Z-ANO - České vysoké učení technické v Praze

Z-ANO - České vysoké učení technické v Praze

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ
Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
Jitka Pelikánová
2012
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ
Katedra biomedicínské techniky
Stanovení biogenních aminů pro fluorescenční
senzory:
Příprava citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a
enzymem.
Týmový projekt
Vedoucí projektu:
Ing. Marie Pospíšilová, CSc.
Studentka:
Jitka Pelikánová
leden 2012
Anotace
Název práce:
Stanovení biogenních aminů pro fluorescenční senzory:
Příprava citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem
Autor:
Jitka Pelikánová
Konzultant práce:
Ing. Marie Pospíšilová, CSc.
Abstrakt:
Cílem projektu bylo připravit citlivé vrstvy s rutheinovým
komplexem a enzymem pro měření fluorescenčími senzory.
Pomocí biogenních aminů je snaha jejich využití v humánní
medicíně, proto je třeba dobře znát jejich vlastnosti. Práce se
zkládá z teoretických kapitol, týkajících se luminiscence,
biosenzorů, biogenních aminů a experimentální části s popisem
přípravy citlivé vrstvy čočky.
Klíčová slova:
Biogenní aminy, polyaminy, fluorescenční senzory, biosenzory,
luminiscence
Title:
Determination of biogenic amine for fluorescence sensors:
Preparation of sensing layer with Ru-complex and enzyme
Author:
Jitka Pelikánová
Supervisor:
Ing. Marie Pospíšilová, CSc.
Abstract:
The main tasks of thesis was to prepare the sensitive layer with
Ru-komplex and enzyme for measuring fluorescence sensors.
Use of biogenic amines is the effort to their use in human
medicine, therefor it´s necessary to have a good knowledge their
properties. The project is composed of theoretical chapters of
luminiscence, biosensors, biogenic amines and experimental
section with a description preparation of sensitive layers of the
lents.
Key words:
Biogenic amines, polyamines, fluorescence sensors, biosensors,
luminiscence
Poděkování:
Chtěla bych poděkovat Ing. Marii Pospíšilové CSc. za vysvětlení témata a objasnění
všech nejasností.
Dále bych chtěla poděkovat Ing. Gabriele Kuncové CSc. za pomoc v laboratoři ÚChP
AV ČR, užitečné rady a doplňující informace při měření.
Tato práce by nevznikla bez spolupráce Heleny Paďourkové a Terezy Juráskové při
měření v laboratoři ÚChP AV ČR.
Prohlášení:
Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem Stanovení biogenních aminů pro
fluorescenční senzory: Příprava citlivé vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem,
vypracovala samostatně a použila k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím
v seznamu přiloženém k práci.
Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona
č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně
některých zákonů (autorský zákon).
V Praze dne 3.1.2012
…………………….
Podpis
Obsah
Úvod ......................................................................................................................................... 10
Teoretická část.........................................................................................................................15
Luminiscence ........................................................................................................................ 11
Fluorescence ..................................................................................................................... 11
Fosforescence .................................................................................................................... 12
Chemiluminiscence ........................................................................................................... 12
Biosenzory ............................................................................................................................ 12
Optické vláknové biosenzory ............................................................................................ 12
Enzymatické převodníky .................................................................................................. 12
Biogenní aminy..................................................................................................................... 13
Tyramin ............................................................................................................................. 13
Histamin ............................................................................................................................ 14
Putrescin ............................................................................................................................ 14
Kadaverin .......................................................................................................................... 15
Bakterie podílející se na produktivitě biogenních aminů ................................................. 15
Potenciální zdravotní problémy ........................................................................................ 15
Polyaminy ......................................................................................................................... 16
Experimentální část................................................................................................................ 17
Použité chemikálie ............................................................................................................ 17
Použité pomůcky ............................................................................................................... 17
Použité přístroje ................................................................................................................ 17
Příprava citlivé vrstvy čočky ................................................................................................ 18
Příprava citlivé vrstvy ....................................................................................................... 18
Závěr ........................................................................................................................................ 20
Seznam obrázků
Obr. 1: Jablonskeho diagram.[13] ............................................................................................ 11
Obr. 2: Strukturní vzorec Tyramin (C8H11NO) [10] ................................................................ 13
Obr. 3:Strukturní vzorec Histaminu (C5H9N3). [7] .................................................................. 14
Obr. 4:Strukturní vzorec Putrescinu (C4H12N2) ....................................................................... 14
Obr. 5: Strukturní vzorec Kadaverinu (C5H14N2). [9] .............................................................. 15
Obr. 6: Čočka bez citlivé vrstvy ............................................................................................... 21
Obr. 7: Čočka s citlivou vrstvou............................................................................................... 18
Obr. 8:Struktura citlivé vrstvy senzoru .................................................................................... 19
Obr. 9:UV lampa pro vytvrzování............................................................................................ 19
Úvod
Fluorescenční senzor využívající jako převodníku enzym s Rutheiniovým komplexem
(3) patří do skupiny biosenzorů.(13) Stanovení biogeních aminů je v současné době
využíváno především v potravinářském průmyslu. Snahou je jejich využití v humánní
medicíně, proto je důležité znát jejich vlasnosti.
Byl izololován nový enzym diaminooxidáza, který se ukazuje být vhodným
převodníkem pro biosenzory, využívající princip zhášení fluorescence (14). Mým úkolem
bylo připravit aktivní vrstvu na bázi ORMOCERu do které byl imobilizován tento enzym s
Rutheniovým komplexem, jako fluorescenčním převodníkem. Tato vrstva se nanesla na
optickou čočku, jež tvoří aktivní část biosenzoru. Aktivní vrstva obsahuje enzym
diaminooxidáza, který katalyzuje reakci s kyslíkem a tím dojde i ke snížení koncentrace
kyslíku v roztoku. Kyslík zháší fluorescenci převodníku Rutheinového komplexu na
λe ~ 620 nm, která je excitovaná s λα ~ 460 nm.
Práce je členěna na dvě základní části, na Teoretickou a Experimentální část.
Teoretická část je dále dělena do podkapitol týkajících se luminiscense, biosenzorů a
biogeních aminů . V Experimentální části se zabývám dílčím tématem, a to přípravou citlivé
vrstvy s rutheniovým komplexem a enzymem.
Teoretická část
Luminiscence
Luminiscence je samovolné záření látky s maximem na vlnové délce λmax, úměrné
rozdílu energií excitované a základní hladiny látky, jako výsledek absorpce záření na vlnové
délce s λα s látkou. Přižemž platí s λα < λmax .
Vlnová délka absorbovaného záření λα je nižší než vlnová délka λe. Jejich rozdíl Δ λ se
nazývá Stokesův posuv. Jeho velikost charakterizuje daný materiál. Tyto energetické
přechody jsou graficky znázorněny v Jablonskeho diagramu (obr. 1).
VR…vibrační relaxace
IC…interní přechod
ISC…Mezisystémový
přechod
Obr. 1: Jablonskeho diagram.[13]
Luminiscence se dělí na fluorescenci a fosforescenci.
Fluorescence
Při fluorescenci dochází k nezářivému přechodu molekuly z vyšší na základní vibrační
hladinu excitované energetické hladiny a poté k zářivému přechdu na základní energetickou
hladinu (viz. Obr. 1).
Fosforescence
Během fosforescence přejde molekula na přechodný tripletový stav, přitom se změní
spin a poté přechází zářivým přechodem na základní energetickou hladinu. Fosforescence
odeznívá mnohem pomaleji než fluorescence.
Chemiluminiscence
Speciálním případem luminiscence je chemiluminiscence, kdy je molekula excitována
na vyšší energetické hladině energií z chemické reakce.
Biosenzory
Biosenzor je integrované zařízení, které je schopné poskytovat specifickou
kvantitativní
nebo
semikvantitativní
analytickou
informaci,
obsahující
biologickou
(bioelement) nebo od biologie odvozenou složku (receptor), která je v přímém nebo úzkém
kontaktu s převodníkem. Bioelement plní rekogniční funkci, tzn., rozpoznává analyt až na
molekulové úrovni, což zaručuje vysokou citlivost, specifičnost a možnost optimalizace
senzoru pro daný analytický problém.
Naproti tomu chemické senzory, jako např. sodné nebo draselné iontově selektivní
elektrody, jsou často používány k monitorování těchto iontů v tělních tekutinách, jako moč
nebo krev.
Převodník (senzor) je zařízení umožňující převod signálu k dalšímu zpracování. [15]
Optické vláknové biosenzory
Optický biosenzor je optickým senzorem, kde je v detekčním místě zachycen
biologický opticko-chemický převodník (dále biopřevodník). Interakcí analyzované látky
s tímto převodníkem dojde ke změně optických vlastností v detekčním místě a tím se změní
výstupní signál senzoru. Jako převodníky jsou využívány látky z biologických systémů, (např.
buňky získané z myší či králíků), proto jim přisuzujeme přívlastek biologický. [13]
Enzymatické převodníky
Enzymatické nebo také katalytické biopřevodníky zahrnují různé enzymy, tj. složité
bílkoviny, které katalyzují (umožňují, urychlují) chemické reakce.
Tabulka… Příklady enzymatických senzorů pro lékařství. [13]
Analyt
Glukóza
Bilirubin
Cholesterol
Penicilin
Močovina
Enzym
Glukosooxidáza
Bilirubinoxidáza
Cholesteroloxidáza
Penicilináza/Penicilin
G amidáza
Ureáza
Cholin
Cholinooxidáza
Matrice;
Akrylamid
Akrylamid
Grafit
Polyvinyl
Alkohol
Polyvinyl
Alkohol
PVA gel
Detekován
Kyslík
Kyslík
Kyslík
pH
Převodník
Ru(phen)2Cl2
Ru(phen)2Cl2
Ru(phen)2Cl2
Aminofluorescein
pH
Aminofluorescein
H2O2
Luminol
Biogenní aminy
Biogenní aminy jsou organické sloučeniny osahující dusík. Jsou tvořeny enzymatickou
dekarboxylací přirozeně se vyskytující aminokyseliny, které se běžně podílejí na
metabolických procesech v živých tkáních a vykazují různé biologické účinky. Největší nárůst
hladiny biogenních aminů je obvykle pozorován během procesu stárnutí. [2]
Mohou přímo fungovat jako hormony (histamin) nebo mohou být např. stavební
látkou pro biosyntézu hormonů (např. fenylethylamin) nebo alkaloidů (halucinogenní účinky).
V nízkých koncentracích jsou biogenní aminy přirozenou složkou řady potravin. Mezi 4
nejobvyklejší biogenní aminy vyskytujících se ve víně patří Tyramin, Histamin, Putrescin a
Kadaverin. [8]
Tyramin
Tyramin (4-hydroxyphenethylamine, para-tyramin, mydrial nebo uteramin) je
aromatický amin, působí jako katecholaminy ( dopamin, noradrenalin, adrenalin ).
Vyskytuje se hojně v rostlinách a zvířatech a je metabolizován enzymem
monoaminooxidázy. V potravinách je často produkován dekarboxylací z tyrosinu v průběhu
kvašení a rozkladu.
Obr. 2: Strukturní vzorec Tyramin (C8H11NO) [10]
Histamin
Fyziologicky je histamin velmi účinný. Působí na hladké svalstvo, způsobuje
intenzivní kontrakce dělohy, rozšiřuje cévy a tím snižuje krevní tlak.
Je to látka vznikající z aminokyseliny histidinu. Vyskytuje se zejména v některých
bílých krvinkách, ale také i v ostatních orgánech. Jeho nadměrné uvolnění při alergické reakci
způsobuje zúžení průdušek (u astmatu), kopřivku aj. Histamin se uplatňuje i při vzniku zánětu
a zvyšuje též vylučování žaludeční šťávy. Potlačení jeho působení je součástí léčby
alergických stavů (antihistaminika H1) a žaludečního vředu (antihistaminika H2).
Obr. 3:Strukturní vzorec Histaminu (C5H9N3). [7]
Putrescin
Putrescin, nazývaný též tetramethylendiamin nebo butan-1,4-diamin, je alifatickým
diaminem. Vzniká dekarboxylací aminokyseliny lysin či aminokyseliny ornithin. Vzniká také
při hnití masa. Jeho toxické účinky jsou téměř stejné jako u amoniaku, někdy se proto
označuje společně s dalšími aminy jako mrtvolné jedy.
Obr. 4:Strukturní vzorec Putrescinu (C4H12N2)
Kadaverin
Kadaverin, nazývaný též pentamethylendiamin či pentan-1,5-diamin, je alifatickým
diaminem. Vzniká podobně jako putrescin, dekarboxylací aminokyselin lysinu, ornithinu a při
hnití masa
Obr. 5: Strukturní vzorec Kadaverinu (C5H14N2). [9]
Bakterie podílející se na produktivitě biogenních aminů
Mnoho kmenů bakterií (např. Lactobacillus, Pediococcus) ve zkaženém víně má
schopnost vytvářet biogenní aminy. K tomu, aby mohl být biogenní amin produkován, je
třeba tří podmínek:
1) Ve víně musí být přítomny aminokyseliny, jako je arginin, histidin a tyrosin.
2) Stálé prostředí ve víně, např. pH, alkohol, stálá teplota příznivá pro růst bakterií
3) Bakterie musí obsahovat odpovídající enzym pro dekarboxylaci dostupné
aminokyseliny.
Potenciální zdravotní problémy
V lidském organismu se z buněk kůže a sliznice tvoří histamin, který se při
nadměrném vylučování stává průvodním znakem alergické reakce. Jeho uvolňování může
vyvolat symptomy jako je například svědění, bolesti hlavy, pokles krevního tlaku a kožní
vyrážka. Pokud je organismus intaktní, spouštějí se určité mechanismy, které likvidují
histamin produkovaný vlastním tělem.
Do těla je Histamin také přijímán potravou. Vzniká při mikrobiologickém rozkladu
potravin, a proto se velmi hojně vyskytuje v potravinách živočišného původu, jako jsou ryby,
mléčné výrobky nebo maso. Kromě toho může být obsažen i ve výrobcích procházejících
mikrobiologickým kvašením a fermentací, např. v pivu, vínu, kyselém zelí, uzeninách či
sýru. [11]
Přítomné množství histaminu lze použít jako indikátor čerstvosti (zkažené maso
obsahuje cca 60mg/kg kadaverinu a putrescinu). [8]
Polyaminy
Polyaminy jsou polykationty alifatických aminů se dvěma nebo více amino skupinami.
Základní polyaminy jsou spermidin, putrescin a spermin, které vzniknou syntetizováním Largininu a L-methioninu.
Polyaminy jsou důležitými růstovými faktory, protože stabilizují nukleovou strukturu
kyseliny a podporují tak syntézu bílkovin, jsou tak nezbytné pro dělení a růst buněk či pro
aktivitu imunitního systému. Podporují však zároveň růst nádorů, i když samy nejsou
karcinogenní. Putrescin je syntetizován z buněk Escherichia coli.
Experimentální část
Použité chemikálie
Benzen
Aceton
Ethanol 96%,p.a.
Třená sacharosa, p.a.
Odstředěné Sepabeads® EC-HA403 s imobilizovanou diaminooxidasou (DAOX )
ORMOCER® KSK1238 s Ru-komplexem
Fosfátový pufr (0,1 mol/l, pH 5,9 při 25°)
Použité pomůcky
Mistička s tloučkem
Ochranné brýle pro manipulaci s UV zářením
3 podložní sklíčka
Pinzeta
2 Eppendorfovy zkumavky
2 optické čočky – d 7,00 mm, th. 2,2mm, f´ 12,75mm
Kovová špachtlička
Použité přístroje
UV lampa
Analytické váhy
Lednice
Předvážky
Příprava citlivé vrstvy čočky
Čočka je připravena z citlivé vrstvy, která se skládá ze složek:
1) ORMOCER® KSK1238 – organicko anorganický kopolymer se siloxanovou
strukturou s Rutheinovým komplexem
2) Enzym – diaminoxidasa (DAOX) imobilizovaná na sepabeads
3) Sacharosa – pro lepší přístup monitorované látky k enzymu
Obr. 6: Čočka bez citlivé vrstvy
Obr. 7: Čočka s citlivou vrstvou
Příprava citlivé vrstvy
K přípravě citlivé vrstvy je potřeba odstředěné Sepabeads® s imobilizovanou DAOX,
které je třeba rozetřít v mističce s tloučkem na jemnou kašičku. Jednotlivé složky citlivé
vrstvy se smíchají na předem očištěném podložním sklíčku.
Podložní skla se očistí vatou, postupně namočenou v benzenu, acetonu a etanolu, aby se
odstranila mastnota a drobné nečistoty.
Na jednom podložním sklíčku se naváží 0,01g třené sacharosy a 0,04g třených
Sepabeads® s navázanou DAOX, které se následně smíchají. Sacharosa zde chrání enzym a
slouží jako porogen. Uložením čočky do pufru se z pórů sacharosa vyplavuje. Ke směsi se
naváží 0,04g ORMOCER ® KSK1238 s Ru-komplexem. Všechny složky se dohromady
smíchají v mističce s tloučkem, dokud se nevytvoří hladká kašička. Pomocí pinzety se na
zbylá podložní sklíčka připraví čočky. Kovovou špachtličkou se na ně rovnoměrně nanese
tenká vrstvička směsi. Směs se musí nanášet rychle, neboť rychle vysychá a poté se špatně
roztírá, čímž dochází k nerovnoměrnému rozvrstvení citlivé vrstvy.
Obr. 8:Struktura citlivé vrstvy senzoru
Nyní se čočky vloží pod zdroj UV a po dobu 20min se nechají vytvrzovat. Je nutné
zapnout UV lampu 30min před vytvrzováním, aby se záření stabilizovalo. Intenzita se nastaví
na maximální intenzitu do výšky 10cm. Po vytvrzení se čočky uchovávají v Eppendorfových
zkumavkách s fosfátovým pufrem (0,1mol/l, pH 5,9 při 25°) aby se uchovala aktivita enzymu.
Na noc se zkumavky uloží do lednice. V ní je třeba je ponechat po dobu 16 hodin.
Obr. 9:UV lampa pro vytvrzování
Závěr
Cílem projektu bylo zvládnutí stanovení biogenních aminů s jejich využitím pro
fluorescenční senzory, zjištěním vlastností měřeného enzymu a seznámením se s přístroji, se
kterýmy jsme pracovaly.
Ve své dílčí části jsem vytvořila citlivou vrstvu čočky s rutheniovým komplexem a
enzymem, která určuje selektivitu a citlivost biosenzoru. Během nanášení citlivé vrsvy na
čočku se musí postupovat opatrně, něboť směs rychle vysychá a následně se loupe.
Při měření jsme naměřily lineární odezvu na dávky putrescinu, což slibuje do
budoucna perspektivu při dalších měření.
Seznam použité literatury
[1] Y. Ramot, M. Pietila, G. Giuliani, F. Rinaldi, L. Alhonen, R. Paus,: „Polyamines and hair:
a couple in search of perfection“, Experimental Dermatology 2010; 19: 784–790
[2] Biogenic Amines, TECHNICAL BULLETIN, 20 January 2011
[3] J. Lakowitz.: Fundamental of fluorescence Spectroscopy, ed.3, Springer, 2006, Vybrané
kapitoly, ISBN 978-0306460937
[4] E. Václavíková.: Enzymové biosensory pro fermentační procesy, Diplomová práce,
VSCHT Praha, (2008).
[5] S. Kurihara, H. Suzuki, M. Oshida, Y Benno.: A novel Putrescine importer required for
type 1 pili-driven surface motility induced by extracellular Putrescine in Escherichia coli,
JBC, 25 January 2011
[6] http://www.safibra.cz/matinoes, on-line
[7] http://cs.wikipedia.org/wiki/Histamin, on-line
[8] http://www.agronavigator.cz/az/vis.aspx?id=76472,
[9] http://cs.wikipedia.org/wiki/Kadaverin, on-line
[10] http://en.wikipedia.org/wiki/Tyramine, on-line
[11] http://zdrava-vyziva.doktorka.cz/reakce-histamin-potravinach, on-line
[12] http://www.bezpecnostpotravin.cz/biogenni-aminy-a-polyaminy-v-potravinach.aspx,
on-line
[13] M. Pospíšilová, I. Kašík.: Vláknová optika pro biologii a medicínu, ČVUT 2011
[14] M. Šebela, Z. Lamplot, M. Petřivalský, D. Kopečný, K. Lemr, I. Frébort, P.Peč: Recent
news related to substrates and inhibitors of plant amine oxidases, BBA, January 2003
[15] http://www.peta.unas.cz/biosenzory/Biosenzory_soubory/definice.htm, on-line