Modelové systémy pro studium toxického poškození hepatocytů in

PŘEHLEDNÉ ČLÁNKY
Modelové systémy pro studium
toxického poškození hepatocytů
in vitro
MUDr. Otto Kučera, Ph.D., MUDr. Halka Lotková, Ph.D., Mgr. Pavla Křiváková,
Mgr. Tomáš Roušar, doc. MUDr. Zuzana Červinková, CSc.
Ústav fyziologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové
SÚHRN
Játra jsou častým cílem toxického účinku řady xenobiotik, což je především důsledek jejich ústřední úlohy v intermediálním a energetickém metabolizmu a biotransformačních procesech. Etické, ekonomické, legislativní, výzkumné
a další důvody neumožňují testovat všechny nově syntetizované látky v podmínkách in vivo. Proto byly vyvinuty
a dále se vyvíjejí nové metodiky a přístupy k testování hepatotoxicity in vitro. Nejdůležitějšími systémy pro testování toxicity a metabolických aktivit in vitro jsou izolovaná perfundovaná játra, jaterní řezy, izolované jaterní buňky
v suspenzi nebo v primárních kulturách, včetně kokultivací a speciálních 3D technik, dále různé subcelulární frakce
a stabilizované buněčné linie. Tyto modely lze využít pro screening cytotoxických a genotoxických sloučenin, stanovení hepatoprotektivní kapacity látek, charakterizování toxických poškozeních a mechanizmů jejich vzniku. V současné době neexistuje ideální model pro testování hepatotoxických látek in vitro, nicméně tyto modelové systémy
významně redukují ekonomické náklady a etické a legislativní problémy. Umožňují detailněji studovat mechanizmy
hepatotoxicity než na úrovni celého organizmu. Znalost jejich výhod i limitací pak umožňuje vhodně zvolit modelový
systém pro konkrétní záměr. Současný výzkum si již bez jejich využití nelze představit.
Klíčová slova: in vitro modelové systémy jater, hepatotoxicita, toxikologie in vitro, primární kultury hepatocytů,
hepatocyty in vitro
SUMMARY
The liver is a common target of toxic effect of a number of xenobiotics, which is in particular a result of its central
role in intermediary and energetic metabolism and in biotransformation processes. Ethical, economic, legislative,
research and other reasons do not allow testing all of newly-synthesized compounds in in vivo conditions. Hence
new methods and approaches for hepatotoxicity testing in vitro have been developing. The most important systems
for study of toxicity and metabolic activity in vitro are isolated perfused liver, liver slices, isolated liver cells in suspensions or in primary cultures including co-culture methods and special 3D techniques, various subcellular fractions
and stabilised cell lines. These models can be used for cytotoxicity and genotoxicity screening, evaluation of potential hepatoprotective capacity of different compounds, study of toxic injury and characterization of hepatotoxicity
mechanisms. Currently there is no an ideal in vitro liver model system for testing of hepatotoxic substances in vitro,
nevertheless use of these model systems reduces economic costs and ethic and legislative problems. Model systems in vitro afford opportunity to study in detail mechanisms of hepatotoxicity in comparison with in vivo conditions.
Definition of their actual advantages and disadvantages allows choosing a suitable model system for study of particular problem. We cannot imagine current research of liver toxicity without using these model sytems.
Key words: in vitro liver models, hepatotoxicity, in vitro toxicology, primary cultures of hepatocytes, hepatocytes in vitro
52
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
1. ÚVOD
2. MODEL PERFUNDOVANÝCH JATER
Játra jsou hlavním biotransformačním orgánem těla.
Podílejí se významnou měrou na metabolizmu většiny
endogenních i exogenních látek včetně léků, což je jednou
z hlavních příčin jejich častého toxického poškození. Játra
jsou pro život nepostradatelným orgánem. Mezi jejich hlavní
funkce patří udržení stálého vnitřního prostředí (Červinková,
2005). Mají nezastupitelnou úlohu v metabolizmu sacharidů,
lipidů a bílkovin resp. aminokyselin. Udržují stálou hladinu
glukózy v krvi. Jako jediný orgán jsou schopná tvorby urey
z amoniaku v Krebs-Henseleitově cyklu; tvoří se v nich
většina plazmatických bílkovin včetně koagulačních faktorů
a některých složek komplementového systému. Podílejí se
na tvorbě a biologických přeměnách cholesterolu, fosfolipidů i triacylglycerolů. Játra jsou jediným orgánem schopným
tvorby ketolátek. Tvoří se v nich žluč, která je nezbytná
pro trávení a vstřebávání lipidů a do které jsou vylučovány
degradační produkty některých endogenních a exogenních
látek. Z výše uvedeného je zřejmé, že závažné poškození
funkcí jater vede velmi rychle k rozvratu vnitřního prostředí
s ohrožením života jedince.
Neustále se zvyšující počet nově syntetizovaných látek
klade velké nároky na testování jejich toxicity. V minulosti byly k hodnocení škodlivých účinků látek používány
výhradně experimenty in vivo. Hlavní výhodou in vivo
metod je možnost studovat celou patofyziologii toxického
poškození jater včetně vztahů postižených jater s okolními
i vzdálenými orgánovými systémy a se všemi důsledky na
organizmus. To je zároveň i velká nevýhoda tohoto systému, neboť nelze dost dobře postihnout jednotlivé kroky
v mechanizmech poškození. Ekonomické, etické (zásady
3R – Reduction, Refinement and Replacement (Russell
a Burch, 1959)) a v neposlední řadě i legislativní důvody
vedly a vedou k hledání, rozvoji a využívání alternativních
postupů in vitro. K používání in vitro modelů významně
přispívají i výzkumné důvody, neboť tyto metody jsou méně
komplexní, což umožňuje detailnější studium patofyziologie
mechanizmů hepatotoxicity.
Z in vitro modelů se nejčastěji používají izolovaná
perfundovaná játra, jaterní řezy, izolované jaterní buňky
v suspenzi nebo v primárních kulturách, včetně kokultivací
a speciálních 3D modelů, dále různé subcelulární frakce
a stabilizované buněčné linie. Obvykle se využívají pro
screening cytotoxických a genotoxických sloučenin, stanovení hepatoprotektivní kapacity látek, charakterizování
toxických poškozeních a mechanizmů jejich vzniku (Guillouzo et al., 1998). Řada xenobiotik vykazuje toxický účinek
až po metabolické aktivaci pomocí některého z enzymových
systému hepatocytů. Existence významných mezidruhových
rozdílů ve vstřebávání, distribuci, místě účinku, eliminaci
a zejména biotransformaci xenobiotika díky odlišné enzymové výbavě je příčinou rozdílné toxicity látek u jednotlivých biologických druhů. Používání některého z in vitro
postupů umožňuje i využití lidského materiálu v pokusech.
Tím se redukují problémy s extrapolací výsledků z pokusů
na zvířatech na lidi (Kosina et al., 1999).
Nejblíže podmínkám in vivo má model perfundovaných
jater (Powell et al., 1989), který zachovává trojrozměrnou
cytoarchitektoniku jater s mezibuněčnými kontakty a tvorbu
a vylučování žluče. Tu lze snadno sbírat a analyzovat. Jde
o jediný model in vitro, kde můžeme do jisté míry sledovat
hemodynamické parametry jaterní cirkulace. Patogenezi
poškození studuje na úrovni jater bez ovlivnění jinými systémy. Je s úspěchem využíván pro studie lékových a toxických
poškozeních a pro toxokinetické modelování. Jeho hlavními
nevýhodami jsou obtížná manipulace, časová a prostorová
náročnost, rychlý pokles funkčních aktivit (lze využít pouze
několik hodin), nemožnost testovat více koncentrací či toxinů zároveň. Navíc při použití perfundovaných izolovaných
jater neredukuje počet pokusných zvířat a nejsou dostupné
lidské vzorky.
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
3. JATERNÍ ŘEZY
Druhým nejkomplexnějším modelem in vitro, který se
hojně v současnosti využívá, jsou jaterní řezy (Lerche-Langrand a Toutain, 2000). Doporučovaná standardizovaná šířka
řezů je 200 až 250 mm (Bach et al., 1996). Tato vzdálenost
je dostatečně malá pro difúzi kyslíku a živin k jaterním buňkám a metabolitů do kultivačního média a zároveň i velká
pro zachování lobulární struktury. Výhodou řezů jsou díky
zachovalé cytoarchitektonice neporušené mezibuněčné
interakce při stejném zastoupení různých typů jaterních
buněk jako v situaci in vivo (Červenková et al., 2001).
Dalšími výhodami je poměrně snadná a rychlá příprava
vzorků, jednoduchá manipulace a relativně malé nároky na
technické vybavení (Krumdieckův mikrotom). Podobně jako
u jiných in vitro modelů dochází i u jaterních řezů k poklesu
obsahu cytochromu P-450 v průběhu kultivace (Renwick
et al., 2003). Z jaterních řezů lze připravit histologické
preparáty. Použitím tohoto modelu se významně redukuje
počet pokusných zvířat. Bohužel nelze sbírat a analyzovat
žluč přímo ze žlučového vývodu. U tohoto modelu přichází
v úvahu využití i lidských vzorků (např. z jaterní biopsie či
operačně odstraněných laloků). Nepoužitý materiál či již
připravené řezy lze skladovat kryoprezervací pro pozdější
využití. Jejich dostatečná metabolická aktivita je udržena po
dobu několika dní (Červenková et al., 2001).
4. ZÍSKÁVÁNÍ IZOLOVANÝCH JATERNÍCH
BUNĚK
Objev vysokovýtěžných izolací buněk jater potkana
(Berry a Friend, 1969; Seglen, 1976) byl prvním důležitým
krokem pro zavedení, rozvoj a rozšíření modelů buněčných
suspenzí a zejména primárních kultur hepatocytů do farmakologických, metabolických a toxikologických studií.
Z jater ryb, obojživelníků, ptáků i savců, včetně člověka
(Liddiard et al., 1980), lze dvoustupňovou kolagenázovou
53
perfuzí získat vysoký počet viabilních jaterních buněk
s relativně vysokým zastoupením hepatocytů (Berry et al.,
1991). Izolačním stresem dochází k proteolýze membránových bílkovin, k poškození struktury plazmatické membrány
a ke ztrátě diferenciace hepatocytů na krevní a žlučový pól.
Na izolačním stresu se zejména podílí použití proteolytickýc enzymů, narušení buněčného mikroprostředí a ztráta
intercelulárních kontaktů. Pro omezení izolačního stresu je
nutné dodržovat přesně protokol izolace (optimální aktivita
kolagenázy, dostatečné sycení izolačního roztoku kyslíkem,
pH a iontové složení izolačních roztoků, délka izolace, podmínky centrifugace atd.).
Zdrojem jaterních buněk obvykle bývají hlodavci, zejména pak potkani. Méně se využívají jiné biologické druhy
např. prasata, jejichž hepatocyty však vykazují metabolické
vlastnosti bližší buňkám lidským ve srovnání s hepatocyty
hlodavců. Navíc jich lze získat velká množství, takže mohou
být potencionálně využity i pro bioarteficiální jaterní systémy. V posledních letech se upřednostňuje používání lidských
hepatocytů (Kosina et al., 1999). Jejich širšímu využití brání
obtížná dostupnost materiálu, nižší viabilita izolovaných
buněk a rovněž riziko přenosu infekčních onemocnění na
manipulující personál (zejména HIV, HBV a HCV infekce).
Výhodou používání lidských hepatocytů je naopak snazší
extrapolace výsledků do in vivo podmínek, čehož se využívá
ke studiu specifických metabolických funkcí lidských jater
a ve výzkumu, vývoji a testování nových léčiv (Kosina et
al., 1999).
5. BUNĚČNÉ SUSPENZE
Buněčné suspenze jsou relativně méně nákladné a velice
snadno se s nimi manipuluje. Při jednom pokusu lze testovat
více koncentrací jednoho toxinu či více různých toxinů.
Současně s xenobiotiky lze podávat i hepatoprotektivní
substance či jiné látky a studovat jejich účinek na suspenzi.
Buněčné suspenze lze uchovat pro pozdější použití pomocí
metod kryoprezervace (Lloyd et al., 2003). Hepatocyty
v suspenzi nevytvářejí vzájemné mezibuněčné kontakty
a uchovávají si tak kulovitý tvar získaný při izolačním stresu
(obr. 1). Jejich využití je limitováno rychlým poklesem viability buněk v suspenzi, a proto jsou vhodné pouze pro studie
sledující vlastnosti těchto buněk po dobu kratší než 3–4
hodiny (Elaut et al., 2005). Hodí se zejména pro krátkodobé
toxikologické studie a mezidruhová porovnání a rovněž pro
studium regulací některých aktivit enzymů v hepatocytech,
včetně hodnocení energetického metabolizmu (Červinková
et al., 2002). Použití kultivačního média výrazně ovlivňuje
přežívání hepatocytů v suspenzi a rovněž jejich funkční stav,
pro určité typy pozorování jsou pak vhodná různá média
(Elaut et al., 2005).
6. PRIMÁRNÍ KULTURY HEPATOCYTŮ
Výhodnějším systémem v in vitro podmínkách jsou
primokultury hepatocytů. Vzhledem k špatné dostupnosti
54
lidských hepatocytů pro většinu laboratoří se převážně
využívají potkaní hepatocyty. Hlavním problémem primárních kultur hepatocytů je poměrně rychlá ztráta aktivit biotransformačních enzymů a jejich „dediferenciace“ směrem
k metabolizmu fetálních hepatocytů (Berry et al., 1991). To
se projevuje i snížením exprese morfologických a funkčních
charakteristik hepatocytů in vitro. Je patrný pokles funkční
kapacity jaterních buněk, např. hepatocyty potkana v primární kultuře sníží produkci albuminu resp. tvorby urey mezi 24.
a 48. hodinou o 25 % resp. 54 % oproti stavu za prvních 24
hodin (Kučera et al., 2006). Podobně klesá i obsah a aktivita
cytochrómu P450 a naopak se zvyšuje exprese P-glykoproteinu, který je zodpovědný za tzv. multidrug resistance
(Guillouzo, 1998).
Bylo zjištěno, že zachování mezibuněčných interakcí je
nezbytnou podmínkou pro udržení hepatocytů v diferencovaném stavu. Napodobení podmínek in vitro co nejblíže
stavu in vivo může oddálit a zpomalit proces dediferenciace.
Volba kultivačního média, vhodné suplementace, extracelulární matrix a případně kokultivace s jinými typy buněk, ať
už jaterních či mimojaterních, do značné míry ovlivňuje stav
primární kultury hepatocytů.
Řada studií popisuje výhodnost či nevýhodnost různých
firemně vyráběných médií. Pro studium toxicity na primokulturách hepatocytů bylo vyhodnoceno jako vhodné
Williamsovo E médium (Grant et al., 1985), pozdější práce
pak upřednostňují spíše Chee´s medium (Hamilton et al.,
2001). Přítomnost hormonů, zejména pak glukokortikoidů
(dexametazonu) a inzulinu, je rovněž nezbytná pro udržení
specifických funkcí hepatocytů (McMillan et al., 1991).
Dalším z hormonů, který se často přidává do média, je
glukagon, neboť se spolu s inzulinem podílí na regulaci
metabolizmu sacharidů (Kobayashi et al., 1988). Rovněž
byl prokázán jeho duální účinek na syntézu DNA (Thoresen
et al., 1990), kdy náhlé zvýšení glukagonem stimulovaného cAMP inhibuje přechod z G1 do S fáze buněčného
cyklu. Tato inhibice je následována za přítomnosti inzulinu dlouhodobou stimulací DNA syntézy (Vintermyr et
al., 1993). Pro přichycení buněk k podkladu je výhodné
obohatit kultivační médium o 5–10 % fetálního bovinního séra, po přichycení (cca 2–3 hodiny) někteří autoři již
sérum do kultivačního média nepřidávají. Fetální bovinní
sérum obsahuje bovinní pankreatický inhibitor trypsinu,
který může příznivě ovlivňovat izolačním stresem aktivované trypsinu podobné proteázy obsažené v membránách
hepatocytů, a tak zabránit autodegradaci buněk (Berry
a Edwards, 2000). Přítomnost určitých aminokyselin v kultivačním médiu podstatně mění některé funkce hepatocytů
(Hasegawa et al., 1994). Například Williamsovo E médium
je obohaceno o asparagin, cystein, prolin a kyselinu glutamovou. Vhodné je přidat i glutamin, který je znám svým
inhibičním účinkem na proteolýzu (vom Dahl et al., 1995).
Nověji se přechází k suplementaci různými typy růstových
faktorů, které vykazují dobrý účinek na udržení diferenciace hepatocytů in vitro (Hohne et al., 1990). Jejich širšímu
rozšíření brání zejména jejich cena. Standardem prevence
kontaminace kultur je obohacení médií antibiotiky (nejčastěji pak penicilinem a streptomycinem).
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
Mezibuněčné kontakty jsou nezbytným faktorem pro
udržení specifických funkcí hepatocytů. Nejde jen o interakci hepatocytů s jinými hepatocyty (gap junction) a okolními
buňkami, ale i o kontakt s vhodnou extracelulární matrix.
Jejími nejdůležitějšími komponentami v játrech in situ jsou
kolagen, laminin, fibronektin a heparan sulfát (Berry et al.,
1991). V in vitro podmínkách se hepatocyty daleko rychleji
a snadněji přichytávají k podkladu potaženému některou ze
složek matrix než bez ní. Navíc takto kultivované buňky
přežívají déle a udržují si pro játra specifické funkce po
delší dobu.
Nejčastějším způsobem kultivace hepatocytů in vitro je
konvenční forma monolayeru, kdy se hepatocyty přichytávají na plastové povrchy kultivačních nádob potažené složkou
extracelulární matrix, nejčastěji kolagenem typu I. Při tomto
způsobu kultivace se obnovuje polarita buňky a polygonální
tvar (obr. 2). Bohužel v těchto podmínkách dochází poměrně
rychle ke ztrátě fenotypové diferenciace buněk. Pro studium
toxického poškození je nejzávažnější pokles aktivity biotransformačních enzymů (Rogiers et al., 1990), zejména pak
cytochróm P450-dependentních monooxygenáz (Coecke
et al., 1992) i samotného cytochrómu P450 (Grant et al.,
1985). Důležitý je i pokles enzymů fáze II biotransformace (McMillan et al., 1991). Hlavním důvodem pro pokles
aktivity těchto enzymů se zdají být nedostatečné interakce
hepatocytů s jinými buňkami a extracelulární matrix. To lze
vyřešit použitím kokultivačních technik s neparenchymovými jaterními či mimojaterními buňkami či speciálními
3D modely. Poklesu aktivity biotransformačních enzymů
v hepatocytech lze rovněž předcházet přidáváním některých
substrátů do kultivačního média či enzymovou indukcí.
Obvykle se využívají dimethylsulfoxid (Su a Axman, 2004),
nikotinamid (Paine et al., 1979), glukokortikoidy (McMillan
et al., 1991), fenobarbarbital (Rogiers et al., 1990), a valproát (Rogiers et al., 1995). Primární kultury hepatocytů jsou
vhodné k farmakokinetickým, toxikologickým a metabolickým studiím, mezidruhovému srovnávání, ke sledování
interakcí xenobiotik s jinými xenobiotiky, včetně léků
a k predikci chování těchto látek in vivo. Dále je možné je
využít při studiu exprese genů, růstu a dělení in vitro. Obecně
jsou primární kultury vhodné k popisu mechanizmů, které se
podílejí na vzniku toxické léze.
7. KOKULTIVAČNÍ TECHNIKY A 3-D MODELY
Jednou z možností, jak zabránit dediferenciaci hepatocytů
in vitro, je použítí kokultivace hepatocytů s neparenchymovými jaterními či mimojaterními buňkami. Kokultivační
techniky prodlužují dobu, po kterou si hepatocyty uchovávají své morfologické a funkční charakteristiky, například nejpoužívanější kokultivace hepatocytů s jaterními
epiteliálními buňkami prodlužuje přežívání buněk in vitro
a udržuje po delší dobu vyšší biotransformační kapacitu
systému (Henkens et al., 2006). Kokultivace hepatocytů
s hvězdicovitými buňkami (stellate cells) na speciálních substrátech vede k organizaci třídimenzionálních sféroidů, což
umožňuje hepatocytům udržet si své specifické vlastnosti po
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
dobu téměř dvou měsíců (Riccalton-Banks et al., 2003). Pro
různé účely se mohou využít i jiné neparenchymové buňky
– fibroblasty (Lu et al., 2005), Kupfferovy (Lelbach et al.,
2001), či endoteliální buňky (Morin a Normand, 1986).
V in vivo podmínkách jsou hepatocyty obklopeny, mimo
jiných hepatocytů, ze dvou stran extracelulární matrix Disseho prostoru (Berry a Edwards, 2000). Napodobením těchto
podmínek in vitro bylo zavedení metody sendvičových
kultivací. Při nich se hepatocyty umístí mezi dvě vrstvy
kolagenového gelu, což zvyšuje množství mezibuněčných
kontaktů. Bylo popsáno, že při inkubaci lidských hepatocytů
sendvičovou technikou buňky přežívají po dobu delší než
4 týdny, udržují si polygonální tvar s kanalikulárními strukturami a vysokou produkci albuminu, rovněž si udržují podstatně déle aktivitu cytochrómu P450 1A2 oproti konvenčnímu
monolayeru a vyšší inducibilitu tohoto cytochromu oproti
kokultivaci se žlučovými epiteliálními buňkami (Kono et al.,
1997). S výhodou lze použít i tzv. matrigel, což je mezibuněčná hmota získaná z myšího Engelbreth-Holm-Swarmova
sarkomu bohatá na laminin (Schuetz et al., 1988). Hepatocyty
pěstované v 3D prostředí matrigelu mění svůj tvar z kulovitého na kubický a dlouho si udržují své funkční parametry
(produkci albuminu, polaritu buněčné membrány aj.), rovněž
napomáhá udržení exprese a možnosti indukce biotransformačních enzymů (Gross-Steinmeyer et al., 2005).
Jinou moderní metodou jsou mnohobuněčné sféroidy,
které vznikají při kultivaci jaterních buněk ve speciálních
porézních systémech (např. porézní polyuretanová pěna)
nebo v nádobách s nepřilnavým pozitivně nabitým povrchem (poly-(2-hydroxyetylmetakrylát)). Buňky vytvářejí
shluky o velikosti kolem 100 µm, neboť absence kapilár
v jejich struktuře limituje přežívání buněk dostupností
kyslíku a výměnou živin a produktů metabolizmu (Glicklis
et al., 2004). Jejich výhodou je díky 3D struktuře zvýšený
počet mezibuněčných interakcí, který vede k udržení strukturální a funkční polarity buněk. Mezi buňkami se vytvářejí
spojení typu tight junctions a mikroklky vystlané kanálky
připomínající žlučové kapiláry. Morfologie a ultrastruktura
hepatocytů se podobá podmínkám in vivo. Životnost těchto
systému je popisována mezi 1 až 2 týdny (Dvir-Ginzberg
et al., 2004), jiní autoři hovoří i o měsících (Tong et al.,
1992). Bohužel sféroidy mají tendenci se dále shlukovat
a pak v centru velkých agregátů dochází ke smrti buněk
a zániku sféroidů. Proto byly vyvinuty speciální metody
úprav povrchů, které mohou ovlivňovat velikost formovaných sféroidů (Fukuda et al., 2006). Sféroidy se používají
především k toxikologickým testům a studiu metabolizmu
farmak. Modifikací mnohobuněčných sféroidů lze vytvořit tzv. microencapsulated hepatocytes, kdy se zachycují
hepatocyty do alginátové membrány, čímž vznikají tělíska
o velikosti 0,4 až 1 mm. Tento model dává nové možnosti
transplantaci hepatocytů.
K testování cholestatických účinků xenobiotik se s výhodou používají dublety hepatocytů („hepatocyte couplets“),
které si zachovávají žlučovou kapiláru mezi sousedními
hepatocyty (Thibault, 1994). Získávají se speciálně modifikovanou metodou izolace. Jejich nevýhodou je pouze
několikahodinová funkčnost.
55
8. MODEL BIOREAKTORU
9. VYUŽITÍ KMENOVÝCH BUNĚK
S rozvojem tkáňového inženýrství a biotechnologie se
stává hitem v oblasti in vitro technik využití hepatocytů
v bioarteficiálních podpůrných systémech (bioarteficial
liver, model bioreaktoru). Úlohou bioreaktoru je náhrada
jaterních funkcí u pacientů s jaterním selháním, čímž se získá
potřebný čas pro nalezení vhodného štěpu pro transplantaci
nebo v optimálním případě může dojít i ke spontánní obnově jaterních funkcí v důsledku mimořádné schopnosti jater
regenerovat (např. při akutním jaterním selhání v důsledku
toxického poškození jater). Základ bioreaktoru tvoří imobilizované hepatocyty promývané kultivačním médiem.
Oproti statickým kultivačním technikám (např. klasická
kultivace hepatocytů v primární kultuře), kde hrozí riziko
hypoxie a hromadění produktů metabolizmu, jsou modely
bioreaktoru blíže fyziologickým podmínkám.
První pokusy s vytvořením bioarteficiálních jaterních systémů se prováděly na primokulturách hepatocytů, které byly
kontinuálně promývány kultivačním médiem. Tento způsob
byl brzy opuštěn a nahrazen novějšími technikami. Jednou
z nich je tzv. „thread technique“, kdy jsou izolované hepatocyty (Farghali et al., 1994), nověji i sféroidy hepatocytů
(Park a Song, 2006) smíchány s roztokem gelu (např. agarózovým), následně vytvořený gel je protlačen speciálním
sítem, čímž se získá imobilizovaný systém. Další metoda
využívá hepatocyty kultivované na kolagenem potažených
kuličkách tzv. „microcarrier beads“, kterými se plní systém dutých vláken „hollow fibre system“. Využití modelů
bioreaktoru je limitováno především dostupností lidských
hepatocytů, dále složitostí imobilizace hepatocytů a zachováním standardních podmínek kultivace. Mimo terapeutické
využití je lze použít pro sledování metabolických funkcí
hepatocytů a toxikologické účely (Farghali et al., 2001).
BAL jsou obvykle plněny lidskými či prasečími hepatocyty
nebo hepatomovými buňkami.
Výzkum posledních let obrací pozornost ke studiu
proliferace hepatocytů v primárních kulturách a k využití
kmenových buněk (Kulkarni a Khanna, 2006). K indukci
dělení in vitro je třeba přítomnost kompletního mitogenu
a dalších suplementů. Za kompletní mitogen se považují tyto
růstové faktory: epidermal growth factor (EGF), hepatocyte
growth factor (HGF), transforming growth factor-alpha
(TGFa) (Block et al., 1996) nebo heparin-binding EGF-like
growth factor (HB-EGF). Mezi nejdůležitější suplementy
patří nikotinamid (Sato et al., 1999); dále stopové kovy ve
dvoumocné formě – měď, železo a zinek (Cable a Isom,
1997); aminokyseliny – prolin, kyselina glutamová (Block et
al., 1996; Hasegawa et al., 1994) či arginin; a bikarbonátové
anionty (Mitaka et al., 1991).
Obr. 1: Mikrofotografie hepatocytů v suspenzi za 1 hodinu po
izolaci buněk (fázový kontrast, 200×).
56
10. HEPATOMOVÉ A GENETICKY
MODIFIKOVANÉ BUŇKY
Dalším ze systémů, který lze do jisté míry využít pro toxikologické studie, je kultivace hepatomových buněk (např.
lidské linie HepG2). Výborná dostupnost a „nesmrtelnost“
buněk jsou hlavními výhodami tohoto systému. Naopak je
třeba zmínit, že tyto buňky si uchovávají pouze některé pro
hepatocyty specifické funkce a často je u nich detekována
genotypová nestabilita, která se může projevit změnami
fenotypu v průběhu kultivace a další dediferenciací buněk.
Rovněž lze využít imortalizované linie. Ty lze v zásadě
získat 2 způsoby, buď použitím virového vektoru (např.
virus SV 40), nebo fuzí hepatocytu s hepatomovou buňkou
za vzniku hybridní buněčné linie. Dostupné jsou lidské, potkaní i prasečí linie hepatocytů s různým stupněm zachování
funkcí hepatocytu a exprese biotransformačních enzymů.
Geneticky modifikované buňky vznikají transfekcí
DNA kódující nejčastěji lidské cytochromy P450 (Nouso
et al., 1992) či enzymy II. fáze biotransformace nebo akti-
Obr. 2: Mikrofotografie hepatocytů v primární kultuře za 2 hodiny po nasazení na kolagenované Petřino misky (fázový kontrast, 200×).
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
vátory genů (Tollet et al., 1995). Tyto buňky pak exprimují
příslušný enzym. Jsou využívány pro studium charakteristik
exprimovaných enzymů (Guillouzo, 1998).
11. SUBCELULÁRNÍ FRAKCE
Ze subcelulárních frakcí je třeba jmenovat mikrozomální frakci, izolované mitochondrie
a jádra, menší využití mají cytozolární frakce a izolované
proteiny. Výhodami subcelulárních frakcí je snadné uchování ve zmraženém stavu a poměrně snadná a rychlá příprava.
Jejich využití je však limitováno použitím speciálních kultivačních médií (intracelulární média) a nutností dodávat
mimo substrátů i koenzymy. Mikrozomální frakce hepatocytů obsahují části endoplazmatického retikula a jsou
bohaté na cytochrómy P450. Jsou vhodné pro testování
některých jaterních biotransformačních enzymů. Dále je lze
využít k detekci tvorby lipoperoxidů a ke sledování možností
ochrany před lipoperoxidačním poškozením (Cheeseman et
al., 1987). Limity při použití mikrozómů jsou velmi krátká
funkčnost (1–2 h), chybění enzymů II. fáze biotransformace
a potřeba kofaktorů k jejich aktivitě. Jinou subcelulární frakcí jsou izolované mitochondrie. Ty se používají zejména
pro testování vlivu xenobiotik na aktivitu enzymů respiračního řetězce, včetně syntézy ATP (Červinková et al., 2002).
Lze je využít i pro sledování b-oxidace mastných kyselin
v mitochondriích a tvorbu ROS mitochondriemi. Zvláštní
subcelulární frakcí je tzv. S-9 frakce, která obsahuje jak
mikrozómy, tak i cytozol.
12. ZÁVĚR
Optimální modelový systém pro studium toxického
poškození hepatocytů in vitro by měl splňovat řadu kritérií.
Mělo by jít o systém bezpečný, stabilní (beze změn enzymových aktivit v čase), dostupný, levný a snadno manipulovatelný. Výsledky získané jeho využitím by měly být relevantní, reprodukovatelné a snadno přenositelné do podmínek in
vivo a na člověka. V neposlední řadě musí splňovat všechna
etická a právní kritéria.
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
Nejčastěji využívaným modelem jsou v současnosti bezesporu primární kultury hepatocytů spolu s kokultivačními
technikami a 3-D modely. Rychlý rozvoj biotechnologií
vede k rozšíření používání modelu bioreaktoru nejen pro
experimentální účely, ale i pro dočasnou náhradu selhávajících jater. Přestože každý ze systémů popsaných v tomto
článku má své výhody, má i své limity. Proto lze konstatovat, že v současnosti neexistuje ideální model pro studium
hepatotoxicity in vitro, který by plně nahrazoval pokusy in
vivo. To ovšem vůbec neznamená, že využití těchto modelových systémů nemá v současné vědě opodstatnění. Naopak
postupy in vitro významně redukují počet zvířat použitých
v experimentu a jejich utrpení a snižují ekonomické náklady na výzkum. Dalším významným přínosem je možnost
využití lidského materiálu k testování hepatotoxicity, což
v podmínkách in vivo vůbec nepřichází v úvahu. Postupy
in vitro umožňují mnohem detailnější studium dílčích procesů při toxickém poškození jater na celulární, subcelulární
i molekulární úrovni a přispěly k odhalení celé řady mechanizmů, které se účastní poškození buněk. Existuje snaha,
aby experimenty in vivo se spíše využívaly pro ověření dat
získaných na modelových systémech in vitro.
Nicméně velkým problémem zůstává srovnávání a interpretace výsledků jednotlivých pracovišť a jejich extrapolaci
do humánní medicíny, neboť existuje obrovská škála používaných metodik in vitro. Nejde jen o používání hepatocytů
různých živočišných druhů, ale i o použitý typ kultivace,
kultivačního média a jeho suplementace a dalších faktorů.
Snaha o optimalizaci a standardizaci postupů in vitro vedla
v říjnu 1991 k založení Evropského centra pro validaci
alternativních metod – ECVAM (The European Center for
the Validation of Alternative Methods).
Tato práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM 0021620820.
MUDr. Otto Kučera, Ph.D.
Ústav fyziologie
Univerzita Karlova v Praze,
Lékařská fakulta v Hradci Králové
Šimkova 870
500 38 Hradec Králové
Tel.: 495816186
E-mail: [email protected]
57
LITERATÚRA
1.
22. Hasegawa K, Miyata Y, Carr BI. Glutamic acid potentiates hepatocyte
response to mitogens in primary culture. J Cell Physiol, 158, 1994, s.
365-73.
23. Henkens T, Vanhaecke T, Papeleu P, Elaut G, Vinken M, Snykers
S, Rogiers V. Rat hepatocyte cultures: conventional monolayer and
cocultures with rat liver epithelial cells. Methods Mol Biol, 320, 2006,
s. 239-46.
24. Hohne M, Becker-Rabbenstein V, Kahl GF, Taniguchi H. Regulation
of cytochrome P-450 CYPIA1 gene expression and proto-oncogene
expression by growth factors in primary hepatocytes. FEBS Lett, 273,
1990, s. 219-22.
25. Kobayashi T, Tsuge H, Orita K. Effects of insulin and glucagon on
energy and carbohydrate metabolism of rat hepatocytes in primary culture. Acta Med Okayama, 42, 1988, s. 259-69.
26. Kono Y, Yang S, Roberts EA. Extended primary culture of human hepatocytes in a collagen gel sandwich system. In Vitro Cell Dev Biol
Anim, 33, 1997, s. 467-72.
27. Kosina P, Dvorak Z, Walterova D. The human hepatocyte: I. A model
for studying metabolism and toxicity of xenobiotics. Česká Slov Farm,
48, 1999, s. 65-71.
28. Kučera O, Červinková Z, Lotková H, Křiváková P, Roušar T, Mužáková V, Héžová R, Kanďár R, Rudolf E. Protective effect of S-adenosylmethionine against D-galactosamine-induced injury of rat hepatocytes
in primary culture. Physiol Res, 2006, v tisku.
29. Kulkarni JS, Khanna A. Functional hepatocyte-like cells derived from
mouse embryonic stem cells: A novel in vitro hepatotoxicity model for
drug screening. Toxicol In Vitro, 2006, v tisku.
30. Lelbach A, Scharf JG, Ramadori G. Regulation of insulin-like growth
factor-I and of insulin-like growth factor binding protein-1, -3 and -4
in cocultures of rat hepatocytes and Kupffer cells by interleukin-6. J
Hepatol, 35, 2001, s. 558-67.
31. Lerche-Langrand C, Toutain HJ. Precision-cut liver slices: characteristics and use for in vitro pharmaco-toxicology. Toxikology, 153, 2000,
s. 221-53.
32. Liddiard C, Merker HJ, Nau H. An improved method for the preparation of human fetal and adult hepatocytes. Arch Toxicol, 44, 1980, s.
107-12.
33. Lloyd TD, Orr S, Skett P, Berry DP, Dennison AR. Cryopreservation
of hepatocytes: a review of current methods for banking. Cell Tissue
Bank, 4, 2003, s. 3-15.
34. Lu HF, Chua KN, Zhang PC, Lim WS, Ramakrishna S, Leong KW,
Mao HQ. Three-dimensional co-culture of rat hepatocyte spheroids
and NIH/3T3 fibroblasts enhances hepatocyte functional maintenance.
Acta Biomater, 1, 2005, s. 399-410.
35. McMillan JM, Shaddock JG, Casciano DA, Arlotto MP, Leakey JE.
Differential stability of drug-metabolizing enzyme activities in primary rat hepatocytes, cultured in the absence or presence of dexamethasone. Mutat Res, 249, 1991, s. 81-92.
36. Mitaka T, Mizuguchi T, Sato F, Mochizuki C, Mochizuki Y. Growth and maturation of small hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol
1998;13(Suppl): 70-77.
37. Mitaka T, Sattler GL, Pitot HC. The bicarbonate ion is essential for
efficient DNA synthesis by primary cultured rat hepatocytes. In Vitro
Cell Dev Biol, 27, 1991, s. 549-56.
38. Morin O, Normand C. Long-term maintenance of hepatocyte functional activity in co-culture: requirements for sinusoidal endothelial cells
and dexamethasone. J Cell Physiol, 129, 1986, s. 103-10.
39. Nouso K, Thorgeirsson SS, Battula N. Stable expression of human
cytochrome P450IIE1 in mammalian cells: metabolic activation of
nitrosodimethylamine and formation of adducts with cellular DNA.
Cancer Res, 52, 1992, s. 1796-800.
40. Paine AJ, Williams LJ, Legg RF. Apparent maintenance of cytochrome
P 450 by nicotinamide in primary cultures of rat hepatocytes. Life Sci,
24, 1979, s. 2185-91.
41. Park KH, Song SC. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene)
hydrogel as cell delivery vehicle. J Biosci Bioeng, 101, 2006, s. 23842.
42. Powell GM, Hughes HM, Curtis CG. Isolated perfused liver technology for studying metabolic and toxicological problems. Drug Metabol
Drug Interact, 7, 1989, s. 53-86.
58
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
Bach PH, Vickers AEM, Fisher R, Baumann A, Brittebo E, Carlile DJ,
Koster HJ, Lake BG, Salmon F, Sawyer TW. The use of tissue slices
for pharmacotoxicology studies. ATLA-Altern Lab Anim, 24, 1996, s.
893-923.
2. Berry MN, Edwards AM, Barritt GJ. Isolated hepatocytes preparation, properties and application. 1st ed. New York, Oxford, Amsterdam:
Elsevier 1991; 1-460.
3. Berry MN, Edwards AM. The hepatocyte review, 1st ed. Dordrecht,
Boston, London: Kluwer Academic Publishers 2000; 1-605.
4. Berry MN, Friend DS. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells:
a biochemical and fine structural study. J Cell Biol, 43, 1969, s. 506-20.
5. Block GD, Locker J, Bowen WC, Petersen BE, Katyal S, Strom SC,
Riley T, Howard TA, Michalopoulos GK. Population expansion, clonal growth, and specific differentiation patterns in primary cultures of
hepatocytes induced by HGF/SF, EGF and TGF alpha in a chemically
defined (HGM) medium. J Cell Biol, 132, 1996, s. 1133-49.
6. Cable EE, Isom HC. Exposure of primary rat hepatocytes in long-term
DMSO culture to selected transition metals induces hepatocyte proliferation and formation of duct-like structures. Hematology, 26, 1997,
s. 1444-57.
7. Cheeseman KH, Davies MJ, Emery S, Maddix SP, Slater TF. Effects
of alpha-tocopherol on carbon tetrachloride metabolism in rat liver
microsomes. Free Radic Res Commun, 3, 1987, s. 325-30.
8. Coecke S, Mertens K, Segaert A, Callaerts A, Vercruysse A, Rogiers
V. Spectrophotometric measurement of flavin-containing monooxygenase activity in freshly isolated rat hepatocytes and their cultures. Anal
Biochem, 205, 1992, s. 285-8.
9. Červenková K, Veselý J, Rypka M, Chmela Z, Červinková Z, Riegrová
D. Tkáňové řezy o definované tloušťce – významné systémy pro studie
metabolismu in vitro. Česk Fysiol, 50, 2001, s. 108-14.
10. Červinková Z, Lotková H, Kučera O, Drahota Z, Houštěk J. Hodnocení energetického metabolismu izolovaných hepatocytů pomocí oxygrafie. Acta Medica (Hradec Králové) 2002;45 (Suppl 1): 65-76.
11. Červinková Z. Metabolismus a játra. Sanquis, 40, 2005, s. 14-16.
12. Dvir-Ginzberg M, Elkayam T, Aflalo ED, Agbaria R, Cohen S.
Ultrastructural and functional investigations of adult hepatocyte
spheroids during in vitro cultivation. Tissue Eng, 10, 2004, s. 180617.
13. Elaut G, Vanhaecke T, Heyden YV, Rogiers V. Spontaneous apoptosis,
necrosis, energy status, glutathione levels and biotransformation capacities of isolated rat hepatocytes in suspension: effect of the incubation
medium. Biochem Pharmacol, 69, 2005, s. 1829-38.
14. Farghali H, Kamenikova L, Martinek J, Lincova D, Hynie S. Preparation of functionally active immobilized and perfused mammalian cells:
an example of the hepatocyte bioreactor. Physiol Res, 43, 1994, s. 1215.
15. Farghali H, Linčová D, Kmoníčková E, Bencko V. Potential application of immobilized and perfused hepatocytes in environmental toxicology studies. Cent Eur J Public Health, 9, 2001, s. 102-5.
16. Fukuda J, Sakai Y, Nakazawa K. Novel hepatocyte culture system
developed using microfabrication and collagen/polyethylene glycol
microcontact printing. Biomaterials, 27, 2006, s. 1061-70.
17. Glicklis R, Merchuk JC, Cohen S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular
functions. Biotechnol Bioeng, 86, 2004, s. 672-80.
18. Grant MH, Melvin MA, Shaw P, Melvin WT, Burke MD. Studies on
the maintenance of cytochromes P-450 and b5, monooxygenases and
cytochrome reductases in primary cultures of rat hepatocytes. FEBS
Lett, 190, 1985, s. 99-103.
19. Gross-Steinmeyer K, Stapleton PL, Tracy JH, Bammler TK, Lehman
T, Strom SC, Eaton DL. Influence of Matrigel-overlay on constitutive
and inducible expression of nine genes encoding drug-metabolizing
enzymes in primary human hepatocytes. Xenobiotica, 35, 2005, s.
419-38.
20. Guillouzo A. Liver cell models in in vitro toxicology. Environ Health
Perspect 1998;106 (Suppl 2): 511-32.
21. Hamilton GA, Westmorel C, George AE. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as
spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 37, 2001, s.
656-67.
43. Renwick AB, Watts PS, Edwards RJ, Barton PT, Guyonnet I, Price RJ,
Tredger JM, Pelkonen O, Boobis AR, Lake BG. Differential maintenance of cytochrome P450 enzymes in cultured precision-cut human
liver slices. Drug Metab Dispos, 28, 2000, s. 1202-9.
44. Riccalton-Banks L, Liew C, Bhandari R, Fry J, Shakesheff K. Longterm culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of
primary hepatocytes and stellate cells. Tissue Eng, 9, 2003, s. 401-10.
45. Rogiers V, Akrawi M, Vercruysse A, Phillips IR, Shephard EA. Effects
of the anticonvulsant, valproate, on the expression of components of
the cytochrome-P-450-mediated monooxygenase system and glutathione S-transferases. Eur J Biochem, 231, 1995, s. 337-43.
46. Rogiers V, Vandenberghe Y, Callaerts A, Verleye G, Cornet M, Mertens K, Sonck W, Vercruysse A. Phase I and phase II xenobiotic biotransformation in cultures and co-cultures of adult rat hepatocytes. Biochem Pharmacol, 40, 1990, s. 1701-6.
47. Russell WMS, Burch RL. The Principles of Humane Experimental
Technique. 1st ed. London: Methuen 1959, s. 1-238.
48. Sato F, Mitaka T, Mizuguchi T, Mochizuki Y, Hirata K. Effects of nicotinamide-related agents on the growth of primary rat hepatocytes and
formation of small hepatocyte colonies. Liver, 19, 1999, s. 481-8.
49. Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol,
13, 1976, s. 29-83.
50. Schuetz EG, Li D, Omiecinski CJ, Muller-Eberhard U, Kleinman HK,
Elswick B, Guzelian PS. Regulation of gene expression in adult rat
hepatocytes cultured on a basement membrane matrix. J Cell Physiol,
134, 1988, s. 309-23.
Československá fyziologie 55/2006 č. 3
51. Su T, Waxman DJ. Impact of dimethyl sulfoxide on expression of
nuclear receptors and drug-inducible cytochromes P450 in primary rat
hepatocytes. Arch Biochem Biophys, 424, 2004, s. 226-34.
52. Thoresen GH, Sand TE, Refsnes M, Dajani OF, Guren TK, Gladhaug
IP, Killi A, Christoffersen T. Dual effects of glucagon and cyclic AMP
on DNA synthesis in cultured rat hepatocytes: stimulatory regulation in
early G1 and inhibition shortly before the S phase entry. J Cell Physiol,
144, 1990, s. 523-30.
53. Thibault N. Scanning laser cytometry: alterations induced by cholestatic agents in isolated rat hepatocyte couplets. Cell Biol Toxicol, 10,
1994, s. 323-8.
54. Tollet P, Lahuna O, Ahlgren R, Mode A, Gustafsson JA. CCAAT/enhancer-binding protein-alpha-dependent transactivation of CYP2C12 in
rat hepatocytes. Mol Endocrinol, 9, 1995, s. 1771-81.
55. Tong JZ, De Lagausie P, Furlan V, Cresteil T, Bernard O, Alvarez F.
Long-term culture of adult rat hepatocyte spheroids. Exp Cell Res,
200, 1992, s. 326-32.
56. Vintermyr OK, Boe R, Bruland T, Houge G, Doskeland SO. Elevated
cAMP gives short-term inhibition and long-term stimulation of hepatocyte DNA replication: roles of the cAMP-dependent protein kinase
subunits. J Cell Physiol, 156, 1993, s. 160-70.
57. vom Dahl S, Stoll B, Gerok W, Haussinger D. Inhibition of proteolysis by cell swelling in the liver requires intact microtubular structures.
Biochem J, 308, 1995, s. 529-36.
59