C. difficile toxin A+B

Rapid-VIDITEST
C. difficile toxin A+B Card/Blister
(Jednokrokový imunochromatografický test pro diferenciální detekci Toxinu A a Toxinu
B z Clostridium difficile ve stolici)
Návod k použití soupravy
Výrobce: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II 365, Vestec, 252 42 Jesenice u Prahy,
Tel: 261 090 565, Fax: 261 090 566, E-mail: [email protected], Web: www.vidia.cz
POUŽITÍ:
Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister umožňuje proces kvalitativní detekce
Clostridium difficile toxinu A (TcdA) a toxinu B (TcdB) ve dvou oddělených liniích. Pozitivní
linie pro jeden nebo druhý toxin je známkou probíhající infekce způsobené C. difficile (ICD),
která by měla vzbudit pozornost lékaře.
Test je určen pro detekci ze vzorků tekuté nebo polotekuté stolice. U pevných vzorků je potřeba
mít na paměti, že může jít o asymptomatický průběh a tudíž zdravého jedince.
Na rozdíl od jiných testovacích systémů ELISA nebo Rapid, které pouze detekují přítomnost
TcdA a TcdB najednou bez diferenciace mezi oběma druhy, tento test umožňuje diferenciaci
obou toxinů za použití dvou oddělených linií – červená linie, která se objeví pod modrou
kontrolní linií, znamená přítomnost toxinu A (TcdA) a jiná červená linie, která se objeví nad
kontrolní linií, znamená přítomnost toxinu B (TcdB) ve vzorku (Viz obr.1).
Tento test je založen na vazbě barevných mikročástic na specifické monoklonální protilátky
proti TcdA a TcdB, které byly imobilizovány ve dvou oddělených místech na membráně,
během jejich průchodu membránou. Pouze pro laboratorní použití.
ÚVOD:
Presumptivní diagnózy infekce C. difficile (ICD)
Clostridium difficile produkuje dva různé toxiny, které tvoří základní faktory virulence pro
indukci ICD. Provedené výzkumy1,2 prokázaly, že každý z toxinů samostatně může vyvolat
onemocnění..
C. difficile je zodpovědné za přibližně 25% průjmových onemocnění spjatých s podáváním
antibiotik jako je clindamycin, druhá a třetí generace cefalosporinů, inhibitorů gyrázy,
ampicilinu, nebo amoxicilinu.
Kromě průjmu, může onemocnění vést k pseudomembranózní kolitidě (PMC), která vyžaduje
okamžité léčení antibiotiky účinnými proti C. difficile a která může vést bez léčení k ohrožení
života pacienta.
ICD mortalita může být od 6% až do 30%, zejména když pacient trpí pseudomembranózní
kolitidou. Pacient trpící infekcí C. difficile související s předcházející léčbou antibiotiky
potřebuje o cca 6-10 dní delší hospitalizaci, což přináší vícenáklady 6-8 tisíc EUR.3
1
C. difficile – popis bakterie
Clostridium difficile je anaerobní, gram-pozitivní sporulující bakterie. Asi 5% zdravé populace
mohou být přenašeči. V průběhu hospitalizace může procento přenašečů narůst až na 30%, což
vede k rozvoji nosokomiální infekce. Děti jsou kolonizovány C. difficile brzy po narození, ale
neprojevuje se to i přes intenzivní vyšetřování žádnými klinickými symptomy. Současné
diskuze poukazují na nedostatek střevních receptorů pro toxiny, nebo na rozdíly v pH stolice u
dětí, které brání aktivitě toxinů.
Jak bylo výše zmíněno, C. difficile může produkovat různé toxiny4.
Toxin A (TcdA) (308 kDa) je enterotoxin, který může vyvolávat mnoho symptomů ve
zvířecím modelu. TcdA také vykazuje vysokou cytotoxicitu, ale pouze na specifických TcdA
citlivých buňkách, jako je HT-295.
Toxin B (TcdB) (279 kDa) je klasifikován jako cytotoxin. Ve většině buněčných kultur
v laboratořích (např. Vero, CHO nebo HELA) je tento toxin 1000x silnější než Toxin A.
Aminokyselinová sekvence TcdB se pohybuje v určitém rozmezí v závislosti na různých
kmenech 6.
TcdA/TcdB – detekční systémy
Na základě produkce toxinů mohou být detekovány následující kmeny Clostridium difficile:
Netoxigenní kmeny – jsou nepatogenní kmeny, které neprodukují TcdA a TcdB, ani binární
toxin.
TcdA+ / TcdB+ kmeny jsou nejběžnějšími kmeny, které vyvolávají ICD. Nejvyšší prevalenci
v Evropě mají ribotypy 001; 014 a 078 7.
TcdA- / TcdB+ kmeny byly poprvé identifikovány v Belgii – Delmée et.al8. Jsou považovány
za patogenní, i když neprodukují toxin A.9 Ribotypy kmene 017 patří k této skupině a jsou
zodpovědné za ohniska infekce v severní Americe.
TcdA+ / TcdB- kmeny mohou být identifikovány ze vzorku stolice přímo tímto testem, který
umožňuje jednoduchou a rychlou diferenciaci a detekci toxinu A a toxinu B v jednom testu.
Doposud je známo jen několik izolátů těchto kmenů. Výsledky provedených studií ukazují, že
TcdB mutantní kmeny C. difficile vyvolávají IDC u křečků v důsledku produkce toxinu A2.
Tyto výsledky odrážejí přítomnost těchto kmenů v klinických vzorcích.
PRINCIP TESTU:
Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister využívá kombinace:
1) Červených latexových částic konjugovaných se specifickou protilátkou proti toxinu A,
která reaguje s protilátkou jiného typu, která je umístěna na membráně pod kontrolní
linií.
2) Jiné červené latexové částice konjugované se specifickou protilátkou proti toxinu B,
která reaguje s protilátkou jiného typu, která je umístěna na membráně nad kontrolní
linií.
3) Modré latexové částice konjugované s antigenem, který je rozpoznáván protilátkou
specifickou pro tento antigen a je vázán na membráně a slouží jako kontrolní linie testu.
Při provedení testu je vzorek nejprve naředěn v ředicím roztoku pro vzorek (součást soupravy),
toxin je extrahován ze vzorku stolice. Po extrakci toxinu je část supernatantu aplikována na
testovací strip a 15 minut se nechá působit.
Extrakt prochází testovací membránou, dochází k migraci barevných částic. V případě, že je
vzorek pozitivní, specifické protilátky na membráně reagují s antigenem navázaným na barevné
2
částice. Po 15 minutách inkubace při laboratorní teplotě získáme linie, které slouží
k interpretaci výsledku (viz obr. 1)
OBSAH SOUPRAVY:
Souprava je k dispozici ve dvou různých formátech:
-
Blister : reakční strip balený v hliníkové folii . Souprava obsahuje testovací zkumavku,
která je pro ředění a extrakci toxinu ze vzorku. Lze použít i ELISA destičku. Strip se
ponoří do zkumavky, nebo jamky mikrotitrační destičky (96-jamkové s plochým dnem)
-
Kazeta : reakční strip je uzavřen uvnitř plastové kazety. Extrakt se aplikuje přímo do
okénka testovací kazety.
Oba formáty vykazují stejné charakteristiky, i když jsou zde určité rozdíly v pracovním
postupu (viz Pracovní postup)
Souprava obsahuje:
-
testovací kazety/blistery
ředicí roztok pro vzorky
jednorázové plastové pipety s vyznačeným objemem (jen pro formát blistr)
jednorázové plastové pipety bez vyznačeného objemu (žluté)
dřevěnou odběrovou tyčinku pro odběr a aplikaci vzorku stolice
1,5 ml mikrozkumavky s uzávěrem
Testovací zkumavky (jen pro formát blistr)
Stojánek na zkumavky (jen pro formát blistr)
návod k použití
certifikát kontroly balení
POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU
-
centrifuga na 1,5 ml zkumavky
jednorázové rukavice
stopky
míchačka (vortex)
SBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ:
Vzorky:




Tento test je určen pro analýzu tekutých a polotekutých vzorků stolice. Můžete
analyzovat i pevné vzorky, není to však obvyklé vzhledem k tomu, že hlavním
symptomem infekce C. difficile je průjem.
Nepoužívejte vzorky, které jsou v transportním médiu, nebo jsou odebrány do média
obohaceného různými konzervačními látkami (např. formalin, SAF, PVA apod.),
které mohou interferovat v tomto testu.
Je doporučena analýza nezpracovaných čerstvě odebraných vzorků. Jestliže je
potřeba vzorky skladovat déle, uchovávejte je po dobu 1-2 dnů v lednici při teplotě
+2 až +8 °C. Pro delší skladování vzorky zamražte (-20°C), vezměte ale na vědomí,
že některé vzorky mohou zamražením ztratit reaktivitu.
Obzvláště dávejte pozor při testování hemoragických vzorků, protože často dávají
falešně pozitivní výsledky, když obsahují větší množství krve. Indikátorem
3


destabilizace je často změna barvy barevné linie (do fialova nebo tmavě modré
zbarvení).
Před zpracováním zajistěte, aby byly zmražené vzorky kompletně rozmraženy a
temperovány při pokojové teplotě před zpracováním.
Vyvarujte se opakovaného zmrazování a rozmrazování vzorků, může být poškozena
celistvost toxinů
Příprava vzorků stolice:
Obecná doporučení:
Po celou dobu zpracování vzorků a testování používejte jednorázové rukavice, se vzorkem
zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem. Po ukončení testu proveďte opatření
uvedená v bodě: „Bezpečnostní opatření“.
Protokol přípravy vzorku je stejný pro oba formáty testu (kazeta a blister) a je následující:
1. Pro tekuté a polotekuté vzorky přeneste 3 kapky (asi 75 µl) pomocí žluté negraduované
jednorázové pipety do mikrozkumavky o objemu 1,5ml. Je-li vzorek tuhý, odeberte cca
75 mg (malá kulička o průměru 3 mm) pomocí dřevěné odběrové tyčinky a vložte do
1,5 ml mikrozkumavky. Důležité : Pro zajištění homogenity vzorku odeberte části
vzorku ze 3 různých míst. Je to metoda, jak získat co nejvíce representativní vzorek.
2. Přidejte 1 ml ředicího roztoku k odebranému vzorku do 1,5ml zkumavky (v případě, že
vzorek má větší objem, zachovejte poměr mezi množstvím ředicího roztoku a vzorku tj
75 µl (75mg)vzorku /1 ml ředicího roztoku
3. Vortexujte mikrozkumavku po dobu 30 sekund, abyste dobře resuspendovali vzorek
v ředicím roztoku.
4. Centrifugujte 1,5 ml mikrozkumavku po dobu 5 minut při 700g (přibližně 3000 rpm) ve
stolní centrifuze pro odstranění pevných částic. Pokud nemáte k dispozici centrifugu,
nechte zkumavku 3-5 minut po vortexování na stole a poté odeberte supernatant.
Nejlepších charakteristik testu je dosaženo, pokud je supernatant čirý a pokud po
extrakci vzorek centrifugujeme.
PRACOVNÍ POSTUP:
Před testováním nechte kazetu, vzorek stolice a kontroly vytemperovat na laboratorní teplotu
(+15 až +30°C).
Postup pro KAZETU (Card):
1. Těsně před použitím vyjměte kazetu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card
z obalové folie a položte ji na vodorovnou podložku. Desikant zlikvidujte, slouží pouze
k odstranění nežádoucí vlhkosti. Pro každý vzorek a kontrolu použijte samostatnou
odběrovou zkumavku a kazetu.
2. Pipetujte 4 kapky (cca 100 µl) vzorku upraveného podle odstavce „Příprava vzorků“
pomocí žluté pipety do kruhového okénka pro vzorek (označené šipkou).
3. Po 15 minutách odečtěte výsledek.
4
Postup pro Blister test:
1. Po vytemperování blisteru otevřete obalovou folii v označeném místě.
2. Pokud budete testovat vzorek ve zkumavce, vložte zkumavku do stojánku na zkumavky
3. Odeberte alikvotu ze vzorku po centrifugaci (viz odstavec „Příprava vzorků“) – přibližně
265 µl (čtvrtá značka na plastové graduované pipetě) a přeneste tento objem do testovací
zkumavky
4. Pokud používáte 96-jamkovou mikrotitrační destičku, dostatečné množství vzorku je
přibližně 150 µl (třetí značka na plastové graduované pipetě)
5. Ponořte strip do zkumavky nebo jamky mikrotitrační destičky tak, že šipka ukazuje směrem
do kapaliny
6. Inkubujte strip při pokojové teplotě 15 minut, poté odečtěte výsledek (viz obr.1)
INTERPRETACE VÝSLEDKU:
Na Obr.1 je 5 stripů, kde jsou demonstrovány různé výsledky, které mohou být získány testem
Rapid-VIDITEST toxin A+B. Jsou zde tři různé barevné linie:
Modrá linie: kontrolní linie, která indikuje správné provedení testu
Vrchní červená linie: vzorek pozitivní na TcdB
Spodní červená linie: vzorek pozitivní na TcdA
Modrá linie (kontrolní) by se měla při testu objevit vždy. Pokud se objeví navíc některá
z červených linií, indikuje to přítomnost C. difficile, která produkuje TcdA a/nebo TcdB
v analyzovaném vzorku.
Obr.1:
Strip 1: NEGATIVNÍ výsledek : vzorek neobsahuje C.dificille , nebo obsahuje kmen, který
neprodukuje TcdA/TcdB. Na stripu v centrální části se objeví jedna vodorovná MODRÁ linie,
pokud používáte formát kazet, objeví se modrá linie v části označené písmenem „C“.
5
Tato kontrolní linie by se měla objevit při každém testu a indikuje, že chromatografie proběhla
bez problémů.
Stripy 2-4 POZITIVNÍ výsledky:
Strip 2: Detekce TcdA: Pod kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte –li
formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem „T1“. Intenzita červené
linie závisí na koncentraci toxinu A ve vzorku.
Strip 3: Detekce TcdB: Nad kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte –li
formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem „T2“. Intenzita červené
linie závisí na koncentraci toxinu B ve vzorku.
Strip 4: Detekce obou toxinů TcdB i TcdA: Nad i pod kontrolní MODROU linií se objeví
ČERVENÁ (jedna nad kontrolní linií (TcdB) a jedna pod kontrolní linií (TcdA).
Strip 5: NEPLATNÝ výsledek: Neobjeví se MODRÁ linie. Indikuje to anomální test. Příčiny
mohou být následující:

Některé reagencie mohou být nestabilní a hůře funkční nebo test je proexpirovaný

Vzorek nebyl připraven a zpracován podle Návodu k použití

Vysoký obsah krve ve vzorku
V případě, že dostanete neplatný výsledek, je doporučeno test opakovat a striktně dodržet
pracovní postup.
Pro vzorky s obsahem krve doporučujeme použít alternativní metody, protože destabilizace
obyčejně závisí více na matrici vzorku než na testu samotném.
Pokud se objeví jakákoli linie po době delší než 15 minut, nemá tato linie žádný
diagnostický význam.
Poznámka: Konečná diagnóza ICD/PMC musí být stanovena lékařem. Tento test pouze
detekuje toxin A+B ve vzorku pacienta, ale nelze jím jednoznačně potvrdit, zda pacient má
nebo nemá ICD.
OMEZENÍ TESTU:
1. Tento test analyzuje tekuté a polotekuté vzorky stolice, tuhé vzorky mohou být použity, ale
test pro ně není optimalizován. Zřídka se objevují případy, kdy sekvestrace toxinu byla
pozorována u takovýchto tuhých vzorků.
2. Tento test je kvalitativní, ne kvantitativní, ačkoli intenzita červených linií souvisí
s množstvím toxinu ve vzorku.
3. Byla provedena studie funkční způsobilosti na více než 200 vzorcích stolice k zajištění
správných charakteristik testu. Srovnání výsledků tohoto testu s jinými technikami (ELISA,
stanovení cytotoxicity) byla velmi dobrá. Přesto však nemůže být vyloučena interference u
jiných vzorků.
4. Slabý signál může být způsoben malým množstvím použitého vzorku. Pokud nastane tento
případ, je doporučeno test opakovat s větším množstvím vzorku, poměr mezi ředicím
roztokem a množstvím vzorku musí být zachován (viz kapitola Příprava vzorků)
5. Přebytek vzorku může způsobit špatné vzlínání vzorku (kontrolní linie zůstává neviditelná).
Pro zabránění tohoto jevu je doporučeno opakovat test s menším množstvím vzorku. To je
důležité zejména u tuhých vzorků stolice.
6
6. Negativní výsledek zcela nevylučuje možnost infekce Clostridium difficile (ICD). Výsledek
testu musí být interpretován ve vztahu ke klinickým symptomům pacienta. Navíc je potřeba
mít na paměti, že toxin není stabilní molekula, může být snadno degradována např.
zahřátím při nevhodném skladování vzorků, nebo přítomností inhibitorů. Za těchto
podmínek pak může být koncentrace nižší, než je detekční limit testu. (viz kapitola
Analytická citlivost)
7. Pozitivní výsledek získaný z tuhých vzorků musí být interpretován s velkou opatrností.
V principu je průjem hlavním příznakem infekce Clostridium difficile a tuhé vzorky
vylučují přítomnost průjmu. Osoba provádějící test musí o této skutečnosti informovat
lékaře. Tato informace společně s klinickým obrazem pacienta, umožní lékaři stanovit
správnou diagnózu.
8. Předpokládaná možnost křížové reaktivity s dvěma dalšími mikroorganismy:
* Clostridium sordellii, který produkuje letální toxin (TcsL), který je homologní s TcdB
bakterie Clostridium difficile10. K hodnocení možné křížové reaktivity s TcsL byly
kultivovány ve vhodném médiu 2 kmeny Clostridium sordelii (IP82 a RE1522).
Supernatant ze 3 dny staré kultury byl použit pro test Rapid-VIDITEST C.dificille toxin
A+B. Neobjevily se žádné pozitivní červené linie. Předpokládáme tedy, že se neobjeví
žádná křížová reaktivita v testu pro jiné kmeny Clostridium sordelii, které produkují TcsL.
Entamoeba histolytica: Byl pozorován určitý stupeň křížové reaktivity s tímto parazitem u
vzorků, které obsahovaly jeho vysokou koncentraci. Výsledek testu byl negativní
v případě, že se použil izolát (bez matrice vzorku stolice). Výsledky různých ELISA a
Rapid testů dávají podobné výsledky pro takovéto vzorky. Bylo prokázáno, že všechny
takovéto křížově reagující vzorky stolice se prezentují stejným výsledkem v testu RapidVIDITEST C. difficile toxin A+B: toxin A je negativní, zatímco toxin B je slabě pozitivní.
Proto doporučujeme použít test E.histolytica jako konfirmační test pro vyloučení
přítomnosti tohoto parazita ve vzorku stolice.
9. Bylo pozorováno, že vzorky stolice s vysokým obsahem krve můžou negativně ovlivňovat
test. Destabilizace testu je často spojena se změnou barvy kontrolní linie. Fialová nebo
tmavě modrá se objeví místo očekávané světle modré (viz. Obrázky v odstavci „Interpretace
výsledů“). V takovém případě doporučujeme provést test alternativní metodou.
10. Osídlení bakterií Clostridium difficile u kojenců udávané v literatuře je až 50%. Vysoká
promořenost se udává také u pacientů s cystickou fibrózou. Obvykle tyto dvě skupiny
bývají asymptomatické a nevyžadují žádné specifické léčení. Takovéto pozitivní výsledky,
které nemají klinický význam, je potřeba zpracovávat opatrně, protože v tomto případě
pacienti nevyžadují léčení této infekce.
ANALYTICKÁ CITLIVOST:
Abychom mohli stanovit citlivost testu z různých zdrojů, byly použity různé kontrolní vzorky
jiných výrobců, ředěné v ředicím roztoku z tohoto testu:Připravili jsme interní standard
v koncentraci 1g/ml smícháním stejného množství toxinu A (ref: 152, List Biological
Laboratories:) a toxinu B (ref.155). Všechny šarže testu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin
A+B detekovaly tento standard ředěný nejméně do koncentrace 12 ng/ml pro toxin A a 3 ng/ml
pro toxin B, většina šarží byla schopna detekovat toxin A v koncentraci až 6 ng/ml a toxin B
pod 1 ng/ml.Testy byly dále porovnány s komerčními soupravami Tgc BIOMICs a The Native
Antigen. Testem Rapid-VIDITEST byla detekována koncentrace 0.75 ng/ml toxinu A i toxinu
B v testu se standardem toxinu A (ref: 01A01-1) a toxinu B (ref.01A02-1) od výrobce tgc
BIOMICs, a koncentrace 3 ng/ml toxinu A a 12 ng/ml toxinu B v porovnání s testem toxin A
(ref: CDA-TNL) a toxin B (ref: CDB-TNL) od The Native Antigen.
7
DIAGNOSTICKÁ CITLIVOST A SPECIFICITA:
A.- Externí hodnocení
Bylo provedeno externí hodnocení na 150 negativních a 44 pozitivních vzorcích
charakterizovaných referenční technikou – testem cytotoxicity po 48 hodinách. Všechny vzorky
byly čerstvé. Do hodnocení byly zahrnuty stejné vzorky testovány na komerčním
imunochromatografickém rychlotestu, podobném testu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin
A+B.
Výsledky získané z obou testů a referenční techniky – test cytotoxicity po 24 hodinách – byly:
Citlivost
Specifita
92.5%
95.5%
Rapid-VIDITEST
C. difficile toxin A+B
87.5%
99.3%
Jiný komerční rychlotest
Výsledky s testem cytotoxicity po 48 hodinách:
Citlivost
84.1%
Rapid-VIDITEST
C. difficile toxin A+B
79.5%
Jiný komerční rychlotest
Specifita
95.3%
99.3%
Je velice důležité mít na paměti, že vzorky charakterizované jako negativní testem cytotoxicity
po 24 hodinách a jako pozitivní po 48 hodinách (4 vzorky v této studii) často korelují s nízkým
obsahem toxinů ve vzorku. Proto je velmi pravděpodobné, že koncentrace toxinů v těchto
vzorcích je pod detekčním limitem rychlotestu a ve skutečnosti tyto 4 vzorky byly detekovány
jako negativní v případě obou rychlotestů (Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B i jiný
komerční rychlotest) a tím je spočtena citlivost nižší.
A.- Interní hodnocení
Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B byl testován na 242 negativních a 105 pozitivních
vzorcích charakterizovaných testem cytotoxicity. Všechny analyzované vzorky byly
zamraženy.
Výsledky:
Citlivost = 99.0%
Specificita = 96.3%
Rapid-VIDITEST podle tohoto interního hodnocení vykazuje dobrou citlivost a specificitu,
s hodnotami nad 90% .
PŘESNOST:
OPAKOVATELNOST
Purifikované toxiny A a B od firmy ListLabs byly použity pro vynesení křivky citlivost, aby se
změřila citlivost testu v různých podmínkách. Ředění bylo provedeno dvojkovou řadou a
vzorky byly analyzovány stejnou osobou v tripletu v průběhu jednoho testování. Výsledky se
lišily o méně než faktor 2, co značí vysokou přesnost testu.
REPRODUKOVATELNOST
Jedna šarže testu byla použita k měření křivky citlivosti po dobu čtyř dnů za sebou. Výsledky
ukazují vysokou reprodukovatelnost testu (byla získána stejná hladina citlivosti pro TcdA a
TcdB ve čtyřech dnech měření)
8
Pět různých laboratorních pracovníků bez předchozího zaškolení provádělo měření křivky
citlivosti v duplikátu. Rozdíly, které byly získány při větším ředění (slabší signál) nepřesáhly
faktor 2.
Tři různé šarže testu v duplikátu byly použity pro měření křivky citlivosti. Analýza byla
provedena jedním pracovníkem v jeden den. Rozdíly mezi jednotlivými šaržemi byly přijatelné
a očekávané, nepřesáhly faktor 2.
Rozdíly zjištěné při testování jsou akceptovatelné pro kvalitativní imunochromatografické
techniky, berou v úvahu přirozenou variabilitu testu.
HOOK EFEKT
Několik publikací uvádí, že nejvyšší koncentrace nalezena ve vzorcích stolice je přibližně 112
ng/ml u pacientů s těžkou infekcí C. difficile11. Abychom zjistili efekt vysoké koncentrace
toxinů, byly použity pro testování koncentrace 5000 ng/ml. Jsou to koncentrace mnohem vyšší
než se nachází u ICD. Jsou asi 400-krát vyšší než detekční limit pro toxin A (12.5 ng/ml) a
1500-krát než detekční limit pro toxin B (3 ng/ml), a asi 40-krát vyšší než u vzorků od pacientů.
Pokles intenzity pozitivního signálu nebyl zaznamenán.
INTERFERENCE:
Substance uvedené v tabulce v určitých koncentracích neinterferují s výsledkem tohoto testu,
když byly přidány do vzorků stolice (pozitivním a negativním):
Racecadotril
5% (p/v)
Ibuprofen
20% (p/v)
Cimetidine
10% (p/v)
Acetylsalicylic acid
30% (p/v)
Loperamide
5% (p/v)
Edulcorant
5% (p/v)
Metronidazole
10% (p/v)
Palmitic acid
40% (p/v)
Omeprazole
3% (p/v)
Barium Sulfate
5% (p/v)
Ampicillin
15% (p/v)
Mucin
5% (p/v)
KŘÍŽOVÁ REAKTIVITA S JINÝMI MIKROORGANISMY:
Rapid-VIDITEST C.difficile toxin A+B test byl testován se silně pozitivními vzorky pro
následující mikroorganismy:
Adenovirus - Rotavirus - Norovirus - Astrovirus - Helicobacter pylori - Entamoeba histolytica Giardia lamblia - Cryptosporidium parvum.
Určitý stupeň křížové reaktivity byl zaznamenán u silně pozitivních vzorků na Entamoeba
histolytica (viz kapitola „Omezení testu“)
Křížová reaktivita Rapid-VIDITEST C.difficile toxin A+B byla testována s různými
mikroorganismy, které se někdy můžou vyskytovat v trávicím traktu v dostatečně vysoké
koncentraci. Testy byly provedeny s bakteriální suspenzí 108 cfu/ml. Rapid-VIDITEST
C.difficile toxin A+B nevykazoval křížovou reaktivitu s níže uvedenými mikroorganismy:
Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Bacillus spp, Bacteroides nordii,
Campylobacter jejuni, Candida albicans, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris,
Clostridium perfringens, Clostridium sordellii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae,
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli 1, Escherichia coli 2, Klebsiella
pneumoniae, Lactobacillus gosseri, Listeria monocitogenes, Plesiomonas shigelloides, Proteus
9
mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteriditis, Salmonella typhi, Salmonella
typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenterie, Shigella flexnerii, Shigella sonneii,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Yersinia enterocolitica.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA:
Skladujte v originálním obalu při teplotě +2 až +30°C. Test je stabilní do data expirace
uvedeného na obalu.
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ:
1. Se vzorky stolice pacienta zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem. Při práci
používejte ochranné pomůcky (jednorázové rukavice, ochranné brýle, laboratorní plášť
a další).
2. Ředicí roztok pro vzorky obsahuje azid sodný jako antimikrobiální činidlo. Vyvarujte se
přímého kontaktu roztoku s kůží a sliznicemi. Roztok by neměl být používán, pokud
jeví známky kontaminace nebo precipitace.
3. Nejezte, nepijte a nekuřte v místnosti, kde pracujete s testem a vzorky.
4. Po dokončení práce se soupravou vyhoďte jednorázové rukavice, dezinfikujte pokožku
rukou alkoholovou desinfekcí, pak omyjte mýdlem Výlevku nebo umyvadlo, které při
práci používáte, dekontaminujte vhodným prostředkem proti sporám. Spory Clostridium
difficile nejsou alkoholem eliminovány.
5. Nezaměňujete reagencie mezi jednotlivými šaržemi souprav.
6. Nechte reagencie a vzorky vytemperovat na pokojovou teplotu před použitím.
Nedostatečně vytemperované reagencie nebo vzorky mohou snížit účinnost testu.
Vhodná doba je obvykle 20-30 minut při pokojové teplotě
7. Všechny reagencie jsou pouze pro účely in vitro.
8. Nepoužívejte soupravu po uplynutí data expirace.
9. Jestliže je poškozený obal soupravy, souprava může být použita pouze, pokud nejsou
poškozené obaly jednotlivých reagencií.
10. V případě, že používáte formát Kazety, je velmi důležité aplikovat správný objem
extrahovaného vzorku. Pokud aplikujete menší objem, než je doporučen v návodu,
vzorek se nemusí dostat vzlínáním do reakční zóny a neobjeví se linie. Pokud aplikujete
nadměrné množství vzorku, můžou se objevit místo červené a modré linie, linie hnědé.
11. Test je určen na jedno použití a musí být likvidován v souladu s platnou legislativou.
12. Nepoužívejte test v případě, že se objeví jakákoli barevná linie ještě před provedením
testu.
13. Kritický je správný odběr pacientského vzorku: přibližně 75mg pevného vzorku (malá
kulička o průměru 3 mm), nebo 75 l kapalného nebo polotekutého vzorku. Toto
množství je extrahováno v 1 ml ředicího roztoku, který je součástí soupravy. Pokud
odeberete větší vzorek, zachovejte poměr mezi množstvím vzorku a ředicího roztoku.
Nadměrné množství vzorku v poměru k přidanému množství ředicího roztoku zabraňuje
správnému průběhu chromatografie. Toto je kritické zejména při extrakci pevného
vzorku, protože je obtížné odměřit správné množství. Mějte na paměti, že tento test je
určen pro analýzu tekutého nebo polotekutého vzorku.
14. Abychom zajistili adekvátní průběh chromatografie, je velmi důležité před odběrem
supernatantu centrifugovat 1,5ml mikrozkumavky se vzorkem. Správný výsledek nelze
zaručit, pokud jsou nerozpuštěné partikule ponechány v roztoku, aby se usadily než aby
byly odstraněny centrifugací. Toto se týká zejména pevných vzorků, kde velké množství
suspendovaných částice může interferovat při chromatografii.
10
15. Je velmi důležité dobře uzavřít obal testu, pokud test nepoužijete, může dojít ke zvlhnutí
stripu a tím k jeho poškození.
REFERENCE:
1. Lyras D., O’Connor J. R., Howard P. M., Sambol S. P., Carter G.P., Phumoonna T., Poon
R., Adams V., Vedantam G., Johnson S., Gerding D. N., Rood J. I. Toxin B in essential for
virulence of Clostridium dififcile. Nature. 2009 Apr 30; 458 (7242): 1176.
2. Kuehne S. A., Cartman S. T., Heap J. T., Kelly M. L., Cockayne A., Mintn N. P. The role
of toxin A and toxin B in Clostridium difficille infection. Nature in press Sep. 2010.
3. Vonberg RP, Reichardt C, Behnke M, Schwab F, Zindler S, Gastmeier P. Costs of
nosocomial Clostridium difficille-associated diarrhoea. J. Hosp. Infect. 2008 Sep; 70 (1):
15-20.
4. Rupnik M., Dupuy B., Fairweather N. F., Gerding D. N., Johnson S., Just I., Lyerly D. M.,
Popoff M. R., Rood J. I., Sonnenshein A. L., Thelestam M., Wren B. W., Wilkins T. D.,
von Eichel Streiber C. Revised nomenclature of Clostridium difficille toxins and associated
genes. J. Med. Microbiol. 2005 Feb; (Pt 2): 113-7.
5. Tucker K. D., Carrig P. E., Wilkins T. D. Toxin A of Clostridium difficille is a potent
cytotoxin. J. Clin. Microbiol. 1990 May; 28 (5): 869-71.
6. Soehn F., Wagenknecht-Wiesner A., Leukel P., Kohl M., Weidman M., von Eichel-Streiber
C., Braun V. Genetic rearrangements in the pathogenicity locus of Clostridium difficille
strain 8864--implications for transcription, expression and enzymatic activity of toxin A and
B. Mol. Gen. Genet. 1998 May; 258 (3): 222-32.
7. Barbut F., Mastrantonio P., Delmée M., Brazier J., Kuijper E., Poxton I., European Study
Group on Clostridium difficille (ESGCD). Prospective study of Clostridium difficille
infections in Europe with phenotypic and genotypic characterisation of the isolates. Clin.
Microbiol. Infect. 2007 Nov; 13 (11): 1048-57.
8. Depitre C., Delmee M., Avesani V., L’Haridon R., Roels A., Popoff M., Corthier G.
Serogroup F strains of Clostridium difficille produce toxin B but not toxin A. J. Med.
Microbiol. 1993 Jun; 38 (6): 434-41.
9. Drudy D., Harnedy N., Fanning S., Hannan M., Kyne L. Emergence and control of
fluoroquinolone-resistant, toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficille. Infect
Control Hosp. Epidemiol. 2007 Aug; 28 (8): 932-40.
10. von Eichel Streiber C., Boquet P., Sauerborn M., Thelestam M. Large clostridial
cytotoxins--a family of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins. Trends
Microbiol. 1996 Oct; 4 (10): 375-82.
11. Alex B. Ryder, Ying Huang, Haijing Li, Min Zheng, Xiaobo Wang, Charles W. Stratton,
Xiao Xu and Yi-Wei Tang. Assesment of Clostridium difficile infections by quantitative
detection of TcdB toxin by use of a real-time cell analysis system. Journal of Clinical
Microbiology, Nov 2010, pp: 4129-4134.
POUŽITÉ SYMBOLY:
In vitro diagnostický
prostředek
Šarže
Expirace
Výrobce
Datum poslední revize návodu: září 2014
11