CE-LIF fúzního proteinu AHP5-GFP v komplexních vzorcích

Studium neenzymatické
fosforylace rodiny proteinů AHP
pomocí CE-LIF
Lenka Michalcová
1
Osnova
PTMs – fosforylace
Cytokininová signalizace / rodina proteinů AHP
a) Bakteriální vzorek
b) Citlivost metod western blot a CE-LIF
c) Rostlinný vzorek
2
Posttranslační modifikace
KHOURY, George. ,Scientific Reports [online]. ,2011, 1, 1, dostupný z WWW: <http://www.nature.com/srep/2011/110913/srep00090/full/srep00090.html>.
3
Fosforylace proteinů
4
y
jednou z nejdůležitějších a také
nejčastěji se vyskytujících
posttranslačních modifikací
proteinů
y
u eukaryotických organismů je
cca 1/3 proteinů fosforylována
y
více fosforylačních míst s
rozdílnou regulační funkcí
y
deset aminokyselin, které mohou
být fosforylovány - serin,
threonin, tyrosin, histidin, lysin,
arginin, aspartát, glutamát,
cystein a prolin
KHOURY, George. ,Scientific Reports [online]. ,2011, 1, 1, dostupný z WWW:
<http://www.nature.com/srep/2011/110913/srep00090/full/srep00090.html>.
Fosfoaminokyseliny
N-fosfáty
O-fosfáty
pLys
pSer
pTyr
pArg
pThr
S-fosfáty
pPro
1-pHis
pCys
acyl-fosfáty
5
pGlu
pAsp
3-pHis
Fosfoaminokyseliny
typ fosforylované
aminokyseliny
O-fosfáty
N-fosfáty
acyl-fosfáty
S-fosfáty
kyselé
zásadité
fosfoserin
stabilní
nestabilní
fosfothreonin
stabilní
nestabilní
fosfotyrosin
stabilní
stabilní
fosfohistidin
nestabilní
stabilní
fosfoaspartát
nestabilní
nestabilní
fosfoglutamát
nestabilní
nestabilní
fosfoarginin
nestabilní
stabilní
fosfolysin
nestabilní
stabilní
fosfocystein
stabilní
stabilní
SICKMANN, A; MEYER, HE. Analyst. 2005, 130, 9, s. 1263-1270.
6
prostředí
Dvoukomponentní systémy
U prokaryot, v menší míře u eukaryot (hlenky, houby, kvasinky a rostliny)
y Přenos fosfátu mezi histidinem a kyselinou asparagovou
y His - Asp fosforylace
y
y
dvoukomponentní systémy (two-component system, TCS)
y Klasický (jednokrokový) TCS
y Vícekrokový TCS
Deruere, J.; Kieber, J. J., Journal of Plant Growth Regulation 2002, 21 (1), 32-39.
7
Rodina proteinů AHP
8
y
Cytokininová signální
dráha rostlin
y
A. thaliana proteiny
AHP (Arabidopsis
Histidinephosphotransfer Proteins)
y
AHP1-5 fungují jako
proteiny HPt
y
AHP6/APHP1 negativní regulace
cytokininového
signálu
y
doména HPt s evolučně konzervovaným
strukturním motivem XHQXKGSSXS
To, J.P.,Kieber, J.J. Trends Plant Sci. 2008, 13, 85-92
Fosfohistidin (pHis)
typ fosforylované
aminokyseliny
O-fosfáty
N-fosfáty
acyl-fosfáty
S-fosfáty
kyselé
zásadité
fosfoserin
stabilní
nestabilní
fosfothreonin
stabilní
nestabilní
fosfotyrosin
stabilní
stabilní
fosfohistidin
nestabilní
stabilní
fosfoaspartát
nestabilní
nestabilní
fosfoglutamát
nestabilní
nestabilní
fosfoarginin
nestabilní
stabilní
fosfolysin
nestabilní
stabilní
fosfocystein
stabilní
stabilní
SICKMANN, A; MEYER, HE. Analyst. 2005, 130, 9, s. 1263-1270.
9
y
2 izomery pHis
y
6 % z celkového
počtu fosfoproteinů
prostředí
Jak na to?
10
AHP5
GFP
a) Bakteriální vzorek
Elektroforegram bakteriálního lyzátu
c = 2,6 mg.ml-1; Δh = 3 cm, tinj = 60 s, U = 7 kV,
50 mM Tris se 75 mM NaCl, pH = 8,0
11
Western blot
bakteriálního lyzátu
a) Bakteriální vzorek - FPLC
Elektroforegram bakteriálního lyzátu
a frakcí získaných pomocí FPLC
frakce 8
frakce 9
frakce 10
frakce 11
frakce 12
bakteriální lyzát před purifikací
3
2,8
2,6
2,4
fluorescence [a.u.]
Western blot bakteriálních
frakcí
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
5
10
15
t [m in]
Δh = 3 cm, tinj = 60 s, U = 7,0 kV, 50 mM Tris
se 75 mM NaCl, pH = 8,0
12
20
a) Bakteriální frakce č. 10- fosforylace
Složka pufru
Fosforylační
směs I
Fosforylační
směs II
Fosforylační
směs III
100 mM
100 mM
100 mM
MgCl2
5 mM
5 mM
5 mM
DTT
1 mM
1 mM
1 mM
Acetylfosfát
10 mM
-
-
Fosforamid
-
10 mM
-
Karbamoylfosfát
-
-
10 mM
Tris.HCl pH = 7,0
3 µg proteinu : 5 µl fosforylační směsi
Inkubace vzorku: 10 – 120 min
Lukat, G. S.; McCleary, W. R.; Stock, A. M.; Stock, J. B.,National Academy of Sciences of the United
States of America 1992, 89 (2), 718-722.
13
a) Bakteriální frakce č. 10- fosforylace
Elektroforegram bakteriální frakce před a po fosforylační proceduře
2,6
před fosforylační procedurou
flu o rescen ce [a.u .]
2,5
2,4
po fosforylační proceduře
2,3
2,2
2,1
2
1,9
1,8
0
5
10
t [min]
15
Δh = 3 cm, tinj = 60 s, U = 8,0 kV, 50 mM Tris s 50 mM NaCl, pH = 9,0
14
pI
MW [kDa]
GFP
5,8
26,8
AHP5-GFP
5,52
44,8
20
b) Standard GFP: citlivost WB a CE-LIF
Elektroforegram standardu GFP
5,5
10 µg.ml-1
fluorescence [a.u.]
5
4,5
CE-LIF 0,01
1 µg.ml-1
µg.ml-1
0,1 µg.ml-1
4
3,5
3
2,5
4
5
6
t [m in]
Δh = 3 cm, tinj = 5 s, U = 8 kV, 50 mM Tris se 50 mM NaCl, pH = 9,0
15
7
8
b) Standard GFP: citlivost WB a CE-LIF
Western blot 1,0 µg.ml-1
Western blot standardu GFP
0,03 - 20 µg.ml-1 vždy v objemu 30 µl
CE-LIF 0,01 µg.ml-1
c) Rostlinný vzorek
Odstranění interference chlorofylu:
17
změna v instrumnetaci
redukce chlorofylu (kořeny, tma)
c) Rostlinný vzorek
Elektroforegram extraktů z modifikované
a nemodifikované rostliny
7,5
Elektroforegram lyzátu z
modifikované rostlinné suspenzní
kultury
extrakt z nemodifikované rostliny (2 hodiny)
5,2
f lu o re s c e n c e [ a .u .]
extrakt z nemodifikované rostliny (12 hodin)
5,5
4,5
fluorescence [a.u.]
extrakt z modifikované rostliny (2 hodiny)
6,5
4,2
3,2
3,5
2,2
3
2,5
4
5
6
7
8
t [m in]
1,5
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
t [min]
c = 0,5 mg/ml-1, Δh = 3 cm, tinj = 5 s, U = 8 kV, 50 mM Tris
se 50 mM NaCl, pH = 9,0
Δh = 3 cm, tinj = 5 s, U = 8 kV, 50 mM
Tris se 50 mM NaCl, pH = 9,0
9
10
c) Rostlinný vzorek - imunoprecipitace
Komerčně dostupné agarózové částice s protilátkou proti GFP
Úprava komerčně doporučeného protokolu
Western blot; 1 – pelet, 2 – lyzát před zachycením, 3 – lyzát po
zachycení, 4 – první promytí, 5 – promytí roztokem s vyšší iontovou
silou, 6 – prázdná jamka, 7 – eluát, 8 – imunočástice, 9 – standard
(Martina Válková)
19
c) Rostlinný vzorek - imunoprecipitace
Elektroforegram lyzátu před a po imunoprecipitaci
flu o rescen ce [a.u .]
5,2
lyzát před imunoprecipitací
lyzát po imunoprecipitaci
4,2
3,2
2,2
3
4
5
6
7
8
9
10
t [min]
Elektroforegram eluátu
Δh = 3 cm, tinj = 15 s, U = 8 kV, 50 mM
Tris se 50 mM NaCl, pH = 9,0
eluát
fluorescence [a.u.]
4,2
3,7
eluát s přídavkem
standardu GFP
3,2
2,7
2,2
4
5
6
7
t [m in]
Δh = 3 cm, tinj = 15 s, U = 8 kV, 50 mM Tris se 50 mM NaCl, pH = 9,0
c) Rostlinný vzorek - FPLC
Western blot rostlinných frakcí z FPLC
a) detekce pomocí protilátek proti GFP, b) detekce pomocí protilátek proti AHP5; (Martina Válková)
21
c) Rostlinný vzorek - FPLC
Elektroforegram rostlinných frakcí z FPLC
33
frakce 7
frakce 9
2,8
2,8
fluorescence
fluorescence
[a.u.]
frakce 9
frakce 10
frakce 10
frakce 13
2,6
2,6
2,4
2,4
2,2
2,2
22
44
5
5
6
7 6
8
79
10
8
t (m
t [m
in] in)
Δh = 3 cm, tinj = 5 s, U = 8,0 kV, 50 mM Tris s 50 mM NaCl,
pH = 9,0
22
frakce
Koncenrace celkových
protenů [mg.ml-1]
7
2,72
9
5,14
10
1,33
13
0,02
Závěr
y
23
V budoucnu
y nutné purifikovat čistý fúzní protein AHP5-GFP bez přítomnosti
volného GFP
y
vytvořit metodu vhodnou k přečištění vzorku, která by zachovala
fosforylaci na histidinu
y
vyzkoušet neenzymatické i enzymatické (pomocí membránových frakcí)
fosforylace na čistém AHP5-GFP
Děkuji za pozornost
doc. Mgr. Janu Preislerovi, PhD.
Mgr. Radce Dopitové, PhD.
Bc. Martině Válkové
24