Nastavení real-time PCR cykleru LC 480

Verze: 1.2
Datum poslední revize: 24.9.2014
Nastavení real-time PCR cykleru
Light Cycler® 480 Instrument
(Roche)
generi biotech
OBSAH
Nastavení teplotního profilu ........................................................................................................................ 3
1.1. Nastavení nového teplotního profilu................................................................................3
2. Alelická diskriminace ...................................................................................................................................... 3
2.1. Nastavení pro alelickou diskriminaci ................................................................................3
3. Kvantifikace genové exprese ....................................................................................................................... 5
3.1. Nastavení pro genovou expresi.........................................................................................5
4. Detekční formáty............................................................................................................................................... 7
1.
generi biotech
2/10
1. Nastavení teplotního profilu
1.1.
Nastavení nového teplotního profilu
1.1.1. Při volbě „Program an experiment“ vyberte možnost „Experiment Creation“ a dále
„New Experiment“
1.1.2. Zvolte typ destičky (průhledná nebo bílá)
1.1.3. V tabulce „Run Protocol“ v části „Setup“ vyberte z rozbalovací nabídky „Detection
Format“
2. Alelická diskriminace
2.1.
Nastavení pro alelickou diskriminaci
Pro alelickou diskriminaci vyberte jeden následujících detekčních formátů (viz Kap. 4):
• V módu „Quantification“ zvolte možnost „3 Colors Hydrolysis Probes“ a při
spouštění runu pak vyberte fluorescenční kanály FAM (465-510) a VIC/HEX
(533-580)
• V módu „Endpoint Genotyping (SNP Analysis)“ zvolte možnost „Dual Color
Hydrolysis Probes“ s kanály FAM (465-510) a VIC (533-580)
Nezadávat volbu Color Compensation (ta je pro HRM a melting), zde se zadává Continuous
Acquision mode (fluorescenci snímá kontinuálně)
Acquision Mode (snímání fluorescence)
• Single (data snímá pouze 1x během každého cyklu, na konci zvoleného kroku
2.1.1. Nastavte kroky teplotního profilu uvedeného v manuálu ke kitu a zvolte objem
reakce 20 µl
generi biotech
3/10
Ukázka správného nastavení: FAM: (465-510), VIC/Hex (533-580):
Oblasti excitace:
Oblasti emise:
generi biotech
4/10
Verze: 1.2
Datum poslední revize: 24.9.2014
3. Kvantifikace genové exprese
3.1.
Nastavení pro genovou expresi
Pro kvantifikaci vyberte následující detekční formát (viz Kap.4):
• V módu „Quantification“ zvolte možnost „Monocolor Hydrolysis Probe“ a při
spouštění runu pak vyberte fluorescenční kanál FAM (465-510)
Nezadávat volbu Color Compensation (ta je pro HRM a melting), zde se zadává Continuous
Acquision mode (fluorescenci snímá kontinuálně)
Acquision Mode (snímání fluorescence)
• Single (data snímá pouze 1x během každého cyklu, na konci zvoleného kroku
3.1.1. Nastavte kroky teplotního profilu uvedeného v manuálu ke kitu a zvolte objem
reakce 20 µl
3.1.2. Pro vyhodnocení zvolte možnost „Absolute Quantifiction“
• Data lze vyhodnotit dvěma způsoby:
a) Second Derivative Maximum Method – určí hodnotu Ct jako bod, kde se
křivka pro daný vzorek prudce zvedá
Převzato z manuálu výrobce cykleru: LightCycler480 II_Manual_V1.5
generi biotech
b) Fit Points Method – v oblasti exponenciální log fáze amplifikační křivky jsou
zvoleny body, které protne přímka. Hodnota Ct je dána místem, kde tato
přímka protne linii thresholdu.
Převzato z manuálu výrobce cykleru: LightCycler480 II_Manual_V1.5
generi biotech
6/10
Verze: 1.2
Datum poslední revize: 24.9.2014
4. Detekční formáty
Detekční formáty vhodné pro alelickou diskriminaci
Detekční formáty vhodné pro genovou expresi
Applications
Assay Detection
Format
Dyes
Excitation (nm) Detection (nm)
Product
Characterization
SYBR Green l
SYBR Green I
465
510
465
510
Monocolor
Hydrolysis Probe / UPL FAM
Probe
Dual Color*
Hydrolysis Probes /
UPL Probes
FAM
VIC/Hex/Yellow 555
465
533
510
580
3 Colors
Hydrolysis Probes
FAM
VIC/Hex
Cy 5/Cy 5.5
465
533
618
510
580
660
4 Colors
Hydrolysis Probes
LightCycler® Cyan 500
440
FAM
498
LightCycler® Red 610 533
Cy 5/Cy 5.5
618
488
580
610
660
Monocolor
HybProbe Probes
Fluorescein (Donor)
498
LightCycler® Red 640
640
Monocolor
HybProbe Probes
Fluorescein (Donor)
498
LightCycler® Red 640
640
Multicolor
HybProbe Probes
Fluorescein (Donor)
LightCycler® Red 610
LightCycler® Red 640
Cy 5/Cy 5.5
465
498
498
498
510
610
640
660
Endpoint Genotyping Dual Color*
(SNP Analysis)
Hydrolysis Probes
FAM
VIC
465
533
510
580
Melting Curve
Genotyping
(SNP Analysis)
SimpleProbe Probes
Fluorescein
465
510
Gene Scanning,
Mutation Discovery,
and Methylation
Analysis
High Resolution
Melting
HRM Dye
465
510
Quantification
Melting Curve
Genotyping
(SNP Analysis)
*Universal color compensation objects for dual color FAM/VIC and UPL assays
generi biotech
Seznam detekčních formátů cykelru LightCycler® 480 Real-Time PCR System:
Dostupné na: http://lifescience.roche.com
generi biotech
8/10