrický: Gaussova křivka
2
2
c = c max ⋅ exp − (t − t R ) 2 ⋅ σ t ; parametr polohy tR – retenční čas (čas od nástřiku vzorku
k vrcholu píku); parametr rozšíření σ - polovina šířky píku v inflexním bodě nebo Y – šířka
píku u základny píku; parametr velikosti: cmax - výška píku (pozor: pro kvantifikaci analýzy se
častěji určuje plocha píku A). Jiná stupnice: retenční objemy: VR = tR⋅F (F – průtok mobilní
fáze). Důležitý parametr: mrtvý retenční čas tM (případně mrtvý retenční objem VM) –
retenční čas látky, která není v koloně vůbec zadržována (pozor: k retenčním veličinám nutno
přidat další index označující patřičnou složku). Obvykle se retenční veličiny vztahují
k mrtvým – redukovaný retenční čas složky A: tR',A = tR,A– tM (obdobně redukovaný retenční
objem VR',A). Vztah k distribučnímu poměru a retenčnímu faktoru:
V R′, A = DA ⋅ VS ;
(
)
k A = V R′, A VM .
Odchylky od Gaussova profilu: pík vytváří chvost nebo frontu – způsobeno nelineárním
průběhem adsorpční izotermy (závislosti koncentrace složky v s.f. a m.f.)
Rozlišení píků: píky dvou složek se mohou překrývat, stupeň překryvu je kvantifikován
pomocí rozlišení: Ri, j = 2 ⋅ (t R, j − t R,i ) (Yt, j + Yt,i ) - rozdíl retenčních časů (nebo objemů)
dělený průměrnou šířkou píků při základně. Dostačující rozlišení: R ≥ 1,5.
Separační schopnost kolony:
počet teoretických pater n = (t R , A σ t ) = 16 ⋅ (t R , A Yt ) ;
2
2
2
2
počet efektivních pater nef = (t R′ , A σ t ) = 16 ⋅ (t R′ , A Yt ) . Parametr nezávislý na délce kolony:
výška patra (výškový ekvivalent teoretického patra HETP): H = L/n (L – délka kolony).
(Pozor, jak hodnoty n, tak H odlišné pro různé dělené složky na téže koloně.)
Rozšíření píků: způsobeno nedostatečným ustanovením rovnováhy při chromatografickém
dělení. V ideálním případě: rovnováha mezi s.f a m.f. se ustanovuje okamžitě, H→0, úzké
píky.
Van Deemterův model – aditivní model: výška patra se odhadne jako součet několika
nezávislých příspěvků.
• Vířivá difuze v mobilní fázi: mezi částicemi s. f. jsou kanálky o různém průřezu,
m.f. proudí různou rychlostí – zóna složky se proto rozšiřuje. Příspěvek určený pouze
distribucí velikostí částic s.f. a jejich tvarem, nezávislý na rychlosti proudění m.f.
20
•
•
•
Molekulová difuze v mobilní fázi: zóna složky je obklopena z obou stran čistou m.f.
– koncentrační gradient způsobí difuzi. Příspěvek je přímo úměrný velikosti difuzního
koeficientu složky v m. f. (kapalné m. f. - nízké) a nepřímo úměrný rychlosti proudění
m. f.
Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi: v případě rozdělovací
chromatografie molekuly složky pronikají do různé hloubky s. f. a při zpětné desorpci
jsou různě dlouho zadržovány, příspěvek je ovlivněn tloušťkou vrstvy s. f. a velikostí
difuzního koeficientu složky v s. f., v případě adsorpční chromatografie hraje roli čas
potřebný k sorpci a desorpci, v obou případech je příspěvek přímo úměrný rychlosti
proudění m. f.
Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi: kapalina proudící kanálky mezi
částicemi s. f. má v důsledku viskozity nižší rychlost v blízkosti stěny kanálku než
uprostřed. Molekuly složky se proto pohybují různou rychlostí. Tento jev je částečně
kompenzován difuzí molekul složky kolmo na směr proudění. Příspěvek je přímo
úměrný rychlosti proudění m. f.
6. Chromatografie – úvod, pokračování
Kvalitativní analýza: klasický přístup - založen na porovnání retenčních dat s analýzou
čistých standardů složek, analýzu třeba provést na dvou kolonách s různou polaritou s.f.
Problematika stlačitelnosti nosného plynu v GC viz dále. Jiné možnosti: UV a fluorescenční
detektor – porovnání příslušného spektra s knihovnou spekter standardů; MS detektor –
porovnání s knihovnou MS spekter nebo v případě velmi přesných přístrojů kombinatorické
určení sumárního vzorce z hmotnosti molekulového píku.
Kvantitativní analýza: založena na porovnání ploch píků vzorku. Vnitřní normalizace –
poměrné složení směsi složek odpovídá poměrům ploch jejich píků, není třeba standard, nutná
stejná citlivost pro všechny složky. Vnější standard – nutné další analýzy jednoho nebo více
standardů, vyhodnocení pomocí kalibrační křivky. Standardní přídavek – principy viz
přednáška kalibrace. Vnitřní standard – ke vzorku se přidá složka v něm původně
neobsažená, obsah složky se vypočte z poměru ploch píků složky a vnitřního standardu, stačí
jedna analýza, nutná stejná citlivost detektoru pro všechny složky.
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
S.f. je nanesena v tenké vrstvě na desce (sklo, Al, plast), v nejjednodušším případě se použije
pouze papír (papírová chromatografie). Rychlá a laciná forma kapalinové chromatografie,
výhoda oproti kolonovému uspořádání: lze detekovat i velmi zadržované složky.
Průběh separace: vzorek se v podobě skvrny nanese blízko okraje desky (start), okraj desky
se ponoří do m.f. ve vyvíjecím tanku, m.f. vzlíná kapilárními silami a unáší složky vzorku.
Nejdále doputuje m.f. (čelo) - vzdálenost od startu d), vzdálenosti složek – dA; retardační
faktor: R F , A = d A d = 1 (1 + k ) . Detekce skvrn složek – vybarvení (vyvolání): neselektiví
(H2SO4, I2), selektivní (ninhydrin – aminoskupiny apod.); UV lampa (fluorescenční barvivo je
již zabudováno v s.f. nebo se nanese); složky značené radioizotopy.
21
Stacionární fáze: podobné jako v kapalinové chromatografii: silikagel, alumina (adsorpce),
modifikovaný silikagel (rozpustnost), sephadex (průnik), iontoměniče. Velikost částic 10-30
µm, tloušťka vrstvy okolo 250 µm, velikost desek 5×5 – 20×20 cm.
Mobilní fáze: podobné jako v kapalinové chromatografii, volí se tak, aby hodnoty RF ležely
v rozmezí 0,2–0,8.
Dvourozměrná chromatografie na tenké vrstvě: vzorek se nanese v blízkosti rohu desky,
provede se dělení v první m.f, deska se pootočí o 90 °, provede se dělení v druhé m.f.
Vysokoúčinná chromatografie na tenké vrstvě: velikost částic 5 µm, tloušťka vrstvy okolo
100 µm, dosáhne se zlepšení citlivosti a rozlišení, zkrátí se doba vyvíjejí.
Aplikace: nejčastěji kvalitativní analýza v biochemii, farmacii, kontrola čistoty, sledování
reakcí. Vyhodnocení: porovnání RF se standardy (nutno analyzovat na stejné desce).
Kvantitativní analýza: měří se reflektance skvrn; poměrně nízká přesnost.
Plynová chromatografie (GC)
Plynová adsorpční chromatografie (GSC)
Dnes méně běžná, separace adsorpcí na pevném sorbentu (aktivní uhlí, silikagel, alumina),
náplňové kolony, aplikace: analýza plynů nebo velmi těkavých kapalin (při vyšších teplotách
účinnost adsorpce klesá).
Plynová rozdělovací chromatografie (GLC)
Princip separace: dělení složek na základě různé rozpustnosti v kapalné s.f. Rozpustnost je
ovlivněna těkavostí složek: nižší bod varu → vyšší těkavost → nižší retence v koloně. Látky
s podobným bodem varu: rozhoduje blízkost polarity složky a s.f.
Aplikace: kapaliny s b.v. do 400 °C (při vyšších teplotách dochází k degradaci s.f.), netěkavé
nebo teplotně labilní látky: derivatizace.
Mobilní fáze: (nosný plyn) pouze unáší složky vzorku, nesmí se vzorkem reagovat –
nejčastěji N2, H2 nebo He (vede k lepšímu rozlišení). Musí byt velmi čisté: O2 (při vyšších
teplotách oxiduje složky vzorku) – odstranění na molekulovém sítu, uhlovodíky (ovlivňují
detektor, vysoký signál pozadí) – sorpce na aktivním uhlí, vlhkost (ovlivňuje s.f. a detektor) –
molekulové síto.
Náplňové kolony: průměr 2–3 mm, délka 1–3 m, sklo, ocel, plněné křemelinou (složí jako
velice porézní inertní nosič). Obecně nižší separační schopnost: dělení max. 20 složek.
Kapilární kolony: křemenné kapiláry, průměr 0,1 – 0,7 mm, délka 10 – 100 m. Vysoká
separační schopnost (lze dělit > 100 složek), kolony „narrow bore“ – velmi nízký průřez, malá
kapacita (< 0,1 µl), kolony „megabore“ – průměr > 0,5 mm, vyšší kapacita (do 10 µl vzorku)
avšak nižší rozlišení.
Stacionární fáze: řada nejrůznějších látek od vysoce polárních po nepolární.
Fyzikální vazba: vysoce viskózní kapaliny až konzistence vazelíny, př.: skvalan (uhlovodík,
nepolární), Carbovax (polyethylen glykol, polární).
22
Chemická vazba: hydroxypolysiloxany navázané na křemen pomocí siloxanové vazby,
polarita je určena substituenty na Si atomech: methyl + methyl – nepolární, methyl + fenyl:
středně polární, methyl + nitril, případně pouze nitril – silně polární.
Vliv teploty: ovlivňuje distribuční koeficient: log K D ≈ ∆H S → M ( R ⋅ T ) , pro optimální dělení
složek nutno nalézt vhodný teplotní program.
Vzorek a dávkování: nutný rychlý nástřik do proudu m.f. – úzká zóna. Kapaliny (0,1-10 µl) se
dávkují pomocí injekčních stříkaček přes septum ze silikonové gumy do vyhřívané dávkovací
komory. Plyny – dávkování pomocí dávkovacích ventilů.
Dávkování do kapilárních kolon: malá kapacita, proto často dělič vzorku – z proudu
zplyněného vzorku oddělí 2 – 10 %, které vstupují do kolony. Vzorky s nízkým obsahem
složek: dávkování bez děliče, vzorek se nechá zkondenzovat před kolonou nebo na začátku
kolony a uvolní se naráz nebo postupně teplem.
Dávkování do náplňových kolon: možné dávkovat větší množství vzorku (až 20 µl vzorku),
dávkování do zóny s teplotou o 20-50°C vyšší než teplota kolony nebo přímo do kolony.
Detektory
Tepelně vodivostní detektor (TCD): odporové vlákno umístěné v termostatovaném bloku
omývané efluentem z kolony, změna složení se projeví změnou tepelné vodivosti, ochlazením
vlákna a změnou jeho odporu. Univerzální, málo citlivý.
Plamenově ionizační detektor (FID): spalováním a hydrogenací látek vystupujících
z kolony vznikají ionty, které způsobí vznik elektrického proudu mezi dvěma elektrodami
s vloženým stejnosměrným napětím. Citlivý zejména na uhlovodíkové látky, signál je úměrný
počtu uhlíkových atomů.
Dusíko-fosforový detektor (NPD): obdoba FID, přítomnost keramické vrstvy s obsahem Rb
nebo Cs zvyšuje citlivost k látkám obsahujícím N a P.
Detektor elektronového záchytu (ECD): nosný plyn je ionizován proudem elektronů
emitovaných z radioaktivního β zářiče, některé složky, zejména látky obsahující Cl, elektrony
zachycují a snižují velikost ionizačního proudu.
Plamenový fotometrický detektor (FPD): efluent z kolony je přiváděn do vodíkového
plamene, dochází excitaci a emisi charakteristického záření, citlivý zejména na látky
obsahující S, P a N.
Hmotnostně spektrometrický detektor: viz kapitola o hmotnostní spektrometrii.
Speciální techniky. Pyrolýza a analýza plynných produktů – záznam (pyrogram) slouží k
identifikaci materiálů (barviva, plasty apod.). Analýza nasycených par (headspace analysis):
kapalný vzorek se umístí do uzavřené ne zcela naplněné vialky, po ustanovení rovnováhy se
plynná fáze analyzuje. Vhodné pro směsi těkavých a netěkavých látek.
Tepelná desorpce: analyzované složky jsou zachyceny na pevném sorbentu (např. kontrola
ovzduší: trubička naplněná aktivním uhlím), po zahřátí se uvolní a analyzují; viz též SPME.
23
Kvalitativní analýza:
Porovnání retenčních objemů se standardy, nutné provést na dvou kolonách s různě polární
s.f. problém: nosný plyn je stlačitelný – přibližný retenční objem: VR′, A = (t R , A − tM ) ⋅ Fm , čistý
retenční objem: korekce na tlakový spád v koloně.
Retenční indexy: poměr retenčních objemů neznámé složky a vhodného standardu, porovná
se s publikovanou nebo vytvořenou knihovnou.
Kováčovy indexy: založeny na řadě n-alkanů, porovnání s knihovnou.
Určení příslušnosti do homologické řady: logaritmus retenčního objemu je přímo úměrný
počtu atomů C v molekule.
Kapalinová chromatografie (LC)
Kapalinová adsorpční chromatografie (LSC) (chromatografie s normálními
fázemi)
Princip separace: adsorpce složek na povrch s. f., soutěžení s mobilní fází.
Stacionární fáze: silně polární, zrnitost od 3 do 10 µm, aktivace: ohřevem se uvolní
nasorbovaná vlhkost, která blokuje aktivní místa. Silikagel: nejběžnější, vazba pomocí Hmůstků na silanolové skupiny, kyselý charakter – silná retence bazických složek. Alumina:
vazba elektrostatickými silami, bazický charakter.
Mobilní fáze:nepolární nebo slabě polární rozpouštědla, eluční síla: voda > propanol > aceton
> dichlormethan > ethylether > benzen > cyklohexan > pentan. Gradientová eluce: směs více
rozpouštědel, složení se plynule mění. Izokratická eluce: konstantní složení m.f.
Separované složky: eluce v pořadí stoupající polarity: alkany – alkeny – aromatické
uhlovodíky – ethery – estery – ketony a aldehydy – thioly – aminy a amidy – alkoholy –
kyseliny. Při stejné polaritě: látka s větší molární hmotností je zadržována silněji.
Kapalinová rozdělovací chromatografie (LLC) (chromatografie s obrácenými
fázemi)
Princip separace: rozdělení složek mezi dvě kapalné fáze. Nutná dokonalá nemísitelnost,
proto s.f. musí být chemicky vázaná. Kromě dělení na základě různé rozpustnosti se uplatňuje
i sorpce.
Stacionární fáze: nepolární nebo mírně polární. Chemicky modifikovaný silikagel: silanové
slupiny kondenzují s dimethyl alkyl (R) chlor silanem, vazba Si–O–Si–C. Nepolární s.f.: R =
oktadecyl, oktyl, butyl, ethyl, methyl, fenyl. Mírně polární: R = nitryl, amin, diol.
Mobilní fáze: polární látky, čím nižší polarita, tím větší eluční síla: H2O < CH3OH < CH3–
CN < C4H8O < (CH3)2C = O, gradientová i izokratická eluce.
Separované složky: eluce v pořadí klesající polarity: Největší retence: alkany, zcela
disociované sloučeniny: nulová retence (tr = tM). Chromatografie iontových párů: např.
peptidy s kyselinou trifluoroctovou. Sloučeniny acidobazické povahy (kyseliny, zásady,
amfolyty): stupeň disociace, a tím i retence závisí na pH mobilní fáze, lze využít pro dělení.
Gelová permeační chromatografie (GPC, SEC)
Stacionární fáze: kulové částice (10 µm) s póry o definovatelné velikosti (4 – 250 nm). Se
složkami v ideálním případě neinteraguje, často však slabé elektrostatické interakce, nutno
24
odstínit vyšší iontovou sílou m.f. Polystyren: org. m. f., silikagel a skla: org. i vodné m.f.,
Sephadex : separace peptidů a bílkovin.
Mobilní fáze: nesmí ovlivňovat složky. Vodné roztoky anorganických solí i organická
rozpouštědla.
Princip separace: mechanické dělení podle velikosti molekul. Velké molekuly procházejí
volně mezi částicemi gelu, menší molekuly vstupují dovnitř pórů a jsou zadržovány. Platí:
VR , A = V0 + K D , A ⋅ Vi . Vi je objem m.f. v pórech, V0 je objem m.f. mezi částicemi gelu, KD,A
〈0,1〉. V pracovní oblasti (je řízena velikostí pórů) závisí VR lineárně na logaritmu molární
hmotnosti složky.
7. Kapalinová chromatografie - pokračování
Iontově výměnná chromatografie (IEC)
Stacionární fáze: nosič - kulové částice o průměru asi 10 µm (silikagel, styrendivinylbenzenový kopolymer), na něm navázané funkční skupiny. Katexy (pro analýzu
kationtů): silné – sulfonové skupiny –SO3–H+, slabé – karboxylové skupiny –COO–H+.
Anexy (analýza aniontů): silné – kvartérní amoniové báze –CH2N+(CH3)3OH–, slabé –
primární nebo sekundární aminy.
Mobilní fáze: vždy gradientová eluce, první roztok: pufr, druhý roztok: roztok protiiontu
(silný elektrolyt).
Princip separace: heterogenní iontová výměna protiiontu za ionty dělených složek mezi s.f. a
m.f., např. pro dělení kationtů (protiion H+): (–SO3–H+)s.f. + (Na+)m.f. ⇔ (–SO3–Na+)s.f. +
(H+)m.f. Hodnota retenčního faktoru je nepřímo úměrná koncentraci protiiontu v m.f.
Průběh analýzy: kondiciování kolony protiiontem – všechna vazebná místa jsou obsazena
protiiontem; promytí roztokem pufru – protiion je pouze v s.f.; nanesení vzorku – dojde
k navázání všech iontů příslušného náboje; gradientová eluce roztokem protiiontu – nutno
předem stanovit koncentraci postačující k úplné eluci všech složek vzorku.
Iontová chromatografie (IC)
Forma IEC pro analýzu anorganických a silných organických elektrolytů.
Potlačovací kolony: umístěná za analytickou kolonou – přemění elektrolyt v m.f. na vodu, v
roztoku zůstanou pouze ionty analyzovaných složek.
Detekce: vodivostní.
Další chromatografické techniky
Chirální separace - dělení enantiomerů, s.f. – nosič (silikagel, silikagel) s navázaným
chirálním selektorem, př.: cyklodextriny, L–prolin pro dělení aminokyselin apod.
Afinitní (vylučovací) chromatografie: s.f. nosič s navázanou látkou, která specificky váže
pouze určité látky, ostatní složky procházejí v mrtvém objemu, zadržená složka se uvolní
změnou m.f. Použití zejména v biochemii. Př.: s.f. s imobilizovanou Cibacromovou modří
váže albumin.
25
Instrumentace v kapalinové chromatografii
Odplynění a filtrace m.f.: pevné částice se zachytí na filtru o porozitě 2 µm. Odplynění:
probubláváním He (rozpuštěný vzduch by se vylučoval v podobě bublin v detektoru).
Čerpadla: 0,01 – 10 ml/min, tlak až 35 MPa, materiál: ocel, safír, teflon, PEEK. Pístová: 1 –
2 písty poháněné vačkou, průtok se řídí frekvencí a velikostí zdvihu pístu, musí být zařazen
tlumič pulzů. Lze mísit m.f. až ze čtyř z složek. Lineární dávkovač: princip injekční stříkačky,
píst tlačen servomotorem, velmi přesně nastavitelný průtok, bez pulzů, pouze izokratická
eluce.
Zavádění vzorku: („nástřik“) šesticestný injektor s nástřikovou smyčkou, materiál ocel
nebo PEEK.
Předkolony: krátká kolonka naplněná stejnou s.f. jako hlavní kolona.
Kolony: rovné trubice, ocel nebo sklo, náplňové – částečky 3, 5 nebo 10 µm, úzká distribuce
velikostí – vysoká rozlišovací schopnost (HPLC – high performance liquid chromatography),
nutný vysoký tlak m.f. pro překonání odporu. Klasické kolony: 3 – 25 cm, průměr 4,6 mm,
průtok m.f. 0,5 – 2 ml/min. „Mikrobore“ kolony: 25 – 50 cm, lze spojovat dohromady,
průměr 1 – 2 mm, průtok m.f. 0,01 – 0,1 ml/min. Dosahuje se vysokého rozlišení, analýza je
však pomalá, nutné dávkovací zařízení pro malé objemy vzorku a detektory s malým
objemem průtočné měřící cely.
Detektory: všeobecné požadavky – rychlost, citlivost, univerzálnost, dynamický rozsah,
malý objem měřící cely. Používají se optické a elektrochemické detektory.
Fotometrický detektor: měří se závislost absorbance na retenčním objemu Φf = f(VR),
pracuje obvykle v UV oblasti od 190 nm (zdroj – D2 lampa), kyveta 10 mm dlouhá, objem 5 –
10 µl. Dostatečná citlivost, detekuje molekuly obsahující chromofory (nenasycené skupiny,
násobné vazby atd.), není významně citlivý na změny teploty, lze použít pro gradientovou
eluci. Jednodušší detektory: měření pouze na jedné vlnové délce. Diode array detektory:
snímají celé absorpční spektrum najednou, rozsah 190 – 800 nm (zdroj je doplněn o W
žárovku), rychlost až spektrum za 0,1 s. Spektrum lze využít pro identifikaci složek –
porovnání s knihovnou spekter.
Fluorimetrický detektor: měří se intenzita fluorescenčního záření vydáveného molekulami
složek po jejich excitaci primárním zářením (viz kapitola Molekulová spektrometrie) Φf =
f(VR). Velmi citlivý, teplotně nezávislý, lze použít pro gradientovou eluci. Detekuje zejména
molekuly obsahující aromatická jádra (PAH apod.), některé látky lze převést na fluoreskující
pokolonovou derivatizací, např. reakce aminů a aminokyselin s dansyl chloridem.
Diferenciální refrektometrický detektor: měří se rozdíl indexu lomu efluentu z kolony
oproti čisté m.f. ∆n = f(VR), je univerzální avšak málo citlivý, náročný na teplotní stabilitu,
nelze použít pro gradientovou eluci.
Voltametrický detektor: měří se proud protékajíc mezi dvěma elektrodami (pracovní –
polarizovatelná, Pt, Au, skelný C, + referentní) I = f(VR); napětí je konstantní, detekuje složky
schopné oxidace nebo redukce, m.f. musí být vodivá, vysoká citlivost.
Konduktometrický detektor: měří se změny vodivosti G = f(VR), vhodné pro separaci
silných elektrolytů (iontová chromatografie), mírně závislý na změnách teploty.
26
Chromatografie tekutinou v nadkritickém stavu (SFC)
Mobilní fáze:
-velice hustá tekutina - teplota mírně nad Tk , vysoký tlak >> pk. Př.: CO2 Tk = 31°, pk = 7,3
MPa, pracovní teplota 40 – 90 °C, pracovní tlak 20 – 30 MPa.
srovnání s LC a GC:
– viskozita nižší než u kapaliny (lepší proudění v kapiláře)
– difuzní koeficienty nižší než u plynu (nižší hodnota výšky patra)
Aplikace: látky které nelze analyzovat GC (vysoký bod varu nebo termolabilní) ani LC (není
vhodný detektor).
Kolona: kapilární (0,05 – 0,1 mm × 5 – 10 m) umístěná v termostatu, vázaná s.f.
(polysiloxan),
zakončení: kapilára průměr 5 µm – přechod do atmosférického tlaku.
Detektor: FID
Elektromigrační metody
Základní principy separace: migrace iontů v elektrickém poli, na ion působí elektrostatická
síla: F1 = z ⋅ e ⋅ E (E – potenciálový spád V/m) proti ní působí brzdná síla (odpor prostředí):
F2 = −6 ⋅ π ⋅η ⋅ r ⋅ v (η - viskozita prostředí, r – velikost iontu, v – rychlost pohybu iontu).
Rovnoměrný pohyb: obě síly jsou vyrovnány v = u ⋅ E (u - pohyblivost).
Gelová elektroforéza
Uspořádání: gel (desky, délka 5 – 25 cm, tloušťka 1 – 2 mm; naplněné kolony, průměr 5
mm, délka 7 – 10 cm), případně pouze papír, se nasytí pufrem, vzorek (0,1 – 1 ml) spolu se
standardy se nanesou v podobě skvrn do prohlubní na okraji desky nebo na vršek kolony,
okraje desky nebo kolony se připojí ke stejnosměrnému napětí (do 50 V/cm), separace trvá až
několik hodin.
Kvalitativní vyhodnocení: porovnání délky dráhy neznámé složky s dráhou standardu, také
je možné skvrny vyříznout a zpracovat další technikou (MS), případně laserová ablace.
Druhy gelů: polymerové gely, např. polyakrylamid (univerzální použití), agarosa (dělení
makromolekul), škrob, Sephadex.
Používané pufry: zajišťuje elektrickou vodivost a stabilitu pH. Obvykle koncentrace 0,05 –
0,5 mol/l. Pozor: u molekul s kyselými i bazickými skupinami hodnota pH rozhoduje o to, zda
se molekula bude ve formě kationtu nebo aniontu – izoelektrický bod: molekula je formálně
elektroneutrální (obojetný ion).
Detekce: vybarvení skvrn pomocí specifické reakce, např. ninhydrin pro aminokyseliny,
Coomassie modř pro proteiny.
Speciální aplikace
Dvourozměrná gelová elektroforéza – první dělení pomocí izoelektrického fokusování,
další dělení v kolmém směru pomocí elektroforézy v gelu s přídavkem dodecylsulfátu
sodného. Částice vytvoří ionty o shodném náboji: dělení proběhne podle velikosti částice.
27
Izoelektrické fokusování: pufr, kterým je gel nasycen, má gradient pH. Molekuly doputují
pouze do místa, jehož pH odpovídá izoelekrickému bodu.
Imunoelektroforéza: po elektroforetické separaci proteinů se gel nasytí vhodným antisérem,
dojde k tvorbě sraženiny.
Kapilární elektroforéza (CE)
Základní uspořádání: separace probíhá v SiO2 kapiláře délky 25 – 75 cm, průměr 20 – 100
µm, potenciálový spád do 500 V/cm (nutné chladit). Vzorky (1 – 50 nl) se nanášejí do začátku
kapiláry tlakem nebo elektrokineticky. Pufry stejné jako v gelové elektroforéze, detektory
podobné jako u LC – UV a fluorescenční.
Elektroosmotický tok (EOF): kromě migrace iontů se uplatňuje další hybná síla:
elektroosmotický tok vyvolávající hydrodynamické proudění unášející všechny složky vzorku
(anionty, kationty, elektroenutrální částice) směrem ke katodě. Vznik: silanolové skupiny na
povrchu kapiláry se ionizují a uvolňují protony, hydratované protony putují ke katodě a
strhávají všechny součásti roztoku v kapiláře.
Speciální aplikace
Kapilární zónová elektroforéza (nejběžnější): složky jsou unášeny pomocí směrem ke
katodě, EOF se kombinuje s migrací: kationty postupují rychleji než EOF a jsou vzájemně
separovány, elektroneutrální částice postupují pouze vliv EOF a nejsou separovány, anionty
postupují pomaleji než EOF a jsou vzájemně separovány.
Micelární elektrokinetická chromatografie: do pufru se přidá povrchově aktivní látka
(např. dodecylsulfát sodný) vytvářející velké agregáty (micely s hydrofóbním centrem a
iontovým obalem), které působí jako pesudostacionární fáze. Micely se pohybují rychleji,
případně pomaleji než EOF (podle jejich náboje), elektroneutrální molekuly se separují na
základě různé distribuce mezi micely a pufr.
Kapilární gelová elektroforéza: kapilára je naplněna gelem (polyakrylamid, agaróza), větší
molekuly jsou zadržovány více než molekuly malé.
Kapilární izoelektrická fokusace: viz výše. Obvyklý rozsah pH 3 – 10, molekuly doputují
do zóny odpovídající izoelektrickému bodu a obsah kapiláry se tlakem vytlačí do detektoru.
Kapilární elektrochromatografie
Kombinace HPLC a elektroforetického dělení. Kapilára je plněná s.f. – chemicky
modifikovaný silikagel, nutná velmi jemná zrnitost < 5µm, dosáhne se velmi vysokého
rozlišení.
Izotachoforéza
Základní uspořádání: podobné jako CE, teflonová kapilára, na konce vložené napětí (102
kV, proud 102 µA).
Dva druhy elektolytů. Vedoucí elektrolyt – elektrodový prostor, do kterého směřuje migrace
+ separační kapilára – pohyblivost větší, než pohyblivost všech dělených iontů. Koncový
elektrolyt
– pohyblivost menší, než pohyblivost všech dělených iontů, uzavírá vzorek.
Separace: jednotlivé složky se rozdělí do zón v pořadí pohyblivosti, pohybují se konstantní
rychlostí.
28
Detektor: vodivostní nebo teplotní (měří se teplo uvolněné vedením proudu ≈R⋅I2, proud
musí být v celém obvodu shodný, zóny mají proto v důsledku různé vodivosti rozdílnou
teplotu).
Kvalitativní vyhodnocení: hodnota odezvy detektoru, kvantitativní vyhodnocení: délka
zóny (záznamu).
8. Spektrometrie - principy, spektrometrická instrumentace
Spektrometrie je soubor analytických metod (kvalitativních i kvantitativních) využívajících
interakci hmoty (molekul, atomů, jader atomů) s elektromagnetickým zářením široké škály
vlnových délek. Při interakcích dochází k výměně energie.
Dělí se
• podle mechanismu: absorpční, emisní, fluorescenční, rozptylové
• podle stavu hmoty: atomová, molekulová
• podle oblastí vlnových délek zkoumaného záření
• podle druhu energie: elektronová, vibrační, rotační, spinová
Oblast vlnových délek
vlnová délka
druh přechodu
zdroj záření
Rentgenová (X)
Vakuová ultrafialová
Ultrafialová (UV)
Viditelná (VID)
Blízká infračervená (IČ)
Střední infračervená
Vzdálená infračervená
Mikrovlnná
Radiofrekvenční
0,01–10 nm
10 – 180 nm
180 – 380 nm
380 – 780 nm
0,78 – 2 µm
0,002 – 0,02 mm
0,02 – 1 mm
0,1 – 10 cm
0,1 – 100 m
vnitřní elektrony
valenční elektrony
rtg. lampa
elektrický výboj,
plamen plazma
vibrace
molekul
rozžhavené
vlákno/tyčinka
rotace molekul
spin jader nebo elektronů
elektrický obvod
Vlastnosti záření
Korpuskulární teorie: záření je proud elementárních částic – fotonů: rychlost v, energie E
(vyjadřuje se často v elektronvoltech eV; 1 eV = 1,602⋅10–19 J).
Vlnová teorie: elektromagnetické vlnění šířící se prostorem charakterizuje frekvence ν počet kmitů za 1 s [Hz = s–1], důležité: nezávisí na prostředí, kterým se záření šíří. Vlnová
délka λ - vzdálenost mezi dvěma maximy na vlnění, rychlost v = λ ⋅ ν. (Pozor: rychlost
světla je nejvyšší ve vakuu c = 2,998⋅108 m/s; důležitá fyzikální konstanta). Další veličina:
vlnočet ν~ = 1 λ , obvykle [cm–1]: počet vln záření na 1 cm.
Spojení obou přístupů: Planckova teorie: E = h ⋅ ν = h ⋅ c λ = h ⋅ c ⋅ν~ (h – Planckova
konstanta 6,626⋅10–34 J/s).
Spektrum: závislost intenzity záření (počtu fotonů) na energii fotonů. Energie může být
vyjádřena pomocí vlnové délky, frekvence či vlnočtu.
29
Energetické hladiny atomů
Kvantová teorie: atom může nabývat pouze diskrétních hladin energie, přechody jsou
dovoleny pouze mezi těmito hladinami. Elektrony jsou lokalizovány v atomových orbitalech
s charakteristickou prostorovou distribucí okolo jádra. Popis: hlavní kvantové číslo n –
významně ovlivňuje energii; vedlejší kvantové číslo l – určuje tvar orbitalu, mírně ovlivňuje
energii; magnetické kvantové číslo m – určuje orientaci orbitalu v prostoru, bez přítomnosti
vnějšího magnetického pole energii neovlivňuje; spinové magnetické číslo ms – odpovídá
směru rotace elektronu či jádra. Povolené jsou pouze vybrané přechody (výběrová pravidla).
Absorpční i emisní spektra atomů jsou čárová.
Energetické hladiny molekul
Elektronové hladiny: při vzniku chemické vazby vznikají molekulové orbitaly kombinací
atomových orbitalů; rozeznáváme vazebné orbitaly σ (jednoduché vazby) a π (násobné
vazby), nevazebné orbitaly (neúčastní se vazeb – volné elektronové páry, např. na atomech O
či S) a antivazebné (protivazebné) orbitaly σ* a π* (v základním energetickém stavu
molekuly nejsou obsazeny).
Vibrační a rotační hladiny energie: molekuly (na rozdíl od atomů) mohou vibrovat a
rotovat. Oba příslušné typy energie jsou opět kvantované. Pro energetické rozdíly mezi
jednotlivými typy stavů platí přibližně: ∆ Eel : ∆ Evib ≈ 1000, ∆ Eel : ∆ Erot ≈ 109. Molekula
obsahuje řadu blízkých energetických hladin: absorpční i emisní spektra jsou obvykle pásová.
Interakce záření s hmotou: emise – absorpce – fluorescence/fosforescence - rozptyl
Kvalitativní vyhodnocení: energie (vlnová délka, vlnočet, frekvence) absorbovaného nebo
emitovaného záření je určena druhem interagující částice: strukturou molekuly, strukturou
elektronového obalu atomu.
Kvantitativní vyhodnocení: intenzita spektrálních čar nebo pásů (tedy počet absorbovaných
nebo emitovaných fotonů) závisí na počtu částic v daném výchozím stavu a kvantově
mechanické pravděpodobnosti přechodu z výchozího do výsledného stavu. Počet částic
v daném energetickém stavu určuje Boltzmannův zákon:
N n N m = g n g m ⋅ exp(− ∆E mn k ⋅ T ) , N jsou počty části, g stupně degenerace daných
energetických stavů, T je teplota a k je Boltzmannova konstanta (k = 1,38⋅10–19 J/K).
Sledované veličiny: zářivý tok Φ - výkon přenášený zářením [W], intenzita záření I – zářivý
tok emitovaný do jednotkového prostorového úhlu [W/sr].
Absorpce záření: sleduje se světelný tok vstupující do absorpčního prostředí (Φ0) a zářivý
tok vystupující Φ. Veličiny: transmitance (propustnost) τ = Φ Φ 0 , absorbance A = –logτ
Absorpční spektrum: závislost τ nebo A, příp. ε (spektra v databázích) na λ nebo ν~ či E,
případně na ν.
Lambertův-Beerův zákon: A = ε⋅b⋅c
Absorbance (při dané vlnové délce) závisí přímo úměrně na koncentraci sledované látky c a
délce absorpčního prostředí b, ε je molární absorpční koeficient, je dán pravděpodobností
daného kvantového přechodu, závisí tedy na druhu částice i vlnové délce, lze ho vypočítat
metodami kvantové mechaniky, v praxi se určuje pomocí kalibrace (přibližné hodnoty ε lze
pro vybrané látky a vlnové délky nalézt v chemických/analytických tabulkách).
30
Absorbance je aditivní veličina, lze využít i pro analýzu směsi absorbujících látek: při
analýze n látek je nutno měřit na n různých vlnových délkách a znát n×n absorpčních
koeficientů.
Podmínky platnosti LB zákona: monochromatické záření, rovnoběžné paprsky dopadající
kolmo na absorpční prostředí, nedochází k rozptylu záření, absorbující částice se vzájemně
neovlivňují.
Emise záření: sleduje se intenzita emitovaného záření I, ta závisí na počtu excitovaných
částic: I = K ⋅ N 0 ⋅ exp(− ∆E mn k ⋅ T ) . K je konstanta daná pravděpodobností daného
přechodu, N0 je počet částic v základním (nejnižším) energetickém stavu. Při konstantní
teplotě a dalších experimentálních podmínkách platí zjednodušený vztah: I = K ′ ⋅ c . Emisní
spektrum: závislost I na λ. Vnitřní standard (správněji: porovnávací prvek): složka původně
nepřítomná ve vzorku, přidá se ve stejné koncentraci ke vzorkům i kalibračním standardům,
při vyhodnocování se sleduje poměr signálu analytu a vnitřního standardu, je méně závislý na
experimentálních podmínkách.
Fluorescence: sleduje se intenzita emitovaného fluorescenčního záření IF, ta závisí na
množství absorbovaného budícího záření: IF = k⋅(Φo − Φ) = k⋅Φo (1 − 10−ε⋅ b⋅ c). Konstanta k je
fluorescenční výtěžek. Pro nízké koncentrace platí: IF = k⋅Φo⋅ 2,303⋅ε⋅b⋅c =k’⋅c. Citlivost
analýz lze tedy ovlivnit intenzitou budícího záření.
Základní části spektrometrů
Absorpční spektrometry
Zdroje záření: D2 lampa pro UV oblast, W (příp. halogenová) žárovka pro viditelnou oblast,
žhavená keramická tyčinka pro IČ oblast, další speciální zdroje viz další přednášky.
Absorpční prostředí: pro molekulovou spektroskopii (analýza roztoků) to jsou kyvety křemen pro UV, sklo pro viditelnou oblast, krystaly halogenidů pro IČ oblast. Pro atomovou
spektroskopii např. plamen.
Monochromátory (rozklad polychromatické záření na monochromatické paprsky): starší
přístroje - hranoly (využívají závislost indexu lomu na vlnové délce), současné přístroje – ryté
(interferenční) mřížky. Interferenční filtry.
Detektory: starší přístroje – záznam na fotografickou desku, dnes – využití fotoelektrického
jevu (obecně převod optického signálu na elektrický)..
Fotonásobiče využívají vnější fotoelektrický jev, po dopadu fotonu na fotokatodu (materiál
s nízkou výstupní prací elektronu) je vyražen elektron, který vyráží další elektrony na systému
dynod. V reálném čase snímá signál pouze na jedné vlnové délce.
Fotodiody využívají vnitřní fotoelektrický jev, lze je uspořádat plošně tak, že snímají celé
spektrum najednou - detektory typu diodové pole („diode array detector - DAD“, „chargecoupled device - CCD“)
Emisní spektrometry
odpadá zdroj záření, zdrojem je sám excitovaný vzorek. Excitace v atomové spektrometrii –
tepelnou energií (plamen, plazma, elektrický výboj, mikrovlnné pole), v molekulové
31
spektrometrii – tyto způsoby excitace nelze použít, nutné pracovat technikou fluorescenční
spektrometrie (excitace zářením).
Jednopaprskové spektrometry: jednodušší uspořádání, srovnávací paprsek (hodnota Φo
v absorpční spektrometrii, signál vnitřního standardu v emisní spektrometrii) musí být měřen
separátně.
Dvoupaprskové spektrometry: paprsek zdroje je rozdělen do dvou toků, které se
zpracovávají samostatně. V případě absorpční spektrometrie lze současně měřit hodnoty Φo i
Φ, v případě emisní spektrometrie lze měřit současně signál analytu i vnitřního standardu.
Uspořádání je méně citlivé vůči kolísání experimentálních podmínek
Spektrometry využívající Fourierovu transformaci
Michelsonův interferometr
9. Atomová spektrometrie
Plamenová emisní spektrometrie (FES)
Princip
Měření charakteristické emise záření atomů v plynném stavu za teploty plamene (propanvzduch 2000 K, acetylen-vzduch 2500 K, acetylen-N2O 3000 K) hlavně pro prvky ze
skupiny I.A a II.A (mají relativně nízké excitační energie teplota plamene stačí vybudit
pozorovatelnou emisi), také jednoduchá plamenová zkouška (např. Na barví plamen žlutě).
Průběh experimentu: 1. vznik aerosolu z roztoku (zmlžování), 2. odstranění rozpouštědla,
3. přechod do plynného stavu, 4. atomizace, 5. excitace až ionizace, 6. emise (vedle emise
analytu též emise H2O, CO a spalin – nutno provádět korekci na pozadí)
Instrumentace
Plamenový fotometr (levný, jednoduchý přístroj)
Roztok analytu nasáván palivem a oxidovadlem přes zmlžovač (tvorba aerosolu) do plamene.
Emitované záření prochází monochromátorem nebo interferenčním filtrem do detektoru
(fotonásobič).
Aplikace: stanovení Na, K, Ca (srovnávací měření – kalibrace pomocí standardních roztoků,
intenzita emise přímo úměrná koncentraci v ověřeném rozsahu hodnot)
Optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP – OES)
Princip
Měření charakteristické emise záření atomy v plynném stavu za teploty plazmatu (vzniká
ionizací argonu v magnetickém poli vysokofrekvenční cívky, teplota 6000 - 10000 K).
32
Instrumentace
Vzorek se přivádí do zmlžovače a do plazmového hořáku emitované záření přes
polychromátor (rozdělí záření podle λ -srovnej monochromátor!!) nebo sadu monochromátorů
na detektory (fotonásobiče nebo diodové pole) .
Místo zmlžovače také laserová ablace (přechod vzorku do plynného stavu působením
laseru), hydridová technika a elektrotermická atomizace (viz AAS).
Aplikace
Mnohem vyšší citlivost než u plamenové fotometrie, možné současné stanovení desítek
analytů – metoda vhodná pro tzv. „screening“.
Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS)
Princip
Ionty po snížení tlaku vstupují z plazmatu do hmotnostního spektrometru většinou
s kvadrupólovým analyzátorem (viz kap. o MS), obecně o řád vyšší citlivost než u ICP-OES,
možnost sledovat různé izotopy téhož prvku.
Izobarické interference: různé prvky poskytují ionty o stejném poměru hmotnosti a náboje m/z
(např. Ca a Ar).
Polyatomické interference: molekulové fragmenty nebo vícenásobně nabité ionty o stejném
m/z jako analyt (např. ArO a Fe), odstranění pomocí tzv. reakční cely. Vlivy matrice
(netěkavé pevné látky a přebytky solí).
Rentgenová fluorescenční spektrometrie (rentgenová emisní analýza)
Princip
Vyražení vnitřního elektronu rentgenovým zářením nebo částicí (elektron, alfa částice) a
následné přechody elektronu z vyšších hladin ⇒ emise RTG záření specifická pro daný
prvek. Označování přechodů.
Moseleyův zákon: 1/λ = a.(Z-b)2 , kde Z je atomové číslo, λ.vlnová délka pro daný typ
přechodu (např. Kα), a,b jsou konstanty.
Zároveň dochází k absorpci RTG záření: průběh závislosti absorpce RTG na λ vykazuje
extrémy ⇒ některé linie emitované analytem mohou být právě absorbovány jiným prvkem.
Instrumentace (dva typy přístrojů)
Vlnově disperzní:
Zdroj RTG záření - rentgenka.
Vzorek
Kolimátor (propouští jen rovnoběžné paprsky)
Otočný krystal (LiF nebo křemen) - platí Braggova rovnice: nλ = 2dsinθ, kde n je řád
difrakce, d je mřížková vzdálenost, 2θ úhel difrakce
Detektor (plynový na principu Geigerovy trubice, neproporcionální – snímá pouze intenzitu
záření) .
Energeticky disperzní – zároveň detekovány a poté analyzovány všechny energie
emitovaného RTG záření pro získání prvkového složení vzorku – EDAX (energeticky
disperzní RTG analýza).
Detektory proporcionální (měří počet i energii dopadajících fotonů)- plynové, scintilační
nebo polovodičové.
33
Přístroj může být využit i pro elektronovou mikroskopii a mikroanalýzu umožňující získat
zároveň obraz povrchu i prvkové složení vzorku. Vzorek bombardován elektrony jako
v rastrovacím (skenovacím) elektronovém mikroskopu (SEM) pro získání obrazu.
Aplikace v kvalitativní analýze
Výhodná pro elementární analýzu, nehodí se ale pro stopové obsahy. Výtěžek fluorescence u
lehkých prvků (Ti) malý.
Aplikace v kvantitativní analýze
Intenzita fluorescence je úměrná obsahu vzorku, přesnost je srovnatelná s chemickou
analýzou. Je to metoda nedestruktivní!
Atomová absorpční spektrometrie (AAS)
Princip
Míra absorpce záření o specifických vlnových délkách z oblasti UV-VIS prvky v plynném
stavu odpovídá koncentraci, platí Lambertův-Beerův zákon – AAS absorpcí energie - přechod
na excitované hladiny, (pak může následovat emise charakteristických λ – fluorescence
(AFS)).
Instrumentace
zdroj – výbojka s dutou katodou – emise čárového spektra pro daný analyt (skleněná
trubice s křemenným okénkem, plněná např. Ar, elektrickým výbojem excitovaný plyn
vyráží z katody obsahující stanovovaný prvek atomy, které jsou výbojem excitovány a při
návratu do základního stavu emitují charakteristické záření) také bezelektrodové výbojky (k
excitaci dochází radiofrekvenčním polem cívky).
Způsoby atomizace vzorku:
• zmlžování do plamene (obdobně jako u FES) – měřená absorbance odpovídá
koncentraci,
• atomizace v grafitové pícce (elektricky vyhřívaná grafitová trubička se vzorkem,
promývaná plynným Ar) – integrál časové závislosti absorbance (pík) odpovídá
množství analytu, zvýšená citlivost stanovení (až o 3 řády)– stačí malé množství (µl)
vzorku reprodukovatelnější výsledky,
• hydridová technika pro prvky tvořící těkavé hydridy (např. As, Sb, Se) působením
NaBH4 .
Za absorpčním prostředím umístěn monochromátor a detektor.
Nutno eliminovat:
• spojité záření plamene (modulací záření výbojky),
• absorpci matrice vzorku – tzv.pozadí buď použitím deuteriové výbojky (vedle
výbojky s dutou katodou) jako zdroje spojitého záření, měří se střídavě absorpce
záření z obou zdrojů, nebo využitím Zeemanova jevu (působením magnetického pole
dojde k rozštěpení atomových orbitalů a tím i linií emitovaných zdrojem na linie, na
kterých absorbuje pouze pozadí a na linie, na kterých absorbuje pozadí i analyt. Tyto
linie jsou současně i různě polarizované.
Interference
• matrice - eliminuje se metodou standardního přídavku nebo měřením standardů ve
stejné matrici,
34
•
•
•
chemická – tvorba netěkavých solí ,
ionizační – ionizace vedle excitace u snadno ionizovatelných analytů (alkalické
kovy), potlačuje se nadbytkem snadno ionizovatelných příměsí,
spektrální – linie dvou analytů velmi blízko sebe, nutno měřit na jiné linii.
Aplikace
Stanovení jednotlivých prvků v nízkých koncentracích, metoda se nehodí pro „screening“.
10. Molekulová spektrometrie – 1. část
Molekulová absorpční spektrometrie v oblasti ultrafialové a viditelné
Absorpce záření z oblasti ultrafialové (běžně 200-400 nm) nebo viditelné (400-800 nm),
spojená s přechodem na excitovanou elektronovou hladinu a uplatňuje se u
• prvků s d a f orbitaly
• u organických molekul – energie orbitalů roste (obvykle) v řadě:
σ (vazebný) π (vazebný) n (nevazebný) π∗ (antivazebný) σ∗ (antivazebný)
přechody σ - σ∗
pod 200 nm (vakuová UV), např.alifatické uhlovodíky
přechody π - π∗
kolem 200 nm, λ roste s konjugací, např. aromáty
přechody n - σ∗
kolem 200 nm, např. ketony
přechody n - π∗
kolem 300 nm, např. azosloučeniny
• komplexů s přenosem náboje („charge transfer“)
Jednotlivé elektronové hladiny obsahují hladiny vibrační a rotační, ve spektru měřeném
v kondezované fázi, běžně v roztoku nerozlišené ⇒ absorpční pásy široké, udává se vlnová
délka maxima λmax.
Instrumentace
Zdroj – wolframová žárovka nebo halogenka pro viditelnou oblast, deuteriová výbojka pro
UV, Xe výbojka pro obojí.
Vzorek – roztok analytu v neabsorbujícím rozpouštědle umístěný v kyvetě (sklo, plast pro
VIS, křemen pro UV).
Monochromátor a detektor nebo disperzní prvek a detektor s diodovým polem
(simultánní detekce různých λ pomocí stovek fotodiod, rozlišení až 1 nm při velké úspoře
času).
Fotometry s vláknovou optikou
Aplikace v kvalitativní analýze
Chromofory – funkční skupiny organických molekul vykazující charakteristickou absorpci
v UV-VIS, např. aromatické sloučeniny (200-250 nm), ketony (slabá absorpce kolem 300
nm), obecně při konjugaci dvojných vazeb zvyšování λmax.
35
Vliv rozpouštědla:
u přechodů π - π∗ excitovaný stav polárnější než stav základní ⇒ dipól-dipólové interakce
s polárními rozpouštědly ⇒ snížení ∆E přechodu ⇒ roste λmax (červený posun),
u přechodů n - π∗ základní stav polárnější než excitovaný ⇒ dipól-dipólové interakce nebo
vodíkové můstky s polárními rozpouštědly ⇒ zvýšení ∆E přechodu ⇒ klesá λmax (modrý
posun) .
Auxochromy - skupiny, které ovlivňují hodnotu λmax nebo ε, např. OH skupina v sousedství
C=O.
d-d přechody u komplexů přechodných kovů – obecně slabá absorpce závisí na ligandu, ve
spektrochemické řadě ligandů s rostoucí silou ligandového pole klesá λmax.
Přechod založený na přenosu náboje (mezi vazebným
orbitalem přechodného kovu ) – např. komplex Fe3+ s SCN-.
orbitalem
ligandu
a
Aplikace v kvantitativní analýze
Molární absorpční koeficienty ε velmi rozdílné (1 až 105 mol l-1 cm-1) ⇒ rozdílná citlivost
stanovení. Sledované složky musí být stabilní v roztoku.
Naměření kalibrační křivky pro známé koncentrace analytu ve standardních roztocích a
ověření platnosti Lambertova- Beerova zákona, u analytů ve složitých matricích předchází
separace.
Analýza dvousložkové směsi (obecně vícesložkové): měření absorbance při dvou (resp. více)
vhodných hodnotách λ, pro každou z hodnot λ platí aditivita absorbancí složek – řeší se
soustava 2 (resp. více) lineárních rovnic pro neznámé koncentrace složek ve směsi.
Molekulová fotoluminiscenční analýza
Dva rozdílné mechanizmy:
Fluorescence – po excitaci ze základního singletového stavu do některé z vibračních hladin
excitovaného singletového stavu dochází k nezářivé deexcitaci (relaxaci) na nejnižší vibrační
hladinu excitovaného elektronového stavu. Odtud přechod na některou z vibračních hladin
základního elektronového stavu (krátký dosvit, pod 10-6 s).
Fosforescence - po excitaci dojde k mezisystémovému přechodu do („zakázaného“)
tripletového stavu („elektrony se stejným spinem“) a pak návrat do singletového základního
stavu (dlouhý dosvit, až desítky sekund).
Dva typy fluorescenčních spekter
Excitační spektra: závislost intenzity fluorescence na vlnové délce excitačního záření při
konstantní vlnové délce záření emitovaného.
Emisní spektra: závislost intenzity fluorescence na vlnové délce emitovaného záření při
konstantní vlnové délce záření excitačního.
Instrumentace
Podobná jako pro absorpční spektrometrii, nutné jsou ale dva monochromátory: pro nastavení
excitační λ a měřené emisní λ. Emitované záření se sleduje ve směru kolmém k záření
excitačnímu.
Měří se velmi zředěné roztoky kvůli zabránění reabsorpce analytem a zhášení fluorescence
matricí, v nehomogenních roztocích dochází k nežádoucímu rozptylu.
36
Fluorimetrické měření obecně citlivější než měření absorpce, ale fluoreskujících látek je
poměrně málo: polycyklické aromatické sloučeniny, rigidní struktury (chinin, kodein,
vitamin A), některé komplexy kovů (např. Al(III) s alizarinem). Fosforescence je ještě řidší
jev.
Infračervená spektrometrie
Absorpce záření (IČ) v rozsahu vlnočtů 13 000 – 10 cm-1 (tj. ve vlnových délkách přibližně
770 nm – 1 mm), blíže označované jako oblasti blízká IČ (angl. NIR), střední IČ (4000 –
400 cm-1) (tj. ve vlnových délkách 2,5 µm až 25 µm) a vzdálená IČ (angl. FIR). Vzácně i
emise záření.
Přechody mezi vibračními hladinami – pro nelineární molekulu o n atomech – (3 n – 6)
vibračních modů (různých typů vibračního pohybů o různých frekvencích), při jednotlivých
vibracích změny délek vazeb (valenční vibrace) a úhlů mezi vazbami v molekule
(deformační). V plynném stavu se současně projevují přechody mezi rotačními hladinami.
Matematický model valenční vibrace dvouatomové molekuly: harmonický oscilátor, jeho
vibrační frekvence ν = (1/2π). (k/µ)1/2, kde µ je redukovaná hmotnost µ = mA.mB/(mA + mB),
mA a mB hmotnosti atomů A a B, k je silová konstanta.
Energie vibračních hladin je kvantována Ev = hν ( v + ½), kde v vibrační kvantové číslo (0,
1, 2 …).
Reálný model: anharmonický oscilátor, výběrová pravidla ∆v = ±1 pro fundamentální
přechody, ∆v = +2, +3 atd. pro svrchní tóny (angl. overtony). Pravidlo: vibrace aktivní v IČ při vibraci musí docházet ke změně dipólového momentu. Např. C=O vibrace aktivní v IČ,
zatímco N≡N vibrace neaktivní v IČ.
Ramanova spektrometrie
Rozptylová technika: interagující fotony excitačního záření „ztrácejí“ (Stokesovy přechody)
či „získávají“ energii (anti-Stokesovy přechody), která odpovídá kvantovaným přechodům
mezi vibračními hladinami molekuly. Na vlnové délce excitačního záření tedy nezáleží.
Aktivní jsou vibrace, při kterých dochází ke změně polarizovatelnosti.
Počet vibračních stupňů volnosti pro lineární molekulu 3n-5, pro nelineární molekulu 3n-6,
kde n je počet atomů v molekule. Aktivitu v IČ i Ramanově (Ra) spektru ovlivňuje symetrie
molekuly.
např. O=C=O celkem 4 vibrační stupně volnosti:
symetrická valenční
neaktivní v IČ, aktivní v Ra
antisymetrická valenční
aktivní v IČ, neaktivní v Ra
deformační ve 2 směrech
aktivní v IČ, neaktivní v Ra
např. H2O celkem 3 vibrační stupně volnosti:
symetrická valenční
aktivní v IČ i v Ra
antisymetrická valenční
aktivní v IČ i v Ra
deformační
aktivní v IČ i v Ra
U větších molekul – charakteristické frekvence funkčních skupin
• valenční vibrace mezi H a dalším atomem – vlnočet charakteristický v závislosti na
hmotnosti druhého atomu (H má výrazně nižší hmotnost než další atomy!!),
37
•
•
•
u vibrací OH, NH vodíkové vazby v kapalném stavu vlnočet snižují, pás se rozšiřuje,
v plynném stavu pásy úzké!!
valenční vibrace dvojných a trojných vazeb a aromatických systémů – vlnočet,
charakteristicky roste s násobností vazby (vlivem růstu k) , málo ovlivněn zbytkem
molekuly,
• některé deformační vibrace organických molekul jsou rovněž charakteristické (např.
vibrace CH3).
Deformačním vibracím odpovídají obecně nižší vlnočty než valenčním vibracím
symetrickým a antisymetrickým. Většina vlnočtů deformačních vibrací vazeb silně
ovlivněna strukturou celé molekuly, tj. „otisk prstu“ konkrétní struktury.
Blízké IČ – pásy svrchních tónů a kombinačních přechodů, tj. násobky a součty vlnočtů
z oblasti střední IČ. Např. fundamentální vibrace H2O: 3700, 3600, 1600 cm-1 ⇒ kombinační
přechod (součet) u 5300 cm-1, svrchní tóny (2, 3 a 4-násobek) pod 7200, 11 000, 13500 cm-1.
Ramanova spektrometrie: vibrace H2O mnohem méně intenzivní – lze snadno použít jako
rozpouštědlo,
svrchní tóny a kombinační přechody obecně méně časté,
vibrace symetrických struktur velmi intenzivní.
11. Molekulová spektrometrie – 2. část
Instrumentace pokračování části Infračervená spektrometrie
Zdroj pro střední IČ - rozžhavená keramická tyčinka (např. SiC), pro blízké IČ žárovka
wolframová (nebo halogenová), pro Ramanovu spektrometrii laser jako monochromatický
velmi intenzivní zdroj kvůli nízké výtěžnosti rozptylu (např. pro viditelnou oblast argonový
laser, He-Ne laser).
Vzorek
Transmisní měření u IČ:
• kyvety z NaCl a KBr pro plynné a kapalné vzorky (sklo a plast absorbují IČ záření !),
• plynné analyty: dlouhé kyvety (~10cm) kvůli nízkým koncentracím, je vidět i rotační
struktura rotačních přechodů,
• kapalné analyty: úzké kyvety (~0,1 mm), málo absorbujíc rozpouštědla (CCl4, CHCl3,
CS2),
• pevné vzorky: ideálně tenké fólie, pro přímé měření práškového vzorku vadí rozptyl a
silná absorpce, proto se měří naředěný vzorek (parafinovým olejem, KBr).
Ve vzduchu absorbují IČ záření H2O a CO2 - pro kvalitní spektra nutnost profukování
přístroje N2 nebo alespoň sušeným vzduchem.
Reflexní techniky u IČ:
• ATR (attenuated total reflection) - měří se zeslabení paprsku vlivem absorpce
vzorkem při totálním odrazu paprsku na rozhraní krystalu a vzorku, použitelné pro
kapaliny a pevné látky.
38
•
difuzní reflexe – difuzně odražené záření od částic pevného práškového vzorku –
hojně používaná v blízké IČ, ve střední IČ ruší silná absorpce vzorku ⇒ artefakty.
Interferometr: dnes běžný u IČ spektrometrů Michelsonův interferometr. Záření ze zdroje
rozděleno v děliči svazku na dvě části, optické dráhy obou částí jsou rozdílné: jedna část
postupuje k pevnému zrcadlu a zpět, zatímco druhá část k pohyblivému zrcadlu a zpět).
Setkávají se opět na děliči svazku, přičemž vzájemně interferují. Dále postupují společně přes
vzorek k detektoru. Zaznamenává se interferogram – odezva detektoru v závislosti na
rozdílu optických drah obou paprsků. Interferogram se převede na spektrum pomocí
Fourierovy transformace (FT).
Výhody FT spektrometrů ve srovnání s disperzními spektrometry:
Fellgettova (multiplexní) výhoda – za srovnatelný čas se místo měření pro jeden vlnočet u
disperzního spektrometru změří u FT spektrometru celý interferogram,
akumulací
interferogramů roste poměr signálu k šumu ve spektru úměrně odmocnině počtu
průměrovaných měření.
Jacquinotova výhoda – toky záření nejsou omezovány štěrbinami ⇒ je možno měřit široký
rozsah intenzit signálů.
Výhoda Connesové – funkce laseru v interferometru.
Detektor: pyroelektrický (působením tepla změna struktury krystalu, vzniká náboj, měří se
proud) nebo fotovoltaický.
Aplikace v kvalitativní analýze
Využití spektra jako „otisku palce“ sloučeniny – porovnání s databázemi (knihovnami)
spekter, interpretace spekter pomocí tabulek charakteristických frekvencí.
Aplikace v kvantitativní analýze
Využívá se platnosti Lambertova-Beerova zákona: absorbance A nebo plocha pásů je úměrná
koncentraci analytů, k vyhodnocení se často používají multivariační metody.
Spektrometrie nukleární magnetické rezonance (NMR)
Princip
Absorpce záření z oblasti 108 Hz (radiové vlny) pro jádra s nenulovým spinovým kvantovým
číslem I v magnetickém poli (B0). V magnetickém poli obecně 2I+1 energetických hladin
jaderného spinu. Pro I = 1/2 (jádra 1H, 13C) existují dvě energetické hladiny, mezi nimiž může
docházet k přechodu. Pro I = 0 (jádra se sudým počtem protonů i sudým počtem neutronů,
např.12C, 16O) existuje pouze jedna energetická hladina ⇒ neposkytují NMR odezvu.
Energetické hladiny téměř stejně zastoupeny (poměr populací nižší a vyšší hladiny je
1 000 064 : 1 000 000 pro B0 = 10 T a jádro 1H) ⇒ celkově velmi slabá výsledná absorpce!!
Omezení dáno také přirozeným výskytem jádra: 13C 1,1% (1H 99,99 %).
Spontánní návrat excitovaných jaderných spinů na nižší. hladinu - relaxace jader.
Rezonanční frekvence ν = γ B0/2πB0 , γ je gyromagnetický poměr pro dané jádro [T-1 s-1] ).
39
Stínění: na dané jádro působí vedle B0 ještě magnetická pole vyvolaná hlavně elektrony ze
sousedních vazeb, takže efektivní magnetické pole působící na dané jádro je Beff = B0 . (1-σ),
kde σ j tzv. konstanta stínění. Proto se liší rezonanční frekvence jader v různých strukturách
molekuly.
Chemický posun: δ = (ν-νref)106/νspektrometr , kde νref rezonanční frekvence standardu (pro 1H
a 13C v nevodných rozpouštědlech je standardem TMS - (CH3)4Si ), νspektrometr je pracovní
frekvence spektrometru pro dané jádro, νspektrometr ≈ νref.
Chemický posun nezávisí na B0, číslo řádově 10-6, vyjadřuje se v ppm.
Interakce sousedních jader: daná různou možnou orientací spinů, která způsobuje další
malé změny Beff a v jejich důsledku štěpení signálů na multiplety, tj. multiplicitu signálů.
Počet linií multipletu: pro nejjednodušší případy pravidlo n + 1, kde n je počet jader
sousedících s daným jádrem, event. skupinou ekvivalentních jader.
Poměr intenzit linií v multipletu: 1 singlet,1:1 dublet, 1 :2:1 triplet, 1:3:3: 1 kvartet , atd.
(Pascalův trojúhelník).
Interakční konstanta J - vzdálenost linií v multipletu [Hz], nezávisí na B0.
Instrumentace
Supravodivá cívka chlazená kapalným He na teplotu 4 K (teplotně odizolována ještě vrstvou
kapalného N2 a vakuem od dalších částí spektrometru) vytváří magnetické pole B0 (až 20 T);
čím vyšší B0, tím vyšší citlivost měření a zároveň přehlednější spektra.
Radiofrekvenční cívka – slouží jako zdroj radiofrekvenčního záření pro excitaci jader a
zároveň jako detektor rezonančních frekvencí emitovaných v průběhu relaxace jader (Pozor:
v učebnici je popsán starší typ spektrometru!!).
Vzorek v NMR kyvetě je umístěn v magnetickém poli supravodivé cívky a také uvnitř
radiofrekvenční cívky.
Měření pulzní technikou, sleduje se tzv. FID (free induction decay, doznívání volné indukce)
– interferogram (časová závislost odezvy detektoru), pomocí FT (Fourierovy transformace)
přepočet na frekvenční závislost odezvy – NMR spektrum.
Aplikace v kvalitativní analýze
Vyhodnocujeme chemický posun signálu, jeho multiplicitu a relativní plochu (vzájemný
poměr ploch signálů odpovídá poměru počtu jader různě umístěných ve struktuře molekuly).
Chemické posuny jader v určitých funkčních skupinách jsou tabelovány, stejně tak jako
interakční konstanty.
H : CH vedle C δ = 1 – 2 ppm, CH vedle C=O, C=C, aromátu δ = 2 – 3 ppm, CH vedle O δ
= 3 – 5 ppm, aromatický H δ = 6 – 9 ppm, aldehydické H δ kolem 10 ppm, COOH δ = 12 –
14 ppm (často široký signál), OH, NH, NH2 velký rozsah δ, často široký signál.
1
C : C alifatické δ = 10 – 30 ppm , C vedle O δ = 40 – 60 ppm, C aromatické δ = 100 –
160 ppm C=O δ = 170 – 210 ppm.
13
Aplikace v kvantitativní analýze
Všechny signály ve spektru jsou úměrné koncentraci sledovaného jádra.
40
12. Hmotnostní spektrometrie a kombinované techniky
Hmotnostní spektrometrie
Kvalitativní i kvantitativní analýza vzorku po jeho ionizaci a fragmentaci na základě zjištění,
jaké ionty (podle m/z) se nacházejí ve spektru a jaká je jejich relativní četnost. Uplatňuje se
při identifikaci a strukturní analýze organických látek a stanovení stopových množství
organických i anorganických látek.
Části hmotnostního spektrometru: vstup vzorku, iontový zdroj, analyzátor (separátor)
vytvořených iontů, detektor, řídicí jednotka kontrolující jednotlivé části a umožňující sběr dat
a počítačem pro zpracování a vyhodnocení získaných dat.
Vstup vzorku
•
•
•
•
umožňuje vnesení vzorku do systému, ve kterém je velmi vysoké vakuum,
vstup přes zásobník, přímý vstup,
vzorek, popř. jeho část, se okamžitě převede do plynného stavu (důsledek vakua) a
vstupuje do iontového zdroje,
velké molekuly (např. biomolekuly) nelze převést do plynného stavu v dostatečném
množství – speciální postup.
Iontový zdroj
Ionizace, fragmentace a urychlení - z původně neutrální molekuly vzniká ionizací molekulový
ion-radikál, který se dále rozpadá - fragmentace – vzniklý molekulový ion se rozpadá na
fragmentové ionty (fragmentační schémata, souvislost se strukturou analytu a s použitou
ionizační technikou).
Různé techniky ionizace
Elektronová ionizace (EI) - ionizace molekuly interakcí s proudem vysokoenergetických
elektronů; „tvrdá“ ionizace – významná fragmentace molekuly na menší části, malá intenzita
molekulového píku).
Chemická ionizace (CI) - interakcí s proudem vysokoenergetických elektronů je přednostně
ionizován reakční plyn (např. methan), který následně ionizuje molekuly vzorku; měkčí
ionizace oproti EI.
Ionizace nárazem atomů (FAB) - desorpce a ionizace analytu v důsledku interakce s
proudem urychlených atomů (argonu); vzorek rozpuštěn ve viskózní matrici; vhodné pro
velké molekuly, které nelze převést do plynného stavu.
Desorpční techniky ionizace (desorpce a ionizace velkých molekul, které nelze převést do
plynného stavu, je způsobena silným elektrickým polem nebo laserem) – např. MALDI.
Ionizace za atmosférického tlaku - např. elektrosprej (ESI)) – „vypařování“ iontů – rostoucí
hustota náboje ve zmenšující se kapičce – vhodné pro kombinaci s kapalinovou
chromatografií; vysoký stupeň ionizace.
Četnost jednotlivých fragmentů zásadně závisí na použitém způsobu ionizace, vhodnou
volbou ionizační metody lze fragmentaci výrazně potlačit, což způsobí zvýšení intenzity
signálu molekulového iontu ve spektru.
41
Získané ionty (kladné nebo záporné) jsou elektrostaticky urychleny a vylétávají z iontového
zdroje do analyzátoru (nelze analyzovat nenabité částice (molekuly, radikály)).
Analyzátor (separátor) iontů
Základní charakteristiky analyzátoru: rozlišovací schopnost a rozsah měřitelných hodnot
m/z.
Magnetický, sektorový (magnetický a elektrostatický) analyzátor
Působením magnetického nebo elektrického pole (nebo obou zároveň) dojde k zakřivení
trajektorie letu urychlených iontů a tím k jejich separaci; v daný okamžik proletí vstupní
štěrbinou do detektoru jen ionty o určitém poměru jejich hmotnosti (m) a náboje (z),
Kvadrupólový analyzátor
Trajektorie iontů je ovlivňována současným působením stejnosměrného a zároveň
vysokofrekvenčního střídavého napětí připojeného na čtyři (kvadrupol) nebo osm (oktapol)
kovových tyčí, které jsou symetricky umístěny kolem trajektorie iontů vylétávajících
z iontového zdroje.
Iontová past
Vzorek jednorázově ionizován. Aplikací stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého
napětí se ionty pohybují v iontové pasti po kruhových trajektoriích umožňuje další ionizaci již
zachycených iontů (tzv. MS–MS analýza).
Průletový analyzátor (TOF)
Vzorek jednorázově ionizován, měří se doba průletu iontů od iontového zdroje do detektoru;
tato doba opět závisí na poměru m/z.
Detektor
Dopad iontu na detekční materiál je provázen uvolněním elektronů, jejichž počet je následně
znásoben na měřitelnou úroveň (násobič elektronů). Jednotlivé elektrické signály detektoru
zpracovává řídicí jednotka.
MS spektrum
je graf relativní četnosti detekovaných iontů v závislosti na jejich poměru m/z.
Popis intenzit jednotlivých signálů je vztažen k tzv. základnímu píku spektra (rel. četnost 100
%). Každé spektrum musí být doprovázeno informací především o podmínkách ionizace
vzorku. Izotopy prvku se liší svou hmotností, daný prvek se proto může ve spektru projevit
více píky podle přirozeného zastoupení jeho izotopů. Charakteristická je např. přítomnost 13C
(1,1 %) vedle 12C nebo 37Cl (ca 33 %) vedle 35Cl, či 79Br a 81Br.
Aplikace v kvalitativní analýze
S využitím databází („knihoven“) spekter a výpočetní techniky probíhá kvalitativní analýza
na základě porovnání naměřeného a tabelovaného spektra. Je-li ve spektru identifikován
signál molekulového iontu, lze získat informaci o relativní molekulové hmotnosti i empirický
vzorec. Analýzou jednotlivých fragmentů (podle jejich existence a relativní četnosti) lze
získat informace o mechanismu rozpadu původního molekulového iontu a odtud informace o
struktuře analytu.
42
Aplikace v kvantitativní analýze
Kvantitativní analýza metodou vnitřního standardu (metoda izotopového zřeďování) nebo
spojením s jinou metodou (viz kombinované techniky).
Kombinované techniky
Řada reálných vzorků je natolik složitých, že pro jejich analýzu je nezbytné kombinovat více
technik. Jako první je třeba identifikovat všechny složky tvořící vzorek, následuje jejich
izolace ze směsi, identifikace jednotlivých frakcí a konečně stanovení obsahu jednotlivých
složek tvořících vzorek.
Řešení :
• multidisciplinární přístup, na vzorek se postupně aplikují různé metody
• simultánní přístup, vzorek je najednou analyzován obvykle dvěma metodami.
Multidisciplinární přístup
Různé metody lze charakterizovat různou mírou schopnosti identifikace i kvantifikace.
Obvyklý postup využití metod při identifikaci chemického individua je následující:
• výpočet sumárního/empirického vzorce z výsledku elementární analýzy,
• výpočet čísla nenasycenosti ze sumárního vzorce (číslo, které udává počet násobných
vazeb a kruhů, které musí v molekule být, aby byla splněna základní pravidla o
vaznosti atomů),
• identifikace typu skeletu a funkčních skupin z infračervených, popř. Ramanových
spekter,
• nalezení píku molekulového ion-radikálu v MS spektru umožňuje získat relativní
molekulovou hmotnost a odtud sumární/empirický vzorec; vzhled MS spektra
(fragmentační obraz) odráží strukturní fragmenty molekuly,
• interpretace NMR spekter (1H, 13C) nejvíce přispívá k pochopení, jak jsou jednotlivé
části molekuly (funkční skupiny, fragmenty) vzájemně propojeny,
• využití absorpčních spekter v ultrafialové a viditelné oblasti pro identifikaci analytu
není zdaleka takové jako v případě předchozích metod, lze ji však využít pro potvrzení
přítomnosti chromoforů (konjugované dvojné vazby, kondenzovaná aromatická jádra
apod. - např. databáze UV-vis spekter PAH – polycyklických aromatických
uhlovodíků).
Simultánní přístup – spřažené techniky
Řada výhod, především úspora času a zvýraznění odlišností v chování jednotlivých složek
vzorku. Jde o spojení techniky umožňující rozdělení komplexního vzorku na jednotlivé složky
(GC, LC nebo ICP) a techniky schopné tyto složky identifikovat (MS nebo IČ, vzácně NMR).
GC–MS
Spojení velmi účinné separační metody a velmi účinné metody identifikace vzorku, spojení
pomocí rozhraní, ve kterém je většina plynné mobilní fáze odsáta vakuovou pumpou a pouze
malý podíl vstupuje do vysokého vakua v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru.
Chromatogram, který lze využít pro kvantitativní analýzu, lze získat buď paralelním
zapojením vhodného detektoru pro GC (např. FID apod.), nebo zachycením časového
závislosti iontového proudu vyvolaného v daném okamžiku dopadem všech iontů do
detektoru (tzv. TIC, Total Ion Current).
43
GC–IČ
Oproti hmotnostnímu spektrometru má infračervený spektrometr především tu výhodu, že je
několikanásobně levnější. Pro snížení meze detekce řady látek se často paralelně s IČ
spektrometrem zapojuje i detektor pro plynovou chromatografii. Horší mez detekce než MS.
LC–MS
Dvě techniky pracující za zcela odlišných podmínek: kapalná mobilní fáze versus vysoké
vakuum; v místě spojení obou částí dochází k odpaření kapalné mobilní fáze a tento proces je
zároveň spojen s ionizací vytvořené nabité ionty potom vstupují do analyzátoru a do detektoru
hmotnostního spektrometru.
ICP–MS
Aplikace při identifikaci a stanovení anorganických prvků v anorganické i organické matrici.
Indukčně vázané plasma (ICP), které je primárně zdrojem excitovaných atomů – viz kapitoly
o atomové spektrometrii, je také zdrojem iontů. Spojením s hmotnostní spektrometrií se
dosahuje především velmi nízké meze detekce pro řadu prvků, což je významné např. pro
stanovení stopových prvků v živých systémech nebo pro stanovení různých kontaminantů
životního prostředí
13. Termické metody, senzory a automatizované postupy
Termické metody
-
-
termickými metodami je studován vliv působení tepla na vzorek
metody pro kvalitativní i kvantitativní analýzu vzorku; dochází k jeho rozkladu,
odpaření těkavých složek, popřípadě k reakci s okolní atmosférou
aplikace:
o analýza anorganických solí
o charakterizace anorganických a organických polymerů (např. kaučuků,
polyethylenglykolů)
termogram – teplotní závislost měřené veličiny (hmotnost, dodané teplo apod.)
řada materiálů je charakterizována svým termogramem bez jeho hlubší interpretace
(naměřený termogram odpovídá chování celého vzorku)
Termogravimetrie (TG) – termogravimetrická analýza (TGA)
-
sledování změn hmotnosti vzorku v průběhu zahřívání konstantní rychlostí či za přesně
popsaných podmínek daných teplotním programem
pro zvýraznění velmi malých změn - diferenční technika (zároveň se vzorkem je
zahříván i standard; do termogramu se vynáší změna hmotnosti vzorku vůči standardu)
např. stanovení obsahu těkavých látek (vody, rozpouštědel) v různých materiálech.
Diferenční termální analýza (DTA) a diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)
-
obě techniky založeny na měření toku tepla ze vzorku nebo do něj
v případě DTA se měří rozdíl teploty vzorku a standardu při zahřívání konstantním
příkonem, při DSC je sledován příkon, který musí být dodán na zahřívání vzorku,
přičemž teplota vzorku a standardu je udržována konstantní
44
-
využití těchto metod je při kontrole čistoty látek, neboť i velmi malý obsah nečistot
způsobuje neostrost fázových přechodů analyzovaného vzorku (např. při tání vzorku)
DSC se využívá také pro stanovení termodynamických konstant (charakterizace systému
včetně interakce mezi molekulami v roztoku (při titraci))
-
Analýza uvolněných plynů
-
kvalitativní i kvantitativní analýzu rozkladných produktů při zahřívání analyzovaného
materiálu
spojení např. s termogravimetrií, kdy (plynné) rozkladné produkty jsou spektrometricky
identifikovány (TGA spojené s MS či s FTIR spektrometrií) a je stanoveno jejich
množství chromatograficky
-
Chemické senzory a biosenzory
Senzor
-
-
zařízení pro kontinuální sledování fyzikálně-chemických nebo biochemických vlastností
(sensor (sen·sor) (sen´sər) something that senses; a device specifically designed to
respond to a physical stimulus (light, heat, pressure, etc.) by generating an impulse
that can be measured or otherwise interpreted, or used as a control)
tvořen aktivní vrstvou, převodníkem a detektorem
o aktivní vrstva senzoru reaguje na přítomnost analytu v roztoku (příp. v plynné
fázi) (např. kovovou elektroda sledující koncentraci redoxního páru nebo
imobilizovaná látka (selektor) reagující na přítomnost analytu v roztoku
tvorbou mezimolekulárního komplexu)
o převodník transformuje chemickou nebo biochemickou interakci na elektrický
nebo optický signál (např. změna potenciálu elektrody, změna fluorescence
(nebo jiných optických vlastností) aktivní vrstvy)
o detektor registruje změny signálů vystupujících z převodníku
- uplatnění: sledování výrobních procesů, sledování kvality ovzduší (složení odpadních
či vyráběných plynů, přítomnost výbušných plynů), klinická vyšetření apod.
Vlastnosti dobrého senzoru
•
•
•
•
•
mechanická a chemická odolnost
rychlá a opakovatelná odezva
maximální selektivita (reaguje pouze na hledaný analyt, jiné složky vzorku
neovlivňují jeho odezvu)
dostatečný pracovní rozsah koncentrací analytu
stabilní odezva senzoru nezávislá (minimálně závislá) na vnějších podmínkách (s
časem by se odezva neměla měnit vůbec co nejméně závislá na změnách teploty a
tlaku)
Typy senzorů
•
•
•
podle principu funkce aktivní vrstvy existují chemické senzory a biosenzory (využití
bioafinitních interakcí, např. enzym-substrát, protilátka-antigen)
konstrukce senzorů založena na miniaturizaci běžných měřicích zařízení
elektrochemické senzory připravené miniaturizací redoxních a iontově selektivních
elektrod
45
•
•
•
optické senzory založené například na použití optických vláken přivádějících záření ze
zdroje a umožňujících. sběr fluorescenčního záření vzorku či refraktometrické senzory
(sledování změn indexu lomu při interakci aktivní vrstvy s analytem)
jiným případem elektrochemických senzorů je využití tranzistorů řízených polem
o funkce je založena na modifikaci řídicí části tranzistoru (hradla) aktivní
vrstvou senzoru
o změny vodivosti aktivní vrstvy (jako důsledek přítomnosti analytu) se projeví
změnami elektrických charakteristik tranzistoru
miniaturizace umožňuje tvorbu tzv. senzorových polí – souběžné (kontinuální)
sledování více analytů
Automatizované procedury
•
•
cílem automatizace v (analytické) laboratoři je zrychlení práce, minimalizace kontaktu
pracovníků s nebezpečnými látkami a minimalizace „lidského faktoru“ jako zdroje
chyb či zhoršené opakovatelnosti výsledků
uplatnění v oblastech
přípravy a úpravy vzorku (např. příprava vzorku, přidávání činidel, míchání,
mineralizace, filtrace, zřeďování, extrakce tuhou fází, nastavení parametrů
přístroje), při použití všech metod (titrace, chromatografická separace,
spektrofotometrické měření, elektrochemická měření, termické techniky,
radiometrická měření apod.).
Řízení počítačem a sběr dat
•
•
spojení výpočetní techniky (pracující s digitálními daty) s měřící technikou (pracující
s analogovými signály) umožňuje analogově-digitální (A/D) a digitálně-analogový
(D/A) převodník
běžnou součástí současných měřících přístrojů je řídicí program provádějící
diagnostiku přístroje, nastavení a kontinuální kontrolu parametrů metody, sběr dat
z detektoru a jejich vyhodnocení
Využití počítače při zpracování dat, databázovém vyhledávání a komunikaci
•
•
•
•
zpracování signálů (dat) z detektoru (záznam, filtrování šumu, statistické
vyhodnocení, Fourierova transformace (IČ, NMR))
použití různých databází pro identifikaci složek vzorku (porovnání naměřeného
infračerveného spektra se stovkami spekter z vybrané spektrální databáze); ukládání
do databáze
řízení komunikace jednotlivých měřících jednotek s okolím (Laboratory Information
Management System - LIMS) – systém správy a výměny dat mezi počítači)
využití elektronických záznamníků (Electronic Laboratory Notebook – ELN) pro
vedení záznamů o analýzách – často ve spojení se systémem LIMS a databázovými
systémy – archivace dat
46
14. Vyhodnocení analytických měření
Rozdíl mezi skutečnou hodnotou obsahu analytu ve vzorku a hodnotou naměřenou je
způsoben existencí různých chyb (nejistot), které se projevují v průběhu analýzy. Výsledek
analýzy může být také přímo ovlivňován dalšími látkami obsaženými ve vzorku. Cílem
vyhodnocení analytických dat je všechny tyto faktory identifikovat, určit (či alespoň
odhadnout) jejich velikost (význam, „váhu“) a v případě jednotlivých chyb minimalizovat
jejich vliv.
Obor, který se zabývá tímto vyhodnocením založeným na statistickém zpracování výsledků,
je chemometrika.
Chyby analytických měření*
Rozlišujeme chyby hrubé, systematické a náhodné.
• hrubé chyby
o málo pečlivá práce analytika, špatné nastavení přístroje nebo jeho porucha
o ze souboru naměřených dat je třeba je vyloučit
• systematické chyby
o zatěžují výsledek stále stejným způsobem – výsledky analýzy jsou potom vyšší
nebo nižší, než je skutečná hodnota
o systematická chyba metody, přístroje a obsluhy
o identifikace těchto chyb analýzou certifikovaných referenčních materiálů
• náhodné chyby
o přirozená povaha vzorku a měření; způsobují určitý rozptyl naměřených
hodnot
o často lze tyto chyby popsat tzv. normálním (Gaussovým) se střední hodnotou µ
a směrodatnou odchylkou σ, které lze odhadnout výpočtem aritmetického
průměru x (odhad střední hodnoty) a výpočtem odhadu směrodatné odchylky
s.
o interval spolehlivosti definuje rozmezí hodnot, ve kterém s určitou zvolenou
pravděpodobností leží střední hodnota
o zákon šíření chyb definuje, jakým způsobem se projeví jednotlivé chyby na
chybě celkového výsledku
Hodnocení přesnosti a správnosti*
• přesnost získaného výsledku analytického měření
o pojem vztažený k variabilitě jednotlivých výsledků a je tudíž ovlivněna
především náhodnými chybami
o čím jsou výsledky méně rozptýlené, mají menší směrodatnou odchylku, tím
jsou přesnější
o opakovatelnost
je
přesnost
výsledku
(nebo
metody)
získaná
několikanásobným opakováním analýzy jedním operátorem, na jednom
přístroji a v krátkém časovém úseku.
o reprodukovatelnost je přesnost výsledku (nebo metody) získaná
několikanásobným opakováním analýzy více lidmi, ve více laboratořích na
různých přístrojích v delším časovém úseku
• správnost výsledku analýzy vzorku
*
terminologie viz též http://www.vscht.cz/lam/new/barekterminologie2000_07_01.pdf
47
o je charakterizována rozdílem mezi výsledkem provedené analýzy a skutečnou
hodnotou obsahu analytu ve vzorku.
o je ovlivněna především systematickými chybami
o ověřuje se pravidelnou analýzou certifikovaných referenčních materiálů a
mezilaboratorními testy
Testování významnosti
• test významnosti slouží k rozhodnutí o vzájemném vztahu dvou hodnot (např.
porovnání výsledků analýzy získaných dvěma metodami, nebo porovnání přesnosti
dvou metod analýzy)
• jsou založeny na volbě tzv. nulové hypotézy a na jejím potvrzení nebo zamítnutí
o z naměřených hodnot se vypočítá podle daného testu hodnota kritéria, která se
na dané hladině významnosti (α, např. 5 %) porovnává s tabelovanou kritickou
hodnotou.
o je-li kritická hodnota kritéria vyšší, existuje (1-α) procentní pravděpodobnost,
že nulová hypotéza je pravdivá
• příklady testů významnosti:
o Q-test je test odlehlosti výsledků (identifikace výsledku, který je zatížený
hrubou chybou)
o t-test slouží k porovnání středních hodnot, porovnáváme např. zda se
významně liší výsledek získaný experimentálně s hodnotou udanou např.
výrobcem
o F-test se aplikuje při srovnání, jestli se významně liší variabilita dvou souborů
dat (porovnává se shoda odhadů směrodatných odchylek); využití při testu
rozptylů ANOVA (Analysis of Variance)
Kalibrace a lineární regrese (jedna proměnná)*
• kalibrační funkce je závislost odezvy detektoru (měřené veličiny) na koncentraci
sledovaného analytu.
• cílem kalibrace je určení parametrů této závislosti; provádí se měřením kalibračních
standardů, např. roztoků o známém obsahu analytu, a statistickým zpracováním (např.
metoda nejmenších čtverců)
• nejčastěji lineární kalibrační závislost – oblast linearity (rozmezí koncentrací) mimo
níž se závislost měřeného signálu na koncentraci zakřivuje
• rozsah koncentrací použitých kalibračních standardů často definuje dolní a horní mez
stanovitelnosti; nikdy bychom neměli extrapolovat mimo rozsah koncentrací, které
byly použity při kalibraci
• hodnota korelačního koeficientu vyjadřuje míru shody navrženého lineárního modelu
a experimentálních hodnot; zda je závislost skutečně lineární, je třeba prověřit testem
linearity (jeden z testů významnosti)
• kalibrace se provádí metodou (srovnej se základními pojmy v úvodních přednáškách)
o kalibračních roztoků – měří se série standardů o známé koncentraci
o standardních přídavků (tzv. spiking) – k roztoku vzorku o stále stejném objemu
přidám rostoucí množství standardu; přítomností matrice ve všech roztocích
kalibračních standardů dojde k potlačení jejího vlivu
o vnitřního standardu (tam, kde změny experimentálních podmínek významně
ovlivňují přesnost dat, např. v chromatografii); přidám známé množství
standardu, jehož signál neinterferuje a sleduji poměr odezvy detektoru
analyt/standard
48
o interní normalizace, kdy suma signálu představuje 100 %; používá se tehdy,
jestliže sleduji vzájemný poměr zastoupení složek ve vzorku a nezajímají mě
absolutní hodnoty
Multivariační vyhodnocení (více proměnných)
• založeno na sledování vlivu více parametrů na signál analytu najednou a jak se tyto
parametry vzájemně ovlivňují (korelují)
• normalizace dat (různé způsoby, např. výpočet z-skóre (z = (yi – yprům)/sy), Min-Max
Normalization, Zero-Mean Normalization, Vector Normalization, Decimal Scaling
atp.)
• analýza hlavních komponent (Principal Component Analysis – PCA)
o výpočet parametrů (tzv. hlavních komponent), které mají největší vliv na
signál analytu a které nejsou vzájemně korelované (transformace souřadného
systému)
o snížení celkového počtu parametrů; možnost 2D nebo 3D zobrazení –
zobrazení struktury dat (podobnosti a odlišnosti)
o míra vlivu hlavních komponent na signál analytu – graf zátěží (loadings)
• klastrová analýza (shluková analýza) o identifikace parametrů, které mají vzájemný vztah (korelují)
o umožňuje běžně 2D zobrazení (dendrogram) i pokud nelze snížit počet
parametrů zobrazení hledání struktury dat (podobnosti a odlišnosti)
o dnes i vícedimenzionální shluková analýza (vícedimenzionální dendrogramy)
• jednoduchá kalibrace je nahrazena multivariačním modelem – např. regrese hlavních
komponent (Principal Component Regression – PCR, založeno na kombinaci analýzy
hlavních komponent a regrese, kde se uplatní metoda nejmenších čtverců)
Systém řízení jakosti
• má zabránit tomu, aby laboratoř neopustil chybný výsledek
• kvalita výsledků laboratoře (jakost výsledků) je sledována/zajištěna několika způsoby
(Quality Assurance – QA, Quality Control – QC)
• zahrnuje např.:
o použití validovaných metod (ověření, že daná metoda na daném pracovišti
dává správné výsledky, určení celkové nejistoty těchto výsledků, vypracování
standardních operačních postupů)
o vyhodnocení regulačních diagramů – vynáší se výsledek měření pro vzorky
se stále stejným obsahem analytu; laboratoř sama zařadí mezi analyzované
vzorky standardy o známém obsahu sledované látky a naměřené hodnoty se
vynáší do regulačního diagramu; v diagramu vyznačeny varovné a regulační
meze (slouží ke kontrole kvality používaných činidel, stability přístroje nebo
opakovatelnosti příp. reprodukovatelnosti v delších časových úsecích)
o účast v mezilaboratorních testech - ověření správnosti získaných výsledků
obsahu analytu analýzou v různých laboratořích
o školení a další vzdělávání zaměstnanců
49