Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA - MolOch

„Propojení výuky oborů Molekulární a
buněčné biologie a Ochrany a tvorby
životního prostředí “
Reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0032
Odběr a uchovávání vzorků
pro extrakci DNA
Miloslav Kitner
Katedra botaniky PřF UP
Jaký máme vzorek/biologický objekt?
•
•
•
•
•
•
Bakteriální kultura
Rostlinný materiál
Krev
Živočišná tkáň
Fosilní materiál
Forenzní materiál
• Volba vhodné odběrové a extrakční metody…
Bukální stěry
Sady pro odběry vzorků
DNA Collection Cards: The Fitzco Card
Krev
- Uchování ve speciální roztoku
- Queen´s buffer (4°C)
- 10 ml 1M TRIS (pH 8,8)
- 2 ml 5M NaCl
- 2,92 g EDTA
- 10 g N-lauroylsarkosin
- 900 ml vody  pH 7,5  1l
- EDTA – antikoagulant, blokuje DNázy
www.sciencedirect.com
Kožní deriváty
Odběr u mořských živočichů
Odběry vzorků ze živočišných tkání
Uchovávání: malé kousky tkání
- -80°C
- Ethanol (100%, 70%)
- Nasycený roztok soli s DMSO
http://www.flmnh.ufl.edu/grr/tour_birds.htm
-20% dimethyl sulfoxyde,
- 0.25M EDTA,
- saturatedCanadian
with NaCl,
Journal of Zoology, 1991, Vol. 69:
-pH 8.0.
82-90
Fosilní materiál
- speciální metodiky extrakce DNA
- úspěšnost závisí na stupni degradace DNA
- DNA pro určité typy markerů (sekvenace, SSR)
Forenzní materiál
Ukázkový postup odběru a uchování vzorku
pro extrakci DNA
Uchování vzorků z živočišných tkání
Popsané nádobky, Eppendorfky, sáčky
Sáčky: Vzorky bez nutnosti konzervace
• chlupy, šupiny, kosti apod.
Nádobky: - Tělní tekutiny, kusy tkání, celé organismy
• Ethanol
• Queen´s pufr
- DMSO-NaCl
DNA of beetles stored in ethanol will be degraded in six weeks (Reiss et al., 1995), hymenopterans kept in ethanol for
twenty four months still provides DNA in good condition (Dillon et al., 1996).
aDNA – ancient DNA
• Po smrti – autodegradace DNA - štěpení DNA autokatalytickými enzymy –
pokud je ve tkáni nedostatek vody – aktivita je snížena
rt.com
• Obecně platí, že aDNA je značně fragmentovaná (několik stovek bp)
• Záleží na prostředí, ve kterém se ostatky nacházejí
• Zmrazení – permafrost, ledovce (mamut, Ötzi – desetitisíce let)
• Vysušení – mumifikace (stáří tisíce let – egyptské mumie)
• Zalití do media – hmyz v jantaru (miliony let)
• sedaDNA – „sedimentary“ ancient DNA
•
www.livescience.com
www.businessinsider.com
aDNA vyextrahovaná z permanentně zmrzlých sedimentů, které jsou přesně odatovány (podle zastoupení
izotopů uhlíku v sedimentu)
•
Pokud je daná studie podložena správně datovaným paleolimnologickým záznamem, pak může zpřesnit stávající informace o
výskytu dnes vymřelých organismů
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Ideální případ:
- použít čerstvý materiál a hned zpracovat
- odebrat apikální části mladých listů a ihned provést izolaci
- napěstováním z osiva na jaře
- odběrem přímo z experimentální plochy, skleníku, lokality...
Odběr:
- vzorky odstřihnout (očištěné nůžky ethanolem)
- přenést do PE sáčku, alobalu, papírového sáčku – záleží na odebíraném druhu
- popsat
- do chladícído boxu
- doprava do laboratoře
- vyextrahovat DNA
- popř. ošetřit tekutým dusíkem a přenést do -80°C pro dlouhodobé uchovávání
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Když nejsou listy…..specifické metodiky
- pylová zrna, somatická embrya, dormantní pupeny
- kořeny, kořenové vlášení
- kukuřičné klasy
- suché dřevo (extrém)
- sukulenty - problematické, velké množství polysacharidů
- odstranění polysacharidů v sorbitolovém pufru (váže a vysráží polysacharidy)
- homogenizace v tekutém dusíku, pak přídavek sorbitolového pufru
- centrifugace – znovu přídavek sorbitolu – centrifugace….
- opakovat tak dlouho, doku je roztok po centrifugaci viskózní
- převést na explantátovou kulturu,
- použít korunní plátky květů
- zamrazit než sušit
- semena - výhody: „může mi to vyrůst čerstvé“
• méně inhibitorů PCR (např. polyfenolů)
• část endospermu většinou poskytne dostatek DNA
• výhoda oproti listům – skladovatelnost a doprava
• nedestruktivní metoda
• nevýhoda u některých metod (AFLP) změny
výsledných profilů při srovnání výsledků semena-listy
• methylace restrikčních míst
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Problém nastává pokud víme, že vzorek nebude zpracován okamžitě
- vzdálená lokalita
- sběr materiálu v průběhu několika veget. sezón
Nutnost úpravy vzorku pro dlouhodobého uchovávání (dny – měsíce – roky)
a) chlazení, mražení, lyofilizace
b) chemická konzervace
• v roztoku CTAB+NaCl
• v ethanolu
d) Rychlé vysušení v silikagelu nebo jiném desikantu
e) Herbarizace
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Ad a) chlazení, mražení, lyofilizace
- Nejčastěji – odebrat vzorek a přenést do chladícího boxu s ledem nebo chladícími
bloky
- dlouhodobé uchovávání vyžaduje
- ošetření tekutým dusíkem a přenesení do – 80°C (hlubokomrazící box)
- takto připravené vzorky (nebo čerstvý materiál) poskytuje vyšší výtěžky a kvalitnější
(intaktní) DNA
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
- U některých druhů je z důvodu velkého obsahu sekundárních metabolitů
rychlé zmražení podmínkou úspěšné extrakce DNA
- Materiál:
- Strobilanthes cusia
- čel. Paznehtníkovité (Acanthaceae), řád hluchavkotvaré (Lamiales).
- výroba tradičního barviva indigová modř
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Ad a) chlazení, mražení, lyofilizace
- Lyofilizace = vakuové vymrazování
- metoda založená na sublimaci zmrzlé vody při nízkém tlaku a teplotě
- 1. fáze: zmrazení vzorku – udržování při teplotě pod bodem tání (-50°C až -100°C)
- 2. fáze: první sušení – v přístroji se sníží tlak a následně se dodá do systému teplo
- dojde k sublimaci vody (přímo přechází z pevného do plynného skupenství)
- až 95 % obsažené vody
- pomalý proces – několik hodin až dnů
- 3. fáze: druhé sušení – v případech, kdy je potřeba ještě více snížit obsah vody
- další snížení tlaku, teplota kolem 0°C
- odstraní se i voda adsorbovaná na povrchu částic
www.merci.cz
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Ad b) chemické ošetření
• roztok CTAB+NaCl
• kousky listů v nasyceném viskózním roztoku CTAB-NaCl
• 2,5% CTAB v nasyceném roztoku NaCl
• homogenizace materiálu a další kroky „CTAB protokolu“
• doporučováno pro vzorky sukulentů a další xerofytů obtížně vysušitelných
v silikagelu
• v ethanolu (95% - 100%)
• denaturuje proteiny (histony) a vytváří nerozpustné komplexy DNA
• v protokolu je často použita proteináza (porušení a uvolnění DNA z
komplexů DNA-protein)
https://subulatepalpomere.wordpress.com
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Ad d) Vysušení v silikagelu nebo jiném desikantu
• Ideální odebrat do sáčků pro přípravu čaje a přenést do nádoby s
vysušeným silikagelem, popř:
• listy v PE zipových sáčcích s nasypaným silikagelem (listy se mohou
drolit)
• listy zabaleny do alobalu a uchovávány ve větším PE sáčku se
silikagelem.
• Výhody – snadnější následná manipulace
• vysušené vzorky není třeba před extrakcí ošetřit tekutým dusíkem
• V přítomnosti desikantu lze skladovat roky při pokojové teplotě
Ukázkový příklad odběru a uchovávání rostlinných vzorků
• 1-2 listy do papírové obálky (např. sáček na přípravu čaje) s
popisem:
–
–
–
–
Taxon
Označení/Číslo vzorku
Popis lokality (GPS, lokalita, typ společenstva)
Kdo vzorek odebral
• Obálku se vzorkem do plast. sáčku nebo nádoby se silikagelem
• Chránit před přímým slunečním světlem
• Ideálně – odebrat a uchovat (archivovat) i herbářovou položku
http://botany.si.edu/projects/dnabarcode/sample.htm
Odběr a uchovávání rostlinných pletiv pro izolaci DNA
Ad e) Herbarizace
- taxonomicky založené studie
- správné značení položky – název, odběrové místo, …..
- správně vysušit (pozvolna)
- duplikát – většina zemí preferuje uchování jedné z položek v
národním nebo specializovaném herbariu
Někdy to ale nefunguje

degradovaná DNA

DNA!
Příklad zpracování vzorků po doručení
do laboratoře
PCHP Rameno u Stříbrného rybníka
Autor: L. Adamec
Příklad zpracování vzorků po doručení
do laboratoře
DNA - extrakce a kvantifikace
– princip, kroky, protokoly
Složení buňky
Složení eukaryotní i prokaryotní buňky je
velice obdobné
Molekulární biologie využívá řady postupů umožňujících získání nepoškozených
makromolekul nebo membránových buněčných struktur – například organel.
Izolace DNA
• První krok většiny analýz NK
• Odstranění inhibitorů, které blokují činnost enzymů v
následných analýzách
• Volba metody extrakce NK závisí na:
• Typu molekuly, kterou chceme extrahovat (genomová=genomická
DNA, plazmidová DNA, fragment DNA z agarózového gelu, RNA)
• Typu buněk z nichž má být NK izolována
• Požadované čistotě NK
• Požadovaném množství NK
• Často je výhodnější zisk DNA ve vyšší kvalitě na úkor
výtěžku izolace
Izolace DNA
Kdy se DNA neizoluje:
1. Zničený nebo kontaminovaný vzorek
– nevím co analyzuji – zapomenout na extrakci DNA
2. Máme málo vstupního materiálu pro extrakci
Pro PCR použít přímo zkoumaný objekt (specifické primery)
•
Př. Studovaný organismus se nedá kultivovat
•
•
např. sinice Konvophoron – single cell PCR
Př. herbarizované položky rostlinných patogenů
•
Pseudoperonospora – spory do Epp a přidat PCRmix
Výsledek PCR amplifikace bez extrakce DNA – spory P.
cubensis odebrané z povrchu z infikovaných listů
• ITS
• COX
Problémy s extrakcí DNA
DNA patogena
Získat nekontaminovanou DNA patogena je u obligátních biotrofů problém
•
Nemožnost kultivace patogena na médiu
•
Seškrabávání mycelia
•
Odběr spor
•
•
oplach spor pipetováním vodou, podtlakové systémy odsávající spory…
Izolovaná DNA obsahuje i DNA hostitelské rostliny
•
Některé metody jsou obtížně použitelné – zejména pokud používají
nespecifické primery (AFLP, RAPD….)
•
Jak odstranit:
•
kultivace na stejném genotypu hostitelské rostliny
•
zařadit kontrolní vzorky s DNA hostitele
•
nehodnotit PCR produkty odpovídající hostitelské DNA
Metody izolace DNA
Metody využívající rozdíly v rozpustnosti DNA v různých roztocích
• Obecně rozšířené, široce aplikované postupy
• Metody vhodné pro vysokomolekulární genomické NK
• extrakce fenolem, CTAB metoda – viz dál
Metody adsorpční
• DNA se váže na křemičité částice v přítomnosti chaotropní látky
• Rychlá purifikace plazmidů
• Zisk malých fragmentů DNA s vysoký výtěžkem
• Zisk vysokomolekulární DNA s nižším výtěžkem
• Podstata komerčních kitů $ $ $ € € €
•
Metody založené na magnetických částicích
• Modifikovaný povrch částic s vysokou afinitou pro NK
• Imobilizace částic pomocí magnetu, centrifugace, eluce vhodným
roztokem
• $$$€€€$
Další metody:
• Centrifugace v hustotním gradientu
Izolace DNA – obecný postup
1.
2.
3.
4.
Homogenizace materiálu
Inkubace s lyzačním roztokem
Odstranění polysacharidů, proteinů, fosfolipidů
Zisk přečištěné DNA
Izolace DNA – homogenizace materiálu
1) Porcelánová miska, tlouček,
- přídavek mořského písku, tekutý dusík
Izolace DNA – homogenizace materiálu
2) Homogenizace v Eppendorfkách.
Izolace DNA – homogenizace materiálu
3) Homogenizační mlýny
FastPrep
www.mpbio.com
Mixer Mill
www.retsch.com
Izolace DNA – metoda CTAB - postup
1) homogenizace materiálu
2) Inkubace s extrakčním roztokem CTAB při teplotě 65°-68°C
-
detergent: poruší membrány, denaturuje proteiny a uvolňuje proteiny z DNA,
odstraňuje fosfolipidy
pufr: udržuje optimální pH (8-9)
soli: uvolňují proteiny (histony) z DNA, udržují polysacharidy v rozpustné formě,
vysolují PCR inhibitory
redukční činidla (merkaptoethanol) - blokují oxidační procesy vedoucí k destrukci DNA
Chelatační činidla (EDTA) - blokují dvojmocné ionty kovů = blokace Dnáz
- další složky (PVP – odstraňuje polyfenoly)
Po centrifugaci:
3) Přídavek roztoku chloroform-isoamylalkohol
•
Vysrážení proteinů a polysacharidů proteiny, rozpouští tuky, odděluje fáze
4) Inkubace 5minut, centrifugace
Supernatant: vodná fáze s extrahovanou DNA –
odpipetujeme a dále s ní pracujeme
pás vysrážených proteinů a
polysacharidů- ODPAD
Organická fáze - ODPAD
CTAB - CetylTrimetylAmoniumBromid)
Izolace DNA – metoda CTAB - postup
Po centrifugaci:
1) homogenizace ;materiálu
2) Inkubace s extrakčním roztokem CTAB při teplotě 65°-68°C
rozrušení buněčných stěn
3) Přídavek roztoku chloroform-isoamylalkohol
•
Vysrážení proteinů a polysacharidů proteiny, rozpouští tuky, odděluje fáze)
4) Inkubace 5minut, centrifugace
5) Přenesení vodné fáze do nové Eppendorfky
DNA
6) vysrážení nukleových kyselin (NK) etanolem nebo izopropanolem
• Min. 30 minut -20°C, nejlépe přes noc
7) izolace precipitátu NK centrifugací, vysušení NK
8) rozpustění získaného odparku ve vhodném roztoku
9) Uchování DNA
- chladnička 4°C – pro okamžité použití
- hlubokomrazící box -80°C pro dlouhodobé uchovávání
Izolace DNA – (silikát) komerční kity
DNA v přítomnosti tzv. chaotropních solí (jodid sodný nebo ionty guanidinu)
adheruje na silikátový povrch.
1. Homogenizace
2. Inkubace s lyzačním roztokem
3. Vazba DNA na kolonku
potaženou DNA-vazebným
povrchem (silikátová
membrána)
4. následným promýváním DNA
uchycené na kolonce
5. vymytí DNA z kolonky vhodným
rozpouštědlem (voda)
Izolace DNA – adsorpce na silikát
• DNA
v přítomnosti tzv. chaotropních solí (jodid sodný nebo ionty guanidinu) adheruje na
silikátový povrch (sklo).
• K roztoku, obsahujícímu zlyzovaný buněčný obsah, se přidává chaotropní sůl a
suspenze silikátových částic
• Protřepáváním směsi se usnadňuje vazba DNA na částice.
• Ostatní sloučeniny zůstávají v roztoku a lze je pak elegantně odstranit – částice
necháme usadit nebo centrifugujeme
• Odsajeme roztok nad částicemi a propláchneme novou dávkou pufru s chaotropními
solemi.
• Přečištěnou DNA na povrchu částic lze snadno uvolnit přidáním vody nebo vhodného
pufru, který neobsahuje chaotropní soli.
• Po odstředění zůstanou na dně jen samotné částice, nad nimi je čistý roztok DNA.
Výhodou metody založené na adsorpci na silikát je rychlost a pohodlnost, proto jsou na
ní založeny komerční soupravy (kity) pro rutinní extrakce DNA.
Izolace DNA – př. izolační kity Invitek
Typ vzorku
Doporučený Kit
Invisorb Spin Micro DNA Kit
Invisorb Spin Blood Mini Kit
Krev, „buffy coat“ – frakce leukocytů a Invisorb Spin Blood Midi Kit
trombocytů po ultracentrifugaci
Invisorb Spin Blood Maxi Kit
Invisorb Blood Giga Kit
Invisorb Blood Universal Kit
Objem vzorku
Výtěžek
1 - 50 μl
1 - 200 µl
200 μl - 2 ml
1 - 10 ml
0.2 - 20 ml
1 ml - 10 ml
1 - 2 μg
up to 10 µg
up to 60 μg
up to 300 μg
up to 600 μg
up to 400 μg
Tělní tekutiny, kostní dřeň
Invisorb Spin Micro DNA Kit
Invisorb Spin Blood Mini Kit
Invisorb Genomic Kit III
1 - 50 μl
1 - 200 µl
1 - 200 µl
depending on type and amount of
starting material
Lidské a zvířecí tkáně , tkáně zalité v
parafinu
Invisorb Spin Micro DNA Kit
Invisorb Spin Tissue Mini Kit
Invisorb Spin Tissue Midi Kit
Invisorb Spin FFPE Tissue Kit
Invisorb Genomic Kit II
0.5 - 5 mg
0.5 - 40 mg
30 - 100 mg
2 - 3 paraffin sections
0.5 - 40 mg
1 - 2 μg
up to 50 μg
up to 80 μg
up to 50 μg
up to 50 μg
Lidské a zvířecí buňky
Invisorb Spin Micro DNA Kit
Invisorb Spin Tissue Mini Kit
Invisorb Spin Tissue Midi Kit
Invisorb Genomic Kit III
Invisorb Spin Cell Mini Kit
100 -105cells
10 –107cells
106 -108cells
1 x 105 cells
2 x 106 cells
depending on type and amount of
starting material
Suspenze kvasinkových buněk
Invisorb Spin Yeast DNA Mini Kit
Invisorb Genomic Kit III
107 cells, swab
depending on type of starting material
3 - 10 ml bacterial or yeast suspension
Swab material = výtěry
Invisorb Spin Swab Kit
Invisorb Genomic Kit III
Invisorb Spin Cell Mini Kit
depending on starting material
depending on starting material
Forensic material
Invisorb Spin Forensic Kit
Invisorb Forensic Kit I
depending on type and amount of
starting material
depending on type and amount of
starting material
Plant material
Invisorb Spin Plant Mini Kit
Invisorb Spin Plant Midi Kit
up to 100 mg
up to 500 mg
5 - 35 μg
up to 140 μg
Potraviny rostlinného/živočišného
původu
Invisorb Spin Food Kit I (animal)
Invisorb Spin Food Kit II (plant)
0.5 – 40 mg
up to 100 mg
up to 50 μg
up to 50 μg
Izolace DNA – magnetické částice
Izolační kity pro izolaci genomické DNA, total RNA nebo DNA a/nebo RNA z patogenů
- magnetické částice (InviMag beads, Dynabeads) pro purifikaci NK 15, 24 nebo 96 vzorků
naráz v jednom běhu (podle typu přístroje)
- DNA se váže na magnetické částice, které jsou přístrojem v konečném kroku izolovány ze
vzorku
KingFisher Systems
Izolace DNA – automatizované metody
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Dynal/Dynabeads-Typesand-Uses.html
Postup izolace DNA pomocí
izolačního kitu –
manuálně bez přístroje
Příklad dostupných kitů – firma Invitek
Sample Source
Recommended Kit
Genomic DNA Purification
Whole human or animal blood, buffy coat, bone marrow, rinse
InviMag Blood DNA Mini Kit/ KFmL
liquid from swabs
Fresh or frozen tissue, rodent tail, paraffin embedded tissue,
mammalian cells
InviMag Tissue DNA Mini Kit/ KFmL
Saliva, swabs
Human and animal stool sample
InviMag SalivaGene DNA Kit/ KFmL
InviMag Stool DNA Mini Kit/ KFmL
Forensic material
InviMag Forensic Kit/ KFmL
Plant material
InviMag Plant DNA Mini Kit/ KFmL
Sample Volume
Yield
up to 200 µl
6 -10 µg
5 - 20 mg tissue sample, 0.5 cm rodent
tail,
10 – 25 µg
10 –106mammalian cells
500 µl
up to 10 µg
100 – 300 mg
up to 50 µg
depending on type and amount of
depending on type and amount of starting
starting material
material
up to 100 mg
5 – 25 µg
Nucleic Acid Purification from Pathogens
Bacterial DNA
Bacteria pellets, tissue samples, paraffin embedded tissue,
blood, cell-free body fluids, urine, paper points, water
InviMag Bacteria DNA Mini Kit/ KFmL
depending on type and amount of
starting material
depending on starting material
Human and animal stool sample
Saliva, swabs
Viral DNA and/or RNA
InviMag Stool DNA Mini Kit/ KFmL
InviMag SalivaGene DNA Kit/ KFmL
100 – 300 mg
500 µl
up to 50 µg
up to 10 µg
Serum, plasma, cell-free body fluids, rinse liquid from swabs,
cell culture supernatants, tissue biopsies
InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/
KFmL
up to 200 µl
up to 10 mg
depending on starting material
InviMag Virus RNA Mini Kit/ KFmL
up to 200 µl
up to 50 mg
depending on viral load
Plasma, serum, whole blood, cell-free body fluids, rinse liquid
InviMag Virus DNA Mini Kit/ KFmL
from swabs, cell culture supernatants
up to 200 µl
depending on viral load
Viral RNA
Plasma, serum, cell-free body fluids, rinse liquid from swabs,
stool samples, small tissue samples, cell culture supernatants
Viral DNA
Total RNA isolation
Human or animal cells, lymphocytes pellet, tissue samples
5 x 106 cells
InviMag Universal RNA Mini Kit/ KFmL up to 1.0 ml blood
up to 20 mg
up to 20 µg
Další metody extrakce DNA – malé množství vstupního materiálu
DNA patogena
Často máme malé množství vstupního materiálu
•
Extrakce DNA pomocí SDS metody
•
Pod stereomikroskopem seškrábnout mycelium do Eppendorfky
•
Homogenizace tloučkem
•
Přídavek 350 ul SDS pufru – dodatečná homogenizace
•
5 min centrifugace při max. otáčkách
•
Supernatant přenést do nové Epp.
•
Přidat 350 ul isopropanolu – 30x převrátit
•
10 min centrifugace při max. otáčkách
•
Supernatant slít a zbytky isopropanolu osušit otřením Epp o filtrační papír
•
500 ul 75% EtOH
•
5 min centrifugace při max. otáčkách
•
Supernatant slít – osušit – nechat vyschnout ve flow boxu/vakuové odparce
•
Odparek DNA rozpustit v 50 ul sterilní vody (PCR grade)
•
Rychlá metoda (~1hod, podle počtu vzorků).
•
„Dirty extraction protocol“ – vhodné pro markery založené na PCR.
•
DNA je stabilní po jeden rok od data extrakce.
Další metody extrakce DNA – malé množství vstupního materiálu
Často máme malé množství vstupního materiálu
•
Extrakce DNA pomocí Chelex/InstaGene Matrix
•
Rozpipetovat 300ul 10% Chelexu do 1,5 ml Eppendorfek (Chelex má kašovitou konzistenci)
•
Vysterilizovat pinzetu (opakovaně ožehnout nad lihovým kahanem)
•
Sterilní pinzetou odebrat kousek pletiva)bakteriální suspenze vložit do Chelexu
•
•
(velmi malá množství pletiva!!! Velké množství vstupního materiálu by mohlo inhibovat PCR)
•
Negativní kontrola (vysterilizovat pinzetu a vymáchat ji v samostatné tubě s Chelexem)
•
Krátce vortexovat (10-15 sec) a centrifugovat (10-15 sec)
•
Eppendorfky vložit na 20 min do termobloku předehřátého na 95°C
•
centrifugovat (10-15 sec)
•
Supernatant použít do PCR (Chelex inhibuje Taq)
•
Někdy je potřeba odladit navazující kroky:
•
Počkat s PCR do druhého dne
•
Naředit supernatant 1:1 až 1:10.000
•
Pokud PCR nevyjde – opakovat centrifugaci, nechat stát přes noc a vyzkoušet PCR znova….. Ale i to někdy
nemusí vést k pozitivní PCR
theolb.readthedocs.org
Rychlá metoda (~30 min podle počtu vzorků).
https://www.eeb.ucla.edu/Faculty/Barber/Protocols.htm
www.bio-rad.com
www.ebiotrade.com
Izolace DNA – stanovení koncentrace a čistoty
Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA v UV spektru
Princip:
- MĚŘENÉ VLNOVÉ DÉLKY V UV SPEKTRU
- A230 - 230 nm - absorbční maximum guanidiových solí, fenolu,
sacharidy
- A260 - 260 nm – absorbční maximum nukleových kyselin
- A280 - 280 nm - absorbční maximum proteinů (zbytky tyrosinu a tryptofanu)
- A320 (A340 ) – 320 (340) nm – turbidita (zakalení) vzorku – odečet pozadí, nespecifické
kontaminace
Izolace DNA – stanovení koncentrace a čistoty
Spektrofotometricky
Po proměření vzorku DNA v UV spektru přístroj poskytne následující údaje:
a) koncentrace studované DNA:
b) Poměr R 260/280
a) R 260/280 = od 1,8 do 2,0 (blíž 1,8) = OK!
b) R 260/280 < 1.8 = kontaminace proteiny
c) R 260/280 > 2.0 = kontaminace organickými sloučeninami
(chloroformem, fenolem)
c) Poměr R 260/230
a) hodnota by měla být > 2.0
b) hodnota pod 2.0 – kontaminace sacharidy
Izolace DNA – stanovení koncentrace a čistoty
spektrofotometrické stanovení
- příklad – výstup měření na přístroji Nanodrop
A260 : absorbance NK
A280 : absorbance proteinů
R 260/280 : kvalita NK
Výsledná koncentrace DNA
Izolace DNA - Ověření kvality a integrity agarózovou elektroforézou
Elektroforéza nukleových kyselin
Agarosový gel ……. AGAR vs AGAROSA
- Agar - směs agarosy a agaropektinu
- zisk z polysacharidové buněčné stěny ruduch extrakcí horkou vodou
- druhy: Gracilaria lichenoides, Gelidium sp., Euchema sp.
- Agarosa - lineární polymer
- základ agarobiosa = disacharid (D-galaktosa + 3,6-anhydro-L-galaktopyranosa)
- molekula nemá prakticky žádný náboj – vhodná ELFO matrice
Obsah agarosy v gelu
Délka DNA
0,5 %
1–30 kbp
0,7 %
0,8–12 kbp
1,0 %
0,5–10 kbp
1,2 %
0,4–7 kbp
1,5 %
0,2–3 kbp
2,0 %
50 bp–2 kbp
3–4 %
10 bp–1 kbp
Čím je koncentrace AGRS vyšší:
- lepší rozlišovací schopnost, ale
- pomalejší průběh elfo
Elektroforéza nukleových kyselin
Agarosový gel ……. barvení
Ethidium bromid
se vmezeřuje mezi sousední páry bazí a vytváří s NK komplex, který v UV světle červeně
fluoreskuje (DNA i RNA).
Vmezeřením se do DNA dochází k inhibici replikace DNA (separaci dvoušroubovice) a
navazujících reakcí – transkripce a translace
= buňka umírá, protože
1. nemůže se replikovat a
2. netvoří se proteiny potřebné pro její život
toxický a mutagenní účinek EtBr!!!
je třeba pracovat s respektem a rozvahou,
používat ochranné pomůcky (nitrilové rukavice), separovat kontaminované
předměty
Elektroforéza nukleových kyselin
Polyakrylamidový gel
- gel je tvořen lineárními molekulami polyakrylamidu, které
jsou zesíťované N,N‘-methylenbisakrylamidem
- pro dělení kratších molekul
polymerace: akrylamid N,N‘-methylenbisakrylamid +
peroxydisíran amonný (APS) – zdroj kyslíkových radikálů, kt. spouští polymeraci
N,N,N‘,N‘-tetramethylendiamin (TEMED) – stabilizuje radikály
Polyakrylamid
3,5 %
Délka DNA
1–2 kbp
5%
75–500 bp
8%
50–400 bp
12 %
35–250 bp
15 %
20–150 bp
20 %
5–100 bp
!
O kvalitě a koncentraci vyextrahované DNA rozhoduje mj.
- typ použité metody extrakce (kolonková, CTAB, magnetické kuličky…)
- kvalita vstupního materiálu
- špatně uchované vzorky = fragmentovaná DNA, omezené množství použitelných
PCR aplikací
- kontaminované, špatně určené vzorky, neznámý původ
- množství vstupního materiálu (dodržovat navážky, objemy…..)
Před realizací studie na novém organismu/druhu je potřeba si vše vyzkoušet a odladit!!!!!
That´s all folks!