Srdeční troponiny při hodnocení kardiotoxicity v experimentu

Srdeční troponiny při hodnocení kardiotoxicity v experimentu

Srdeční troponiny při hodnocení
kardiotoxicity v experimentu
Michaela Adamcová
Ústav fyziologie
Lékařská fakulta v Hradci Králové
Karlova Univerzita v Praze
Hodnocení myokardiálního
poškození v experimentálních
studií dříve….
• CK-MB je druhově specifická
• CK-MB není kardiospecifická a poškození
kosterního svalu často doprovází manipulaci se
zvířaty (např. i.m. aplikace léčiv, anestezie)
• Detekce myokardiálního poškození založena na
hodnocení histopatologických změn postmortem
1999
Adamcová et al. J.Cancer Res. Clin. Oncol. 125:268-274, 1999
2009
Berridge et al. Am Heart J. 158(1):21-9, 2009
Hlavní výhody srdečních troponinů
● vysoká specifita - struktura
troponin T a I se liší u srdeční
a kosterní svaloviny
● vysoká senzitivita – detekce
tzv. „minor“ lézí myokardu
● široké diagnostické okno 14 – 21 dní
● robustnost metody – rychlá,
jednoduchá, robustní
● mezidruhová homologie
struktura troponinů je
fylogeneticky konzervována
Nové poznatky - revize???
Intracelulární kompartmentalizace cTn:
• pool cytosolový a pool vázaný na myofibrily (Katus et al. 1991)
• cytosolový → „early appearing pool“ (Thygesen et al. 2010)
• cTnT je špatně rozpustný, zvýší-li se iontová síla pufru, extrakce může
dosáhnout až 80 % (Starnberg et al. 2014)
Mechanismy uvolnění troponinů (White 2011):
- nekróza
- apoptóza
- fyziologický turnover
- uvolnění fragmentů troponinu, které vznikly proteolytickou degradací
- zvýšení permeability buněčné membrány nadměrným napětím
- bleby
Srdeční troponin T
Roche (C: 125-131; D: 136-147)
130
140
Human
ENRKKEEEEL VSLKDRIERR
Mouse
ENRKKEEEEL ISLKDRIEKR
Rat
ENRKKEEEEL ISLKDRIEKR
Rabbit ENRKKEEEEL VSLKDRIEKR
Cat
ENRKKEEEEL ISLKDRIEKR
Dog
ENRKKEEEEL ISLKDRIEKR
Porcine ENRKKEEEEL VSLKDRIEKR
Bovine ENRKKEEEEL VSLKDRIEKR
Goat
TKNITEIADL NQKVFDLRGK
Sheep
uncharacterized
150
RAERAEQQRI
RAERAEQQRI
RAERAEQQRI
RAD*AEQLRI
RAERAEQQRI
RAERAEQQRI
RAERAEQQRI
RAERAEQQRI
FKRPALRRVR
160
RNEREKERQN
RNEREKERQN
RNEREKERQN
RAEREKERQN
RNEREKERQT
RNEREKERQT
RTEREKERQT
RAEREKERQT
ISADAMMQAL
170
RLAEERARRE
RLAEERARRE
RLAEERARRE
RLAEERARRE
RLAEERARRE
RLAEERARRE
RLAEERARRE
RLAEERARRE
LGARAKETLD
180
EEENRRKAED
EEENRRKAED
EEENRRKAED
EEESRRKAED
EEENRRKAED
EEENRRKAED
EEENRRKAED
EEESRRKAED
LRAHLKQVKK
http://www.uniprot.org
Srdeční troponin I
Abbott ARCHITECT (C: 24–40; D: 41–49)
10
20
Human
MADGSSDAAR EPRPAPAPIR
Mouse
MADESSDAAG EPQPAPAPVR
Rat
MADESSDAAG EPQPAPAPVR
Rabbit
ADESRDAAG EARPAPAPVR
Cat
MADNDDAAG CPPPAPAPVR
Dog
MADESGDAAG CPPPAPAPIR
Porcine MADRSGDAAG DSRPAPAPVR
Bovine MADRSGGSTA GDTVPAPPPV
Goat
MADRSGSSTA GDTVPAPPPV
Sheep
uncharacterised
30
RR*SS*NYRAYA
RR*SSANYRAYA
RR*SSANYRAYA
RR*SSANYRAYA
RR*SSANYRAYA
RQ*SSANYRAYA
RR*SSANYRAYA
RRRSSANYRAYA
RRRSSANYRAYA
40
TEPHAKKKSK
TEPHAKKKSK
TEPHAKKKSK
TEPHAKSKKK
TEPHAKKKSK
TEPHAKKKSK
TEPHAKKKSK
TEPHAKKKSK
TEPHAKKKSK
50
ISASRKLQLK
ISASRKLQLK
ISASRKLQLK
ISASRKLQLK
ISASRKLQLK
ISASRKLQLK
IPASRKLQLK
ISASRKLQLK
ISASRKLQLK
60
TLLLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
TLMLQIAKQE
http://www.uniprot.org
Antracyklinová kardiomyopatie a troponiny
• 30 % pacientů léčených antracykliny má vyšší hladiny cTn
• Troponiny pravděpodobně detekují přítomnost antracyklinové
kardiotoxicity velmi časně v době, kdy poškození funkce
srdce nemůže být odhaleno některými z dalších metodických
přístupů využívaných v současné době v klinické praxi
(review Dolci et al 2008).
• Navíc se zdá, že by bylo možné na základě měření troponinů
vytypovat pacienty s vysokým rizikem kardiotoxicity, kteří
vyžadují důslednější monitorování srdeční funkce.
??? klinické praxe
•
•
•
•
Diagnostické okno troponinů
Časový profil koncentrací cTn v různých cyklech terapie
Prediktivní hodnota troponinů
Možnost využití hs setů cTn
versus
• Heterogenita pacientů
• Heterogenita chemoterapeutických protokolů
Cíle experimentální studie
• určit „diagnostické okno“ srdečních troponinů na
validovaném modelu chronické daunorubicinové
kardiomyopatie
• přispět k optimálnímu časování odběrů pro stanovení
troponinů za účelem získání maximální prediktivní
hodnoty v klinické praxi
Model chronické antracyklinové
kardiomyopatie u králíka
• králíci New Zealand
• opakované i.v. podání (1x týdně, 8 aplikací)
• kontrolní skupina, n = 6, (fyziologický roztok 1 ml/kg i.v.)
• daunorubicin, n = 9, (Daunoblastina Phizer,3 mg/kg i.v.)
Metodika I
Plazmatická koncentrace srdečních troponinů
• odběry krve byly provedeny před zahájením
experimentu, v 1., 2., 5., 6., 8., 9. a 10. týdnu
• po 1., 5. a 8. podání daunorubicinu v čase 0, 2, 4, 16,
12, 24, 48 a 72 hod.
• Plazmatické koncentrace srdečních troponinů byly
měřeny pomocí vysoce sensitivních setů hs cTnT
(Roche) s detekčním limitem 0,003µg/l a hs cTnI
(Abbott) s detekčním limitem 0,0007 µg/l.
Metodika II
Měření systolické funkce LK
• Echokardiografické hodnocení LVFS (Vivid 4 - sonda10 MHz
(GE Healthcare, UK)
• Invazivní vyšetření dP/dtmax a dP/dtmin (ADI PowerLab/8SP
(Adinstruments, Australia)
Histologické a imunohistochemické vyšetření myokardu
• H&E a Masson's blue trichrome
• primární MAb anti-human cTnI (HyTest, 1:5000) a anti-mouse
TnT (Sigma, 1:100) and sekundární donkey-anti-mouse IgG
antibody (Jackson ImmunoResearch Lab., USA; 1:500)
Metodika III
Stanovení troponinů v LK - Western blot
• Izolace v RIPA
• Separace na TGX AnykD Precast Gels (BioRad, CA,
USA)
• Primární MAb anti - mouse cTnI (Chemicon; 1:10 000)
a anti-mouse TnT (Sigma, 1:5 000)
• Sekundární Ab - horseradish peroxidase-conjugated goat
anti-mouse IgG (DakoCytomation, Denmark, 1:10 000)
Výsledky
Frakční zkrácení LK
50
45
40
***
LV FS (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
control
dauno
Invazivní vyšetření LK
Plazmatické koncentrace cTnT
Plazmatické koncentrace cTnI
Korelace cTnT a cTnI v plazmě
Srdeční troponiny (AUC)
*
8
6
*
4
2
0
1
5
week
control
8
dauno
30
cTnI (AUC)
cTnT (AUC)
10
*
20
*
10
0
1
5
week
control
dauno
8
Analýza prediktivního významu srdečních
troponinů pro vývoj dysfunkce LK
*
cTnT vs
dP/dtmax
8
6
r
P
*
4
2
cTnT vs
LVFS
r
P
0
1
5
week
control
8
dauno
AUC 1 AUC 5
AUC 8
0.47
-0.84
-0.86
0.244
0.009
0.006
AUC 1
AUC 5
AUC 8
0.0476
0.885
-0.738
0.029
-0.786
0.015
30
cTnI vs
dP/dtmax
AUC 1
AUC 5
AUC 8
r
P
0.57
0.123
-0.74
0.029
-0.86
0.02
cTnI (AUC)
cTnT (AUC)
10
*
20
*
10
0
cTnI vs LVFS
r
P
AUC 1
0.26
0.498
AUC 5
-0.69
0.047
AUC 8
-0.69
0.047
1
5
week
control
dauno
8
Korelace srdečních troponinů
s dP/dtmax
s LVFS
cTnT
R
p
cTnI
R
p
cTnT
R
p
0.931
1 - 0h
-0.316
0.423
1 - 0h
0.31
0.423
1 - 0h
-0.302
0.423
0.81
0.0096
1 - 2h
0.904
0
1 - 2h
0.357
0.353
1 - 2h
0.566
0.12
1 - 4h
0.786
0.0149
1 - 4h
0.786
0.0149
1 - 4h
0.524
0.16
1 - 4h
0.524
0.16
1 - 6h
0.857
0.00178
1 - 6h
0.714
0.0374
1 - 6h
0.548
0.139
1 - 6h
0.5
0.182
1 - 12h
0.548
0.139
1 - 12h
0.476
0.207
1 - 12h
0.429
0.26
1 - 12h
0.19
0.619
1 - 24h
0.714
0.0374
1 - 24h
0.5
0.182
1 - 24h
0.405
0.29
1 - 24h
0.143
0.705
1 - 48h
0.5
0.182
1 - 48h
0.479
0.207
1 - 48h
0.214
0.578
1 - 48h
0.168
0.662
1 - 72h
0.548
0.139
1 - 72h
0.193
0.619
1 - 72h
0.19
0.619
1 - 72h
-0.157
0.662
2
0
0.977
2
-0.874
0
***
2
-0.407
0.29
2
-0.886
0
***
5 - 0h
-0.857
0.00178
5 - 0h
-0.85
0.00178
**
5 - 0h
-0.81
0.0096
**
5 - 0h
-0.778
0.0149
**
5 - 2h
-0.619
0.086
5 - 2h
-0.738
0.0287
*
5 - 2h
-0.81
0.0096
**
5 - 2h
-0.714
0.0374
*
5 - 4h
-0.786
0.0149
5 - 4h
-0.81
0.0096
**
5 - 4h
-0.524
0.16
5 - 4h
-0.595
0.102
5 - 6h
-0.238
0.537
5 - 6h
-0.643
0.0716
5 - 6h
0
0.977
5 - 6h
-0.571
0.12
5 - 12h
-0.643
0.0716
5 - 12h
-0.69
0.0474
*
5 - 12h
-0.571
0.12
5 - 12h
-0.405
0.29
5 - 24h
-0.548
0.139
5 - 24h
-0.81
0.0096
**
5 - 24h
-0.524
0.16
5 - 24h
-0.548
0.139
5 - 48h
-0.643
0.0716
5 - 48h
-0.805
0.0096
**
5 - 48h
-0.286
0.46
5 - 48h
-0.952
0
***
5 - 72h
-0.571
0.12
5 - 72h
-0.964
0
***
5 - 72h
-0.548
0.139
5 - 72h
-0.819
0.0096
**
6
-0.643
0.0716
6
-0.833
0.00526
**
6
-0.643
0.0716
6
-0.714
0.0374
*
8 - 0h
-0.762
0.0212
*
8 - 0h
-0.833
0.00526
**
8 - 0h
-0.69
0.0474
8 - 0h
-0.833
0.00526
**
8 - 2h
-0.69
0.0474
*
8 - 2h
-0.69
0.0474
*
8 - 2h
-0.667
0.0588
8 - 2h
-0.667
0.0588
8 - 4h
-0.738
0.0287
*
8 - 4h
-0.69
0.0474
*
8 - 4h
-0.595
0.102
8 - 4h
-0.667
0.0588
8 - 6h
-0.833
0.00526
**
8 - 6h
-0.738
0.0287
*
8 - 6h
-0.595
0.102
8 - 6h
-0.619
0.086
8 - 12h
-0.762
0.0212
*
8 - 12h
-0.786
0.0149
*
8 - 12h
-0.667
0.0588
8 - 12h
-0.81
0.0096
**
8 - 24h
-0.595
0.102
8 - 24h
-0.929
0
***
8 - 24h
-0.619
0.086
8 - 24h
-0.69
0.0474
*
8 - 48h
0.857
0.00178
**
8 - 48h
-0.619
0.086
8 - 48h
-0.81
0.0096
**
8 - 48h
-0.476
0.207
8-72h
-0.857
0.00178
**
8-72h
-0.69
0.0474
*
8-72h
-0.69
0.0474
*
8-72h
-0.619
0.086
9
-0.905
0
***
9
-0.886
0
***
9
-0.738
0.0287
*
9
-0.755
0.0212
*
PZH
-0.262
0.498
PZH
-0.922
0
***
PZH
-0.119
0.749
PZH
-0.707
0.0374
*
cTnI
R
p
1 - 0h
-0.0238
1 - 2h
**
*
*
Histologické vyšetření myokardu
control
dauno
Imunohistochemické vyšetření myokardu
kontrola
daunorubicin
a
cTnI
c
cTnT
Srdeční troponiny v myokardu - WB
Fragment Mw 23 kDa
Závěr
• Antracykliny indukovaná kardiotoxicita je spojena s dlouhodobým a
kontinuálním uvolňováním troponinů, které závisí na kumulativní
dávce antracyklinů a přetrvává ještě po vysazení chemoterapie.
• Po 5. a 8. aplikaci DAU bylo maximálních hodnot troponinů
dosaženo mezi 4. až 6. hod a v dalších sledovaných časových
intervalech byl zaznamenán již zřetelný pokles
• Odlišné „diagnostické okno“ (ve srovnání s AMI) může být
vysvětleno rozdílným wash-outem troponinů, souvisejícím s intaktní
koronární cirkulací.
• Hladiny troponinů korelovaly se systolickou dysfunkcí LK
(dP/dtmax, resp. LVFS).
Poděkování
M. Štěrba1, O. Popelová-Lenčová1, E. Jirkovský1, V. Geršl1, Y.
Mazurová2, J. Vávrová3, J. Maláková3 , V. Palička3
1 Ústav farmakologie,
2 Ústav histologie
a embryologie,
Lékařská fakulta v Praze, Univerzita Karlova v Hradci Králové,
3Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice
v Hradci Králové
Tato práce byla podporována grantem PRVOUK P37/5 a IGA
NT13457-4-2012.