Pfiíruăka QIAamp® DSP Virus Kit

1050717_CS
16.04.2008
8:57 Uhr
Seite 1
Listopad 2007
Pfiíruãka QIAamp® DSP Virus Kit
Σ
50
Verze 1
IVD
Souprava QIAamp DSP Virus Kit je generický systém, který využívá technologii
QIAamp pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin ze vzorků lidské
plazmy nebo lidského séra pro in vitro diagnostické účely.
Pouze pro in vitro diagnostické účely.
REF
60704
H B
1050717CS
11/2007
QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden,
Tel: +49-2103-29-0
R1
MAT
1050717CS
Sample & Assay Technologies
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 2
Ochranné známky: QIAGEN®, QIAamp®, QIAvac, MinElute™ (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR®, AMPLICOR HCV MONITOR®, AMPLICOR HIV-1
MONITOR® (Roche Molecular Systems, Inc.); artus™, RealArt™ (artus GmbH); COBAS® (Roche Diagnostics Systems, Inc.); Eppendorf® (Eppendorf-Netheler-Hinz
GmbH). Registrované názvy, ochranné známky, atd. používané v tomto dokumentu, dokonce ani pokud nejsou jako takové označeny, nelze považovat za
nechráněné právními předpisy.
Technika PCR je chráněna U.S. Patenty 4,683,195 a 4,683,202 a ekvivelntními zahraničními patenty ve vlastnictví firmy Hoffmann-La Roche AG.
© 2004 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 3
Obsah
SloÏení soupravy
4
Symboly
5
Uchovávání
6
¤ízení jakosti
6
Zam˘‰lené pouÏití
6
Omezení pro pouÏití produktu
7
Bezpeãnostní informace
7
Úvod
9
Princip a popis metody
9
Vybavení a reagencie, které má zajistit uÏivatel.
14
DÛleÏité poznámky
15
Důležité body před zahájením
15
Příprava RNA
15
Uchovávání vzorků
16
Příprava reagencií a pufrů
16
Eluce virových nukleových kyselin
19
Výtěžek a kvalita virových nukleových kyselin
19
Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus
19
Protokol
Izolace a purifikace virov˘ch nukleov˘ch kyselin z plazmy a séra
Distributofii firmy QIAGEN
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
22
27
11/2007
3
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 4
SloÏení soupravy
Pfiíruãka QIAamp® DSP Virus Kit
Katalogové ãíslo
60704
Poãet stanovení
50
MinElute™
COL
QIAamp MinElute Kolonky QIAamp
s promývacími zkumavkami (WT) (2 ml)
50
EXT
Nástavce kolonky (3 ml)
COL
EXT
50
ET
Eluční zkumavky (1,5 ml)
ELU
TUBE
50
VC
VAC
Vakuové konektory (VacConnectors)
CON
50
LT
Lyzační zkumavky (2 ml)
WT
Promývací zkumavky (2 ml)
AL
Lyzační pufr*
AW1
LYS
TUBE
50
WASH
TUBE
50
LYS
BUF
33 ml
Promývací pufr 1* (koncentrát)
WASH
BUF
1 CON
BUF
2 CON
19 ml
AW2
Promývací pufr 2 (koncentrát)
WASH
AVE
Eluční pufr† (purpurový uzávěr)
ELU
BUF
PS
Roztok pro ředění proteáz†
QPROT
SOLV
4,4 ml
CAR
RNA
310 g
†
Nosičová RNA
Nosičová RNA (červený uzávěr)
QP
QIAGEN Proteáza
®
CD
Příručka
†
QPROT
H
B
H B
13 ml
4 x 2 ml
1 lahvička
1
1
* Obsahuje guanidin hydrochlorid. Není kompatibilní s dezinfekčními přípravky obsahujícími bělící prostředky. Bližší informace: viz strana 7.
†
Obsahuje azid sodný jako konzervační látku.
†
Rozpouštěcí objem 4,4 ml.
4
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 5
Symboly
Σ
Souprava obsahuje reagencie pro přípravu 50 vzorků
50
Viz informace v příručce
i
Použít do (datum exspirace)
IVD
Prostředky zdravotnické techniky pro in vitro diagnostiku
REF
Katalogové číslo
LOT
Číslo šarže
MAT
Číslo materiálu
Komponenty
COMP
Objem
VOL
Teplotní meze
Oprávněný výrobce
Při doručení
i
Důležitá poznámka
Po provedení daného kroku protokolu s tímto označením si vyměňte rukavice
8°C
2°C
?
Otevřít při převzetí; uchovávejte kolonky QIAamp MinElute při 2–8°C
Zapište datum přidání ethanolu do lahve
EtOH
ADD
Přidání
CONT
Obsahuje
LYOPH
Lyofilizováno
RCNS
Rozpusťte v
EtOH
Ethanol
GuHCI
Guanidin hydrochlorid
SUBT
➡
Subtilisin
Pokračujte směrem k
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
5
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 6
Uchovávání
Kolonky QIAamp MinElute je nutné po převzetí uchovávat při teplotě 2–8 °C.
Všechny pufry mohou být uchovávány při laboratorní teplotě (15–25 °C).
Lyofilizovaná nosičová RNA může být uchováván při laboratorní teplotě (15–25 °C).
Nosičová RNA se může rozpouštěná pouze v elučním pufru (AVE); rozpuštěná nosičová
RNA se musí okamžitě přidat do lyzačního pufru (AL) podle popisu na straně 16. Tento
roztok se připravuje čerstvý a při teplotě 2–8 °C je stabilní po dobu 48 hodin. Nespotřebovaná nosičová RNA rozpuštěná v elučním pufru (AVE) má být zamražena
v alikvotech při –20 °C.
Lyofilizovaná proteáza QIAGEN (QP) může být uchovávána při laboratorní teplotě
(15–25 °C) až do data exspirace, aniž by došlo ke snížení její účinnosti.
Rozpuštěná proteáza QIAGEN (QP) uchovávaná při teplotě 2–8 °C je stabilní po dobu
jednoho roku.
Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) a rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) jsou stabilní po dobu 1 roku, pokud jsou uchovávany při laboratorní teplotě (15–25 °C).
¤ízení jakosti
V souladu s certifikovaným systémem řízení jakosti firmy QIAGEN Total Quality Management System je každá šarže soupravy QIAamp DSP Virus Kit podrobena testům předem definovaných parametrů, které zajišťují odpovídající jakost produktů.
Zam˘‰lené pouÏití
Souprava QIAamp DSP Virus Kit je generický systém, který využívá technologii QIAamp
pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin ze vzorků lidské plazmy nebo lidského séra pro in vitro diagnostické účely. Veškeré diagnostické výsledky získané
pomocí postupu pro přípravu vzorků v souladu s jakoukoliv následnou diagnostickou
NAT analýzou musí být interpretovány s přihlédnutím k ostatním klinickým a laboratorním nálezům.
Produkt je určen k použití profesionálními pracovníky, např. techniky nebo lékaři
školenými v technikách molekulární biologie. Je určen k použití v jakékoliv další následné aplikaci využívající enzymatickou amplifikaci nebo jinou enzymatickou modifikaci
DNA nebo RNA, která je následována detekcí nebo amplifikací signálu. Izolované
a purifikované virové nukleové kyseliny mohou být použity v kvalitativních (např. screening krevních parametrů) i v kvantitativních (např. monitorování zátěže způsobené viry)
diagnostických NAT analýzách.
Aby bylo možné minimalizovat odchylky diagnostických výsledků, je produkt určen
k použití s interní kontrolou a s pozitivní a negativní kontrolou během procesu přípravy
vzorku, amplifikace vzorku a detekce v závislosti na použitém následném testu.
Produkt je určen k použití s vakuovým systémem QIAvac 24 Plus nebo s jinýmekvivalentním vakuovým systémem.
6
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 7
Omezení pro pouÏití produktu
Souprava není určena k použití se vzorky krve, tkáně, kostní dřeně nebo s buněčnými
kulturami. Souprava není rovněž určena k izolaci nebo purifikaci bakteriálních, fungálních nebo parazitárních nukleových kyselin. Účinnost soupravy při izolaci a purifikaci
virových nukleových kyselin z jiných nebuněčných tkáňových tekutin, například z moči
nebo cerebrospinální tekutiny (CSF), není stanovena.
Bezpeãnostní informace
Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno
použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech. Bezpečnostní listy jsou k dispozici online v pohodlném a kompaktním formátu PDF na stránkách www.qiagen.com/ts/msds.asp, kde můžete nalézt, zobrazit
a vytisknout příslušný bezpečnostní list pro každou soupravu QIAGEN a pro každou
komponentu těchto souprav.
POZOR: NEP¤IDÁVEJTE roztoky bûlících prostfiedkÛ nebo kyselin pfiímo do
odpadu z pfiípravy vzorku.
Lyzační pufr (AL) a promývací pufr 1 (AW1) obsahují guanidin hydrochlorid, který
může v kombinaci s bělícími prostředky tvořit vysoce reaktivní látky. V případě rozlití
tekutin obsahujících tyto pufry vyčistěte kontaminované místo vhodným laboratorním
detergentem a vodou. Pokud rozlitá tekutina obsahuje potenciálně infekční látky,
vyčistěte zasaženou oblast nejprve laboratorním detergentem a vodou a poté 1% (vol)
roztokem chlornanu sodného.
Jestliže jsou lahve s pufrem poškozeny nebo prosakují, použijte při likvidaci těchto lahví
rukavice a ochranné brýle, abyste zabránil/a poškození vašeho vlastního zdraví nebo
zdraví jiných osob.
Firma QIAGEN netestuje tekutý odpad vzniklý použitím metody QIAamp DSP Virus na
přítomnost reziduálních infekčních materiálů. Kontaminace odpadní tekutiny reziduálními infekčními materiály je vysoce nepravděpodobná, nelze ji však zcela vyloučit.
Tekutý odpad musí být proto považován za infekční a je nutné s ním nakládat a likvidovat jej v souladu s místními bezpečnostními předpisy.
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
7
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 8
Pro komponenty soupravy QIAamp DSP Virus Kit platí tyto R-věty a S-věty:
Lyzaãní pufr (AL) a prom˘vací pufr 1 (AW1)
Obsahuje guanidin hydrochlorid: zdraví škodlivý, dráždivý R-věty a S-věty:* R2236/38, S13-26-36-46
Proteáza QIAGEN (QP)
Obsahuje subtilisin: senzitizující, dráždivý R-věty a S-věty:* R37/38-41-42, S22-24-2636/37/39-46
24hodinová nouzová linka
Nouzové lékařské informace je možné získat v anglickém, francouzském a německém jazyce 24 hodin denně na telefonním čísle:
Poison Information Center Mainz, Německo
Tel: +49-6131-19240
* R22: Zdraví škodlivý při požití; R36/38: Dráždí oči a kůži; R37/38: Dráždí dýchací orgány a kůži; R41:
Nebezpečí vážného poškození očí; R42: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování; S13: Uchovávejte
odděleně od potravin, nápojů a krmiv; S22: Nevdechujte prach; S24: Zamezte styku s kůží; S26: Při
zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc; S36: Používejte vhodný
ochranný oděv; S36/37/39: Používejte vhodný ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle nebo
obličejový štít; S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení.
8
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 9
Úvod
Souprava QIAamp DSP Virus Kit používá dobře zavedenou technologii pro simultánní
izolaci a purifikaci virové DNA a RNA. Metoda QIAamp DSP Virus využívá selektivní
vazebné vlastnosti membrán na bázi křemíku při použití minimálních elučních objemů
20 µl nebo 60 µl.
Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus je stanoven pro HIV RNA a HBV DNA v
několika dalších následných diagnostických testech (Tabulka 1, Obrázek 1 a 2).
Tabulka 1. Následné diagnostické testy, v nichÏ byl testován lineární rozsah metody
QIAamp DSP Virus.
Test
Souprava
Real-time RT-PCR pro stanovení HIV RNA
TaqMan® test a COBAS® AMPLICOR
HIV-1 MONITOR® Test
Real-time PCR pro stanovení HBV DNA
TaqMan® test COBAS AMPLICOR
HBV MONITOR® Test
Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus pfii TaqMan testech
log result IU/ml
8
6
4
y = 1.0042x + 0.0832
R2 = 0.9974
2
0
1
2
3
5
4
6
log input IU/ml
7
8
log result IU/ml
B
A
6
5
4
3
2
1
0
y = 0.9725x + 0.0982
R2 = 0.9984
1
2
3
4
log input IU/ml
5
6
Obrázek 1 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus při elučním objemu 60 µl je stanoven pomocí testů
TaqMan pro A HIV RNA a B HBV DNA.
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
9
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 10
Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus pfii pouÏití COBAS AMPLICOR
B
6
5
4
3
2
1
log result IU/ml
log result IU/ml
A
y = 1.0098x + 0.1234
R2 = 0.9982
2
3
4
log input IU/ml
5
4
3
2
y = 0.8839x + 0.1718
R2 = 0.984
1
0
1
2
3
log input IU/ml
4
5
Obrázek 2 Lineární rozsah metody QIAamp DSP Virus při elučním objemu 60 µl je stanoven pomocí testů
COBAS AMPLICOR MONITOR pro A HIV RNA a B HBV DNA.
Daný postup je vhodný k použití s plazmou nebo sérem (Obrázek 3); Vzorky plasmy
i séra mohou obsahovat buď citran sodný nebo EDTA. Vzorky mohou být buď čerstvé,
lyofilizované nebo zamražené, za předpokladu, že nebyly zmraženy a rozmraženy
více než jednou. Danou metodu lze použít k izolaci virové DNA nebo RNA z široké
řady DNA nebo RNA virů. Metoda je navržena tak, aby zamezila křížové kontaminaci mezi vzorky a umožnila bezpečné zacházení s potenciálně infekčními vzorky.
Metoda se výborně hodí pro simultánní zpracování několika vzorků. Virové nukleové
kyseliny jsou eluovány v elučním pufru (AVE) a jsou hotové k použití v amplifikačních
reakcích nebo k uchovávání při -20 °C.
Princip a popis metody
Metoda QIAamp DSP Virus zahrnuje 4 kroky:
■
Lyze virových částic ve vzorku
■
Vázání virových nukleových kyselin v lyzátu k membráně kolonky QIAamp
MinElute
■
Promytí membrány
■
Eluce virových nukleových kyselin z membrány
Tato metoda se provádí pomocí kolonky QIAamp MinElute s využitím vakuového systému.
10
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 11
Objem vzorku
Detekční limit (DL) a kvantifikační limit (QL) byl stanoven podle směrnic ICH 2QA a 2QB
pro metodu QIAamp DSP Virus (s počátečním objemem vzorku 500 µl a elučními objemy 20 µl a 60 µl) pomocí různých následných diagnostických testů (Tabulka 2 a 3).
Tabulka 2. Detekãní limit metody QIAamp DSP Virus
Test
Eluãní objem
TM
TM
95% cut off
artus RealArt HBV DNA
20 µl
2,31 IU/ml (n=240)
artus RealArt HCV RNA
20 µl
24,31 IU/ml (n=192)
AMPLICOR manual HIV RNA
60 µl
90,92 IU/ml (n=209)
TaqMan HBV DNA
60 µl
4,73 IU/ml (n=192)
Tabulka 2. Kvantifikaãní limit metody QIAamp DSP Virus
Test
QL
CV
TaqMan HBV DNA
5,7 IU/ml
< 70% (n=88)
TaqMan HCV RNA
52 IU/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HIV RNA
100 IU/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HBV DNA
30 IU/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HCV RNA
700 IU/ml
< 60% (n=66)
Lyze virov˘ch ãástic
Vzorky jsou lyzovány za denaturačních podmínek při zvýšených teplotách. Lyze se
provádí v přítomnosti proteázy QIAGEN (QP) a lyzačního pufru (AL), které společně
zajišťují inaktivaci RNasis.
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
11
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 12
Vázání nukleov˘ch kyselin k membránû kolonky QIAamp MinElute
Pro optimalizaci vázání virové DNA a RNA k membráně kolonky QIAamp MinElute se
nejprve přidá k lyzátům ethanol. Poté se každý lyzát nanese na kolonku QIAamp MinElute a virové nukleové kyseliny jsou adsorbovány na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu indukovaném působením podtlaku.
Odstranûní reziduálních kontaminant
Zatímco virové nukleové kyseliny zůstávají vázány na membránu kolonky QIAamp
MinElute, kontaminanty se účinně vymývají nejprve promývacím pufrem 1 (AW1), poté
promývacím pufrem 2 (AW2) a poté ethanolem.
Eluování ãist˘ch nukleov˘ch kyselin
Virové nukleové kyseliny jsou eluovány z membrány kolonky QIAamp MinElute pomocí
elučního pufru (AVE). Kolonky QIAamp MinElute umožňují získat eluční objemy 20 µl
nebo 60 µl.
V závislosti na použitém následném testu může eluát nukleové kyseliny obsahovat až
50 % reakčního objemu bez jakéhokoliv inhibičního účinku.
12
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 13
Metoda QIAamp DSP Virus
Sample
Pfied zahájením si peãlivû proãtûte protokol (strana 22)
Do LT přidejte 75 µl QP, 500 µl vzorku a 500 µl AL
Míchejte 15 s na vortexu
Lyse
Inkubujte 15 min (±1 min) při 56°C (±1°C)
Přidejte 600 µl ethanolu
Míchejte 15 s na vortexu
Inkubujte 5 min (±1 min) při laboratorní teplotě (15–25 °C)
Bind
Přeneste lyzát na kolonku QIAamp MinElute s připojeným nástavcem
EXT
Vacuum
Wash
(AW1)
Remove EXT
before vacuum
is applied
Přidejte 600 µl rozpuštěného AW1
Odstraňte EXT
Vacuum
Wash
(AW2)
Přidejte 750 µl rozpuštěného AW2
Vacuum
Wash
(ethanol)
Přidejte 750 µl ethanolu
Vacuum
Dry spin
Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT
Elute
Centrifugujte 1 minutu při 14 000 rpm
Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT
Inkubujte 3 min při 56 °C
Vložte kolonku QIAamp MinElute do WT
Přidejte 20 µl nebo 60 µl AVE
Inkubujte 3 min při laboratorní teplotě (15–25 °C)
Pure viral nucleic acids
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
Centrifugujte 1 minutu při 14 000 rpm
11/2007
13
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 14
Vybavení a reagencie, které má zajistit uÏivatel.
Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno
použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech, které lze získat od dodavatele produktu.
■
Ethanol (96–100%)
■
Pipety* a pipetovací špičky (pro zamezení křížové kontaminace doporučujeme
používat pipetovací špičky s aerosolovými bariérami)
■
Rukavice na jedno použití
■
Termoblok* pro lyzi při 56 °C (doporučujeme Eppendorf® Thermomixer comfort s
termoblokem pro 2,0 ml mikrozkumavky†)
■
Mikrocentrifuga*
■
Odměrný válec (50 ml)
■
Vortex (třepačka)*
■
QIAvac 24 Plus vakuový systém (QIAvac 24 Plus, kat. č. 19413, QIAvac
Connecting System, kat. č. 19419, a vakuová pumpa Vacuum Pump,
kat. č. 84020), nebo ekvivalentní standardní laboratorní vakuový systém
†
* Pro zajištění správného zpracování vzorků při provádění metody QIAamp DSP Virus doporučujeme použití
nástrojů (tj. pipet a zahřívacích bloků) kalibrovaných podle doporučení výrobce.
†
Uvedený výčet není úplný a nezahrnuje řadu důležitých materiálů a pomůcek používaných v biologické
laboratoři.
†
v prodeji od druhého pololetí roku 2004. Více informací na www.qiagen.com/products/accessories
14
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 15
DÛleÏité poznámky
DÛleÏité body pfied zahájením
■
Po obdržení soupravy zkontrolujte, zda nejsou její komponenty poškozeny. V případě poškození blistrového obalu kontaktujte oddělení technických služeb QIAGEN Technical Services nebo místního distributora. V případě rozlití postupujte
podle “bezpečnostních pokynů” (strana 7). Nepoužívejte poškozené komponenty
soupravy, použití poškozených komponent by mohlo negativně ovlivnit účinnost
soupravy.
■
Používejte vždy vybavení a materiály bez RNázy.
■
Během pracovního postupu uchovávejte ethanol (96–100%) na ledu.
■
Před každým přenosem kapalných materiálů vyměňte pipetovací špičku. Pro
zamezení křížové kontaminace doporučujeme použít pipetovací špičky
s aerosolovou bariérou.
■
Všechny kroky centrifugace se provádějí při laboratorní teplotě (15–25 °C).
■
Používejte vždy rukavice na jedno použití a pravidelně kontrolujte, zde nedošlo
k jejich kontaminaci testovaným vzorkem.
■
Vyhoďte rukavice do odpadu v případě jejich kontaminace a minimálně před
každým krokem označeným symbolem rukavic.
■
Pro zamezení křížové kontaminace neotevírejte více zkumavek současně.
■
Při práci se soupravou nepoužívejte komponenty jiných souprav, pokud nemají stejné číslo šarže.
■
Zamezte mikrobiální kontaminaci reagencií soupravy.
■
Pro zajištění ochrany před potenciálně infekčními materiály doporučujeme pracovat za podmínek laminárního proudění až do lyze vzorků.
■
Tuto soupravu smí používat pouze personál školený v in vitro laboratorních
metodách.
■
Metoda obsahuje pokyny pro zpracování jednoho vzorku plazmy nebo séra.
Pomocí vakuového systému QIAvac 24 Plus je však možné zpracovávat až 24
vzorků současně.
Pfiíprava RNA
Při přípravě virové RNA pracujte rychle během všech manuálních kroků dané metody.
Eluční pufr (AVE) obsahuje azid sodný *, antimikrobiální prostředek, který brání růstu
organismů produkujících RNázu. Protože však tento pufr neobsahuje žádné chemikálie
degradující RNázu, není schopen aktivně inhibovat RNázy zanesené nesprávným
zacházením. Při manipulaci s elučním pufrem (AVE) je nutné vynaložit maximální úsilí
k zamezení kontaminace RNázami.
* Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné
brýle.
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
15
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 16
Uchovávání vzorkÛ
Po odběru a centrifugaci je možné uchovávat plazmu a sérum nejvýše 6 hodin při
teplotě 2-8 °C. Pro dlouhodobé skladování se doporučuje zamražení v alikvotech při
–20 °C nebo –80 °C. Zmražené vzorky plazmy nebo séra nesmí být rozmraženy více
než jednou. Opakované zmrazení a rozmražení vede k denaturaci a precipitaci proteinů a k následnému snížení virových titrů a tím i výtěžku virových nukleových kyselin.
Kryoprecipitáty vytvořené během zmrazování a rozmrazování navíc ucpávají membránu kolonky QIAamp MinElute. Pokud jsou patrné kryoprecipitáty, musí být odděleny centrifugací při 6800 x g po dobu 3 minut. Pročištěný supernatant je nutné ihned
odsát a zpracovat bez porušení peletu.
Pfiíprava reagencií a pufrÛ
Pfiíprava QIAGEN proteázy
Přidejte celý obsah lahvičky obsahující 4,4 ml roztoku pro ředění proteáz (PS) do
lahvičky s lyofilizovanou QIAGEN proteázou (QP) a pečlivě promíchejte. Je nutné
zamezit tvorbě pěny, proto míchejte několikanásobným převrácením lahvičky. Ujistěte
se, že je QIAGEN proteáza (QP) zcela rozpuštěná.
i
Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL)
Pfiidání nosiãové RNA a interní kontroly do lyzaãního pufru
Nosičová RNA slouží dvěma cílům. Za prvé: zvyšuje vázání virových nukleových kyselin
na membránu kolonky QIAamp MinElute, zvláště pokud vzorek obsahuje malé množství
cílových molekul. Za druhé: přidání velkých množství nosičové RNA snižuje možnost
degradace virové RNA ve vzácných případech, kdy RNázové molekuly nejsou denaturovány chaotropními solemi a detergenty v lyzačním pufru (AL). Nepřidání nosičové
RNA do lyzačního pufru (AL) může vést ke snížení výtěžku virové RNA nebo DNA.
Nosičová RNA může být také přítomna v některých reagenciích pro interní kontrolu
komerčních diagnostických testů. V těchto případech se prosím podívejte na odpovídající návod k použití od výrobce diagnostického testu.
Použití interní kontroly se doporučuje, pokud se souprava QIAamp DSP Virus Kit
používá v kombinaci s diagnostickými amplifikačními systémy. Interní kontrola RNA
nebo DNA a rozpuštěná nosičová RNA musí být přidány k lyzačnímu pufru (AL) a důkladně promíchány desetinásobným převrácením zkumavky. Nemíchejte na vortexu;
zamezíte tím tvorbě pěny.
Pro určení optimální koncentrace interní kontroly se řiďte pokyny výrobce. Použití jiné
než doporučené koncentrace může vést k nesprávným výsledkům. Při výpočtu
správného množství používané interní kontroly vezměte v úvahu počáteční množství
vzorku a eluční objem. Mějte na paměti, že souprava QIAamp DSP Virus Kit používá
startovací vzorek o velikosti 500 µl.
16
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 17
Pro přípravu roztoku nosičové RNA přidejte 310 µl elučního pufru (AVE) do zkumavky,
která obsahuje 310 µg lyofilizovaného nosiče RNA, získáte tak roztok o koncentaraci
1 µg/µl. Nosič RNA důkladně rozpusťte, rozdělte jej do vhodných alikvotů a uchovávejte při –20°C. Nerozmrazujte alikvoty nosičové RNA více než dvakrát.
Nosičové RNA se nerozpouští v lyzačním pufru (AL). Musí být nejdříve rozpuštěna
v elučním pufru (AVE) a poté přidána k lyzačnímu pufru (AL). Ujistěte se, že je nosičová
RNA úplně rozpuštěna ve správném množství elučního pufru (AVE) dříve, než ji
smícháte s lyzačním pufrem (AL).
i
Pro následné testy vždy používejte správnou interní kontrolu. Další informace jsou
uvedeny v pokynech výrobce.
Vypočítejte objem směsi lyzačního pufru (AL)/nosičové RNA potřebný pro danou
šarži vzorků tak, že z tabulky 4 (strana 18) zvolíte počet vzorků, které mají být
simultánně zpracovány. Objemy jsou kalkulovány podle následujích vzorců:
n x 0,55 ml = y ml
y ml x 11,2 µl/ml = z µl
kde: n = počet vzorků, které mají být simultánně zpracovány
y = vypočítaný objem lyzačního pufru (AL)
z = objem nosičové RNA/elučního pufru (AVE), který má být přidán
k lyzačnímu pufru (AL)
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
17
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 18
Tabulka 4. Objemy lyzaãního pufru (AL) a nosiãové RNA/eluãního pufru (AVE), které
jsou zapotfiebí pro metodu QIAamp DSP Virus
âíslo
vzorkÛ
Objem AL
(ml)
Objem nosiãové
RNA/AVE (µl)
âíslo
vzorku
Objem AL Objem nosiãové
(ml)
RNA/AVE (µl)
1
0.55
6.2
13
7.15
80.0
2
1.10
12.3
14
7.70
86.0
3
1.65
18.5
15
8.25
92.4
4
2.20
24.6
16
8.80
98.6
5
2.75
30.8
17
9.35
104.7
6
3.30
37.0
18
9.90
110.9
7
3.85
43.1
19
10.45
117.0
8
4.40
49.3
20
11.00
123.2
9
4.95
55.0
21
11.55
129.4
10
5.50
61.6
22
12.10
135.5
11
6.05
67.8
23
12.65
141.7
12
6.60
73.9
24
13.20
147.8
Pfiíprava prom˘vacího pufru 1
Pomocí odměrného válce přidejte 25 ml ethanolu (96–100%) do lahve obsahující
19 ml koncentrátu promývacího pufru 1 (AW1). Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1)
uchovávejte při laboratorní teplotě (15–25 °C).
i
Před zahájením procedury vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1)
několikanásobným převrácením lahve.
Pfiíprava prom˘vacího pufru 2
Pomocí odměrného válce přidejte 30 ml ethanolu (96–100%) do lahve obsahující
13 ml koncentrátu promývacího pufru 2 (AW2). Rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2)
uchovávejte při laboratorní teplotě (15–25 °C).
i
Před zahájením procedury vždy promíchejte rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2)
několikanásobným převrácením lahve.
Pfiíprava eluãního pufru
Souprava obsahuje čtyři zkumavky elučního pufru (AVE). Dbejte na to, aby nedošlo ke
kontaminaci pufru RNázami. Při provádění 4 (nebo menšího počtu) purifikačních procedur pomocí jedné soupravy doporučujeme vyhodit zkumavku s elučním pufrem (AVE)
do odpadu na konci každé procedury.
18
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 19
Eluce virov˘ch nukleov˘ch kyselin
Pro následné aplikace, které vyžadují malé startovací objemy (např. některá vyšetření
PCR a RT-PCR), může být zvýšena citlivost testu použitím virových nukleových kyselin
eluovaných v 20 µl elučního pufru (AVE).
Objem virových nukleových kyselin eluovaných z kolonky QIAamp MinElute může být
až o 5 µl nižší než objem elučního pufru (AVE) naneseného na kolonku. Například
vymývání nukleových kyselin pomocí 60 µl elučního pufru (AVE) vede k eluci přibližně
55 µl, zatímco eluování pomocí 20 µl dává přibližně 15 µl eluátu. Objem získaného
eluátu závisí na povaze vzorku. Je-li objem získaného eluátu příliš nízký pro následný
test, zvyšte jeho objem přidáním elučního pufru (AVE).
Eluované virové nukelové kyseliny se jímají do elučních zkumavek (ET). Pro uchovávání
virových nukleových kyselin po dobu do 24 hodin doporučujeme teplotu skladování
2–8 °C.
V˘tûÏek a kvalita virov˘ch nukleov˘ch kyselin
Výnosem a kvalitou jsou izolované nukleové kyseliny vhodné pro všechny typy
následných detekčních metod používaných v molekulární diagnostice. Diagnostické
testy musí být prováděny podle pokynů výrobce.
Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus
Dbejte na správné nastavení nástavce Column Extender (EXT), kolonky QIAamp MinElute, vakuového konektoru (VacConnector VC) a vakuového ventilku (VacValve)
(viz Obr. 3).
4
3
2
1
Obrázek 3 Sestavení komponent soupravy QIAamp DSP Virus Kit pro vakuové zpracování vzorků:
1: Vakuový ventilek (VacValve) (dodává se s vakuovým systémem)
2: Vakuový konektor (VacConnector VC)
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
3: Kolonka QIAamp MinElute
4: Nástavec kolonky (Column Extender EXT)
19
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 20
Doporučujeme označit lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp
MinElute k použití ve vakuovém systému QIAvac 24 Plus podle schématu na obrázku
4, tímto značením se zamezí záměně vzorků. Obrázek je možné oxeroxovat a označit
názvy vzorků.
20
01
02
03
04
05
06
13
14
15
16
17
18
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 21
Datum:
UÏivatel:
Pracovní ID ãíslo:
07
08
09
10
11
12
19
20
21
22
23
24
Obrázek 4 Schéma značení pro lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolonky QIAamp MinElute
Columns pro použití ve vakuovém systému QIAvac 24 Plus.
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
21
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 22
Protokol
Protokol: Izolace a purifikace virov˘ch nukleov˘ch
kyselin z plazmy a séra
Pro izolaci a purifikaci virových nukleových kyselin z 500 µl plazmy nebo séra
ošetřeného EDTA nebo citratem.
Co je nutné provést pfied zahájením
■
Vytemperujte vzorky na laboratorní teplotu (15–25 °C) a důkladně je promíchejte.
■
Přidejte nosičovou RNA rozpuštěnou v elučním pufru (AVE) nebo interní kontrolu
do lyzačního pufru (AL) podle pokynů na straně 16.
■
Promývací roztok 1 (AW1), Promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP)
musí být připraveny podle pokynů v “důležitých poznámkách” na straně 15.
■
Vytemperujte eluční pufr (AVE) na laboratorní teplotu (15–25 °C) pro použití v
kroku 18. Pokud to bude možné, použijte čerstvý eluční pufr (AVE) pro každou
proceduru (4 zkumavky jsou součástí soupravy).
■
Nastavte zahřívací blok na teplotu 56 °C pro použití v kroku 4 a 17.
■
Pro zamezení křížové kontaminace vložte vakuový konektor (VacConnector VC)
do každého luer adaptéru vakuového systému.
■
Zkontrolujte, zda je prázdná nádoba na odpadní materiály a zda jsou všechny
spoje řádně propojeny.
■
Podrobné informace o provozu vakuového systému, zejména informace o údržbě,
jsou uvedeny v příručce přiložené k tomuto systému.
Postup
1.
Pomocí pipety naneste 75 µl proteázy QIAGEN (QP) do lyzaãní zkumavky (LT).
i
Před použitím zkontrolujte datum exspirace rozpuštěné proteázy.
2.
Pfiidejte 500 µl plazmy nebo séra do lyzaãní zkumavky (LT).
3.
Pfiidejte 500 µl lyzaãního pufru (AL) (obsahuje 11,2 µg/ml nosiãové RNA) do lyzaãní zkumavky (LT), uzavfiete víãko a míchejte po dobu 15 s na pulsním vortexu.
Pro zajištění účinné lyze je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr
(AL) do homogenního roztoku.
4.
22
i
Lyzační pufr (AL) obsahuje interní kontrolu. Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL)
pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety, například vícekrokové
pipety Eppendorf nebo ekvivalentního zařízení.
i
Nepřidávejte QIAGEN proteázu (QP) přímo do lyzačního pufru (AL)
Inkubujte 15 min (±1 min) pfii 56°C (±1°C).
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
5.
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 23
Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální
rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka.
6.
VymûÀte si rukavice a opatrnû otevfiete lyzaãní zkumavku (LT).
Pfiidejte do lyzaãní zkumavky (LT) 600 µl ethanolu (96–100%), zavfiete víãko a
promíchejte dÛkladnû na pulsním vortexu po dobu minimálnû 15 sekund. Inkubujte po dobu 5 min (±1 min) pfii laboratorní teplotû (15–25 °C).
8.
Centrifugujte lyzaãní zkumavku (LT) po dobu minimálnû 5 sekund pfii maximální
rychlosti, tímto krokem se odstraní kapky z vnitfiní strany víãka.
9.
VloÏte kolonku QIAamp MinElute do vakuového konektoru (VacConnector VC)
vakuového systému (viz Obrázek 3, strana 19). VloÏte nástavec kolonky (Column
Extender EXT) do otevfiené kolonky QIAamp MinElute.
i Ponechte si promývací zkumavku (WT) pro centrifugaci k vysušení kolonky
v kroku 16.
10.
VymûÀte si rukavice; otevírejte vÏdy pouze jednu zkumavku.
11. Opatrnû naneste ve‰ker˘ lyzát z kroku 7 na nástavec (EXT) kolonky QIAamp MinElute, dbejte na to, aby nedo‰lo ke zvlhãení okraje. Nedot˘kejte se membrány
kolonky QIAamp MinElute pipetovací ‰piãkou.
12. Zapnûte vakuovou pumpu. Po prÛchodu lyzátu pfies kolonku QIAamp MinElute
otevfiete ventilek vakuového systému a uvolnûte podtlak.
Při souběžném zpracování několika kolonek QIAamp MinElute doporučujeme po
průchodu lyzátu uzavřít vakuový ventilek (VacValve) každé kolonky, tímto postupem se sníží doba potřebná k uskutečnění tohoto kroku.
i
Pokud veškerý lyzát neprojde membránou do 15 minut, vyhoďte kolonku
QIAamp MinElute Column do odpadu a zopakujte celý postup s použitím
nového vzorku.
i
Pro rychlé uvolnění podtlaku se má používat ventilek vakuového systému.
13. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 600 µl prom˘vacího pufru 1 (AW1) . Opatrnû sejmûte nástavec Column Extender (EXT) a vyhoìte jej do odpadu, zavfiete
ventilek vakuového systému. Po prÛtoku prom˘vacího pufru 1 (AW1) pfies kolonku
QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak.
i
Pro zamezení křížové kontaminace dbejte na to, abyste při odstraňování nástavců (EXT) nemanipulovali s nástavci nad sousedními kolonkami QIAamp
MinElute.
14. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 750 µl prom˘vacího pufru 2 (AW2), aniÏ
by do‰lo k navlhãení okraje kolonky. Nedot˘kejte se membrány kolonky QIAamp
MinElute pipetovací ‰piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek
vakuového systému. Po prÛtoku prom˘vacího pufru 2 (AW2) pfies kolonku
QIAamp MinElute otevfiete ventilek a uvolnûte podtlak.
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
23
Protokol
7.
Protokol
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 24
15. Naneste na kolonku QIAamp MinElute 750 µl ethanolu (96–100%), aniÏ by do‰lo
k navlhãení okraje kolonky. Nedot˘kejte se membrány kolonky QIAamp MinElute
pipetovací ‰piãkou. Nechte víãko kolonky otevfiené a uzavfiete ventilek vakuového
systému. Po prÛtoku ethanolu pfies kolonku QIAamp MinElute otevfiete ventilek
a uvolnûte podtlak.
i
K aplikaci ethanolu na kolonku QIAamp MinElute
s aerosolovou bariérou.
použijte špičky
16. Uzavfiete víãko kolonky QIAamp MinElute, odstraÀte kolonku z vakuového systému a vyhoìte vakuov˘ konektor (VacConnector VC) do odpadu. VloÏte kolonku
QIAamp MinElute Column do prom˘vací zkumavky (WT) uschované z kroku
9 a centrifugujte pfii maximální rychlosti (pfiibliÏnû 20 000 x g, nebo 14 000 rpm)
po dobu 1 minuty, pfii centrifugaci dojde k úplnému vysu‰ení mambrány. Vyhoìte
prom˘vací zkumaku (WT) obsahující filtrát do odpadu.
i
Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolonky, může vést
k inhibici následného testu.
17. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do nové prom˘vací zkumavky (WT) a inkubujte
ji s otevfien˘m víãkem pfii 56 °C po dobu 3 minut, bûhem této doby dojde k evaporaci ve‰keré zb˘vající tekutiny.
18. VloÏte kolonku QIAamp MinElute do ãisté eluãní zkumavky (ET) a vyhoìte prom˘vací zkumavku (WT) do odpadu. Opatrnû otevfiete víãko kolonky QIAamp MinElute
a naneste 20 µl nebo 60 µl eluãního pufru (AVE) (v závislosti na daném následném
testu) na stfied membrány. Zavfiete víãko a inkubujte pfii laboratorní teplotû
(15–25 °C) po dobu 3 minut (± 30 s). Centrifugujte pfii maximální rychlosti
(pfiibliÏnû 20 000 x g, nebo 14 000 rpm) po dobu 1 minuty, bûhem centrifugace
dojde k eluci virov˘ch nukleov˘ch kyselin.
i Po provedení tohoto protokolu proveďte údržbu vakuového systému (bližší
informace: viz příručka dodávaná s vakuovým systémem).
24
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 25
Poznámky
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
25
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 26
Poznámky
26
Příručka QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 27
Poznámky
Příručka QIAamp DSP Virus Kit
11/2007
27
1050717_CS
16.04.2008
8:58 Uhr
Seite 28
www.qiagen.com
Australia ■ Orders 03-9840-9800 ■ Fax 03-9840-9888 ■ Technical 1-800-243-066
Austria ■ Orders 0800/28-10-10 ■ Fax 0800/28-10-19 ■ Technical 0800/28-10-11
Belgium ■ Orders 0800-79612 ■ Fax 0800-79611 ■ Technical 0800-79556
Canada ■ Orders 800-572-9613 ■ Fax 800-713-5951 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)
China ■ Orders 021-51345678 ■ Fax 021-51342500 ■ Technical 021-51345678
Denmark ■ Orders 80-885945 ■ Fax 80-885944 ■ Technical 80-885942
Finland ■ Orders 0800-914416 ■ Fax 0800-914415 ■ Technical 0800-914413
France ■ Orders 01-60-920-926 ■ Fax 01-60-920-925 ■ Technical 01-60-920-930 ■ Offers 01-60-920-928
Germany ■ Orders 02103-29-12000 ■ Fax 02103-29-22000 ■ Technical 02103-29-12400
Hong Kong ■ Orders 800 933 965 ■ Fax 800 930 439 ■ Technical 800 930 425
Ireland ■ Orders 1800-555-049 ■ Fax 1800-555-048 ■ Technical 1800-555-061
Italy ■ Orders 02-33430411 ■ Fax 02-33430426 ■ Technical 800-787980
Japan ■ Telephone 03-5547-0811 ■ Fax 03-5547-0818 ■ Technical 03-5547-0811
Korea (South) ■ Orders 1544 7145 ■ Fax 1544 7146 ■ Technical 1544 7145
Luxembourg ■ Orders 8002-2076 ■ Fax 8002-2073 ■ Technical 8002-2067
The Netherlands ■ Orders 0800-0229592 ■ Fax 0800-0229593 ■ Technical 0800-0229602
Norway ■ Orders 800-18859 ■ Fax 800-18817 ■ Technical 800-18712
Singapore ■ Orders 65-67775366 ■ Fax 65-67785177 ■ Technical 65-67775366
Sweden ■ Orders 020-790282 ■ Fax 020-790582 ■ Technical 020-798328
Switzerland ■ Orders 055-254-22-11 ■ Fax 055-254-22-13 ■ Technical 055-254-22-12
UK ■ Orders 01293-422-911 ■ Fax 01293-422-922 ■ Technical 01293-422-999
USA ■ Orders 800-426-8157 ■ Fax 800-718-2056 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)
1050717CS 11/2007
Sample & Assay Technologies