3 Proteosynteza

Základy molekulární biologie
KBC/MBIOZ 2006
Ivo Frébort
3. Translace a tvorba proteinů
Centrální dogma molekulární biologie
Rozluštění genetického kódu „in vitro“
• Marshall Nirenberg a Heinrich Matthaei zjistili, že poly-U
RNA produkuje polyfenylalanin v „cell-free“ roztoku z E. coli
• Studie s nukleotidovými kopolymery, objasnily některé
kodóny
• Poly-A dává polylysin, poly-C polyprolin, poly-G polyglycin
• V roce 1964 rozluštili Marshall Nirenberg a Philip Leder celý
kód
• Ukázali, že trinukleotidy navázané na ribosomy řídí vazbu
specifických aminoacyl-tRNA
• Pomocí 14C značených aminokyselin se všemi možnými
kombinacemi trinukleotidů přiřadili všech 64 kodónů
Technika
rozluštění
genetického
kódu
Univerzální genetický kód
Aktivace aminokyselin pro proteosyntézu
Aminoacyl-tRNA synthasa
• Kodóny jsou rozpoznávány aminoacyl-tRNA na základě
komplementarity bazí
• Párování bazí umožňuje tRNA vnést určitou aminokyselinu
do ribosomu
• Aminoacyl-tRNA také aktivují aminokyselinu pro tvrobu
peptidové vazby
• Enzym aminoacyl-tRNA synthasy zajišťují správné
přiřazení aminokyseliny k odpovídající tRNA
• U E. coli 21 aminoacyl-tRNA synthas
Rozpoznávání tRNA specifickou aminoacyl-tRNA synthasou
Komplex tRNA a aminoacyl-tRNA synthasy
The Wobble Hypothesis
(Francis Crick, 1966)
• První dvě báze kodónu tvoří normální „kanonické“ párování
(vodíkové vazby A=U, G≡C) s 2 a 3 bazí antikodónu
• Poslední pozice je méně striktně kontrolována a může se
objevit i „nekanonické párování“
• Pravidla pro třetí bázi antikodónu: A=U, C≡G, ale navíc
U – A/G, G – U/C, I (vzniklý deaminací A) – U/C/A
• Výhody: disociace tRNA z mRNA templátu je rychlejší a tím
je rychlejší i proteosyntéza
• Pravidla jsou v souladu s genetickým kódem a nezpůsobují
nesprávné přiřazení aminokyseliny !!!
Struktura ribosomů
E. coli ribosom
• průměr 25 nm, 2520 kDa, 2 disociabilní podjednotky
• Malá podjednotka 30S - 930 kDa, 21 proteinů a 16S rRNA
• Velká podjednotka 50S - 1590 kDa, 34 proteinů, dvě rRNA
- 23S a 5S
• Ribosomy tvoří zhruba 2/3 RNA
• 20,000 ribosomů na buňku, 20% buněčné hmoty
Eukaryotní ribosomy
• Mitochondriální a chloroplastové ribosomy podobné
prokaryotním – předpokládaný prokaryotní původ
• Cytoplasmatické ribosomy jsou větší a komplexnější, ale
mají shodnou většinu strukturních a funkční vlastností
Prokaryotní a eukaryotní ribosomy
Proteosyntéza a její fáze
• Proteosyntéza má vždy tři fáze: iniciaci, elongaci a
terminaci
• Iniciace spočívá ve vazbě mRNA a iniciační
aminoacyl-tRNA na malou podjednotku ribosomu a
následnou vazbu velké podjednotky
• Elongace: probíhá syntéza peptidových vazeb mezi
tRNA navázanými v akceptorovém místě (A)
peptidylovém místě (P) ribosomu
• Terminace nastává při dosažení "stop" kodónu –
dochází k uvolnění peptidového řetězce a rozpadu
translačního komplexu
Vazba tRNA na ribosom
Iniciace proteosyntézy u prokaryot
• Iniciační tRNA přenáší N-formylovaný Met: f-Met-tRNAfMet
• Je použita pouze pro iniciaci, při elongaci působí
Met-tRNAmMet (neformylovaný Met)
• N-formyl Met je první aminokyselina u všech E. coli
proteinů, ale zhruba u poloviny je posttranslačně odštěpen
• N-formyl je přidán enzymem formyltransferasa
• Vazba mRNA na ribosom vyžaduje interakci pyrimidinové
sekvence na 3'-konci 16S RNA s purinovou sekvencí na
5'-konci mRNA
• Vazebné místo ribosomu na 5'-konci mRNA –
Shine-Delgarno sekvence
• Poté je vytvořen iniciační komplex za účasti proteinových
iniciačních faktorů, GTP, f-Met-tRNAfMet, mRNA and 30S
podjednotky ribosomu
Iniciace proteosyntézy u prokaryot
Shine-Delgarno sequence
Iniciace u eukaryot
• Zásadním iniciačním signálem je struktura mRNA s 5'methyl-GTP a poly A koncem
• Komplexní interakce iniciačních faktorů (nejméně 11)
• Iniciační tRNA je specifická – přenáší Met a působí pouze
při iniciaci - tRNAiMet , není formylována
• Met nacházející se uvnitř peptidového řetězce je přenášen
jinou tRNA
Iniciace proteosyntézy u eukaryot
Elongační cyklus
• Elongační faktory jsou nezbytné pro funkci buňky, vysoký
obsah (EF-Tu tvoří 5% celkových proteinů E. coli)
• EF-Tu váže aminoacyl-tRNA a GTP
• Aminoacyl-tRNA se váže do A místa ribosomu jako komplex
s 2EF-Tu a 2GTP
• GTP je pak hydrolyzováno a EF-Tu:GDP disociuje
• EF-T recykluje EF-Tu výměnou GTP za GDP
• Nezbytné konformační změny jsou řízeny energií získanou
hydrolýzou GTP
• Celkem pět GTP je nutných pro přidání jedné aminokyseliny,
tři při elongaci a dvě při aktivaci - tvorbě aminoacyl-tRNA
Elongace
Terminace proteosyntézy
• Proteiny nazývané terminační faktory rozpoznávají
stop kodón v A místě ribosomu
• Vazba terminačního faktoru transformuje
peptidyltransferasu na hydrolasu, která odštěpí
peptidový řetězec z tRNA
• Terminační faktor způsobuje rozpad elongačního
komplexu
Terminace
Recyklace
ribosomů v buňce
„Polyribosom“
Shrnutí
Produkce proteinů
eukaryotní buňkou
Skládání proteinů „Protein Folding“
• Proteiny jsou skládány do aktivní formy molekulárními
chaperony a chaperoniny
• Chaperony E. coli Hsp70, rozpoznává nesložené
hydrofobní části peptidového řetězce
• Váže se na tyto části a ochraňuje je dokud nedojde ke
správnému složení
• GroES-GroEL komplex – hlavní chaperonin u E. coli
• GroEL 2 kruhy, každý 7 x 60 kDa podjednotek (Hsp60)
• Nesložený protein se váže dovnitř komplexu a jeho
skládání je řízeno energií získanou hydrolýzou ATP
(stovky ATP/ molekulu)
Chaperony a
chaperoniny
Struktura komplexu GroES-GroEL u E. coli
Degradace proteinů
• Některé proteinové degradace jsou nespecifické,
náhodně rozštěpené nebo poškozené proteiny jsou
rychle degradovány
• Existuje ovšem také selektivní degradační dráha
využívající energie ATP a hydrolýzy v proteasomu –
ubichitinová degradační dráha
• Ubichitin je malý protein s vysoce konzervovanou
sekvencí v eukaryotech, 76 aminokyselin (8.5 kDa)
• Proteiny určené k degradaci jsou označeny
ubichitinovým řetězcem
• Aaron Ciechanover, Avram Hershko, Irwin Rose –
Nobelova cena za chemii 2004
Značení proteinů ubichitinem a
jejich degradace v proteasomu
76 aa
Příklad chyby při skládání proteinů – PrP a PrP* priony
Translokace proteinů
Nutný proces pro membránové a sekreční proteiny
• Tyto proteiny jsou syntetizovány se "signální sekvencí"
cca 16-26 aminokyselin na N-konci
• Signální sekvence má bazický N-konec, centrální doménu
7-13 hydrofobních residuí a nehelikální C-konec
• Signální sekvence směruje nově syntetizovaný protein do
jeho správné destinace
Všechny proteiny mimo cytoplasmu musí být translokovány
• Signální sekvence zabraňuje samovolnému skládání
proteinu, takže molekulární chaperony s ním mohou
interagovat
• Signální peptid slouží také pro rozpoznání translokačním
aparátem buňky
• Signální peptidasa odštěpí signální peptid poté co je
zajištěno správné složení a cílení proteinu
Třídění proteinů v eukaryotní buňce
Eukaryotní buňka obsahuje řadu kompartmentů oddělených
membránami
• Většina (ale ne všechny) signálních sekvencí je tvořena
odštěpitelným signálním peptidem na N-konci proteinu
• Některé sekvence jsou u C-konce nebo uvnitř proteinové
sekvence (signální kotvy)
• Rozpoznání signální sekvence je založeno na rozložení
náboje, polaritě a sekundární struktuře, ne na specifické
sekvenci aminokyselin
• Syntéza sekrečních a membránových proteinů je spojena
s translokací přes membránu endoplasmatického retikula
Translokace proteinů do endoplasmatického retikula