práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem

Transkript

Kolektiv
Lékařská chemie, biochemie a
molekulární biologie
Praktická cvičení I
Univerzita Karlova v Praze
1. lékařská fakulta
Ústav biochemie a experimentální onkologie
Vedoucí ústavu: Prof. MUDr. Aleksi Šedo, Dr.Sc.
Autorský kolektiv:
Editor: Doc. MUDr. Jaromír Křemen, CSc.
MUDr. Jana Stříbrná, CSc.
RNDr. Eva Bubnová, CSc.
RNDr. Alena Buděšínská, CSc.
Doc. MUDr. Zdeněk Kleibl, PhD.
Doc. MUDr. Michal Zikán, PhD.
MUDr. Petr Bušek, PhD.
Mgr. Lucie Šromová
2
OBSAH
Úvod
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
První pomoc v laboratoři
Pomůcky pro praktická cvičení
Práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem
Stanovení koncentrace chloridu železitého
Základní chemické pojmy a zákony
Roztoky - složení, ředění, osmolarita
pH, pufry
Stanovení acidity žaludeční šťávy
Závislost pH acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a
kyseliny octové
Změna pH acetátového pufru po přidání kyseliny
5
6
9
10
11
14
16
17
19
20
Výpočet pH kyselin, zásad a pufrů
Stechiometrické výpočty, iontový zápis chemických rovnic, iontové rovnice
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků
a jejich sloučenin
Důkaz vybraných kationtů
Důkaz vybraných anionů
Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny
Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky významných
organických sloučenin
Oxidace primárních alkoholů
Rozpustnost organických kyselin a jejich solí
Tvorba komplexních sloučenin
Močovina
Aminokyseliny
Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě
Barevné reakce aminokyselin
Reversibilní redox systém cystein-cystin
Bílkoviny I
Biuretová reakce
Emulgační schopnost bílkovin
Irreversibilní srážení bílkovin
Důkaz některých složek bílkovin
Dialýza
Bílkoviny II
Elektroforéza bílkovin
Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru
Stanovení koncentrace albuminu v seru
Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu v séru
26
29
24
25
31
33
37
39
42
43
46
48
49
50
51
54
58
59
60
62
63
65
66
68
69
72
74
76
3
Enzymy
Důkaz substrátove specifity glykosidas
Stanovení Michaelisovy konstanty
Nukleové kyseliny I
Izolace genetického materiálu
Nukleové kyseliny II
Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin
Nukleové kyseliny III
Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR
a restrikčního štěpení
78
80
81
88
89
91
92
95
107
4
ÚVOD
Předkládaná skripta pro výuku praktických cvičení z lékařské chemie, molekulární
biologie a biochemie vycházejí z textu publikovaného v roce 2004. Od té doby došlo k řadě
různých změn a tak bylo nutno texty upravit pro stávající potřeby. V důsledku inovace ve
výuce uvedených oborů byla některá čistě teoretická témata vypuštěna, zejména ta, která
budou probírána na seminářích. Naopak jiné kapitoly byly doplněny. Snažili jsme se klást
důraz na klinický význam a uplatnění určitých úloh s cílem zvýšení zájmu studentů o obor.
Zdá se, že studentům 1. až 3 ročníků chybí informace o důležitosti laboratorních oborů
komplementu, kde je nezastupitelná role laboratorně vzdělaného lékaře se základními
praktickými návyky. Jejich osvojení je v podstatě propedeutikou pro ostatní laboratorní obory.
V molekulárně biologickém oddílu jsme u průkazu genových polymorfismů ApoE
prokazovaných PCR a restrikčním štěpením spolu s gelovou elektroforézou, které v současné
době v rutinní diagnostice ustupují do pozadí, doplnili moderní přístup průkazu
polymorfismů pomocí real-time PCR se specifickou hybridizační FRET sondou. Studenti
pracují s vlastním biologickým materiálem získaným bukáním stěrem a mohou tak porovnat
náročnost obou přístupů.
Praktická cvičení umožňují studentům jednak procvičit teoretické vědomosti, ale i
aplikovat teoretické poznatky do praxe.
V úvodních kapitolách se studenti seznámí s používáním odměrných zařízení,
automatickými pipetami a dávkovači, dále se základním přístrojovým vybavením jako jsou
spektrofotometry, elektroforetická zařízení. Současně se také seznámí s používáním
základních přístrojů POCT - Point of Care Testing, což znamená provádění měření a testů
in vitro v místě péče o pacienta diagnostickými přístroji s jednoduchým ovládáním. Měření a
testy provádějí často pracovníci bez specializovaného laboratorního vzdělání na klinických
odděleních jako součást péče o pacienta, ale jsou kontrolovány lékařem - klinickým
biochemikem.
POCT zahrnuje používání techniky u lůžka pacienta včetně přenosných analyzátorů,
v praktických a odborných ambulancích (primární péče) nebo techniky vlastněné pacientem
(např. sebetestování diabetiků). Analytické postupy, které využívají přístroje a zařízení
POCT, jsou používány také při analýze patologických součástí moče nebo důkazu toxických
látek v séru, slinách i v moči.
Dále jsou zařazeny úlohy, které umožňují provést vyšetření séra a moče simulovaného
pacienta a tím snadněji pochopit biochemické podklady závažných onemocnění. Byla
zvolena témata týkající se zdravotních problémů velké části populace (např. diabetes
mellitus, infarkt myokardu, aterosklerosa).
Studentům doporučujeme, aby si před praktickým cvičením pečlivě prostudovali
příslušný text cvičení a znalosti doplnili navazujícím textem z učebnice.
Praktická cvičení z lékařské chemie, molekulární biologie a biochemie budou
publikována v elektronické formě, což studentovi umožní vytisknout příslušnou kapitolu,
respektive úlohu, a pracovat s nimi jako s pracovními listy.
Závěrem dovolte vyslovit přání, aby praktická výuka i tyto texty, včetně seminářů, vám
pomohly nejen ve studiu biochemie, ale i k získáni laboratorní zručnosti a zájmu o obor se
stále narůstajícím významem nejen ve vědě, ale i ve všech oblastech klinické medicíny.
Nezapomínejte, že se snižují počty lékařů vedoucích laboratorní oddělení a mnozí z vás je
budou muset nahradit. Uvědomte si také, že v postgraduálním studiu se základní informace
již získávají obtížněji.
V Praze 2013
Autoři
5
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři
1. V laboratoři se pracuje v předepsaném pracovním ochranném oděvu: bílý laboratorní
plášť by měl být celý zapnutý. Dlouhé vlasy je nutno mít sepnuté. V případě potřeby se
doporučuje používat další ochranné pomůcky: gumové rukavice, brýle, ochranný štít nebo
roušku.
2. Při práci s biologickým materiálem (krev, sérum, plazma, moč) je nutno vždy používat
gumové rukavice.
3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít, kouřit. Před odchodem z laboratoře je nutno vždy si
umýt ruce mýdlem.
4. Při práci musí být zachován klid a udržována maximální čistota. Pracuje se s maximální
pozorností a rozmyslem.
5. Každá kádinka,zkumavka,láhev na pracovním stole musí být čitelně a srozumitelně
popsána ( obsah - signatura).
6. S pevnými chemikáliemi se nikdy nemanipuluje rukou, neodsypávají se do dlaně apod.
Používá se čistých laboratorních lžiček nebo špachtlí. V případě znečištění chemickou
látkou se ruce ihned opláchnou a umyjí mýdlem a vodou.
7. Malé zátky se při práci přidržují v ruce a neodkládají se na pracovní stůl. Zátky větších
lahví je nutno položit tak, aby obsah lahve na nich ulpělý nekontaminoval pracovní
plochu. Láhve a jiné obaly je po odebrání potřebného množství chemikálie třeba ihned
uzavřít.
8. Reagenční roztoky se odlévají z reagenčních lahví na straně odvrácené od signatury tak,
aby se nepoškodil štítek na lahvi. Nečitelný nápis a s tím spojená případná záměna může
mít nebezpečné následky.
9. Pipetování jedovatých, leptavých, dráždivých a potenciálně infekčních (biologických)
kapalin je nutno provádět bezpečnostními pipetami nebo pomocí balonku. Nikdy ne
přímo ústy!
10. Při manipulacích s látkami ve zkumavkách a jiných nádobách musí ústí nádoby vždy
směřovat od vlastní osoby i od jiných pracovníků.
11. Tekutiny ve zkumavce při zahřívání na otevřeném ohni se zahřívají opatrně a pomalu od
hladiny ke dnu. Zkumavkou se přitom pohybuje, aby se obsah rovnoměrně prohříval a
nedošlo k náhlému varu a vystříknutí vroucí kapaliny.
12. Pachy látek se nezjišťují přímým přičicháváním; výpary se přivanou mávnutím dlaně.
Chemikálie se nikdy nesmí ochutnávat!
13. Koncentrované kyseliny, zvláště kyselina sírová, se ředí vléváním kyseliny do vody.
Kyselina se přilévá tenkým proudem, po částech a za stálého promíchávání roztoku
skleněnou tyčinkou. Obrácený postup, tj. přilévání vody do kyseliny je nepřípustný.
14. Při rozpouštění pevného hydroxidu sodného nebo draselného se sype hydroxid po
malých částech za stálého míchání do vody; vždy se vyčká, až je předchozí podíl
rozpuštěn.Pokud se roztok více ohřívá, ochladí se nádoba vodou ve větší nádobě.
6
15. Rozlité koncentrované kyseliny se nejprve ředí opatrně vodou a pak neutralizují
zředěným roztokem sody nebo alkalického hydroxidu. Rozlité roztoky louhů se ředí
vodou. Kontaminované plochy se pak omyjí vodou. Tyto operace se provádějí
v ochranných rukavicích. Drobné kapky kyselin, louhů a jiných nebezpečných látek se
nasají do filtračního papíru a potřísněné místo se pak omyje vodou.
16. Roztoky chemikálií se vylévají do odpadu jen za současného ředění nadbytkem vody
z vodovodu.
17. Je třeba se vyhnout vdechnutí i minimálních kvant chemických látek. Některé látky, např.
kyanovodík, sirovodík, chlor, fosgen aj. mohou usmrtit už po jediném nadechnutí. Jiné,
např. rtuť, benzen, tetrachlormethan a 2-naftylamin, mohou způsobit těžká poškození
zdraví až po delší době. Pro možnost infekce je třeba dbát úzkostlivé čistoty při práci
s biologickým materiálem.
18. S látkami dráždivými, páchnoucími a jedovatými, např. s chlorem, fosgenem,
chloroformem, tetrachlormethanem, sirouhlíkem aj., a s látkami snadno vznětlivými, např.
s petroletherem, diethyletherem, benzinem, sirouhlíkem, benzenem, acetonem aj. se musí
pracovat v dobře odsávané a zapojené digestoři. Při práci s hořlavinami se dbá na to, aby
nemohlo dojít ke vznícení par od otevřeného ohně, tj. zejména od blízkých kahanů, ale i
elektrických spotřebičů. V jedné digestoři nelze např. pracovat s hořlavým rozpouštědlem
a zahřívat cokoli plynovým kahanem. Nebezpečným zdrojem par mohou být i
chromatografické vany. Nebezpečnou věcí je postřik chromatogramů, kdy vzniká jemný
aerosol činidla; detekci lze provádět jen v dobře odsávané digestoři nebo odsávaném boxu.
Také žíhání, spalování a mineralizace látek se provádějí v digestoři.
19. Při rozlití hořlaviny se ihned zhasnou kahany a vypojí elektrické spotřebiče. Při rozlití
velkého množství hořlavin se ihned zhasnou všechny hořáky a vypnou elektrické
spotřebiče v místnosti, intenzivně se vyvětrá a nezapínají se žádné elektrické spotřebiče,
ani světlo. Nejvyšší přípustné množství hořlavin v laboratoři je stanoveno předpisy. Je
třeba mít na paměti, že hoří všechny organické látky, které obsahují méně než 70 %
halogenu.
20. Při nasazování hadiček na skleněné trubice a zasunování skleněných trubiček, kohoutů a
teploměrů do zátek se postupuje opatrně a bez násilí, nejlépe v ochranných rukavicích
nebo rukou chráněnou čistou utěrkou; sklo se drží u otvoru, do něhož se vsunuje. Vsunutí
skleněných předmětů do otvorů v pryži se usnadní jejich potřením glycerolem.
21. Chemické sklo a skleněné součásti chemických aparatur je třeba před prací prohlédnout;
i nepatrná prasklina může mít velmi vážné následky. Poškozené sklo je třeba ihned
vyřadit, dát do opravy nebo uložit do zvláštní nádoby na skleněný odpad. Poškozené sklo
nesmí přijít do umývárny s ostatním sklem. Střepy skla i drobné střípky na stolech je
nutno opatrně a pečlivě odstranit.
22. Při zahřívání, např. destilaci kapalin s teplotou varu pod 100 C, se užívají elektricky
vyhřívané vodní lázně, elektricky vyhřívaná topná hnízda a infrazářiče. Pokud k ohřevu
slouží zahřívané olejové lázně, nesmí do oleje vniknout voda.
23. Utajenému varu, např. při destilaci, lze zabránit varnými kaménky nebo skleněnými
kuličkami, vloženými do nádoby před začátkem zahřívání. Při podezření na utajený var se
vypne zdroj tepla a kapalina se nechá bez otřesů zchladnout.
24. Tenkostěnné nádoby s plochým dnem nesmějí být vakuovány, hrozí exploze. Pro
vakuovou destilaci se používají výlučně silnostěnné baňky s kulatým nebo oblým dnem.
7
25. Ramena odstředivek musí být stejnoměrně zatížena. Odstředivky musí být během
centrifugace uzavřeny, víko nesmí být otevřeno, dokud přístroj není opět v klidu. Většina
centrifug je chráněna proti předčasnému otevření pojistkou.
8
První pomoc v laboratoři
1. Vnikne-li chemická látka do úst, je třeba zamezit jejímu spolknutí; vyplivne se a ústa
vyplachují vodou. Při požití jedovaté látky nebo roztoku se ústa opakovaně vypláchnou
vodou, po vypití asi půl litru tekutiny se vyvolá zvracení (dráždění hrdla prstem) a
vyhledá se lékařská pomoc.
2. Při poleptání kůže kyselinami a louhy se postižené místo ihned dostatečně opláchne
proudem studené vody. Při větším potřísnění se pak vyhledá lékařská pomoc. Zvlášť
nebezpečná poleptání způsobují kyselina fluorovodíková, kyselina dusičná, kyselina
sírová, alkalické hydroxidy, peroxid vodíku a fenol.
3. Zasažené oko se ihned vypláchne proudem studené vody, přiloží se sterilní obvaz a ihned
se vyhledá lékařská pomoc.
4. Při popálení ohněm nebo horkými předměty je třeba postižená místa ihned ochladit
ledovou vodou nebo přikládáním igelitových sáčků s vodou a ledem (ne samotný led).
Části oděvu stmelené s popáleninami se zásadně neodstraňují. Při opaření je nutno co
nejrychleji stáhnout nasáklý oděv, popálené plochy se kryjí jen sterilním obvazem (žádné
masti nebo zásypy). Při těžších popáleninách nebo popálení většího rozsahu je třeba
vyhledat lékařskou pomoc.
5. Při úrazu elektrickým proudem, je-li postižený pod napětím, je nutno nejprve přerušit
přívod proudu nebo postiženého vyprostit tak, že je zachránce dostatečně izolován od
země suchou dřevěnou, gumovou nebo skleněnou podložkou. Zabezpečí se dýchání,
srdeční činnost a přivolá se lékařská pomoc.
6. Při vzniku řezných ran, např. laboratorním sklem, se krvácející rána omyje proudem vody,
případně desinfikuje. K dezinfekci menších ran je možno použít Ajatin, Famosept,
Septonex nebo roztok manganistanu draselného. Rána se přelepí rychloobvazem nebo
ováže. Jsou-li v ráně cizí tělesa, např. střepiny skla, musí je vyjmout lékař. Při
rozsáhlejším krvácení se přiloží kompresní obvaz a vyhledá lékařské ošetření.
7. Před zahájením praktik jsou studenti povinni se seznámit s teorií používané laboratorní
metody a s postupem práce daného experimentu. Před začátkem každé úlohy je třeba se
předem zamyslet nad možnými pracovními riziky.
PŘI JAKÉKOLI POCHYBNOSTI NEBO PODEZŘENÍ NA RIZIKO
NEBEZPEČÍ SE NIKDY NEROZPAKUJTE DOTÁZAT ASISTENTA.
9
Pomůcky na praktika
1. Identifikační karta studenta
2. Přezutí
3. Bílý laboratorní plášť
4. Lihový popisovač na sklo
5. Návody na prakt. cvičení
6. Psací potřeby
7. Kalkulačka
8. Zámeček na skříňku v šatně
9. Rukavice nesterilní
10. Protokolový sešit
10
PRÁCE S AUTOMATICKÝMI PIPETAMI A SPEKTROFOTOMETREM
Práce s automatickými pipetami
Klíčová slova: převod – mililitry,mikrolitry, látková koncentrace, komplexní sloučeniny,
spektrofotometrie, transmitance, absorbance, molární absorpční koeficient, měřený vzorek,
standardní vzorek, slepý vzorek.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
roztok thiokyanatanu draselného 1 mol/l
roztok chloridu železitého 400 µmol/l
standardní roztok chloridu železitého 200 µmol/l
roztok kyseliny sírové 1 mol/l !ŽÍRAVINA!
Pokyny pro práci s automatickými pipetami:
1. Před pipetováním nasaďte na pipetu špičku, jejíž barva obvykle odpovídá barvě tlačítka
pístu.
2. PIPETU DRŽTE VŽDY ŠPIČKOU DOLŮ!!!
3. Při pipetování stlačte píst k první zarážce, ponořte pipetu do roztoku a pomalým
uvolňováním stlačeného pístu nasajte kapalinu (pozor na vzduchové bubliny).
Pomalým stlačením pístu k druhé zarážce vypusťte obsah špičky (špička nesmí být
ponořena do kapaliny) do zkumavky.. Špička se při tom dotýká stěny zkumavky.
4. Pro pipetování nového roztoku použijte vždy novou špičku.
5. Pipety odkládejte svisle do stojánku a nepokládejte je na pracovní desku stolu.
Nastavení zvoleného objemu:
1. Podle požadovaného objemu roztoku zvolte pipetu s vhodným rozsahem uvedeným na
barevném tlačítku pístu pipety!
2. Požadovaný objem nastavte na stupnici pipety otáčením šroubu.
11
Příklady:
rozsah pipety 200/1000 (údaj na barevném pístu):
nejmenší objem 200 µ1
největší objem 1 000 µl
1
0
0
1000 µl
0
6
6
660 µl
0
2
0
200 µl
160 µl
0
2
0
20 µl
16 ul
0
2
0
2 µl
nejmenší objem 20 µl
největší objem 200 µl
2
0
0
200 µl
1
6
0
nejmenší objem 2 µl
největší objem 20 µl
2
0
0
20 µl
1
6
0
Spektrofotometrie:
Závislost absorbance roztoku na koncentraci rozpuštěné látky podle LambertovaBeerova zákona umožňuje stanovit neznámou koncentraci látky z naměřené hodnoty
absorbance příslušného roztoku:
A = –log T= ·c·l
A = absorbance při zvolené vlnové délce
T = transmitace při zvolené vlnové délce
 = molární absorbční koeficient při zvolené vlnové délce
c = látková koncentrace měřeného roztoku (mol/l)
l = tloušťka měřené vrstvy = 1 cm
12
Hodnotu koncentrace lze získat těmito způsoby:
a)
b)
c)
d)
výpočtem z Lambertova-Beerova zákona, známe-li molární absorbční koeficient
odečtením z kalibračního grafu
výpočtem pomocí kalibračního faktoru
změřením absorbance standardního roztoku o známé koncentraci, absorbance
roztoku vzorku a následným výpočtem ze vztahu:
Ast/Avz = cst/c
Ast = absorbance standardu
Avz = absorbance vzorku
cst = látková koncentrace standardu
cvz = látková koncentrace vzorku
13
ÚLOHA 1.
Stanovení koncentrace roztoku chloridu železitého
Při spektrofotometrickém stanovení koncentrace Fe3+ se využívá intenzívně červeně
zbarveného komplexu [Fe(SCN)]2+, který vzniká reakcí Fe3+ s thiokyanatanovými anionty v
kyselém prostředí (viz. Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků,
(úloha 1.3.).
Složení zadaných vzorků:
vzorek
Fe3+ 400 µmol/l (µl)
destilovaná voda (µl)
A
B
C
D
250
750
750
250
200
800
800
200
slepý
vzorek
–
1000
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
–
–
–
Každý student připravuje jeden ze vzorků A – D podle zadání.
Připravte a očíslujte sedm zkumavek.
Do zkumavek 1 – 3 připravte vždy 1 ml zadaného vzorku. Tímto způsobem připravíte
tři identické vzorky (triplet).
Do zkumavek 4 – 6 napipetujte vždy 1000 µl standardního roztoku chloridu
železitého 200 µmol/l .
Do sedmé zkumavky připravte slepý vzorek (1000 µl destilované vody).
Do všech sedmi zkumavek odměřte dávkovačem 0,5 ml roztoku kyseliny sírové
(1 mol/l), protřepejte a přidejte 0,5 ml roztoku thiokyanatanu draselného (celkový
objem v každé zkumavce bude 2 ml). Obsah zkumavek dobře promíchejte.
Po 10 min změřte absorbanci vzorku (Avz) i standardu (Ast) při 530 nm proti slepému
vzorku.
Naměřené hodnoty zaznamenejte do tabulky 1. a 2.
14
Tabulka 1.
vzorek:
standard
vzorek
–
–
–
absorbance
průměr
Z průměrné hodnoty absorbance vzorku a z průměrné hodnoty absorbance standardu
vypočítejte koncentraci Fe3+ (exp.).
Ze zadaného složení vzorku (A-D) spočítejte teoretickou koncentraci a porovnejte obě
hodnoty.
Všechny údaje zapište do tabulky 2.
Tabulka 2.
vzorek
Fe3+ (µl)
voda (µl)
průměr Ast průměr Avz
cFe3+
(µmol/l)
teoret.
cFe3+
(µmol/l)
exp.
Poznámky:
15
ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY
Klíčová slova: relativní atomová hmotnost (Ar), relativní molekulová hmotnost (Mr),
Avogadrova konstanta (NA), látkové množství (n, mol), molární hmotnost (M, g/mol),
molární objem (Vm, dm3/mol), hmotnostní zlomek prvku ve sloučenině (w).
Příklady na procvičování:
1. Jakou molární hmotnost má: a) oxid uhličitý, b) ethanol, c) glukosa, d) alanin?
2. Jaké látkové množství představuje: a) 90 g vody, b) 6 g kyseliny octové, c) 2,9 g
chloridu sodného, d) 4,86 g hydrogenuhličitanu vápenatého?
3. Jaký je za normálních podmínek objem: a) 7 g dusíku, b) 2,2 g oxidu uhličitého ?
4. Jakou hmotnost má za normálních podmínek: a) 1 l amoniaku, b) 10 l kyslíku ?
5. Kolik molů Fe2+ obsahuje 77,5 g jodidu železnatého ?
6. Kolik mmolů Na+ obsahuje 0,67 g oxalátu sodného?
7. Kolik % dusíku obsahuje močovina ?
8. Kolik g dusíku vyloučil pacient za den, když v celkovém objemu moči bylo nalezeno
500 mmol močoviny ?
9. Bílkoviny obsahují v průměru 16 % dusíku. Kolik g bílkovin musíme podat pacientovi,
když mu potřebujeme dodat 5 g dusíku?
10. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní při dekarboxylaci 25,5 mg kyseliny acetoctové?
Dodatky:
Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků:
Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S = 32, Fe=56, Cl = 35, I = 127
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
a) 44 g/mol, b) 46 g/mgl, c) 180 g/mol, d) 89 g/mol
a) 5 mol, b) 0,1 mol, c) 0,05 mol, d) 0,03 mol
a) 5,61, b) 1,121
a) 0,76 g, b) 14,28 g
0,25 mol
10 mmol
46 %
14 g
31,25 g
5,6 ml
Poznámky:
16
ROZTOKY - SLOŽENÍ, ŘEDĚNÍ, OSMOLARITA
Klíčová slova: koncentrace látková = molární (mol/l roztoku), koncentrace hmotnostní
(g/l roztoku, g/100 ml roztoku = g %), směšovací rovnice, křížové pravidlo, osmotický tlak,
osmolarita (látková koncentrace osmoticky aktivních částic), izotonické roztoky.
Příklady k procvičovaní:
1. Vypočítejte látkovou koncentraci roztoků o tomto složení:
a) 17,4 g chloridu sodného / 300 ml,
b) 2,49 mg jodidu draselného / 15 ml
c) 385 mg chloridu vápenatého / 0,007 l
d) 4.2 g hydrogenuhličitanu sodného / 20 ml
e) 4,5 g glukosy / 2.5 l
2. Kolik g kyseliny šťavelové bude obsaženo ve 250 ml roztoku o látkové koncentraci 0,1
mol/l?
3. Roztok glycinu má látkovou koncentraci 3 mmol/l. Kolik mg glycinu bude rozpuštěno v
0,1 1 tohoto roztoku?
4. Kolik g chloridu sodného musíte navážit pro přípravu 350 m1 fyziologického roztoku
chloridu sodného (c = l50 mmol/l)?
5. Kolik mmol Fe2+ bude obsaženo v 10 ml roztoku jodidu železnatého o látkové
koncentraci 0,5 mol/l?
6. V jakém objemu roztoku chloridu vápenatého o látkové koncentraci 0.1 mol/l budou
obsaženy 4 mmol chloridových iontů?
7. Kolik mmol hořečnatých kationtů bude obsaženo ve 100 ml roztoku chloridu
hořečnatého o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l?
8. Kolik mmol chloridových ionty bude obsaženo ve 100 ml roztoku chloridu hořečnatého
o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l?
9. Koncentrace draselných iontů v infúzi nesmí přesáhnout 40 mmol/l. Kolik m1 roztoku
chloridu draselného o hmotnostní koncentrace 148 g/1 smíme dát do jedné infúzní láhve
o objemu 300 ml?
10. Kolik vody musíme přidat ke 2 ml roztoku, chceme-li jej zředit
a) 2x, b) 3x, c) 5x, d) 10x, e) 20x?
11. Kolik ml vody musíme přidat k 10 ml 8% (g/100 ml) roztoku glukosy, aby výsledný
roztok byl 2%?
12. K 5 ml roztoku močoviny o látkové koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká
bude látková koncentrace výsledného roztoku?
13. K 5 m1 roztoku chloridu vápenatého o koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká
bude hmotnostní koncentrace výsledného roztoku?
14. Kolikrát musíme zředit roztok chloridu draselného o látkové koncentraci 0,24 mmol/l,
když výsledný roztok má mít hmotnostní koncentraci 5,92 mg/l?
15. Jakou osmolaritu má roztok o látkové koncentraci 0,15 mol/l?
a) chloridu sodného,
b) chloridu hořečnatého
c) hydrogenfosforečnanu sodného
d) glukosy
e) močoviny
17
16. Které z uvedených roztoků jsou izotonické s fyziologickým roztokem chloridu sodného
(c = 150 mmol/l)?
a) glukosy c = 300 mmol/l
b) chloridu vápenatého c = 50 mmol/l
c) chloridu draselného c = 300 mmol/l
d) dihydrogenfosforečnanu sodného c = 0,15 mol/l
17. Kolik ml vody musíme přidat ke 100 ml roztoku, ve kterém je rozpuštěno 14,2 g
hydrogentosforečnanu sodného, abychom získali roztok izotonický s fyziologickým
roztokem chloridu sodného?
18. Jakou osmolaritu má roztok připravený smícháním 100 ml roztoku chloridu sodného
o hmotnostní koncentraci 5,8 g/l a l00 ml roztoku chloridu vápenatého o hmotnostní
koncentraci 11 g/l?
Dodatky:
Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S=32, Fe = 56, Cl = 35, I = 127
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
a) 1 mol/l, b) 0,001 mol/l, c) 0,5 mol/l. d) 2,5 mol/l, e) 0,01 mol/l
2,25 g
22,5 mg
3,045 g
5 mmol
20 ml
1 mmol
2 mmol
6 ml
a) 2 ml, b) 4 ml, c) 8 ml, d) 18 ml, e) 38 ml
30 ml
0,002 mol/l
0,22 g/l
3x
a) 0,3 mol/l, b) 0,45 mol/l, c) 0,45 mol/l, d) 0,15 mol/l, e) 0,15 mol/l
a) ano, b) ne, c) ne, d) ano
900 ml 1
8. 0,25 mol/l
Poznámky:
18
pH, PUFRY
Klíčová slova: Hendersonova - Hasselbalchova rovnice, pH pufru, funkce pufru, koncentrace
pufru, kapacita pufru, aktuální a titrační acidita.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
roztok kyseliny octové 1 mol/l
roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l
roztok hydroxidu sodného 1 mol/l
fenolová červeň (0,1 g se rozpustí v 60ml ethanolu a doplní do 100ml destil.vodou)
vzorky žaludečních šťáv
19
ÚLOHA 1.
Stanovení acidity žaludeční šťávy
Žaludeční šťáva je čirá bezbarvá kapalina, někdy vazká od přimíšeného hlenu. Má
charakteristický zápach a silně kyselou reakci, pocházející od volné kyseliny chlorovodíkové
(HCl). pH žaludeční šťávy se pohybuje v rozmezí 0,8 – 1,5, což odpovídá HCl o koncentraci
30-150 mmol/l. Spolknutá potrava ji pufruje na pH 1,8 – 4, které je optimální pro působení
pepsinů a žaludeční acidorezistentní lipasy. Hustota šťávy kolísá mezi 1,001 - 1,010 g/ml.
Sekrece žaludeční šťávy je regulována neurohumorálně. Produkce se pohybuje v rozmezí 1
000 – 3 000 m1/24 hod. Žaludeční sekret je produkován třemi typy buněk žaludeční sliznice.
Hlavní buňky tvoří pepsinogeny, vedlejší, mucinózní buňky produkují hlen a krycí buňky
vylučují H+, K+, Cl. Poslední typ buněk vylučuje HCl o koncentraci 143 mmol/l. Kyselina
chlorovodíková je v kontaktu se slizničním povrchem zčásti neutralizována alkalickým
mucinem, který obsahuje NaHCO3. Kyselost a množství žaludeční šťávy jsou určeny
především počtem buněk, které se sekrečního děje účastní. Významným faktorem je hladina
peptidového hormonu gastrinu, produkovaného endokrinními buňkami žaludeční sliznice.
V klinické praxi je možné přítomnost kyseliny chlorovodíkové v průběhu
gastroskopie orientačně stanovit vstříknutím malého množství acidobazického indikátoru
kongo červeně (při pH <3 dochází ke zbarvení do modra až černa), v minulosti bylo
prováděno i kvantitativní stanovení acidity žaludeční šťávy titrací 0,1 mol/l NaOH (tzv.
acidimetrie). Ke kvantitativnímu posouzení sekrece HCl pomocí adicimetrie byl stanoven tzv.
výdej kyseliny chlorovodíkové (tj. součin látkové koncentrace HC1 a množství žaludeční
šťávy) měřený v určitém časovém intervalu. Tento ukazatel byl měřen jednak v klidových
bazálních podmínkách a dále po stimulaci (provokaci) žaludeční sekrece k maximálním
možným hodnotám. Ke stimulaci sloužilo podání histaminu nebo syntetického hormonu
pentagastrinu.
Odběr žaludeční šťávy k stanovení výdeje kyseliny chlorovodíkové:
K vyšetření se pacient dostavil ráno po nočním 12 hod lačnění, nekouřil. Žaludeční
šťáva byla získána tenkou nasogastrickou sondou, která byla zavedena do nejnižšího místa
žaludeční dutiny. Pacient při polykání sondy seděl, nebo mohl ležet na levém boku, poloha
konce sondy se kontrolovala skiakopicky rentgenem. Injekční stříkačkou o objemu 20 ml byl
odebrán všechen lačný žaludeční obsah, který se nehodnotil, a pak byla tímto způsobem ve
20
2minutových intervalech pod lehkým tlakem odčerpávána žaludeční šťáva po dobu celého
odběru.
Při dvouhodinovém odběru byla odebírána za bazálních klidových podmínek za
60 minut frakce B. Následně byl podkožně injikován pentagastrin a za další hodinu byly
v l5minutových intervalech odebrány frakce S1 až S4.
Princip:
Odměrnou analýzou (titrací hydroxidem sodným), acidimetrií se stanoví koncentrace
HC1 a vyhodnotí se výdej HC1.
Pracovní ·postup:
- Nejdříve je nutno si všimnout zápachu, barvy a konzistence žaludeční šťávy. Zelená
nebo žlutá barva ukazuje příměs žluči, červená nebo tmavá příměs krve. Žaludeční obsah
s příměsi žluči, ve které bývá přítomen také pankreatický sekret, nelze kvantitativně na
výdej HC1 hodnotit (pankreatická šťáva obsahuje hydrogenkarbonát).
- Každá dvojice zpracuje jednu frakci žaludeční šťávy. Jeden pacient je tedy
anaylzován ve spolupráci 5ti dvojic studentů, kteří si vzájemně sdělí naměřené
hodnoty.
- Do titrační baňky (objem 100 ml) se pipetou přesně odměří 2,0 ml frakce, přidají se 3
kapky fenolové červeně a titruje se NaOH o koncentraci 0,1 mol/l. Analýzu provedeme
2x a pro výpočet použijeme průměrnou spotřebu NaOH v ml.
*** Bod ekvivalence se při titraci žaludeční šťávy projeví přechodem ze žluté do červené
barvy. Pokud se červené zbarvení objeví hned po přidání indikátoru (před titrací),
spotřebu NaOH hodnotíme jako nulovou.
Vyhodnocení:
- Vypočítejte koncentraci HCl v jednotlivých frakcích (B, S1-S4) podle vzorce:
mmol HCl v 1 l šťávy = a x 50, kde a = spotřeba 0,1 mol/l NaOH vyjádřená v ml (zdůvodněte
výpočet).
- Objem frakcí a koncentrací HCl vyneste do grafu, jehož souřadnice jsou na obr. 1.
21
Obr. 1. Titrace HCl v žaludeční šťávě - bazální sekrece a sekrece po stimulaci pentagastrinem
- Vypočítejte bazální sekreci (výdej, odbyt) HCl. Vynásobením objemu (v ml) a koncentrace
HCl (v mmol/l) frakce B obdržíte po vydělení 1000 bazální výdej HCl v mmolech za
60 minut (normální hodnota je 1,5 až 4 mmol/60 min).
- Podobným způsobem vynásobte objem (v ml) a koncentraci HCl (v mmol/l) ve frakcích S1
až 4 a součet těchto součinů vydělte 1000. Hodnota představuje tzv. vrcholový výdej
kyseliny (peak acid out-put, PAO).
- Vypočítejte maximální sekreci HCl (maximal acid out-put, MAO).
Výpočet se obvykle se provádí takto:
z frakcí 1 až 4 se vyberou ty dvě sousední frakce, ve kterých bylo docíleno nejvyššího
výdeje (tj. součinu koncentrace HCl v mmol/l a objemu frakce v ml děleného 1000). Oba
výdeje se sečtou a násobí dvěma. (Zdůvodněte výpočet.)
Normální hodnoty maximální i vrcholové sekrece HCl jsou mezi 10 až 23 mmol/60 min.
- Vyhodnoťte zjištěné údaje o vašem pacientovi.
22
Bazální výdej vyšší než 15 mmol/hod bývá přítomen u Zollinger-Ellisonova
syndromu (soubor příznaků způsobený nádorem ostrůvků pankreatu nebo hyperplasií
gastrinových buněk v antru).
Hodnoty maximální sekrece bývají vyšší u pacientů s duodenálním vředem, výskyt
duodenálního vředu při bazální achlorhydrii (nepřítomnost HCl v žaludeční šťávě) a
stimulované sekreci nižší než 15 mmol/hod u mužů a 10 mmol/hod u žen je naopak málo
pravděpodobný. Achlorhydrie při maximálním stimulačním testu ukazuje na zánik krycích
buněk, tj. na difúzní poškození žaludeční sliznice (atrofická gastritis). Achlorhydrie bývá
asociována s intestinální metaplazií žaludeční sliznice, která může vést k dysplázii, tento stav
je proto považován za rizikový z hlediska vzniku zhoubného nádoru (karcinomu žaludku).
Fyziologické hodnoty výdeje HCl:
BAO (Basal Acid Output) = bazální výdej HCl na lačno 1 - 5 mmol/hod
MAO (Maximal Acid Output) = celková žaludeční sekrece po stimulaci během
60 min 13 - 25 mmol/hod
PAO (Peak Acid Output) = součet hodnot dvou po sobě jdoucích 15 minutových
frakcí s nejvyšší sekrecí HCl, násobený 2 (přepočet na
1 hodinu) 0 - 34 mmol/hod.
Patologické hodnoty při onemocněních zažívacího traktu:
BAO:
PAO:
1 - 5 mmol/hod normál, žaludeční vřed možný
5 - 15 mmol/hod duodenální vřed
>20 mmol/hod
podezření na gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)
atrofie žaludeční sliznice (chronická atrofická gastritis,
perniciózní anémie)
5 - 40 mmol/hod normál, žaludeční vřed možný
>40 mmol/hod podezření na gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)
BAO/PAO:
0 mmol/hod
<0,20 normál, žaludeční vřed možný
>0,60 gastrinom (Zollinger-Ellisonův sy.)
23
ÚLOHA 2.
Závislost pH acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a
kyseliny octové
Acetátový pufr je tvořen slabou kyselinou octovou (pKA = 4,75) a její silnou
konjugovanou bází, tj. acetátovým aniontem. Podle Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice je
pH pufru závislé na poměru látkových koncentrací obou složek konjugovaného páru.
Příslušné hodnoty poměru [Aˉ]/[HA] získáte různým přídavkem roztoku hydroxidu sodného
k roztoku kyseliny octové.
Pracovní postup:
 Do kádinek napipetujte roztoky kyseliny octové 1 mol/l, hydroxidu sodného 1 mol/l a
destilovanou vodu podle tabulky 1.
Tabulka 1.
kádinka
[Aˉ]/[HA]
CH3COOH 1 mol/l (ml)
NaOH 1 mol/l (ml)
destilovaná voda (ml)
1
1:3
10
2,5
7,5
2
1:1
10
5
5
ZACHOVAT
3
3:1
10
7,5
2,5
pH naměřené
pH vypočtené
[pufr] (mol/l)





Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou.
pH-metrem změřte pH připravených pufrů.
Naměřené hodnoty porovnejte s vypočítanými hodnotami pH.
Vypočítejte látkovou koncentraci připravených pufrů.
Výsledky zapište do tabulky 1.
!POZOR! Pufr připravený v kádince 2 (poměr složek 1:1) budete používat v dalších
úlohách.
Poznámky:
24
ÚLOHA 3.
Změna pH acetátového pufru po přidání kyseliny
Při přidání malého množství silné kyseliny se pH pufru změní jenom málo, díky
rezervě, kterou v acetátovém pufru představují acetátové anionty.
Pracovní postup:
 Do kádinek napipetujte připravený acetátový pufr (poměr složek 1:1), destilovanou
vodu a přidejte roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l podle tabulky 3.
 Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou a změřte pH.
 Porovnejte naměřenou hodnotu pH s hodnotou vypočítanou.
 Zjistěte, o kolik jednotek se změnilo pH po přidání kyseliny k acetátovému pufru a k
destilované vodě.
 Výsledky zapište do tabulky 3.
Tabulka 3.
kádinka
1
2
acetátový pufr (ml)
5
destílovaná voda (ml)

5

5
HCl 0,1 mol/l (ml)
5
pH naměřené
rozdíl pH (naměřených)
pH vypočítané
rozdíl pH (vypočítaných).
Poznámky:
25
VÝPOČET pH KYSELIN, ZÁSAD A PUFRŮ
Klíčová slova: disociace silných kyselin a zásad, disociace slabých kyselin a zásad, disociace
solí, iontový součin vody, disociační konstanty kyselin a zásad, konjugovaný pár, amfolyty,
isoelekrický bod, pufr, koncentrace pufru, pufrační kapacita, pH, pOH, pKw, pKA, pKB, pI,
Henderson-Hasselbalchova rovnice.
Příklady k procvičování:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Vypočítejte pH vodných roztoků následujících kyselin:
a) kyselina octová c =2,5 mmol/l,
b) kyselina octová c =0,025 mol/l
c) kyselina uhličtá c = 1,2 mmol/l
d) kyselina mravenčí c = 44 mmol/l
e) fenol c = 0,7 mol/l
Vypočítejte pH vodných roztoků následujících bází:
a) amoniak c = 5.10-4 mol/l,
b) amoniak c = 50 mmol/l
c) anilin c = 0,01 mol/l
d) acetátový anion c = 100 mmol/l
Vypočítejte látkovou koncentraci hydroxoniových iontů ve vodném roztoku kyseliny
octové o pH = 2,87.
Vypočítejte látkovou koncentraci kyseliny kyanovodíkové ve vodném roztoku
o pH = 5,2.
Jakou hodnotu pKA má kyselina mléčná, když její vodný roztok o látkové koncentraci
10 mmol/l má pH = 2,93?
Jaká je látková koncentrace hydroxidových iontů ve vodném roztoku kyseliny octové
o látkové koncentraci 0,025 mol/l?
Jaká je látková koncentrace hydroxoniových iontů ve vodném roztoku pyridinu
o látkové koncentraci 100 mmol/l?
Vypočítejte pH vodného roztoku dusičnanu amonného o látkové koncentraci 0,05
mol/l.
Jaká je látková koncentrace kyanidu draselného ve vodném roztoku o pH = 11,35?
Jaké pH bude mít roztok kyseliny mléčné, který získáte tak, že 20x zředíte 10 ml
vodného roztoku kyseliny mléčné o látkové koncentraci 100 mmo/l? Kolik ml vody
přidáte?
Vypočítejte pH roztoku, který obsahuje 25 mmol kyseliny octové a 0,075 mol octanu
sodného.
V jakém poměru byly smíchány složky acetátového pufru, když hodnota jeho pH je
5,00?
Vypočítejte pH roztoku, který vznikne smícháním 500 ml roztoku dihydrogencitrátu
sodného a 250 ml roztoku kyseliny citrónové stejné látkové koncentrace.
Vypočítejte pH fosforečnanového pufru, který byl připraven smícháním 100 m1
roztoku hydrogenfosforečnanu draselného (c = 0,05 mol/l) a l00 ml roztoku
dihydrogenfosforečnanu sodného (c = 0,025 mol/l). Jaká je látková koncentrace tohoto
pufru?
Kolik g dihydrogencitrátu draselného použijete pro přípravu 100 ml roztoku, který
smícháním se 100 ml roztoku kyseliny citrónové o látkové koncentraci 0,1 mol/l
poskytne pufr o pH = 1,94?. Jaká bude látková koncentrace tohoto pufru po přidání
800 ml vody? Jaké pH bude mít takto získaný roztok?
26
16. Jaká bude látková koncentrace roztoku hydrogenfosforečnanu sodného a látková
koncentrace roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného, když smícháním 500 ml obou
roztoků získáme pufr o pH = 7,12, jehož osmolarita je stejná jako osmolarita
fyziologického roztoku chloridu sodného (c = 150 mmol/l)?
17. Jaké pH bude mít roztok připravený smícháním 150 ml roztoku kyseliny octové
o látkové koncentraci c = 0,2 mol/l a 100 ml roztoku hydroxidu sodného o hmotnostní
koncentraci 8 g/l?
18. O kolik jednotek se změní pH acetátového pufru (c = 0,4 mol/l, poměr látkových
koncentrací acetátu a kyseliny octové je 4:1), jestliže k 50 m1 pufru přidáte 10 m1
roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 0,4 mol/l)? O kolik jednotek se změní pH, jestliže
totéž množství roztoku kyseliny chlorovodíkové přidáte k 50 ml vody?
19. Kolik ml roztoku NaOH o látkové koncentraci 0,2 mol/l musíte přidat k 500 ml
fosforečnanového pufru (c = 180 mmol/l) o pH = 7,42, aby se jeho pH změnilo o 0,4?
Jaká bude koncentrace vzniklého pufru? O kolik jednotek se změní pH, jestliže totéž
množství roztoku NaOH přidáte k 500 ml vody?
Dodatky:
Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35 I = 127
Hodnoty pKA (25 °C) vybraných kyselin:
H2CO3 = 6,52,
NH = 9.25
C6H5OH = 9,89
HCOOH = 3,75
H2PO =7,12
HCN = 9,40
CH3COOH = 4,75
HPO = 12,32
k. citrónová = 2,94
Hodnoty pKB (25° C) vybraných bází:
NH3 = 4,75
C6H5NH2 = 9,38
CH3COOˉ = 9.25
C5H5N = 8,82
HPO = 6,88
CNˉ = 4 ,60
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
a) 3,68, b) 3,18, c) 4,72, d) 2,55, e) 5,45
a) 9,97, b) 10.97, c) 8,31, d) 8,87
0,00135 mol/l
0,1 mol/l
3,86
1,5.10-11 mol/l
8,13.10-10 mol/l
5,28
0,2 mol/l
pH = 3,08, 190 ml
5,23
1,78
3,24
pH = 7,42, 0,0375 mol/l
0,23 g, 0,011 mol/l, pH =1,94
120 mmol/l
5,05
27
18. o 0,42 jednotek (pH1 = 5,35, pH2 = 4,93), o 5,83 jednotek (pH = 1,17)
19. 75 m1, 0,157 mol/l, o 5,41 jednotek
Poznámky:
28
STECHIOMETRICKÉ VÝPOČTY, IONTOVÝ ZÁPIS CHEMICKÝCH
ROVNIC, IONTOVÉ ROVNICE
Klíčová slova: stechiometrie, iontový zápis, iontová rovnice, součin rozpustnosti,
disociace solí, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách.
Chemická rovnice:
Iontový zápis:
Iontová rovnice:
AgNO3 + NaCl  AgCl + NaNO3
Ag+ +NO + Na+ + Clˉ  AgCl + Na+ + NO
Ag+ + Clˉ  AgCl
Příklady na procvičování (chemické rovnice vyjadřujte iontovým zápisem):
1. Smrtelná dávka kyanidu draselného pro člověka je 200 mg. Kolik m1 kyanovodíku se
uvolní z tohoto množství působením kyseliny chlorovodíkové v žaludku?
2. Kolik mg oxalátu amonného potřebujete k vysrážení Ca2+ z 2 ml roztoku o látkové
koncentraci Ca2+ c=0.01 mol/l?
3. Maximální hodnota přípustné koncentrace dusitanů ve vodě je v České republice 0,1
mg/l. Kolik mmolů kyseliny dusité se uvolní z 0,1 mg dusitanu sodného reakcí s
kyselinou chlorovodíkovou?
4. Jakou hmotnostní koncentraci má roztok jodidu železnatého, když při titraci 10 ml
tohoto roztoku bylo spotřebováno 5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o látkové
koncentraci c=0,4 mol/l?
5. Při titraci 10 ml acetátového pufru o pH 5,75 bylo spotřebováno 40 ml kyseliny
chlorovodíkové (c = 0,25 mol/l). Jaká složka pufru se touto titrací stanoví? Jaká je její
koncentrace? Jaká je koncentrace pufru?
6. Koncentrace roztoku hydrogenuhličitanu se stanovuje zpětnou titrací nezreagované
kyseliny chlorovodíkové přidané v nadbytku. Jaká bude teoretická spotřeba roztoku
hydroxidu sodného (c = 0,4 g/l) použitého při zpětné titraci nezreagované kyseliny
chloorovodikové, když k 1 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného (c = 24 mmol/l
bylo přidáno 5 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 10 mmol)?
7. Vypočítejte o kolik jednotek se změní pH roztoku z původní hodnoty pH = 3, když
bylo do tohoto roztoku přidáno takové množství amoniaku, že koncentrace vzniklého
NH 4 byla 0,0009 mol/l.
8. Kolik mmolů vápenatých kationtů se uvolní ze 64 mg oxalátu vápenatého po přidání
20 ml kyseliny chlorovodíkové (c = 0,1 mol/l)?
9. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní z 84 mg hydrogenuhličitanu sodného reakcí
s 500 ml kyseliny chlorovodíkové o pH = 2?
10. Tableta Superpyrinu obsahuje 400 mg acetylsalicylátu hlinitého. Vypočítejte, kolik
mmolů kationtů hlinitých se uvolní v žaludku při podání tří tablet Superpyrinu.
11. Jakou osmolaritu bude mít roztok, který vznikne smícháním 10 ml roztoku rhodanidu
(thiokyanátu) draselného o osmolaritě 200 mmol osmoticky aktivních částic/l a 10 ml
29
roztoku chloridu železitého o osmolaritě 400 mmol osmoticky aktivních částic/l?
Jedním z produktů je chlorid thiokyanátoželezitý.
12. K 100 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l
přidáte 25 ml roztoku hydroxidu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l.
Vypočítejte hodnoty následujících veličin ve výsledném roztoku:
a) látková koncentrace dihydrogenfosforečnanu sodného
b) látková koncentrace hydrogenfosforečnanu sodného
c) látková koncentrace kationtů sodných
d) osmolarita
e) pH
Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (Ar) vybraných prvků:
Al = 27 Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35
I = 127
Klíč:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
68,9 ml
2,48 mg
0,0015 mmol
31 g/l
acetát, 1 mol/l, 1,1 mol/l
2,6 ml
1 jednotku
0,5 mmol
22,4 ml
2,13 mmol
250 mosmol/l
0,06 mol/l, 0,02 mol/l, 0,1 mol/l, 0,18 osmol/l, 6,64
Poznámky:
30
VLASTNOSTI A REAKCE BIOLOGICKY A TOXIKOLOGICKY
VÝZNAMNÝCH PRVKŮ A JEJICH SLOUČENIN
Klíčová slova: periodický systém, toxicita prvků a jejich sloučenin, disociace, kationty,
anionty, oxidační číslo, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách a zásadách,
součin rozpustnosti, iontový zápis, iontová rovnice, názvosloví, kvalitativní analýza,
skupinová činidla.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
zředěná kyselina chlorovodíková 1:1
nasycený vodný roztok sulfanu !JED!
nasycený vodný roztok sulfidu amonného
roztok uhličitanu amonného 1 mol/l)
roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l
roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/l !JED!
zředěná kyselina dusičná 1:1
zředěná kyselina sírová 1:1
koncentrovaný vodný roztok amoniaku
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŽÍRAVINA!
roztok chromanu draselného 0,25 mol/l
roztok jodidu draselného 0,5 mol/l
roztok chloridu amonného 1 mol/l
roztok ferrikyanidu draselného 0,01 mol/l
roztok thiokyanatanu draselného 0,3 mol/l
roztok hydrogenfosforečnanu sodného 0,3 mol/l
roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve
100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/1)
roztok difenylaminu v kyselině sírové 0,06 mol/l
roztoky vzorků obsahující zkoumané kationty
roztoky vzorků obsahující zkoumané anionty
roztoky vzorků neznámých sloučenin
31
Kvalitativní analýza:
Uvedený postup kvalitativní analýzy je vhodný pro poznání vlastností biologicky a
toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin. Zahrnuje pouze reakce, které jsou
potřebné k důkazu vybraných kationtů a aniontů.
Vybrané kationty:
Ag+, Pb2+, Hg 22 , Hg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ca2+, Ba2+, Mg2+, Na+, K+, NH 4
Vybrané anionty:
HCO 3 , CO 32 , PO 34 , Cl‾, I‾, SO 24 , NO 3
Kationty a anionty jsou rozděleny do skupin podle reakce s vhodně zvolenou látkou skupinovým činidlem. Toto činidlo tvoří sraženiny vždy jen s ionty příslušné skupiny.
Jednotlivé kationty a anionty ve skupinách se pak dokazují speciálními reakcemi.
Základní pravidla pro rozpustnost solí ve vodě:
Rozpustné sole:
a) obsahují anionty NO 3 , Cl‾ (mimo Ag+, Pb2+, Hg 22 ), SO 24 (mimo Ba2+, Pb2+).
b) obsahuji kationty Na+, K+, NH 4 .
Nerozpustné sole:
obsahuji anionty S2‾, CO 32 , HPO 24 a PO 34 (mimo Na+, K+, NH 4 ).
Sloučeniny obsahující hydrogenanionty jsou rozpustnější.
Sole slabých kyselin jsou rozpustné v roztocích silnějších kyselin, uvolní se původní slabá
kyselina.
Sole slabých bází jsou rozpustné v roztocích silnějších bází, uvolní se původní slabá báze.
POZOR! Pro jednotlivé reakce používejte maximálně 1 ml roztoku vzorků i činidel. Protože
jde pouze o kvalitativní reakce, není třeba objemy roztoků odměřovat!
32
ÚLOHA 1.
Důkaz vybraných kationtů
K uvedeným reakcím použijte připravené roztoky, které obsahují příslušný kation. Ke
každé reakci použijte nový roztok vzorku.
1.1. Kationty: Ag+, Pb2+, Hg 22
Skupinové činidlo je zředěná HCl. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě nerozpustné.
Také sulfidy těchto kationtů jsou nerozpustné ve vodě a nerozpouštějí se ani ve zředěných
silných kyselinách, protože jejich součiny rozpustnosti jsou extrémně nízké:
AgCl = 1,8.10-10
PbCl2 = 1,7.10-5
Hg2Cl2 = 1,3.10-18
K s:
Ag2S = 2,5.10-50
PbS = 2,5.10-27
Hg2S ~ 10-45
Ag2CrO4 = 1,1.10-12
Pracovní postup:
Ag+:
Ag+ + HCl

AgCl + H+
bílá sraženina rozpustná v NH3  [Ag(NH3)2]+
2 Ag+ + K2CrO4

Ag2CrO4 + 2 K+
červenohnědá sraženina
Pb2+ + 2 HCl
 PbCl2 + 2 H+
bílá sraženina rozpustná v horké vodě
Pb2+ + K2CrO4
 PbCrO4 + 2 K+
žlutá sraženina
Pb2+:
Hg 22 :
Hg 22 + 2 HCl
 Hg2Cl2 + 2 H+
bílá sraženina, reakcí s NH3 černá vyloučeným Hg2O
33
1.2. Kationty: Hg2+, Cu2+
Skupinové činidlo je H2S. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě rozpustné. Sulfidy jsou
nerozpustné ve vodě i ve zředěných silných kyselinách, protože součiny rozpustnosti těchto
sulfidů mají extrémně nízké hodnoty:
CuS = 8,5.10‾45
K s:
HgS = 1,6.10‾52:
Pracovní postup:
POZOR! Před přidáváním roztoku H2S vzorek okyselte několika kapkami zředěné HCl.
Hg2+:
Hg2+ + H2S
 HgS + 2 H+
černá sraženina nerozpustná v kyselinách
Hg2+ + 2 KI
 HgI2 + 2 K+
oranžovočervená sraženina
rozpustná v přebytku KI  K2[HgI4]
Cu2+ + H2S
 CuS + 2 H+
hnědočerná sraženina nerozpustná v kyselinách
Cu2+ + 2 NaOH
 Cu(OH)2 + 2 Na+
bleděmodrá sraženina
[Cu(NH3)4]2+
Cu2+:
rozpustná
v
NH3

1.3. Kationty: Zn2+, Fe2+, Fe3+
Skupinovým činidlem je (NH4)2S. Vzniklé sulfidy jsou ve vodě nerozpustné, ve
zředěných silných kyselinách jsou však rozpustné, protože hodnoty jejich součinů
rozpustnosti jsou vyšší:
ZnS = 6,9.10‾26
K s:
FeS = 3,7.10‾19
Pracovní postup:
POZOR! Před reakcí s (NH4)2S zkontrolujte pH vzorku zkoumaného roztoku.
Zn2+:
Zn2+ + (NH4)2S
 ZnS + 2 NH 4
bílá sraženina rozpustná v kyselinách
34
Fe2+:
Fe2+ + (NH4)2S
 FeS + 2 NH 4
černá sraženina rozpustná v kyselinách
Fe2+ + 2 NaOH
 Fe(OH)2 + 2 Na+
bílá sraženina, barví se modrozeleně a
hnědne oxidací na Fe(OH)3
Fe2+ + K3[Fe(CN)6]  "berlínská modř"
Fe3+:
2 Fe3+ + 3 (NH4)2S
 2 FeS + S + 6 NH 4
černá sraženina rozpustná v kyselinách
Fe3+ + 3 NaOH
 Fe(OH)3 + 3 Na+
hnědá sraženina
Fe3+ + KCNS
 [Fe(CNS)]2+ + K+
červený komplex
1.4. Kationty: Ca2+, Ba2+
Skupinovým činidlem je (NH4)2CO3. Uhličitany těchto kationtů jsou ve vodě
nerozpustné, ale rozpouštějí se ve zředěných roztocích silných kyselin. Sulfidy jsou ve vodě
rozpustné.
Tyto prvky mají schopnost již v nepatrném množství barvit nesvítivý plamen, jsou-li do
něj vneseny ve formě těkavých sloučenin. Na tomto principu je založena plamenová
fotometrie, umožňující rychlé stanovení některých prvků.
Pracovní postup:
POZOR! Před reakcí s (NH4)3CO3 zkontrolujte pH vzorku zkoumaného roztoku.
Reakce v plameni:
– Do zkumavky odlijte malé množství zředěné HCl, ponořte do ní platinový drátek a
vyžíhejte jej v nesvítivém plameni. Tento postup několikrát zopakujte, aby samotný
drátek plamen nebarvil.
– Po ochlazení namočte drátek do zkoušeného roztoku, vneste jej do plamene a
pozorujte jeho zbarvení.
Ca2+:
Kation vápenatý barví plamen oranžově.
Ca2+ + (NH4)2CO3

CaCO3 + 2 NH 4
bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách
Ca2+ + Na2HPO4

CaHPO4 + 2 Na+
Ba2+:
Kation barnatý barvi plamen světle zeleně.
35
Ba2+ + (NH4)2CO3

BaCO3 + 2 NH 4
Ba2+ + H2SO4

BaSO4 + 2H+
bílá sraženina nerozpustná v zředěných kyselinách
1.5. Kationty: Mg2+, Na+, K+, NH 4
Pro tyto kationty není žádné skupinové činidlo, jednotlivé kationty se dokazují
specifickými reakcemi.
Pracovní postup:
Mg2+:
K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte nejprve 1 ml roztoku NH 4Cl, aby se nesrážel
hydroxid hořečnatý.
Mg2+ + Na2HPO4 + NH3 
MgNH4PO4 + 2 Na+
bílá sraženina
Na+:
Kation sodný barví plamen žlutě.
K +:
Katíon draselný barví plamen fialově (zbarveni je výraznější při pozorování přes
kobaltové sklo).
NH 4 :
NH 4 + NaOH
 NH3 + Na+ + H2O
navlhčený universální indikátorový papírek zmodrá
(papírek držte pouze nad zkumavkou)
Poznámky:
36
ÚLOHA 2.
Důkaz vybraných aniontů
K uvedeným reakcím použijte připravené roztoky, které obsahují příslušný anion.
Reakce jednotlivých aniontů porovnejte s analogickými reakcemi používanými pro důkaz
kationtů v úloze 1.
2.1. Anionty: HCO 3 , CO 32 , PO 34
Skupinovým činidlem je Ba(NO3)2, který poskytuje s uvedenými anionty sraženiny,
rozpustné ve zředěných silných kyselinách.
Pracovní postup:
HCO 3 :
Roztok reaguje slabě alkalicky, pKB(HCO 3 ) = 7,48.
2 HCO 3 + Ba(NO3)2
 Ba(HCO3)2 + 2NO 3
nestálý, přechází na BaCO3
bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách
(uniká CO2)
CO 32 :
Roztok reaguje alkalicky, pKB(CO 32 ) = 3,6.
CO 32 + Ba(NO3)2
 BaCO3 + 2 NO 3
(uniká CO2)
2 PO 34 + 3 Ba(NO3)2
 Ba3(PO4)2 + 6 NO 3
PO 34
PO 34 + (NH4)2MoO4  po zahřátí vznikne žlutá sraženina fosfomolybdenanu
amonného
37
2.2. Anionty: Cl‾, I‾
Anionty této skupiny tvoří sraženinu s AgNO3, vzniklá sraženina je nerozpustná
ve zředěných kyselinách.
Pracovní postup:
Cl‾:
Cl‾ + AgNO3
 AgCl + NO 3
bílá sraženina rozpustná v NH3 [Ag(NH3)2]+
nerozpustná ve zředěných kyselinách
I‾ + AgNO3
 AgI + NO 3
žlutá sraženina nerozpustná v NH3 a nerozpustná ve
zředěných kyselinách
2.3. Anion SO 24 :
Tento anion tvoří sraženinu s Ba(NO3)2, vzniklá sraženina je nerozpustná ve
zředěných kyselinách.
Pracovní postup:
SO 24 :
SO 24 + Ba(NO3)2
 BaSO4 + 2 NO 3
bílá sraženina nerozpustná ve zředěných kyselinách
2.4. Anion NO 3
Tento anion netvoří sraženinu ani s Ba(NO3)2 ani s AgNO 3 .
Pracovní postup:
NO 3 :
K několika kapkám roztoku vzorku přidejte několik kapek roztoku difenylaminu. Objeví
se tmavěmodré zbarvení.
Poznámky:
38
ÚLOHA 3.
Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny.
V roztoku neznámé anorganické sloučeniny dokažte kation a anion. Podle postupu
uvedeného v úloze 3.1. a 3.2. nejdříve zjistěte, do jaké skupiny kationtů nebo aniontů patří
ionty analyzované sloučeniny. Příslušný kation a anion potom dokažte speciálními reakcemi
uvedenými v úloze 1. a 2. (použijte vždy nový roztok vzorku!). Nezapomeňte na zjištění
pH analyzovaného roztoku - tato informace vám pomůže při identifikaci neznámé
sloučeniny!
3.1. Analýza kationtů - zařazení do skupiny
Pracovní postup:
1 ml vzorku + HCl
sraženina
Hg 22 , Pb2+, Ag+
roztok
Hg2+, Cu2+
Zn2+, Fe2+, Fe3+
Ca2+, Ba2+
Mg2+, Na+, K+, NH 4
+ H2S v nadbytku
sraženina
Hg2+, Cu2+
roztok
Zn2+, Fe2+, Fe3+
Ca2+, Ba2+
Mg2+, Na+, K+, NH 4
39
1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH3
+ NH4Cl + (NH4)2S
sraženina
Zn2+, Fe2+, Fe3+
roztok
Ca2+, Ba2+
Mg2+, Na+, K+, NH 4
1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH3
+ NH4Cl + (NH4)2CO3
sraženina
Ca2+, Ba2+
–
roztok
Mg2+, Na+, K+, NH 4
Po zařazení kationtu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi
uvedenými v úloze 1.
40
3.2. Analýza aniontů - zařazení do skupiny
Pracovní postup:
1 ml vzorku + Ba(NO3)2
sraženina
roztok
PO 34 HCO 3 , CO3‾, SO 24
Cl‾. I‾, NO 3
+ zřeďená HCl
roztok
sraženina
PO 34
SO 24
+ AgNO3
sraženina
roztok
C1‾, I‾
NO 3
únik CO2
–
–
Po zařazeni aniontu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi uvedenými
v úloze 2.
Výsledek analýzy vzorku neznámé sloučeniny zapište do tabulky:
vzorek č.
pH
vzorec
název
Poznámky:
41
VLASTNOSTI A REAKCE FUNKČNÍCH SKUPIN BIOCHEMICKY
VÝZNAMNÝCH ORGANICKÝCH SLOUČENIN
Klíčová slova: hydroxysloučeniny, oxosloučeniny, alkoholy, aldehydy, ketony, oxidace
alkoholů, adiční reakce oxoskupiny, kyseliny, báze, fenoly, aminy, karboxylové kyseliny, soli,
estery, amidy, komplexní sloučeniny.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
methanol !JED!
ethanol
4% roztok formaldehydu
kyselina salicylová
kyselina šťavelová
70% roztok fenolu
močovina
dichroman draselný
koncentrovaná kyselina sírová !ŽÍRAVINA!
Schiffovo činidlo (roztok fialového barviva fuchsinu odbarveného hydrogensiřičitanem
sodným)
koncentrovaný roztok amoniaku
roztok chloridu vápenatého 0,1 mol/l
roztok chloridu železitého 0,05 mol/l
roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l
kyselina mléčná
42
ÚLOHA 1.
Oxidace alkoholů a aldehydů
Primární alkoholy se oxidují na karbonylové sloučeniny – aldehydy. V praxi se této
reakce využívalo např. při detekci ethanolu v dechu (oranžový dichroman draselný
v prostředí kyseliny sírové se v přítomnosti alkoholu redukuje na zelený síran chromitý,
zatímco ethanol se oxiduje na acetaldehyd). K průkazu aldehydů lze dále použít tzv.
Schiffova činidla (úloha 1.). Toto činidlo poskytuje reakcí s aldehydy barevnou sloučeninu
za vzniku tzv. Schiffovy báze (aldiminu) (úloha 5.).
Aldehydová skupina je přítomna v celém spektru biologicky významných
organických molekul (sacharidy). K jejímu funkčnímu průkazu se používá zpravidla tzv.
Fehlingovy zkoušky. Vinan měďnatý v alkalickém roztoku reaguje s aldehydem za vzniku
příslušné kyseliny, oxidu měďného a vinanu sodného (úloha 1.2.). Fehlingovo činidlo se
připravuje vždy těsně před použitím smícháním roztoků Fehling I (síran měďnatý) a Fehling
II (hydroxid sodný a vínan sodnodraselný) v poměru 1:1.
43
1.1. Reakce aldehydů se Schiffovým činidlem
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
–
–
Reakci proveďte s methylalkoholem i ethylalkoholem.
Do zkumavky dejte malé množství dichromanu draselného a velice opatrně přidejte
plastikovým kapátkem 5 kapek koncentrované kyseliny sírové.
Přilijte 1 ml alkoholu a opatrně promíchejte,
Zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni.
Na ústřižek filtračního papíru kápněte 1 kapku Schiffova činidla.
Nad ústím zkumavky přidržujte filtrační papír se Schiffovým činidlem, které se
vznikajícím aldehydem barví červenofialově.
Zapište chemickými rovnicemi oxidaci methanolu a ethanolu:
a)
b)
Poznámky:
44
1.2. Příprava a redukce Fehlingova činidla
.
Kyselina vinná, alifatická hydroxykyselina, tvoří velmi snadno komplexy s ionty kovů.
Nerozpustný hydroxid mědnatý přejde po přidání kyseliny vinné do roztoku, protože
vznikající komplexní sloučenina zabrání reakci Cu2+ s hydroxidovými anionty.
Komplexně vázaný Cu2+ se snadno redukuje na Cu+, který již komplexní ion netvoří.
Aldehydy, které se velmi snadno oxidují, vyredukují z tohoto roztoku nerozpustný červený
oxid měďný. Tato reakce je principem tzv. Fehlingova činidla.
Pracovní postup:
–
V jedné zkumavce si připravte asi 2 ml vodného roztoku kyseliny vinné.
–
Ve druhé zkumavce smíchejte 0,5 ml síranu měďnatého s 0,5 ml roztoku hydroxidu
sodného. Vznikne modrá sraženina hydroxidu mědnatého.
–
Potom přikapávejte roztok kyseliny vinné, dokud se sraženina nerozpustí.
Pozn. Vzhledem k nestabilitě vzniklého komplexu se Fehlingovo činidlo připravuje krátce
před použitím a to smícháním roztoků Fehling I (roztok síranu měďnatého 70g/l) a Fehling II
(250g hydroxidu sodného a 350g vinanu sodnodraselného v 1 litru vody) v poměru 1:1 a
důsledně se směs protřepe.
–
Přidejte 2 kapky formaldehydu a krátce zahřejte ve vroucí vodní lázni.
–
V přítomnosti aldehydu dojde k vyredukování červeného oxidu měďného.
Poznámky:
45
ÚLOHA 2.
Rozpustnost organických kyselin a jejich solí
2.1. Kyselina salicylová
Kyselina salicylová (prekurzor pro výrobu kys. acetylsalicylové) je špatně rozpustná
ve vodě, zatímco její sodná sůl se ve vodě rozpouští poměrně dobře.
Pracovní postup:
–
–
–
Do zkumavky dejte několik krystalů kyseliny salicylové, přidejte asi 1 ml vody a
protřepejte. Část látky zůstane nerozpuštěna.
Přidejte asi 2 ml roztoku hydroxidu sodného. Vzniklá sodná sůl je ve vodě rozpustná.
Reakci zapište formou iontového zápisu:
Poznámky:
46
2.2. Kyselina šťavelová
Ze solí kyseliny šťavelové je významný oxalát vápenatý, který je nerozpustný ve vodě,
ale rozpouští se ve zředěných silných kyselinách. Tvorba nerozpustného oxalátu vápenatého
je příčinou toxicity kyseliny šťavelové. Oxalát (šťavelan) vápenatý se může vyskytovat
v moči, kde tvoří snadno močové kameny.
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
Ve zkumavce rozpusťte ve vodě několik krystalů kyseliny šťavelové.
Vzniklý roztok zalkalizujte koncentrovaným roztokem amoniaku (použijte
plastikovou pipeptku). Zkontrolujte indikátorovým papírem pH (a).
Přidávejte po kapkách roztok chloridu vápenatého a pozorujte vznik bílé sraženiny (b).
Sraženinu oxalátu vápenatého rozpusťte přidáním zředěné kyseliny chlorovodíkové,
reakce probíhá kolem pH = 5 (c).
Všechny tři reakce označené a), b), c), vyjádřete formou iontového zápisu:
a)
b)
c)
Poznámky:
47
ÚLOHA 3.
Tvorba komplexních sloučenin
Reakce s chloridem železitým
Roztoky aromatických hydroxysloučenin poskytují s roztokem chloridu železitého
charakteristické barevné reakce, způsobené tvorbou komplexních sloučenin. Fialově
zbarvený roztok, vzniklý reakcí fenolu s chloridem železitým, se pod názvem Uffelmannovo
činidlo používal k průkazu kyseliny mléčné, patologicky přítomné v žaludeční šťávě.
Kyselina mléčná, stejně jako některé další alifatické hydroxykyseliny, tvoří snadno komplexy
s ionty kovů. Protože vazba Fe3+ s kyselinou mléčnou (chelátový ligand) je pevnější než jeho
vazba s fenolem, vytěsní kyselina mléčná fenol z jeho komplexu s chloridem železitým.
Pracovní postup:
–
–
–
–
Do zkumavky dejte 1 ml roztoku fenolu a přidejte 1–2 kapky roztoku chloridu
železitého. Roztok se zbarví fialově (Uffelmannovo činidlo).
Za míchání přikapávejte kyselinu mléčnou (použijte plastikové kapátko) do změny
fialového zbarvení na žluté (komplex kyseliny mléčné s Fe3+ je světle žlutý).
Analogicky jako s fenolem proveďte i reakci chloridu železitého s kyselinou
salicylovou, kterou v tomto případě rozpusťte v 1 ml ethanolu. Vznikne
červenofialový roztok komplexní sole.
Vysvětlete rozdíl ve zbarvení komplexů!
Poznámky:
48
ÚLOHA 4.
Močovina
4.1. Hydrolýza
Močovina (urea), látka velmi dobře rozpustná ve vodě, je diamid kyseliny uhličité. Proto
ji lze, jako jiné amidy, rozštěpit alkalickou hydrolýzou na amoniak a alkalickou sůl původní
kyseliny, v tomto případě uhličitan sodný.
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
Ve zkumavce rozpusťte malé množství močoviny v 1 ml vody.
Přidejte 2 ml roztoku hydroxidu sodného a protřepejte.
Reakční směs zahřívejte ve vroucí vodní lázni několik minut.
Přes ústí zkumavky položte navlhčený indikátorový papírek, který se unikajícím
amoniakem zbarví modře.
Alkalickou hydrolýzu močoviny zapište chemickou rovnicí;
Poznámky:
49
AMINOKYSELINY
Klíčová slova: funkční skupiny kyselé a bazické, izoelektrický bod, tvorba komplexních
sloučenin, nitrace, oxidace, redukce, hydrolýza bílkovin, rozdělovací rovnováhy, adsorpce,
látky polární a nepolární, afinita.
Reagencie:
POZOR! Reagencie ad 1) - 6) jsou určeny pouze pro chromatografii!
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
roztok glycinu 0,005 mol/l (standard)
roztok argininu 0,005 mol/l (standard)
roztok methioninu 0,005 mol/l (standard)
roztok alaninu 0,005 mol/l (standard)
vzorek - směs aminokyselin
vyvíjecí směs: chloroform, methanol, vodný roztok amoniaku 6 mol/l
v poměru 3 : 3 :1
kyselina glutamová
roztok tyrosinu 1,25 mmol/l
roztok tryptofanu 1,25 mmol/l
roztok kaseinu 5 g/l
roztok kyselého hydrolyzátu kaseinu 5 g/1
roztok želatiny 5 g/l
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l, !ŽÍRAVINA!
roztok ninhydrinu v butanolu 2 g/l
Millonovo činidlo (40 g rtuti v 57 ml koncentrované kyselině dusičné, po zahřátí
zředěno 2 objemy vody), !JED!
koncentrovaná kyselina dusičná, !ŽÍRAVINA!
koncentrovaná kyselina sírová, !ŽÍRAVINA!
Ehrlichovo aldehydové činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/1 v kyselině
chlorovodíkové 200 g/1)
roztok cysteinu 0,008 mol/l v HCl 1 mol/l
roztok cystinu 0,004 mol/l v HCl 1 mol/l
nitroprussid sodný
koncentrovaný vodný roztok amoniaku
nasycený vodný roztok sulfanu
síran amonný
50
ÚLOHA 1.
Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě
Chromatografie je souhrnným označením pro separační metodiky používané k dělení
směsi látek na základě jejich rozdílné afinity ke stacionární a mobilní fázi. Jednotlivé složky
směsi rozpuštěné v mobilní (pohyblivé) fázi jsou při průchodu přes stacionární
(zakotvenou) fázi v závislosti na svých fyzikálně-chemických vlastnostech v různé míře
„zbrzděny“ a dochází tak k jejich rozdělení. Mobilní fáze může být kapalina či plyn, zatímco
stacionární fáze je pevná látka (např. papír, Al2O3) nebo kapalina na pevném nosiči. Podle
druhu mobilní fáze se chromatografické metody dělí na dva základní typy: kapalinovou a
plynovou chromatografii.
Kapalinová chromatografie (LC; liquid chromatography):
K proudění mobilní fáze dochází za atmosférického tlaku, nízkého tlaku (FPLC; fast
protein liquid chromatography) nebo vysokého tlaku (HPLC; high-performance liquid
chromatography či high-pressure liquid chromatography), přičemž se vzrůstajícím tlakem
roste rychlost separace směsi látek.
K rozdělení směsi na jednotlivé složky dochází podle charakteru stacionární a mobilní
fáze na základě:
1) velikosti separovaných částic (kapalinová vylučovací chromatografie, gelová filtrace).
Tento typ chromatografie je používán k separaci syntetických nebo biologických polymerů
(proteinů, nukleových kyselin, polysacharidů). Stacionární fázi tvoří mikroskopické gelové
kuličky (agarosa, polyakrylamid, dextran) o definované porozitě, umístěné
v chromatografické koloně. Po nalití směsi látek do kolony pronikají do pórů stacionární fáze
pouze molekuly menší než je velikost pórů, čímž se jejich průchod kolonou zdrží. Frakce
jímané po průchodu kolonou tak obsahují látky s postupně klesající velikostí molekuly, tj.
kolonou nejrychleji prochází velké částice (srovnej s gelovou elektroforézou proteinů či
nukleových kyselin!).
2) náboje částic (iontoměničová či iontová chromatografie). Ionty (kationty, anionty) či
organické sloučeniny nesoucí elektrický náboj (proteiny, aminokyseliny, krátké
oligonukleotidy) jsou děleny na základě interakce s opačně nabitou stacionární fází.
Stacionární fáze je tvořena gelovými kuličkami (agarosa, celulosa) s kovalentně navázanými
funkčními skupinami nesoucími záporný (katex) či kladný (anex) náboj. Navázané složky
směsi mohou být následně ze stacionární fáze uvolněny např. promytím kolony roztokem
obsahujícím ionty se shodným nábojem jako izolovaná látka, čímž dojde k jejímu vytěsnění.
V klinické praxi je ionexová chromatografie užívána v diagnostice některých vrozených
poruch metabolismu např. k identifikaci aminokyselin.
3) hydrofobicity (chromatografie na reverzní fázi). Tento typ chromatografie slouží k
izolaci hydrofobních látek nesených hydrofilní mobilní fází. Stacionární fázi tvoří organické
sloučeniny s alifatickým uhlíkovým řetězcem (C4-C18, s délkou řetězce narůstá jejich
hydrofobní charakter). Navázané hydrofobní součásti dělené směsi látek jsou následně
uvolněny promytím kolony organickým rozpouštědlem (methanol, acetonitril).
51
4) vazebné specifity (afinitní chromatografie). K separaci látek ze směsi dochází na
základě vysoce specifické interakce separované látky se stacionární fází. Příkladem této
interakce je např. vazba ligand – receptor, antigen – protilátka či enzym – substrát.
V klinické biochemii a toxikologii je široce užívána HPLC díky své rychlosti (čas
separace méně než 1hodina), vysoké rozlišovací schopnosti, citlivosti (detekce pikomolárních
množství látek) a možnosti automatizace. Slouží k detekci a stanovení hladiny např.:
1) léků (antiarytmikum amiodaron, psychofarmaka jako např. alprazolam, amitriptylin,
diazepam, zolpidem atd.)
2) metabolitů hromadících se při vrozených či získaných defektech metabolismu
(katecholaminy, homocystein, porfyriny, puriny, pyrimidiny atd.)
3) vitamínů (koenzym Q10, vitamín E, A či jeho prekurzor beta karoten).
4) glykovaného hemoglobinu (HbA1c, jeden ze základních parametrů používaných
k hodnocení kompenzace pacientů s diabetes mellitus, viz Sacharidy II).
Plynová chromatografie (GC; gas chromatography):
Plynová chromatografie využívá jako mobilní fázi plyn. Skleněná či kovová kolona,
ve které separace probíhá, je umístěna v termostatu. Stacionární fáze je tvořena
mikroskopickou vrstvou kapaliny nebo pevnou látkou a mobilní fáze tzv. nosným plynem
(např. helium nebo dusík). Vzorek (kapalina či plyn) se vstřikuje do nástřikového portu,
v případě kapalného vzorku musí být nástřikový port předehřátý na dostatečně vysokou
teplotu, aby byl vzorek ihned po vstříknutí převeden na plynnou fázi. Nosný plyn unáší
vzorek přes kolonu, kde dochází k dělení jednolitých složek na základě jejich fyzikálněchemických vlastností a rozdílné interakce se stacionární fází. Po průchodu kolonou jsou
jednotlivé složky vzorku detekovány na detektoru, který je připojen na počítač. Časový
průběh detekovaného signálu představuje chromatogram tvořený souborem vrcholů, z nichž
v ideálním případě každý odpovídá jedné složce směsi. V klinické biochemii a toxikologii je
GC samotná či v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (MS) využívána k detekci a
kvantifikaci ethanolu a řady drog v tělních tekutinách.
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC; thin layer chromatography):
TLC představuje variantu kapalinové chromatografie, kde je stacionární fáze tvořena
tenkou vrstvou adsorbentu (silikagel, oxid hlinitý, celulosa) nanesenou na inertní destičku
(sklo, plastik, hliníková folie). Destička s nanesenými vzorky se umístí do chromatografické
vany s mobilní fází, která vzlíná po povrchu fáze stacionární. Nanesené vzorky se při
průchodu mobilní fáze v ní rozpustí a v závislosti na své polaritě/hydrofobicitě jsou s mobilní
fází unášeny. Pokud je stacionární fáze tvořena polárním silikagelem a mobilní fáze převážně
nepolárními rozpouštědly, je hydrofobní vzorek unášen dále než vzorek polární, který je
poután k silikagelu větší silou. Po ukončení chromatografie jsou separované látky přímo
viditelné, pokud separujeme směs barevných sloučenin, či u fluoreskujících látek po osvícení
desky UV zářením, v ostatních případech lze vizualizovat jednotlivé skvrny postříkáním
destičky vhodným detekčním činidlem. Při separaci směsi aminokyselin je detekce prováděna
pomocí ninhydrinu, který reaguje s volnými aminoskupinami za vzniku tmavě modrého nebo
fialového zabarvení (Ruhemanova violeť). Identifikaci jednotlivých složek směsi lze
následně provést stanovením tzv. retenčního faktoru (Rf) a jeho srovnáním s Rf standardních
vzorků. Rf se vypočítá podle vzorce:
Rf = vzdálenost vzorku od startu / vzdálenost čelo start
(Rf =1 mají látky putující s čelem mobilní fáze, Rf =0 látky zůstávající na startu)
TLC je v klinické praxi užívána k detekci a průkazu některých léčiv a především drog.
52
V této úloze budete pro dělení směsi aminokyselin používat chromatografii na tenké
vrstvě (TLC). Adsorbentem (stacionární fázi) je v tomto případě silikagel na hliníkové folii
(destičky Silufol), mobilní fází je směs rozpouštědel, mající pH blízko pI dělených
aminokyselin. Jednotlivé aminokyseliny ve směsi budete po detekci identifikovat pomocí
standardních vzorků aminokyselin.
Pracovní postup:
a
b
a = vzdálenost středu skvrny od startu
Rf =
b = vzdálenost čela rozpouštědla od startu
1. Arg
2. Gly
3. vzorek (směs AMK)
4. Ala
5. Met
 Na kratší straně destičky Silufol obyčejnou tužkou lehce vyznačte start (asi 2 cm od
okraje destičky) a pět bodů (po stranách destičky ponechte 1 cm), na které budete
nanášet roztoky AMK (viz schéma).
 Mikropipetkami naneste na příslušné body roztoky standardních AMK a vzorku
(opatrně, aby nedošlo k porušení tenké vrstvy!).
 Destičku vložte do chromatografické vany s připravenou mobilní fází. Start musí být
nad hladinou kapaliny.
 Vanu dobře přikryjte skleněným víkem.
 Když čelo rozpouštědla dosáhne do vzdálenosti 1-2 cm od horního okraje,
chromatogram vyndejte z vany.
 Čelo rozpouštědla označte tužkou a chromatogram sušte nad ploténkou (stupeň 6).
POZOR! Nespálit!
 Suchý chromatogram v digestoři detekujte postřikem roztokem ninhydrinu v butanolu
ze vzdálenosti asi 0,5 cm.
 Chromatogram zahřívejte asi 3 min nad ploténkou (stupeň 6). POZOR! Nespálit!
 Skvrny na chromatogramu odpovídající jednotlivým amininokyselinám obtáhněte
tužkou.
 Pomocí vypočítaných hodnot Rf standardů i vzorků identifikujte jednotlivé AMK.
Vzorek č.: …. obsahoval tyto AMK:
Poznámky:
53
ÚLOHA 2.
Barevné reakce aminokyselin
Tyto reakce se používají k důkazu aminokyselin. Velmi citlivá ninhydrinová reakce je
pro aminokyseliny obecná (s výjimkou prolinu) a využívá se nejen k jejich důkazu (detekce
aminokyselin při chromatografii, viz úloha 1.), ale i k jejich fotometrickému stanovení.
Ostatní reakce jsou specifické pouze pro aminokyseliny určité struktury.
2.1. Ninhydrinová reakce
Kondenzací aminokyselin se dvěma molekulami ninhydrinu (hydrát indantrionu)
vzniká modrofialově zbarvený produkt.
Pracovní postup:
 Připravte si vroucí vodní lázeň.
 K 1 ml roztoku tyrosinu přidejte 0,5 ml roztoku ninhydrinu v butanolu, promíchejte.
 Reakční směs zahřívejte asi 5 min ve vroucí vodní lázni. Po chvíli se objeví v horní
organické vrstvě růžové až modrofialové zbarvení.
 Tutéž reakci vyzkoušejte i s kyselým hydrolyzátem kaseinu.
54
Poznámky:
55
Následující reakce 2.2.2.4, proveďte s tyrosinem, tryptofanem, kyselým
hydrolyzátem kaseinu (indolové jádro je v kyselém prostředí nestabilní!), kaseinem a
želatinou. Všechny výsledky provedených reakcí zapište do tabulky 1.
2.2. Reakce s koncentrovanou kyselinou dusičnou
Aromatické aminokyseliny poskytují reakcí s kyselinou dusičnou žlutě zbarvené
nitrosloučeniny. Tyrosin a tryptofan se za těchto podmínek nitrují zvlášť snadno.
V alkalickém prostředí se zbarvení změní na oranžové, protože vznikne alkalická sůl
tautomerní formy nitrosloučeniny. Stejnou reakci poskytují i bílkoviny, obsahující tyto
aminokyseliny s aromatickým jádrem (xanthoproteinová reakce).
Pracovní postup:
 Do zkumavky odlijte 1 ml zkoumaného roztoku a z dávkovače přidejte 0,5 ml
koncentrované kyseliny dusičné.
 Zahřívejte ve vroucí vodní lázni (případně vzniklá sraženina se rozpustí) do vzniku
žlutého zbarvení.
 Zkumavku ochlaďte pod tekoucí vodou.
 Opatrně přikapávejte plastikovou pipetkou roztok hydroxidu sodného až do vytvoření
oranžového zbarvení.
2.3. Reakce s Millonovým činidlem
Sloučeniny, obsahující v molekule hydroxyskupinu vázanou na aromatické jádro,
poskytují s Millonovým činidlem komplexní rtuťnatou sůl svých nitroderivátů .
Pracovní postup:
 K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou 5 kapek Millonova činidla.
 Vzniklou bílou sraženinu zahřívejte ve vroucí vodní lázni do objevení červeného
zbarveni komplexní rtuťnaté soli.
56
2.4. Reakce s Ehrlichovým činidlem
K důkazu tryptofanu se využívá kondenzační reakce indolového jádra s oxoskupinou
aldehydu, obsaženého v Ehrlichově činidle. Produkty této reakce jsou v kyselém prostředí
fialově zbarveny.
Pracovní postup:
 K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou několik kapek Ehrlichova
činidla a protřepejte.
 Z dávkovače přidejte pomalu po stěně zkumavky 1 m1 koncentrované kyseliny
sírové. V pozitivním případě vznikne na rozhraní obou vrstev fialový prstenec lépe
viditelný proti bílému pozadí.
Tabulka 1.
AMK
HNO3
Millon
Ehrlich
tyrosin
tryptofan
hydrolyzát kaseinu
kasein
želatina
Poznámky:
57
ÚLOHA 3.
Reverzibilní redox systém cystein - cystin
Sloučeniny obsahující -SH skupinu tvoří v alkalickém prostředí s nitroprussidem sodným
(pentakyanonitrosylželezitan sodný) červenofialově zbarvenou komplexní sloučeninu.
Pracovní postup:
 Ve zkumavce si připravte asi 3 ml roztoku nitroprussidu sodného rozpuštěním velmi
malého množství látky ve vodě.
 Dále si připravte tři zkumavky.
 Do první zkumavky odlijte 1 ml vodného roztoku sulfanu.
 Do druhé zkumavky odlijte 1 ml roztoku cysteinu.
 Do třetí zkumavky odlijte 1 ml roztoku cystinu.
 Do všech třech zkumavek přidejte 1 ml roztoku nitroprussidu sodného.
 Za míchání roztok nasyťte síranem amonným.
 Roztoky ve všech třech zkumavkách pomalu alkalizujte amoniakem a pozorujte vznik
barevné komplexní sloučeniny.
 Asi po 5 min porovnejte zbarvení ve všech třech zkumavkách a výsledky
zaznamenejte do tabulky 2.
 Vysvětlete průběh jednotlivých reakcí.
Tabulka 2.
sloučenina
sulfan
cystein
cystin
zbarvení
Poznámky:
58
BÍLKOVINY I
Klíčová slova: biuret, peptidová vazba, koloidní roztok, izoelektrický bod, amfionty,
amfolyty, amfotéry, vliv pH na ionizaci bílkovin, hydrofilní a hydrofobní skupiny, emulgace,
reverzibilní a irreverzibilní srážení bílkovin.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
roztok kaseinu 10 g/1 ve fyziologickém roztoku
roztok vaječného bílku ve fyziologickém roztoku (1:10)
roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l
slunečnicový olej
roztok octanu olovnatého 0,01 mol/l !JED!
roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l
koncentrovaná kyselina dusičná
roztok Ajatinu zředěný 1:4
roztok kyseliny octové 0,15 mol/l
roztok kyseliny octové 1,5 mol/l
chlorid sodný
fyziologický roztok (roztok chloridu sodného 0,15 mol/l)
krevní sérum zředěné fyziologickým roztokem (1 : 1)
roztok močoviny 3 mol/l a laktátu lithného 0,2 mol/l
roztok dusičnanu stříbrného 0,06 mol/l
činidlo pro stanovení močoviny (kyselina sírová 0,9 mol/l + 1 tableta
diacetylmonoxinu 0,05 mmol/l do 50 ml vody)
70% roztok fenolu
roztok chloridu železitého 0,05 mol/l
roztok hydrogenuhličitanu sodného 0.4 mol/l
roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/ !JED!
Molischovo činidlo (roztok 1-naftolu v ethanolu 3 g/l)
koncentrovaná kyselina sírová !ŽÍRAVINA!
koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŽÍRAVINA!
roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve
100 ml vody + 100 ml kyseliny dusičné 320 g/l)
59
ÚLOHA 1.
Biuretová reakce
Biuret je látka vznikající tepelnou kondenzací dvou molekul močoviny za uvolnění
amoniaku a vzniku vazby –CO-NH-.
2 NH2–CO–NH2  NH2–CO–NH–CO–NH2 + NH3
Biuret, stejně jako ostatní sloučeniny, obsahující dvě nebo více peptidových
(amidových) vazeb, tvoří s ionty Cu2+ fialově zbarvenou komplexní sloučeninu (chelát).
Biuretová reakce se používá k průkazu i kvantitativnímu stanovení látek ve kterých
jsou přítomné vazby –CO-NH-, tedy i bílkovin.
V alkalickém prostředí tvoří bílkoviny s měďnatými kationty komplexní sole, které
jsou fialově zbarveny. Volné elektronové páry pro tvorbu komplexu poskytují
elektronegatívní atomy peptidové vazby CONH. Název reakce je odvozen od biuretu
POZOR! Při nadbytku Cu2+ je fialové zbarvení překryto modrou sraženinou hydroxidu
mědnatého.
Pracovní postup:
 Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok
protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku.
 Ke každému roztoku bílkoviny přilijte 1 ml roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l.
 Do obou zkumavek přidávejte po kapkách roztok síranu měďnatého až do vzniku
fialového zbarvení.
60
Poznámky:
61
ÚLOHA 2.
Emulgační schopnost bílkovin
Protože bílkoviny obsahují hydrofilní i hydrofobní skupiny, mají emulgační
schopnosti podobně jako jiné tenzidy. Tenzidy, které jsou součástí detergentů, snižují
povrchové napětí na rozhraní hydrofilní a hydrofobní fáze. Jejich účinkem vzniká poměrně
stabilní emulze tuků ve vodě. Tato vlastnost bílkovin, především albuminu, se uplatňuje při
transportu hydrofobních látek krví (např. mastných kyselin, steroidních hormonů, bilirubínu).
Přirozenou emulzí tuků ve vodě je mléko, v němž bílkoviny působí jako emulgátor.
Pracovní postup:
 Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku bílku a 1 kapku slunečnicového oleje. Po
protřepání se vytvoří emulze.
 Do druhé zkumavky odlijte 1 ml destilované vody a 1 kapku slunečnicového oleje. Po
protřepání se obě vrstvy opět oddělí.
Poznámky:
62
ÚLOHA 3.
Ireverzibilní srážení bílkovin
Denaturace je změna konformace nativní molekuly bílkoviny, která tím přechází na
méně uspořádanou formu a ztrácí svou biologickou funkci. Denaturačně působí všechny
vlivy, které porušují nekovaletní interakce vytvářející sekundární a terciární strukturu
bílkovin.
Mezi fyzikální vlivy patří především rozptýlení bílkoviny na velkém povrchu (pěněním
roztoků) a zvýšená teplota. Srážení varem nastává nejrychleji v okolí pI bílkovin. K chemické
denaturaci dochází např. působením silných kyselin, které ruší iontové interakce změnou
náboje, naproti tomu organická rozpouštědla a tenzidy narušují nepolární interakce.
Primárním účinkem všech denaturačních činidel je rozvinutí peptidového řetězce, snížení
solvatace molekuly a tím i rozpustnosti bílkoviny.
Srážení bílkovin, při kterém dochází k denaturaci bílkovin, může být vyvoláno např. i
ionty těžkých kovů, které s bílkovinami vytvářejí sole nebo komplexní sloučeniny. Díky této
schopnosti se mohou bílkoviny používat jako antidotum při otravách těžkými kovy.
Denaturace bílkovin koncentrovanou kyselinou dusičnou se využívala jako Hellerova
zkouška pro důkaz bílkovin v moči. V současné době se používá reakce s kyselinou
sulfosalicylovou, která je nejcitlivější. Podobný účinek na bílkoviny jako kyselina
sulfosalicylová mají i další silné organické kyseliny např. kyselina trichloroctová nebo
pikrová, které slouží jako deproteinační činidla.
Denaturaci způsobují i kvartérní alkylamoniové sole, které vytvářejí s negativně
nabitými ionty bílkovin těžce rozpustné soli. Na tomto jevu jsou založeny desinfekční účinky
Ajatinu (kvartérní amoniové sole s alkylem C8C18 jako substituentem). Podobnou strukturu
a tedy i vlastnosti má i další desinfekční prostředek Septonex. Kationty těchto tenzidů se
adsorbují na buněčné stěny mikrobů, denaturují jejich životné důležité bílkoviny a tím blokují
transportní funkci membrány mikrobů.
Ajatin, Benzododecinií bromidum:
CH3

RN+CH2C6H5Brˉ

CH3
R = C8C18
63
POZOR! V následujících úlohách používejte jako bílkovinu roztok vaječného bílku.
3.1. Srážení těžkými kovy
Pracovní postup:
 Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok octanu
olovnatého dokud nevznikne sraženina. V nadbytku soli se sraženina rozpustí.
3.2. Srážení kyselinami
Pracovní postup:
 Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a přidejte několik kapek roztoku kyseliny
sulfosalicylové, vytvoří se bílá sraženina.
3.3. Srážení Ajatinem
Pracovní postup:
 Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok Ajatinu, dokud
nevznikne sraženina.
3.4. Srážení varem
Pracovní postup:
 Do 5 zkumavek odlijte 1 ml bílkoviny a další reagencie dle návodu:
zkumavka 1  pouze bílkovina
zkumavka 2  přidejte kapku kyseliny octové 0,15 mol/l
zkumavka 3  přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l
zkumavka 4  přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l a malé množství
chloridu sodného
zkumavka 5  přidejte několik kapek roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l
 Zkumavky povařte ve vodní lázni.
 Výsledky zapište do tabulky 1., vznik sraženiny označte +.
Tabulka 1.
zkumavka
1
2
3
4
5
sraženina
Poznámky:
64
ÚLOHA 4.
Důkaz některých složek bílkovin
4.1. Důkaz cukerné složky Molischovou zkouškou
Mnoho bílkovin (např. řada plazmatických bílkovin) patří mezi glykoproteiny. Jejich
prostetickou skupinu lze dokázat obecnou reakcí pro důkaz sacharidů - Molischovou
zkouškou. Reakce je založena na dehydrataci sacharidů účinkem silných kyselin. Produkty
této dehydratace snadno kondenzuji s fenoly na barevné sloučeniny.
Pracovní postup:
 Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku séra, přidejte přibližně 0,5 ml Molischova činidla,
promíchejte.
 Po stěně zkumavky pomalu přidejte z dávkovače 1 ml koncentrované kyseliny sírové,
aby došlo k podvrstvení roztoku. Na styčné ploše obou vrstev se v přítomnosti
sacharidů vytvoří fialový prstenec.
4.2. Důkaz kyseliny fosforečné ve fosfoproteinech
K důkazu lze použít reakci s molybdenanem amonným, která je vhodná k důkazu
anorganického fosfátu stejně jako pro důkaz kyseliny fosforečné ve fosfolipidech (viz
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha
2.1. )
Pracovní postup:
 Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok
protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku.
 Ke každé bílkovině přidejte z dávkovače 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové a
protřepejte.
 Po 2 min přidejte do každé zkumavky 1 ml roztoku molybdenanu amonného a
zahřívejte na vodní lázni asi 2 min. V přítomnosti fosfoproteinů vznikne žlutý až
oranžový zákal, případně sraženina. `
Poznámky:
65
ÚLOHA 5
Dialýza
Dialýza je proces, který umožňuje pomocí polopropustné membrány oddělovat z roztoku
látky nízkomolekulární od látek vysokomolekulárních. Na jejím principu je založena funkce
umělé ledviny, kdy krev protéká soustavou dialyzačních trubic omývaných roztokem o
specifickém složení iontů. Je samozřejmé, že ionty i ostatní nízkomolekulární látky mohou
membránou procházet oběma směry.
Schéma uspořádání:
Pracovní postup:
 POZOR! Pro důkazy používejte vždy max. 1 ml roztoku!
 Připravte si vroucí vodní lázeň pro důkaz dialyzovaných látek a fosforečnanů (viz
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin,
úloha 2.1)
 Jeden konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na vnitřní okraj kádinky pro
dialýzu.
 Ve zkumavce smíchejte 1 ml séra, 2 ml roztoku močoviny a laktátu, přidejte 9 ml
fyziologického roztoku.
 7 ml takto připraveného roztoku vlijte do dialyzační trubice připevněné kolíčkem ke
kádince. Zbytek roztoku použijte k důkazu látek přítomných v roztoku před dialýzou.
 Druhý konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na protilehlou stranu kádinky.
 Do kádinky nalijte roztok hydrogenuhličitanu sodného tak, aby dialyzovaný roztok
byl ponořen ve vodě, dialýzu nechte probíhat 20 min.
 Zbývající množství původního roztoku rozdělte do pěti zkumavek.
66
 V první zkumavce dokažte přítomnost chloridových iontů reakcí s roztokem
dusičnanu stříbrného (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných
prvků a jejich sloučenin, úloha 2.2.).
 Ve druhé zkumavce dokažte přítomnost bílkovin reakcí s roztokem kyseliny
sulfosalicylové (viz Bílkoviny I, úloha 3.2.).
 Ve třetí zkumavce dokažte přítomnost močoviny: k 1 ml roztoku přidejte 2 ml činidla
pro důkaz močoviny a zkumavku zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni. Přítomnost
močoviny se projeví vznikem červeného zbarvení. Tato reakce se rovněž používá i ke
kvantitativnímu stanoveni močoviny v séru.
 Ve čtvrté dokažte, zda jsou přítomny hydrogenuhličitany reakcí s roztokem dusičnanu
barnatého (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a
jejich sloučenin, úloha 2.1.)
 V páté zkumavce dokažte přítomnost laktátu reakcí s Uffelmannovým činidlem:
k 1 ml roztoku fenolu přidejte 1 až 2 kapky chloridu železitého (roztok se zbarví
fialově).
 Stejnými reakcemi dokažte přítomnost uvedených látek v dialyzátu i dialyzovaném
roztoku po dialýze.
 Výsledky zapište do tabulky I.
Tabulka 1.
roztok
Clˉ
HCO 3
močovina
laktát
bílkoviny
dialyzovaný roztok před
dialýzou
dialyzát
dialyzovaný roztok po
dialýze
Poznámky:
67
BÍLKOVINY II
Klíčová slova: elektroforéza, izoelektrický bod, amfolyty, vliv pH na ionizaci bílkovin,
peptidová vazba, biuretová reakce, krevní plazma, krevní sérum, bílkoviny krevní plazmy,
hypoproteinemie, hyperproteinemie, onkotický tlak, transportní proteiny, reverzibilní a
irreverzibilní srážení bílkovin, iontová síla.
Reagencie:
1. souprava Hydragel protein, SEBIA:
a) Tris-barbitalový pufr pH 8,5
b) barvící lázeň – roztok amidočerni
c) odbarvovací lázeň – roztok kys. citronové 0,05 g/l
2. standardní lyofilyzované bílkoviny pro ELFO ředěné fyziologickým roztokem dle
komerčního návodu
3. vzorky krevního séra
4. souprava Celkové bílkoviny, BioSystems:
a) biuretové činidlo:
síran mědnatý 0,015 mol/l
hydroxid sodný 1,0 mol/l
Chelaton IIl 0,018 mol/l
b) standardní roztok bílkoviny (koncentrace standardu podle aktuálního zadání)
5. souprava Albumin, Biosystems:
a) pracovní roztok pro stanovení albuminu:
bromkresolová zeleň 0,27 mmol/l
citrátový pufr 0,1 mol/l, pH 4,1
b) standardní roztok albuminu (koncentrace standardu podle aktuálního zadání)
6. souprava QuikRead CRP, Orion diagnostika
68
ÚLOHA 1.
Elektroforéza bílkovin
Elektroforéza je separační metoda umožňující rozdělit ve stejnosměrném elektrickém
poli směs látek, které mají v roztoku elektrický náboj. Částice látek rozpuštěných v pufru
o určitém pH migrují v nosiči k elektrodě s opačným nábojem. Rozdělení směsi, dané
pohyblivostí částic, závisí na napětí mezi elektrodami, na typu nosiče, na velkosti částice a
jejím náboji závislým na pH použitého pufru (při fyziologickém pH existuje většina proteinů
ve formě aniontů). Pomoci připojeného densitometru lze odečíst po obarvení i množství látky
v jednotlivých oddělených frakcích (viz Lipidy III, úloha 7.).
Elektroforéza má široké použití nejen ve vědeckém výzkumu, ale je nepostradatelnou
metodou i v klinicko-biochemických laboratořích.
V této úloze budete používat pro elektroforézu bílkovin zařízení SEBIA. Proteiny jsou
děleny na agarosovém gelu v Tris-barbiturátovém pufru o pH 8,5. Elektroforeogram je
barven roztokem amidočerně.
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Úmístěte Hydragel K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu a zvedněte část
s očíslovanými zuby (obr. A).
Naneste 120 µl destil. vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru.
Z obalu vyjmětě agarosovou plotnu a rychle ji osušte filtračním papírem.
Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku – gelem k sobě.
Gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem
bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. B).
Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou
v horní poloze.
Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. C).
Do jamek aplikátoru napipetujte rychle 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat
během 2 min.
Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru.
Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči, čísla musí směřovat k obsluze (obr. D).
Pomalu snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu.
Po 40 sec. aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte.
Gelovou plochu vložte do migrační elektroforetické komory podle polarity vyznačené
na gelu – dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte
plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru (asi 1 cm).
Připojte dělící komoru ke zdroji proudu.
PODMÍNKY DĚLENÍ
Objem pufru ke každé elektrodě
Celkový objem pufru
Čas dělení
Konstantní napětí
Počáteční proud (na gel)
–
SEBIA K20
150 ml
300 ml
20 min
90 V
12 ± 3 mA
Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu.
69
–
–
–
–
–
Gel osušte v sušičce při 80° C asi 10 min.
Usušený gel ponořte do barvícího roztoku amidočerně na 4 min.
Odbarvěte ve 3 po sobě následujících lázních odbarvovacím roztokem (kys.
citronové), dokud není pozadí zcela bezbarvé.
Odsajte přebytečnou tekutinu z gelu filtračním papírem a vysušte gel při 80° C.
Vyhodnoťte gel denzitometrem při 570 nm.
70
ELEKTROFORÉZA PLAZMATICKÝCH BILKOVIN
Obr.4. Elektroforéza plazmatických bílkovin
FRAKCE
Albumin
Alfa-1 globuliny
Alfa-2 globuliny
Beta-1 globuliny
Beta-2 globuliny
Gama-globuliny
NORMÁLNÍ HODNOTY
59,4 – 74 %
1,2 – 3,1 %
7,0 – 12,2 %
4,9 – 9,4 %
1,6 – 5,6 %
6,9 – 14,7 %
Poznámky:
71
ÚLOHA 2.
Stanovení koncentrace bílkovin v séru
Krevní plazma obsahuje asi 100 různých proteinů, podle jejich elektroforetických
vlastností jsou obvykle rozdělovány do 5 různých skupin - albumin a 1, 2-, ß- a γglobuliny. Bílkoviny krevní plazmy kromě svých specifických funkcí zajišťují koloidně
osmotický (onkotický) tlak, který má význam pro udržení normálního objemu krve. Dále se
podílejí na udržování acidobazické rovnováhy a transportu lipofilních látek a iontů kovů.
Většina plazmatických bílkovin je syntetizována v játrech (mimo imunoglobuliny a
proteohormony). S výjimkou albuminu jsou bílkoviny krevní plazmy glykoproteiny.
Za fyziologického stavu jsou plazmatické proteiny ve vzájemné rovnováze a neustále se
obnovují. Za patologických stavů dochází k porušení této rovnováhy, a tím i ke změnám
jejich koncentrace a vzájemného zastoupení jednotlivých frakcí (dysproteinemie) (viz
úloha 1.). Koncentrace celkových bílkovin je snížená (hypoproteinemie) při jejich nedostatku
v potravě, nedostatečném vstřebávání nebo syntéze, při jejich zvýšené spotřebě (např.
u dlouhodobých infekčních onemocněních nebo u nádorových procesů) nebo ztrátě (u
nefrotického syndromu, u popálenin, při silném krvácení). Zvýšená koncentrace bílkovin
(hyperproteinemie) bývá např. při dehydrataci nebo paraproteinemii.
Koncentrace celkové bílkoviny se stanovuje v krevním séru, jednou z používaných
metod je biuretová reakce (viz. Bílkoviny I, úloha 1.). Intenzita modrofialového zbarvení
komplexu se stanovuje spektrofotometricky a je přímo úměrná počtu peptidových vazeb.
Jinou možností je UV spektroskopie, využívající absorbanci peptidové vazby při 280 nm.
Pracovní postup:
 Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.
 Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 1., malé objemy pipetujte ke dnu
zkumavky!
Tabulka 1.
reagencie (ml)
sérum
standardní roztok bílkoviny
destilovaná voda
biuretové činidlo
vzorek
0,02
–
–
1,5
standard
–
0,02
–
1,5
slepý vzorek
–
–
0,02
1,5




Každou zkumavku dobře promíchejte.
Přesně po 12 min změřte absorbanci při 540 nm proti slepému vzorku.
Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2.
Z průměrných hodnot absorbance vzorku (Avz) a standardu (Ast) vypočítejte
koncentraci celkové bílkoviny (g/l) v určeném séru.
 Výsledek zapište do tabulky 2.
72
Tabulka 2.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (g/l)
standard PROT
sérum
Poznámky:
73
ÚLOHA 3
Stanovení koncentrace albuminu v séru
Nejdůležitějším proteinem v krvi je z kvantitativního pohledu albumin (tvoří 60 % všech
bílkovin krevní plazmy). Fyziologická funkce albuminu spočívá v regulaci plazmatického
objemu, dále plní transportní funkci (přenáší např. mastné kyseliny, lipidy, bilirubin, některé
hormony, vitaminy, ionty kovů, léky i toxické látky). Má i funkci rezervní bílkoviny a při
zátěži organismu slouží jako bohatá rezerva aminokyselin, zvláště esenciálních.
Zvýšená koncentrace albuminu v krvi (hyperalbuminemie) bývá obvykle jen sekundární
následek dehydratace. Hypoalbuminemie doprovází mnoho onemocnění (např. infekce,
choroby jater, nefrotický syndrom), biochemickou příčinou je bud' snížení jeho syntézy nebo
zvýšení jeho odbourávání.
Albumin se řadí mezi tzv. negativní proteiny akutní fáze podobně jako transferrin,
glykoprotein přenášející krevní plazmou železo jako Fe3+. V akutní fázi je jejich koncentrace
v plazmě nižší, protože na jejich úkor připadá zvýšená syntéza pozitivních proteinů akutní
fáze (např. C-reaktivní protein).
Ke stanovení albuminu je také vhodné sérum. Běžná metoda využívá reakce albuminu
s bromkresolovou zelení, která tvoří s albuminem, v slabě kyselém prostředí a za přítomnosti
povrchově aktivních látek, barevný komplex vhodný k fotometrování (s globuliny nereaguje).
Pracovní postup:
 Stanovení albuminu proveďte ve stejném séru, ve kterém jste stanovovali koncetraci
bílkovin.
 Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.
 Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3., malé objemy pipetujte ke dnu
zkumavky!
74
Tabulka 3.
reagencie (ml)
vzorek
standard
slepý vzorek
sérum
0,01
–
–
standardní roztok albuminu
–
0,01
–
destilovaná voda
–
–
0,01
pracovní roztok
1,0
1,0
1,0





Každou zkumavku dobře promíchejte.
Nechte inkubovat 10 min při pokojové teplotě.
Změřte absorbanci vzorku i standardu při vlnové délce 630 nm proti slepému vzorku.
Naměřené hodnoty zapište do tabulky 4.
Z průměrných hodnot absorbance vzorku (Avz) a standardu (Ast) vypočítejte
koncentraci albuminu (g/1) v určeném séru.
 Výsledek zapište do tabulky 4.
Tabulka 4.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (g/l)
standard ALB
sérum
VYHODNOCENÍ:
Tabulka 5.
vzorek séra č.:
stanovovaná bílkovina
REFERENČNÍ
HODNOTY
celková bílkovina (g/l)
65 - 85
albumin (g/l)
35 - 53
NAMĚŘENÉ HODNOTY
75
ÚLOHA 4.
Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v séru
C-reaktivní protein (CRP) je markerem akutní fáze zánětu. Normálně je přítomen
v séru zdravých lidí v nízkých koncentracích - méně než 6 mg/l. Je produkován játry, jeho
plazmatická koncentrace se zvyšuje již během 6–12 hodin po vypuknutí zánětlivého procesu
a maxima dosahuje za 24–48 hodin. Vzestup koncentrace může být až 1000x vyšší proti
fyziologické hodnotě. Stanovení CRP pomáhá určit, zda se jedná o infekci bakteriální nebo
virovou a zvolit odpovídající způsob terapie. Zda zánět probíhá a v jaké fázi, určuje
monitorování CRP. Vzhledem k tomu, že zánětlivým procesem reaguje náš organismus
prakticky na cokoliv, jsou zvýšené bílkoviny akutní fáze a tedy i CRP poměrně častým
nálezem. K jejich zvýšení dochází u infekcí jakéhokoliv původu, pooperačních stavů,
u nádorových onemocnění i u autoimunitních chorob. Vyšší plazmatická koncentrace CRP
také predikuje riziko infarktu myokardu nebo mozkové mrtvice.
CRP byl objeven v roce 1930 Tilletem a Francisem, kteří zjistili, že séra některých akutně
nemocných osob precipitují kapsulární C polysacharid bakterie Streptococcus pneumoniae.
Sérový faktor, způsobující precipitaci, byl později identifikován jako protein a označen jako
C-reaktivní protein. CRP aktivuje klasickou cestu komplementu a má funkci jako opsonin
v leukocytové fagocytóze, stimulaci lymfocytů nebo aktivaci monocytů/makrofágů.
CRP koncentrace v séru se zvyšují a snižují rychleji než sedimentace erytrocytů (FW),
jako odpověď na změny ve stavu pacienta. Přetrvávající zvýšení hladiny CRP v plazmě
indikuje neustávající zánět a obvykle znamená neúspěšnou terapii a špatnou prognózu (např.
u maligních onemocnění, infekce a infarktu myokardu).
Malé zvýšení CRP má predikční hodnotu pro výskyt kardiovaskulárních příhod
u pacientů s koronárním srdečním onemocněním a stejně tak i u osob dosud zdravých.
Ukazuje se, že má větší prognostický význam než hladina HDL a LDL.
Stanovení koncentrace CRP je založeno na měření tvorby komplexu antigenu a
protilátky. Reakci rozpustného antigenu s odpovídající protilátkou můžeme prokázat vznikem
precipitátu v roztoku, V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu antigen-protilátka
úměrné koncentraci přítomného antigenu. Stupeň zákalu roztoku se kvantitativně měří
pomocí imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie.
Pracovní postup:
 Zapněte přístroj – na displeji se objeví NAČTĚTE KARTU a poté PŘIPRAVEN
K MĚŘENÍ
 Připravte si kyvetu s pufrem, sejměte ochranný kryt.
 Sestavte si kapiláru – vsuňte píst do kapiláry tam, kde je na kapiláře modrý proužek.
 Proveďte odběr krve z prstu, otřete první kapku se stopami desinfekce.
 Přiložte kapiláru a další kapku krve nechte navzlínat po bílou zátku (20 ul), kapiláru
zvenku pečlivě otřete.
 Vložte kapiláru se vzorkem krve do kyvety s pufrem a vytlačte krev pístem.
 Uzavřete kyvetu víčkem, které vyndáte z tuby. Pozor zatím nepromáčkněte modrý
střed. Razantně promíchejte obsah kyvety – nepřevracejte kyvetu dnem vzhůru –
obsah kyvety bude červeně čirý.
 Vložte kyvetu do přístroje – na displeji se objeví MĚŘENÍ BLANKU (slepé
zkoušky). Je-li vše v pořádku, asi po 30 s se na displeji objeví PŘIDEJTE
ČINIDLO a VYNDEJTE KYVETU
76
 Promáčkněte modrý střed kyvety, která je stále v přístroji. Kyvetu vyndejte z přístroje
a pečlivě promíchejte její obsah převracením dna vzhůru. Na displeji mezitím probíhá
hlášení PROTŘEPEJTE OBSAH KYVETY.
 Až se na displeji objeví hlášení VLOŽTE KYVETU, neprodleně vložte kyvetu
s promíchaným obsahem zpět do přístroje.
 Na displeji mezitím probíhá hlášení PROBÍHÁ MĚŘENÍ a během dvou minut se na
displeji objeví výsledek koncentrace CRP v jednotkách mg/l.
Poznámky:
77
ENZYMY
Klíčová slova: biokatalýza, aktivita enzymu, holoenzym, apoenzym, koenzym,
substrátová a reakční specifita enzymu, pH-optimum, sacharasa (EC 3.2.1.26), α-amylasa
(EC 3.2.1.1.), iontová síla.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
roztok sacharasy (50 g kvasnic ve 100 ml ethanolu 500 g/1)
roztok α-amylasy (sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes gázu)
roztok škrobu 10 g/l
suspenze celulosy 2,5 g/l
roztok sacharosy 5 g/l
Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l
Fehlingův roztok II (125 g hydroxidu sodného a 175 g vinanu sodnodraselného v 1 l
vody)
Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/1 v roztoku jodidu draselného 40 g/l) 50x zředěný
9.
souprava ALP (BioSystems):
a) pufr N-methyl-D-glukamin, pH 10,1
b) substrát 4-nitrofenylfosfat 92 mmol/l
c) inhibitor EDTA 30 mmol/l v roztoku hydroxidu sodného 1 mol/l
10. sérum
78
-amylasa
-amylasa (-1,4-glukan-4-glukan-hydroláza, EC 3.2.1.1) patří mezi glykosidasy.
Glykosidasy náleží mezi hydrolytické enzymy, které jsou specifické vůči typu glykosidové
vazby (α-glykosidasy nebo - glykosidasy) a sacharidu. Pomalu a nespecificky štěpí také
inulin. Slinná α-amylasa je -glykosidasa a štěpí α-1,4-D-glukosidové vazby v substrátech
obsahujících tři a více D-glukosových zbytků spojených vazbou α-1,4.
V organismu je α-amylasa přítomna ve formě dvou izoenzymů kódovaných dvěma
geny ležícími ve stejném lokusu (1p21). Podílí se na trávení sacharidů štěpením škrobu,
částečně již v ústní dutině (slinná α-amylasa, S-amylasa), především však v duodenu
(pankreatická α-amylasa, P-amylasa). Hladina celkové -amylasy je zvýšena u onemocnění
akutní pankreatitidou, ale i u většiny případů bolestí břicha. Pro diagnostiku pankreatitidy má
vyšší diagnostický přínos stanovení pankreatického izoenzymu (P-amylasy). Protože je
molekula α-amylasy relativně malá, přestupuje do moči a můžeme její patologické zvýšení
u akutní pankreatitidy detekovat i v moči. Toto zvýšení přetrvává déle a nastupuje později
než zvýšení hladiny v séru. S-amylasa je zvýšena u onemocnění slinných žláz.
Sacharasa z kvasnic štěpí β-fruktosidovou vazbu mezi fruktosou a glukosou v sacharose,
která je α-D-glukopyranosyl-β-D-fruktofuranosid.
Cílem této úlohy je prokázat přítomnost produktů štěpení slinnou α-amylasou a
sacharasou. Produkty hydrolytické reakce budou mít volné anomerní hydroxylové skupiny, a
tudíž budou redukovat Fehlingovo činidlo. Polysacharidy můžeme prokázat reakcí
s Lugolovým činidlem (roztok jodu), zatímco produkty enzymatické hydrolýzy tuto reakci
neposkytují.
79
ÚLOHA 1.
Důkaz substrátové specifity glykosidas (sacharasy a α-amylasy)
Pracovní postup:
POZOR! Substráty před použitím protřepejte!
– Jako -amylasu použijte sliny l0x zředěné destilovanou vodou a přefiltrované přes
gázu.
– Do označených zkumavek připravte směs substrát - enzym podle tabulky 1.
– Nechte 30 min inkubovat při 37° C, potom reakci ukončete vyndáním z vodní lázně.
– S polovičním množstvím inkubační směsi z každé zkumavky proveďte reakci
s Fehlingovým činidlem (poměr činidlo : inkubační směs = 1:1).
–
– Ve zkumavkách, ve kterých byl jako substrát polysacharid, proveďte také reakci s
jodem.
– Stejnou reakci s jodem proveďte i s nativními polysacharidy a porovnejte zbarvení.
– Výsledky zaneste do tabulky 1. pomocí symbolů + a –.
Tabulka 1.
zkumavka
škrob (ml)
1
1
celulosa (ml)
sacharosa (ml)
sacharasa (ml)
-amylasa (ml)
Fehlingova reakce
reakce s jodem
2
4



1

0,25

5
1
6
8



0,25

1

1



1
0,25



0,25

0,25

0,25
Poznámky:
ÚLOHA 2.
80
Stanovení Michaelisovy konstanty (Km) pro enzym alkalická
fosfatasa
Michaelisova konstanta s určitou dávkou zjednodušení odráží afinitu enzymu
k substrátu. Čím je její hodnota nižší, tím vyšší je afinita k příslušnému substrátu. Číselně tato
hodnota odpovídá koncentraci substrátu, při které je rychlost reakce rovna polovině rychlosti
maximální (limitní). Pro určení Km se měří počáteční rychlost enzymové reakce při nejméně
pěti různých koncentracích substrátu, ležících v rozmezí alespoň jednoho řádu zvolené
koncentrační oblasti, všechny ostatní faktory (pH, teplota a množství enzymu) musí být
konstantní. Ze získaných hodnot sestrojíme graf závislosti počáteční rychlosti reakce na
koncentraci substrátu (saturační křivka podle Michaelise a Mentenové).
Graf 1. Závislost A na [S].
Jelikož z tohoto grafu se Km nedá přímo přesně odečíst, vyneseme do grafu i reciproké
hodnoty koncentrace substrátu a rychlosti (linearizace podle Lineweavera a Burka). V místě
kde nám graf protne osu x získáme hodnotu -1/Km.
81
Graf 2. Závislost 1/A na 1/[S].
Enzym reagující s různými substráty má pro jednotlivé substráty různou hodnotu Km.
Např. Km alkoholdehydrogenasy pro ethanol je menší než pro methanol. Tento rozdíl se
využívá při léčbě otravy methanolem. Také izoenzymy, katalyzující reakci s jedním
substrátem, se mohou lišit hodnotou Km. Glukokinasa, fosforylující glukosu v jaterních
buňkách, má Km asi 10 mmol/l, kdežto hexokinasa, která je přítomná ve všech buňkách, má
Km pro glukosu asi 0,1 mmol/1. Tuto skutečnost využívá organismus jako jednu z možností
regulace metabolismu glukosy.
Alkalická fosfatasa (ALP) v lidském organismu
Alkalická fosfatasa odštěpuje fosfátové skupiny (zbytky kyseliny fosforečné) především
z molekul proteinů a nukleových kyselin. Enzym má pH optimum v alkalické oblasti. ALP se
vyznačuje velkou tkáňovou nespecifitou a vyskytuje se téměř ve všech tkáních těla ve formě
izoenzymů a enzymových izoforem, například v játrech, ledvinách, kostech, střevě a placentě.
Isoenzymy ALP jsou kódováné 4 geny: ALP-L (L,B,K), ALP-I, ALP-P, ALP-PL
(GALP). Tentýž gen může produkovat izoformy, které se liší stupněm glykace a sacharidovou
strukturou.
1. Tkáňově nespecifická alkalická fosfatasa (TNAP), ALP-L/B/K nebo také jaterní
zahrnuje 3 základní izoformy lišící se glykací: játra L (L1,2), kost (B), ledvina (K)
L (liver) - je částečně inaktivována (30 %) při 56°C/10 min
B (bone) – je úplně inaktivována při 65°C/10 min
2. Intestinální alkalická fosfatasa, ALP-I (I1-3), vyskytuje se ve 3 izoformách a je tvořena
vě střevu. Není glykosylovaná a je inhibována L‑fenylalaninem.
3. Placentární alkalická fosfatasa se vyskytuje ve 2 izoformách:
a) ALP-P (P1) tvořená v placentě. Je glykosylovaná a termostabilní
Zvýšeně je exprimována na konci 3. trimestru
b) Pseudoplacentární alklalická fosfatasa, (Placenta Like Alkaline Phosphatase –
PLAP, ALP-PL, ALP-P2) je glykosylovanou dimérní izoformou ALP-P,
82
produkovánou především v germinálních buňkách – GALP (germinal alkaline
phosphatase) a embryonální tkáni. Vyskytuje se také v testis, thymu a určitých
nádorech z germinálních buněk, např. seminom, embryonální karcinom
Tabulka č. 3 ukazuje základní charakteristiky izoenzymů a izoforem ALP:
Tabulka 3. Vliv teploty a inhibitorů na izoenzymy AP:
Izoenzym AP
Teplota
PLAP/GCAP
stabilní ještě při 70°C
IAP
Kostní izoforma TNAP
stabilní ještě při 56°C
labilní při 55°C
Jaterní izoforma TNAP
Ledvinová izoforma TNAP
Specifické inhibitory
neuramidáza, deoxycholát sodný,
L-fenylalanin
L-fenylalanin. L-tryptofan
L-homarginin.
při 55°C stabilnější než
neuramidáza, deoxycholát
kostní izoforma
sodný
labilní již při 45°C
Příslušné izoenzymy a isoformy alkalické fosfatasy ukazuje obrázek č. 1.
Obrázek č. 1. Genová lokalizace, isoenzymy a izoformy alkalické fosfatasy
ALP-L (jaterní) se učastní transportních procesů přes membránu a je vázána v
cytoplasmatické membráně hepatocytů přivrácené do žlučových cest.
83
ALP-B (kostní) je součástí membrány osteoblastů, účastní tvorby kostní architektuy a podílí
se na zabudovávání Ca2+.
ALP-K (ledvinová, kidney) je lokalizovaná vo membráně ledvinových tubulárních buněk
ALP-I (střevní) se podílí na přenosu mastných kyselin a absorpci Ca 2+.
Normální zastoupení ALP v krvi (séru, plasmě):
ALP-L (L1,2)
– 30 - 50 %
ALP-B
– 60 - 70 %
ALP-K
– normálně se v séru nevyskytuje
ALP-I (I1-3)
–
<20 %
ALP-P (P1,2)
– objevuje se v těhotenství
Aktivita ALP v séru se zvyšuje v důsledku mnoha patologických stavů a pro správnou
diagnostiku je nutné odlišit tkáň, ze které detekovaný enzym pochází. Zvýšení jaterní ALP je
charakteristické pro obstrukci žlučových cest. Důvodem této obstrukce je nejčastěji žlučový
kámen nebo zhoubný nádor bránící volnému odtoku žluči. Aktivita kostní ALP se zvyšuje
v důsledku některých kostních chorob (osteomalacie, Pagetova choroba, osteblastické
sarkomy). ALP je fyziologicky je vyšší u dětí a mění se s věkěm.
Patologické změny v zastoupení ALP v krvi (séru, plasmě):
ALP-L – cholestáza, zánět žlučových cest (cholecystitis a cholangoitis), hepatopatie,
nádory – zejména hepatom
ALP-B – osteosarkom (osteoblastický), osteopatie, systémové choroby, některé nádory;
terapie osteoporózy
ALP-I – diabetes mellitus, nádory střeva, jaterní cirhosa, renální insuficience
ALP-P – epiteliální karcinom ovaria, žaludku, pankreatu, sarkomy
Při stanovení Km alkalické fosfatasy se sleduje počáteční rychlost štěpení různých
koncentrací substrátu (4-nitrofenylfosfátu) konstantním množstvím enzymu. Přírůstek
produktu reakce 4- nitrofenolu je úměrný rychlosti enzymové reakce.
84
Pracovní postup:
Do 6 označených zkumavek „eppendorf“ nařeďte substrát dle tabulky 3.
Napipetujte do zkumavky č. 1 0,6 ml neředěného substrátu.
Do "eppendorfek" 2 - 6 napipetujte 0,3 ml destilované vody.
Z "eppendorfky" č. 1 odpipetujte 0,3 ml základního roztoku substrátu do
"eppendorfky" č. 2 a promíchejte.
– Od "eppendorfky" č. 2 postupujte při ředění substrátu analogicky vždy odpipetujte
0,3 ml roztoku z předcházející "eppendorfky" do následující a dobře promíchejte.
–
–
–
–
Tabulka 3.
zkumavka č.
4-nitrofenylfosfát
1
2
3
4
5
6
substrát
ředění 1
ředění 2
ředění 3
ředění 4
ředění 5
substrát
ml
0,6
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
destil. voda
ml
–
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
c mmol/l
92
46
23
11,5
5,75
2,88
– Do 7 nových skleněných zkumavek napipetujte 1 ml pufru - do zkumavky č. 1  6
přidejte 0,02 ml séra.
– Zkumavky 1 - 7 inkubujte ve vodní lázni 5 min při 37 C.
– Z každé "eppendorfky" 1 – 6 odpipetujte 0,2 ml substrátu do skleněných zkumavek.
Zkumavky nevyndávejte z vodní lázně!
– Dodržujte 30 sec interval mezi přidáním do jednotlivých zkumavek.
– Do zkumavky č. 7 (slepá zkouška) napipetujte 0,2 ml neředěného substrátu
(92 mmol/l).
– Zkumavky inkubujte 15 min při 37° C.
– V 30 sec intervalech vyndávejte zkumavky z vodní lázně a do každé zkumavky
přidejte 0,5 ml roztoku inhibitoru.
– Do zkumavky č. 7 ( slepá zkouška ) napipetujte 0,02 ml séra.
– Do 30 min změřte absorbanci při 420 nm proti slepé zkoušce  výsledky zapište do
tabulky č. 4.
85
Tabulka č 4.
zkumavka č.
1
2
3
4
5
6
[Sr]
15,00
7,50
3,77
1,88
0,94
0,47
A
1/[S]
1/A
[Sr] je výsledná koncentrace substrátu v reakční směsi, tj. koncentrace připravených
zásobních roztoků substrátu vynásobená 0,164 (0,2/1,22).
– Na milimetrový papír sestrojte ze získaných hodnot (S], A, 1/[S] a 1/A dva grafy a
určete hodnotu Km jako látkovou koncentraci 4-nitrofenolu.
Závislost A na [S] (exp.):
Hodnotu Km odečtěte na ose x jako souřadnici průsečíku spojnic odpovídajících
hodnot A a [S].
86
Závislost 1/A na 1/[S] (exp.):
Hodnotu –1/Km zjistěte z úseku na ose x, který vytíná přímka proložená
experimentálními body.
 Výsledky zapište do tabulky 5 a porovnejte získané hodnoty K m.
Tabulka 5.
graf
Km (mmol/l)
1
2
Poznámky:
87
NUKLEOVÉ KYSELINY I
Klíčová slova: biopolyméry, DNA, RNA, nukleoproteiny, vysolování.
Reagencie:
1. Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega:
a) Cell Lysis Solution
b) Nuclei Lysis Solution
c) Protein Precipitation Solution
2. isopropanol
3. 70% ethanol
4. redestilovaná voda (ddH2O)
88
ÚLOHA 1.
Izolace genetického materiálu
Prvním krokem molekulárně-biologických analýz je izolace genetického materiálu –
DNA a RNA. Práce s genetickým materiálem přináší některé zvláštní aspekty. Detekcí
dědičných, charakteristik genetického materiálu konkrétního jedince se získávají velmi citlivá
osobní data, se kterými je nutné zacházet náležitým způsobem. Na rozdíl od většiny
biochemických vyšetřeni, která jsou dynamickým obrazem aktuálního dění v těle vyšetřované
osoby, vyšetření genetického materiálu přináší informace o neměnných charakteristikách
jedince, nebo i celých rodin.
Izolace DNA
Izolaci genomové DNA lze provést z libovolného materiálu obsahujícího jaderné buňky.
Nejčastěji je genomová DNA izolována z periferní nesrážlivé krve, kde se nachází
v leukocytech. Při izolaci DNA z tkání je nejprve nezbytné rozrušit tkáň na jednotlivé buňky
(tento krok odpadá při izolaci DNA z krve / kostní dřené nebo buněčné suspenze), lyzovat
cytoplazmatickou a jadernou membránu buněk a uvolnit DNA z nukleoproteinových
komplexů. DNA se následně z roztoku vysráží pomocí isopropanolu nebo ethanolu. Sražená
DNA se po vysušení rozpustí v redestilované vodě.
Pro izolaci genomové DNA použijeme Wizard® Genomic DNA Purification Kit firmy
Promega).
Izolace probíhá ve čtyřech krocích:
1. lýza erythrocytů pomocí Cell Lysis Solutio
2. lýza leukocytů a jejich jader pomocí Nuclei Lysis Solution
3. precipitace proteinů účinkem Protein Precípitation Solution
4. vysrážení DNA isopropanolem
Práce s genetickým materiálem klade vysoké nároky na přesnost a čistotu laboratorních
postupů. Základem většiny analýz nukleových kyselin je amplifikace cílového úseku
DNA/cDNA. Amplifikace znamená zmnožení cílové sekvence v řádech 10 5  107. Z tohoto
důvodu je nezbytné zachovávat přísně sterilní podmínky (práce v rukavicích, sterilní roztoky,
sterilní zkumavky, špičky), aby analyzovaný genetický materiál nebyl kontaminován
cizorodou DNA (např. jiným vzorkem), nebo DNA z "vnějšího prostředí".
89
Izolace DNA z bukální sliznice
Dnes se pro molekulárně genetické vyšetření stále častěji používá stěru z bukální
sliznice, který je zcela neínvazivní a je snadno proveditelný i neodborníkem. Pro izolaci se
používají výše uvedené reagenční systémy.
Pracovní postup:
 Vzorky bukální sliznice získejte stěrem buněk bukálni sliznice krouživým pohybem
pomocí speciální stěrky Před odběrem si vypláchněte ústa vodou. Doporučená doba
mezi odběrem a posledním příjmem potravy je nejméně 10 min.
 Stěrku vložte do 2 ml zkumavky s 300 µl Nuclei Lysis Solution a 10 µl Proteinasy K,
ulomte horní část stěrky.
 Zkumavku protřepejte na vortexu a inkubujte 15 min při 65° C.
 Centrifugujte 1 minutu při 13 000 ot./min (maximální rychlost).
 Supernatant odpipetujte do nové 1,5 ml zkumavky, roztok je viskózní.
 Připipetujte 100 µl Protein Precipitation Solutíon a ihned intenzívně zvortexujte 20 s.
 Centrifugujte 3 minuty maximální rychlostí.
 Opatrně odpipetujte supernatant obsahující DNA do čisté eppendorfky. Pelet se
zkumavkou vyhoďte.
 K supernatantu přidejte 300 µl isopropanolu a zkumavku opatrně obracejte, dokud
neuvidíte formující se sraženinu DNA.
 Centrifugujte 4 min maximální rychlostí.
 Na dně je viditelný pelet DNA. Supernatant opatrné slijte do odpadní kádinky tak,
abyste nevylili pelet a osušte ústí eppendorfky na filtračním papíru.
 K peletu připipetujte 300 µl 70% ethanolu. Eppendorfku několikrát jemně převraťte
pro omytí peletu.
 Centrifugujte 1 min maximální rychlostí.
 Supernatant opatrně slijte do odpadní kádinky. Osušte opatrně vnitřek eppendortky
filtračním papírem srolovaným pomocí pinzety do ruličky tak, abyste se nedotkli
peletu.
 Otevřenou eppendorfku otočte dnem vzhůru a nechte stát na stole, dokud se neodpaří
zbytky ethanolu (cca 10 minut). K peletu DNA připipetujte 40 µl redestilované H 2O.
 Zkumavku uzavřete a jemně zvortexujte
 Opatřete zkumavku přiděleným číslem a odevzdejte praktikovému asistentovi.
 Izolovaná DNA se uchovává při 4° C pro další analýzy.
Poznámky:
90
NUKLEOVÉ KYSELINY II
Klíčová slova: nukleové kyseliny, DNA, integrita, spektrofotometrie absorpční maximum,
gelová elektroforéza.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř , 0,25% xylencyanol , 30% glycerol)
TAE pufr ( Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l)
2,5% agarosový gel v 1 x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium)
redestilovaná H2O (ddH2O)
91
ÚLOHA 1.
Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin
Pro další analýzy je nutné určit koncentraci izolované nukleové kyseliny a ověřit její
čistotu a kvalitu - integritu (neporušenost).
Koncentrace nukleových kyselin se určuje spektrofotometricky. Nukleové kyseliny
absorbují v důsledku přítomnosti dusíkatých bází v ultrafialové oblasti spektra s absorpčním
maximem při 260 nm. Pro určení koncentrace vycházíme z toho, že při měření v 1 cm kyvetě
je optická denzita:
1 OD260 nm dsDNA = 50 µgml-1
1 OD260 nm RNA = 40 µgml-1
1 OD260 nm ssDNA = 33 µgml-1
Vzhledem k tomu, že izolované nukleové kyseliny mohou být často kontaminovány
proteiny, které dosahují absorpčních maxim při 280 nm, provádíme při stanovení koncentrace
nukleových kyselin i vyhodnocení poměru OD260 nm/280 nm. Tento poměr by u čistého roztoku
DNA měl dosahovat hodnot kolem 1,8.
K ověření integrity nukleové kyseliny slouží gelová elektroforéza. Elektroforézu lze
provádět v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Výběr gelové matrice záleží na délce
analyzované nukleové kyseliny. Pro běžné analýzy DNA používáme agarosový gel, který je
schopen separovat DNA fragmenty od 100 bp do 20 kbp. Pro fragmenty kolem 100 bp a
kratší a pro analýzy proteinů používáme gely založené na bázi akrylamidu.
Určení velikostí analyzované DNA/RNA se provádí porovnáním s velikostním
standardem DNA/RNA o známé délce fragmentů. Pro vizualizaci dvouřetězcových
nukleových kyselin se užívá eihidiumbromid - interkalační činidlo, které se vmezeřuje mezi
planárně orientované báze DNA/RNA spojené vodíkovými můstky (obr. 5.).
Po prosvětlení gelu UV světlem emituje ethidiumbromid viditelné jasně oranžové světlo
v místech jeho vysoké koncentrace, tedy v místech, kde se nachází DNA.
Obr. 5. Vizualizace nukleových kyselin pomocí ethidiumbromidu.
Pro vizualizaci dvouřetězcové i jednořetězcové DNA nebo RNA v agarosových i
polyakrylamidových gelech lze místo mutagenního ethidiumbromidu použít fluorescenčního
barviva GelRed, které má navíc i vyšší citlivost.
92
1.1. Měření koncentrace DNA
Pracovní postup:
1.1.1. Měření na spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)
–
Zvedněte „vzorkové rameno“ přístroje a pipetou (0 – 2 µl) naneste na dolní měřící
plošku 1 µl vzorku DNA (viz obr.)
 Přiklopte „vzorkové rameno“ a na obrazovce počítače odečtěte koncentraci vzorku
DNA a poměr její čistoty 260/280 nm.
 Před dalším měřením obě měřící plošky otřete čtverečkem buničiny.
1.1.2. 1.1.1. Měření na spektrofotometru Jenway Genova
 Zkumavku se vzorkem DNA krátce promíchejte na vortexu a zcentrifugujte.
 Do sterilní označené 0,5 ml eppendorfky napipetujte 190 µl redestilovné H 2O a
přidejte 10 µl DNA.
 Promíchejte na vortexu a zcentrifugujte při 13 000 ot/min.
 Do spektrofotometrické 100 µl mikrokyvety odměřte 100 µl roztoku DNA a změřte
OD260 nm a OD280 nm. Výsledek zapište do tabulky 1.
 Z mikrokyvety odsajte pipetou zpět 100 µl roztoku DNA.
 Vypočítejte koncentraci DNA podle vzorce:
cDNA µg/ml] = OD260 nm x 50 x ředění
 Vyhodnoťte čistotu DNA pomocí poměru OD260 nm/280 nm.
93
Tabulka 1.
vzorek č.
OD260 nm
OD280 nm
µg/ml
OD260 nm/280 nm
1.2. Kontrola integrity DNA elektroforézou v agarosovém gelu
Vzorek smíchaný s vzorkovým pufrem se nanáší do jamek v agarosovém gelu
umístěného v elektroforetické vaně obsahující lx TAE pufr. Vzorkový pufr obsahuje glycerol,
který je zde proto, aby při pipetování vzorku klesal vlivem zvýšené hustoty roztok
analyzované DNA na dno jamky. Barevná komponenta ve vzorkovém pufru je směs dvou
barev – bromfenolové modři a xylencyanolu a slouží pro vizuální kontrolu migrace molekul
v průběhu elektroforézy. Bromfenolová modř se pohybuje stejnou rychlostí jako dsDNA
o velikosti 300 bp, kdežto xylencyanol jako dsDNA dlouhá 4 kb. Pohyb molekul DNA v gelu
ve stejnosměrném elektrickém poli (7 V/cm délky gelu) závisí nepřímo na logaritmu délky
DNA fragmentů.
Pracovní postup:
 Do označené 0,2 ml eppendorfky napipetujte 3 µl modrého vzorkového pufru a 3 µl
vaší DNA.
 Promíchejte na vortexu a krátce zcentrifugujte při 13 000 ot/min.
 Naneste celý objem vzorku (6 µl) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve
vaně s 1 x TAE pufrem.
 Zaznamenejte si číslo jamky (zleva) s vaším vzorkem DNA.
 Připojte elektroforetickou vanu na zdroj el. proudu (cca 100 V).
 Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu.
 Vyjměte gel a zkontrolujte jej pod UV světlem.
Poznámky:
94
NUKLEOVÉ KYSELINY III
Klíčová slova. genetický kód, polymerasová řetězová reakce - PCR, RT-PCR, real-time PCR,
polymorfismus, bodové mutace, apolipoprotein E, restrikční enzymy, rekogniční místo,
restrikční fragmenty, palindrom, fragmenty s kohezními a tupými konci, izoschizomery,
gelová elektroforéza, ethidiumbromid.
Reagencie:
1. mastermix [obsahuje 1 U Faststart Taq DNA Polymerase (Roche), 2,5 µl 10x PCR
buffer, 2,5 µl 50x dTP (2,5 mM každého]
2. restrikční mix (APOE) : 10x restrikční pufr s MgCl2, bovinní sérový albumin
v koncentraci 1 µg/µl a 0,25 U restrikční endonukleasy HhaI),
3. vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol)
4. TAE pufr (Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l)
5. 2,5% agarosový gel v 1x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium)
95
PCR – polymerasová řetězová reakce
Podstatou PCR je opakující se enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků
dvouřetězcové DNA, ke které dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé
řetězce DNA tak, že jejich 3´OH-konce směřují proti sobě. Jako primery se obvykle používají
dva uměle připravené krátké oligonukleotidy o délce 16 - 30 bází, odvozené z koncových
sekvencí DNA určených k amplifikaci. Podmínkou pro jejich syntézu je znalost sekvence
studované nukleové kyseliny. Primery ohraničující amplifikovanou oblast, slouží jako
iniciátory polymerační reakce a jsou DNA polymerasou prodlužovány ve směru 5´3´.
Provedení vlastní PCR trvá přibližně 2 hodiny a kompletní analýza prováděná například pro
diagnostické účely obvykle nepřesáhne 48 hodin.
Podle typu výchozího templátu rozeznáváme dvě varianty polymerasové řetězové
reakce: DNA-PCR a RNA-PCR (reverzní PCR, RT-PCR). Obě metody nacházejí široké
uplatnění ve výzkumu i v klinické diagnostice.
DNA-PCR
DNA-PCR je určena pro selektivní amplifikaci vybraných úseků DNA in vitro.
Principem metody je amplifikace cílových úseků DNA vymezených primery
mnohonásobným opakováním cyklů PCR (Tab. 1.). Každý cyklus tvoří 3 periody:
1. tepelná denaturace cílové DNA
2. vazba primerů hybridizací ("annealing") s jednořetězcovýmitempláty
3. extenze (elongace) primerů pomocí termostabilní DNA-polymerasy.
Tabulka 1.
REAKČNÍ PODMÍNKY
teplota
čas
1. CYKLUS
1. ÚVODNÍ DENATURACE
94 - 96°C
3 - 10 min
2. VAZBA PRIMERŮ (annealing)
50 - 65°C
30 - 60 sec
3. EXTENZE – POLYMERACE
72°C
30 - 60 sec
2. - 40. CYKLUS
1. DENATURACE
94 - 96°C
25 - 35 sec
50 - 65°C
30 - 60 sec
3. EXTENZE – POLYMERACE
72°C
30 - 60 sec
POSLEDNÍ CYKLUS
1. DENATURACE
94 - 96°C
25 - 35 sec
50 - 65°C
30 - 60 sec
3. EXTENZE – POLYMRACE
72°C
3 - 10 min
4. OCHLAZENÍ
5°C
dle potřeby
PERIODA
První cyklus PCR má vždy prodlouženou denaturační fázi a poslední cyklus fázi
polymerační. Účelem je účinná aktivace termostabilní polymerasy a terminální elongace
produktu PCR.
Původně se používala jako polymerační enzym termolabilní DNA-polymerasa I
z E. coli, která se však inaktivuje vysokou teplotou (94°C) v denaturační periodě. Enzym se
96
proto musel znovu přidávat v každém cyklu. Problém odstranilo zavedení termostabilní
DNA-polymerasy, Taq DNA-polymerasy, izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus.
Enzym je aktivní při teplotách 37 - 80°C, má také 5´3´ exonukleasovou aktivitu, postrádá
však 3´5´ exonukleasovou aktivitu. Polymerační rychlost je 2 - 4 kbp/min.V současné době
se používají rekombinantní enzymy.
Cílový úsek molekuly DNA je po tepelné denaturaci vymezen dvěma
oligonukleotidovými primery, které hybridizují s komplementárními sekvencemi na okrajích
studovaného segmentu (jeden je komplementární k "+" vláknu a druhý k "-" vláknu DNA).
Primery nesmí obsahovat vzájemně komplementární úseky a jim odpovídající sekvence se
musí v analyzované DNA vyskytovat pouze v jediné kopii. Ideální primery by měly mít
přibližně shodné zastoupení pyrimidinových a purinových bází .
Koncentrace primerů a teplotní podmínky pro jejich nasednutí (annealing) na templát se
pohybují v rozmezí 50 - 65° C (podle zastoupení nukleotidů v primeru). Teplotní optimum
pro prodlužování (elongaci primerů se v závislosti na nukleotidovém složení templátu
obvykle pohybuje mezi 70° - 75° C. K prodlužování primeru dochází již během jeho asociace
s templátem, což je důležité pro stabilizaci vznikajícího hybridu. Primery musí být vzhledem
ke koncentraci amplifikované DNA přítomny v reakční směsi v nadbytku.
Obr. 1. První 3 cykly klasické PCR.
Jelikož produkty každého cyklu PCR slouží zároveň jako templáty pro následující cykly,
narůstá každým opakováním počet kopií amplifikované oblasti exponenciálně (2 n). Po třetím
cyklu jsou produkovány převážně řetězce, jejichž délka odpovídá úseku DNA ohraničenému
97
primery. Většinou postačuje 30 - 35 cyklů, během nichž se může specifická sekvence
amplifikovat teoreticky až 1011krát
Automatické opakování jednotlivých cyklů umožňují speciální programovatelné a
procesorem řízené termostaty, tzv. PCR-termocyklery (obr.2), ve kterých lze dosáhnout
přesně definovaných změn inkubačních teplot během krátkých intervalů (s rychlostí změny
přibližně 1°C/sec). Délka amplifikovaných úseků činí většinou několik desítek, set bází až 10
kb, za speciálních podmínek lze dosáhnout až 47 kb. Současně se vzorky provádí tzv.
negativní kontrola (kompletní reakční směs bez templátu).
Amplifikované úseky DNA se nejčastěji analyzují elektroforeticky v agarosovém gelu a
zviditelňuje se ethidiumbromidem nebo fluorescenčním barvivem GelRed. K průkazu
bodových mutací v produktu PCR slouží elektroforéza v gradientu denaturující látky a
sekvenování.
Obr. 2. MJ Research PTC-100 Thermal Cycler
RNA-PCR (RT-PCR)
Techniku PCR lze rovněž použít při analýzách RNA-molekul, zejména při studiu
expresní aktivity genu a průkazu RNA virů, např. viru hepatitidy C (HCV, VHC).
Reverzní transkriptasová PCR se může provádět dvěma způsoby:
1. Dvoukroková RT-PCR
a) Dvouzkumavková, dvoukroková RT-PCR
b) Jednozkumavková, dvoukroková RT-PCR
2. Jednokroková, jednozkumavková RT PCR
Pro RT-PCR se používají reverzní transkriptasy viru ptačí myeloblastosy (Avian
myeloblastosis virus - AMV) nebo Moloneyové viru myší leukemie (např. Moloney murine
leukemia virus - M-MLV).
Při dvojkrokové, dvouzkumavkové RT-PCR (obr. 3) se používají dva polymerační
systémy, jeden s reverzní transkriptasou v jedné zkumavce a druhým je klasická PCR
s termostabilní DNA-polymerasou ve druhé. V první zkmavce se pomocí reverzní
transkriptasy nasyntetizuje jednovláknová komplementární DNA (cDNA) při použití oligodT nebo random hexanukleotidů jako primerů. Druhým krokem v další zkumavce, po přidání
ekvivalentního množství cDNA z předchozí reverzní reakce a dvou sekvenčně specifických
primerů, je amplifikace cDNA klasickou PCR.
Jednokroková RT PCR se provádí v jednom systému obsahujícím oba enzymy, reverzní
98
transkriptasu i termostabilní DNA polymerasu. Reakce se provádí nejprve při teplotě 55° C a
je syntetizováná cDNA, potom nastupuje klasická PCR. Schéma RT PCR ukazuje obr. 3.
Obr. 3. Schéma RT PCR
Uplatnění PCR v klinické diagnostice
PCR umožňuje přímo identifikovat v infikovaném biologickém materiálu přítomnost
velmi malých množství DNA virových nebo bakteriálních patogenů. Proto nachází široké
uplatnění v rychlé mikrobiologické a virologické diagnostice u řady infekčních onemocnění,
zejména těch, jejichž původci se obtížně nebo zdlouhavě kultivují (chlamydie, mykobakterie,
Treponema pallidum, legionelly, virů hepatitidy B a C, lidského papilomového viru HPV,
HIV atd.).
PCR a následná analýza amplifikovaných sekvencí jsou důležité při identifikaci osob v
kriminalistice, při potvrzování rodičovství v paternitních sporech a při typizaci biologického
materiálu (DNA-fingerprinting). Výhodou je potřeba minimálního množství biologického
materiálu (postačující je jediný vlas, kapka krve, spermatu, potu či slin atd.).
Vzhledem k vysoké stabilitě DNA lze amplifikaci a analýzu provádět i ve vzorcích,
jejichž stáří může dosahovat tisíců let (antropologické, paleoantropologicé i paleozoologické
studie).
V onkologii slouží PCR k detekci mutací některých genů, u nichž se předpokládá vztah
k maligní transformaci buňky. Detekcí tzv. minimálního rezidua nádorové choroby prokázat
přetrvávání nádorové choroby po provedené terapii.
U hematologických maligních onemocnění se PCR a RNA-PCR uplatňuje zejména při
zjišťování chromosomových translokací (např. translokace mezi chromosomy 9 a 22 u
chronické myeloidní leukemie - Philadelphský chromosom).
Širokého uplatnění dosáhla PCR v prenatální diagnostice dědičných onemocnění, kde
poskytuje přímou informaci o eventuálním postižení plodu. Významně časově zkrátila
detekci bodových mutací, které jsou častou příčinou těchto chorob. Materiálem pro izolaci
DNA jsou buňky amniové tekutiny nebo choriových klků a cirkulující fetální DNA
v maternální krvi.
Pomocí PCR lze také z minimálního počtu buněk amplifikovat sekvence DNA
99
specifické pro pohlaví plodu. Markerem chromosomu Y je repetitivní sekvence Hae 3,4.
Přehled využití PCR v základním výzkumu i klinické diagnostice ukazuje tabulka 3.
Tabulka 3.
Základní výzkum
Aplikovaný
genetický výzkum
Klinické disciplíny
Ostatní
izolace genů nebo
jejich částí
Detekce mutací v
genech
detekce patogenních
bakterií, virů, prvoků archeologie
a hub
sekvenace lidského
genomu
studium
polymorfismu genů
typizace patogenních kriminalistika
mikroorganismů
(identifikace jedince)
mutageneze in vitro,
modifikace konců
populační genetika
DNA
analýza klonů
z genových
knihoven
příprava značených
sond
identifikace
onkogenů
soudnictví (určení
otcovství)
typizace nádorů
diagnostika
dědičných
metabolických
chorob
stanovení pohlaví
prenatální
diagnostika
dědičných chorob
Převzato z Jan Šmarda a kolektiv, Metody molekulární biologie.
100
Real-time PCR (R-T PCR)
Základem real-time PCR je klasická PCR se 2 primery, ale
s fluorescenční sondou, což umožňuje kontinuálně monitorovat
přírůstky amplikonů během každého cyklu (u klasického PCR
se detekuje až finální produkt). Amplifikace a detekce produktu
se provádí buď ve skleněných či polykarbonátových kapilárách,
mikrozkumavkách nebo mikrodestičkách s 96 – 384 jamkami
ve speciálních termocyklerech, které umožňují snímat a
kvantifikovat fluorescenci v každém cyklu.
Obr. 3. Lightcycler 2.0
Real-time PCR umožňuje kvantifikovat DNA nebo pomocí RT-PCR RNA. Základní
podmínkou je přítomnost fluorescenční sondy, která se váže na syntetizované amplikony a
úroveň detekované fluorescence pak odráží množství vytvořené nukleové kyseliny. Data jsou
sbírána během celého PCR procesu ve speciálních "termocyklerech" s optikou umožňující
excitaci sondy a následnou detekci fluorescence v každém kapiláře nebo jamce a
vyhodnocení speciálním softwarem. Základní schéma excitace a detekce fluorescence je na
obr. 3. Základní schéma Lightcycleru 2.0® Roche, včetně optické detekční jednotky je na obr.
4.
Obr. 3. Základní schéma excitace a detekce fluorescence. Excitační laserový paprsek
prochází vzorkem s fluorescenční sondou a emituje fluorescenční světlo, které je
snímáno a vyhodnocováno fluorometrickým analyzátorem.
101
Obr. 4. Funkční schéma Lightcycleru 2.0 Roche. Levá část ukazuje vzduchový
termocykler s kapiláramy se vzorkem a pravá část optickou měřící jednotku.
Fluorescenční sondy používané v real-time PCR se dělí do dvou základních skupin:
1. nespecifické - barviva vázající se nespecificky na dvouvláknovou strukturu DNA jako
je SYBR® Green nebo LC Green (Obr. 5A);
2. specifické - oligonukleotidové sondy, které hybridizují s amplikonem PCR. Fungují
na principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluorescenčním
barvivem (fluorofor - F nebo R) a zhášečem (quencher - Q):
a) TaqMan, neboli duální hydrolyzující sondy (Obr. 5B) – v tomto případě nárůst
fluorescenční aktivity je způsoben zvýšením vzdálenosti mezi molekulou R a Q po
rozštěpení navázané sondy polymerasou
102
Obr. 5. Nespecifická sonda SYBR Green (A). Specifická hydrolyzující sonda Taqman (B)
b) Hybridizační FRET sondy Roche (obr. 6 A, B, C) – se sestávají ze dvou různě
značených sond. Jedna je značená na 5´-konci excitačním barvivem a druhá
emitorovým, fluorescenčním barvivem. Fluorescence nastává po dokonalém a
těsném nasednutí obou sond barvivy proti sobě. Fluorescence se snímá při teplotě
nasednutí primerů (annealingu). Tento typ sondy umožňuje prokazovat
polymorfismy na základě změny Tm.
Obr. 6 A. Diagram dvou značených B. Fluorescence emitovaná ve FRET
sond užívaných ve FRET systému. systemu. Oligo 1 je donorová
Oligo 1 je donorová molekula a
molekula a Oligo 2 je receptor.
Oligo 2 je receptor.
C. Oligo 1 a 2 jsou dostatečně těsné,
aby přenesly světelnou energii
k akceptorové molekule, která
potom fluoreskuje.
103
c) Molekular Beacons neboli molekulární majáky (obr. 7) obsahují vlásenkovou,
komplementární strukturu a smyčku tvořenou sondou. Na 3´-konci vázán reporter
(fluorogen), případně přes tzv. bloker, a na 5´-konci zhášeč.
Obr. 7. Molekulární majáková sonda (molecular beacon probe).
Ve vlásenkové formě, nevázané na cílové sekvencce amplikonů je sonda
fluorescenčně neaktivní, při denaturaci dojde k rozvolnění vlásenkové struktury. Při
reasociační teplotě (annealingu) dojde k hybridizaci sondy smyčkou s amplikony,
dokonalému oddálení reportéru a zhášeče a emisi fluorescence.
d) Škorpionové primer-sondy (Scorpion probe) jsou bifunkční molekuly, ve kterých
je primer kovalentně vázán k sondě (obr. 8). Molekuly také obsahují fluorofor a
zhášeč. V nepřítomnosti cílu, zhášeč téměř úplně absorbuje fluorescenci
emitovanou fluoroforem. Během škorpionové PCR ve fázi annealingu
v přítomnosti cílové molekuly se separují fluorofor a zhášeč, což vede k vzestupu
fluorescenční emise. Fluorescence pak může být detekovaná a měřená v reakční
zkumavce. Na rozdíl od TaqManu, FRET hybridizačních sond a molekulárních
majáků, reakce škorpionové primer-sondy, je reakce vedoucí ke tvorbě signálu
monomolekulární, vzhledem k tomu, že sonda je kovalentně spojena s primerem.
104
Obr. 8. Funkce škorpion primer-sondy.
Po jednom cyklu PCR se kompletuje extenze primeru sondy a nově syntetizovaná
cílová oblast se připojí k témuž řetězci jako sonda. Při následujícím druhém cyklu,
denaturace a annealing, hybridizují sonda a cíl na elongovaném primeru.
Denaturace vlásenkové smyčky vyžaduje méně energie, než tvorba nové duplexní
DNA. Následně, vlásenková struktura hybridizuje k části nově tvořeného produktu
PCR, což vede k separaci fluoroforu od zhášeče a vzniku emise světla.
Využití real-time PCR
Real-time PCR na rozdíl od klasické PCR má daleko širší využití:
 detekce a identifikace patogenů (bakterií, hub, virů i parazitů – např. detekce a
kvantifikace cirkulující DNA Plazmodia falciparum.)
 kvantifikace bakteriální a virové nálože
 diferenciální genová exprese pomocí reverzní real-time PCR, zejména
v onkologii při zjišťování exprese genů asociovaných s nádorovým
onemocněním
 monitorování minimální nádorové choroby, jak na úrovni DNA cirkulujících
nádorových buněk, tak na úrovni exprimované RNA
 monitorování efektivity léčby
105
 SNP genotypizace, resp. zjišťování mutací (např. zjišťování polymorfismu







ApoE, FVL – Lydenské mutace faktoru V, faktoru I – protrombinu,
methylentetrahydrofolátreduktasy 677 a 1298
methylace DNA
validace RNA pro DNA čipy
detekce nepříznivého výsledku transplantace
analýza genetických chorob – cystické fibrosy, fenylketonurie, thalassemie,
hemofilie, srpkovité anemie a favismu
neinvazivní prenatální diagnostika analysou fetální DNA v mateřské plazmě.
detekce potravinových a environmentálních patogenů
forenzní studie – identifikace jedince, zjišťování paternity (otcovství)
106
ÚLOHA 1.
Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR
s restrikčním štěpením
Pro detekci známých polymorfismů a bodových mutací se často využívá amplifikace
studovaného úseku DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) s následnou restrikční
analýzou, tj. rozštěpení fragmentu zkoumaného genu enzymem – restrikční endonukleázou,
který má schopnost rozeznat a rozštěpit specifickou sekvenci DNA. Protože restrikční
analýza je volena tak, aby restrikční reakce zasahovala místo polymorfní sekvence, změna
této sekvence vede k vytvoření nebo naopak k zániku restrikčního místa. Produkty restrikční
reakce jsou následně separovány na agarosovém (případně polyakrylamidovém) gelu.
Vizualizace se provádí obarvením DNA fragmentů ethidiumbromidem.
Cílem praktického cvičení je genotypizace genu APOE u pacientů s hyperlipidémií
a/nebo hypercholesterolémií a obezitou nebo detekce specifické mutace genu BRCA 1.
1.1.
Analýza alel genu APOE
Gen APOE je lokalizován na 19 chromosomu (19q13.2). Protein ApoE
(apolipoprotein E) je exprimován v řadě tkání. Je součástí lipoproteinových komplexů
remnantních částic chylomiker, HDL, IDL a LDL. ApoE je důležitou součástí pro receptory
remnantních částic a HDL v jaterních buňkách. V remnantních částicích chylomiker a IDL
resp. LDL se objevuje ApoE sekundárně; během intravazální interakce těchto lipoproteinů
s částicemi HDL.
V exonu 3 genu APOE se nacházejí polymorfní lokusy, které vytvářejí tři alely,
označované jako ε2, ε3 a ε4 (tabulka 1). Tyto alely jsou charakterizovány záměnou
nukleotidu 3932 (kodon 130) a/nebo nukleotidu 4070 (kodon 176). V obou případech se
jedná o záměnu C za T na prvním místě tripletu kódujícího příslušnou aminokyselinu. To
znamená, že se v daném místě nachází buď triplet TGC, kodující cystein (C) nebo triplet
CGC, kodující arginin (R).
Tabulka 1.
Alela
ε2
ε3
ε4
Aminokyselina 130
TGC (C)
TGC (C)
CGC (R)
Aminokyselina 176
TGC (C)
CGC (R)
CGC (R)
V populaci se nacházejí jak jedinci homozygotní, tak heterozygoti s kombinací
jednotlivých alel. Nejčastější je výskyt homozygotní alely ε3. Tato alela znamená expresi
plně funkčního proteinu ApoE. Vzhledem k tomu, že záměna C za T vede ke změně tripletu
kódujícího příslušný aminokyselinový zbytek v polypeptidovém řetězci genu Apo-E, lze
předpokládat, že jednotlivé sekvenční varianty genu mohou mít (a ve skutečnosti mají) dopad
na strukturní a funkční charakteristiky výsledného proteinu ApoE, který se podílí na
107
rozpoznání remnantních chylomiker a LDL částic jejich receptory (záměna Cys za Arg je
záměnou hydrofobní aminokyseliny za kladně nabitou, polární aminokyselinu).
U normálních osob jsou zbytky chylomiker a LDL částice rychle odstraňovány
z cirkulace receptorem zprostředkovanou endocytózou především v hepatocytech. Při
onemocnění familiální dysbetalipoproteinemii nebo hypolipoproteinémii typu III se
setkáváme se zvýšenou plazmatickou hladinou cholesterolu a triacylglycerolů, která je
důsledkem poruchy clearance remnantních chylomiker a LDL na základě defektu
apolipoproteinu E. Akumulace lipoproteinových komplexů v cirkulaci způsobuje vznik
xantomů a předčasné aterosklerózy koronárních a/nebo periferních tepen se všemi závažnými
klinickými důsledky (angina pectoris, akutní infarkt myokardu, apod) v mladém věku.
Většina pacientů s familiální dysbetalipoproteinemií jsou homozygoti ε2/ ε2. Osoby s alelou
ε4 jsou ohroženy zvýšeným rizikem vzniku Alzheimerovy choroby (nejčastější forma
demence v dospělé populaci; progresivní neurodegenerativní onemocnění CNS).
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
REFERENCE
AUTHORS
TITLE
JOURNAL
MEDLINE
PUBMED
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
HUMAPOE4
5515 bp
DNA
linear
PRI 09-NOV-1994
Human apolipoprotein E (epsilon-4 allele) gene, complete cds.
M10065 J03053 J03054
Alu repeat; allelic variation; apolipoprotein; apolipoprotein E;
lipoprotein; repeat region; very low density lipoprotein.
Homo sapiens (human)
Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
1 (bases 1 to 5515)
Das,H.K., McPherson,J., Bruns,G.A., Karathanasis,S.K. and
Breslow,J.L.
Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the
human apolipoprotein E gene
J. Biol. Chem. 260 (10), 6240-6247 (1985)
85207610
3922972
ggaacttgat
agacgagatt
gcttcaagcc
ttcacatgtg
aaaacccagg
ccctcccatc
gacagtctcc
ccgcctcccg
cgcccgccac
tggccaggct
tgctgggatt
cccctagccc
ttacattcat
ctccacattc
cgaggtgtcc
tccttcctcc
gggctgccca
ggacaagtct
ccaggagccg
gagctgggac
ggcttgggga
ctgggcagca
gatgtaagcc
gtccccagtg
ccgtcgattg
taactgtgag
agatggaacc
atggaatttt
ttaaataggg
gctcagagag
cacgccctgg
ctggaaacca
gggagggggc
tcccatttgc
ccacttctgt
ctcttgctga
ggttcaagcg
cacgcctggc
ggtctcaaac
acaggcgtga
tactttcttt
ccaggcacag
cccttccacg
tcccttcctg
ctctgccctg
gcccgcccta
gggatccttg
gtgagaagcg
cctgggaagc
gaggaggagc
gagacgaccc
atagcaggac
tcctcagatc
gagaacttta
gttggagctt
ggcggtgggg
ctatggaggc
aatgggttgg
gacaagtcat
caatttgact
caatacctgt
tcctgtgctc
aaagcctcga
ccagccgcct
ggctggagtg
attctcctgc
taacttttgt
tcctgacctt
gctaccgccc
ctgggatcca
gaaaggacag
cttggccccc
gggactgtgg
ctgtgcctgg
tccctggggg
agtcctactc
cagtcggggg
cctggcctcc
gggggtgagg
gacccgctag
tccacgagtt
tccataactg
aaatgaggac
agaatgtgaa
agggggtggg
cgacctgggg
gggcggcttg
ttgcccaagg
ccagaatcct
ggcagccagg
aaggtcacaa
cttttagcag
agccccactt
cagtggcgag
ctcagcctcc
atttttagta
aagtgattcg
ccagcccctc
ggagtccaga
ggtcaggaaa
agaatggagg
ggggtggtca
ggcaggggga
agggggcggg
agccccagcg
cacggggatg
aggtagtctc
caagcagcag
aaggtggggt
gtcactatca
gggagccagg
tgaattagct
gggagaatga
gggatggaat
atggggagat
gtaaatgtgc
tcacacagct
aaccttaacc
gggaggtgct
ccaaagagga
gtgcatcata
tctttttttt
atctcggctc
caagtagcta
gagatggggt
cccactgtgg
ccatcccact
tccccagccc
ggaggactct
agggtgtctg
aaagacctct
gaacagccca
acagggggag
gaggtgaagg
agctcagggg
aggagagcta
gggactggac
ggggagagca
ttatcgagca
ggcagcgaca
cataaatgga
ggaatgcgag
ttgaaccccg
aagagaagac
tgggattagg
ggcaactggc
cagaagcacg
ggaatctcat
agctgtgatt
ctgttcccac
ctttttttga
actgtaacct
ggattacagg
ttcaccatgt
cctcccaaag
tctgtccagc
cctctccaga
gggcggcagc
tattactggg
atgccccacc
cctcgtgact
ccctataatt
acgtccttcc
cctctagaaa
ctcggggtcg
ctgggaaggg
gctggactgg
cctactgggt
cggtagctag
acacggcgct
actgggactg
ggagaggaag
caggagggag
ctgttgcaga
108
1741 taatgcaaca aggcttggaa ggctaacctg gggtgaggcc gggttggggg cgctgggggt
1801 gggaggagtc ctcactggcg gttgattgac agtttctcct tccccagact ggccaatcac
1
M K V L
W A A
L L V
T F L A
G
1861 aggcaggaag ATGAAGGTTC TGTGGGCTGC GTTGCTGGTC ACATTCCTGG CAGgtatggg
tccgtccttc TACTTCCAAG ACACCCGACG CAACGACCAG TGTAAGGACC GTCcataccc
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
ggcggggctt
ccccattcag
gaacagcgat
agttgttttg
ctgtcgccca
ggtccacgcc
cacacccgac
ctggtctgga
ttacaggcgt
gatagtgaat
cctgcctggg
cctgtaatcc
acaccagcct
gcatggtgcc
gagcccagaa
gacagagcaa
ccctcaccct
taggtagcta
gctcggttcc
acagaccctg
ttgacgctct
ttgttgttgt
ggctggagtg
attctcctgc
taactttttt
actcctgacc
gagccaccgc
accagacacg
gcacacaagg
cagcactttg
gggcaacata
acacacctgt
ggtcaaggtt
gaccctgttt
gcccaccatg
gatgcctgga
ccccgctcct
ggccccctct
ctgggcctcg
ttgttgttgt
cagtggcggg
ctcagcctcc
gtattttcag
tcaggtgatc
acctggctgg
gggcagctgt
acactcaata
ggaggccaag
gtgagaccct
gctctcagct
gcagtgaacc
ataaatacat
gctccaaaga
cggggtcaga
ccccctctca
tctgaggctt
gtttccccca
tgttttgttt
atctcggctc
caagtagctg
tagagacggg
tgcccgtttc
gagttagagg
gatctttatt
catgcttttc
gtgggaggat
gtctctacta
actcaggagg
atgttcaggc
aatgctttcc
agcatttgtg
aggaccctga
tcctcacctc
ctgtgctgct
tccttgagat
ttttgagatg
actgcaagct
ggactacagg
gtttcaccat
gatctcccaa
tttctaatgc
ctccatcacc
cgctgggccg
cacttgagcc
aaaatacaaa
ctgaggcagg
cgctgcactc
aagtgattaa
gagcaccttc
cccgaccttg
aacctcctgg
tcctggctct
aggagttaga
aagtctcgct
ccgcctccca
cacatgccac
gttggccagg
agtgctggga
attgcaggca
cccacacagc
gtggctcacc
caggagttca
aattagccag
aggatcgctt
cagcctgggt
accgactccc
tgtgtgcccc
aacttgttcc
16
C
Q A K
V E Q A
V E T
E P E
P E L R
3001 acacagGATG CCAGGCCAAG GTGGAGCAAG CGGTGGAGAC AGAGCCGGAG CCCGAGCTGC
tgtgtcCTAC GGTCCGGTTC CACCTCGTTC GCCACCTCTG TCTCGGCCTC GGGCTCGACG
34
Q Q T
E W Q
S G Q R
W E L
A L G
R F W D
3061 GCCAGCAGAC CGAGTGGCAG AGCGGCCAGC GCTGGGAACT GGCACTGGGT CGCTTTTGGG
CGGTCGTCTG GCTCACCGTC TCGCCGGTCG CGACCCTTGA CCGTGACCCA GCGAAAACCC
54
Y L R
W V Q
T L S E
Q V Q
E E L
L S S Q
3121 ATTACCTGCG CTGGGTGCAG ACACTGTCTG AGCAGGTGCA GGAGGAGCTG CTCAGCTCCC
TAATGGACGC GACCCACGTC TGTGACAGAC TCGTCCACGT CCTCCTCGAC GAGTCGAGGG
74
V T Q
E L R
3181 AGGTCACCCA GGAACTGAGg tgagtgtccc catcctggcc cttgaccctc ctggtgggcg
TCCAGTGGGT CCTTGACTCc actcacaggg gtaggaccgg gaactgggag gaccacccgc
3241
3301
3361
3421
3481
3541
3601
3661
3721
gctatacctc
ggtctctgct
attctctctc
ctggctctgt
ctgtgttgcc
ccaaagtgct
tctgcctctg
tgccccgttc
tcccagccct
agggtcggga
cccaggtcca
ggttctagct
tcagctttgt
ctctgtcctt
caggctggtc
gggattagag
ccctctgcat
cttctctccc
tctcccccgc
agagggggcg
ggtttcattc
tcctcttccc
ctctctctct
ccctagctct
ttgaacttct
gcatgagcac
ctgctctctg
tcttgggtct
ctccccactg
gaggggtgac
tgcccctgtc
atttctgact
tcccttctga
tttatataga
gggctcaagc
cttgcccggc
catctgtctc
ctctggctca
tgcgacaccc
acgctgtggg
gctaagtctt
cctggcttta
ctcagtctct
gacagagaga
gatcctcccg
ctcctagctc
tgtctccttc
tccccatctc
tcccgccctc
agggcgggag
ggggggcctg
gctctctgga
cacactcgtc
tggggtctca
cctcggcctc
cttcttcgtc
tctcggcctc
gcccgcccca
tcggccgcag
agccggcgtc
80 A L M
D E T M
K E L
K A Y
K S E L
E E Q
3781 GGCGCTGATG GACGAGACCA TGAAGGAGTT GAAGGCCTAC AAATCGGAAC TGGAGGAACA
CCGCGACTAC CTGCTCTGGT ACTTCCTCAA CTTCCGGATG TTTAGCCTTG ACCTCCTTGT
100 L T P
V A E E
T R A
R L S
K E L Q
A A Q
3841 ACTGACCCCG GTGGCGGAGG AGACGCGGGC ACGGCTGTCC AAGGAGCTGC AGGCGGCGCA
TGACTGGGGC CACCGCCTCC TCTGCGCCCG TGCCGACAGG TTCCTCGACG TCCGCCGCGT
109
120 A R L
G A D M
E D V
R G R
L V Q Y R G E
3901 GGCCCGGCTG GGCGCGGACA TGGAGGACGT GCGCGGCCGC CTGGTGCAGT ACCGCGGCGA
CCGGGCCGAC CCGCGCCTGT ACCTCCTGCA CGCGCCGGCG GACCACGTCA TGGCGCCGCT
140 V Q A
M L G Q
S T E
E L R
V R L A
S H L
3961 GGTGCAGGCC ATGCTCGGCC AGAGCACCGA GGAGCTGCGG GTGCGCCTCG CCTCCCACCT
CCACGTCCGG TACGAGCCGG TCTCGTGGCT CCTCGACGCC CACGCGGAGC GGAGGGTGGA
160 R K L
R K R L
L R D
A D D
L Q K R
L A V
4021 GCGCAAGCTG CGTAAGCGGC TCCTCCGCGA TGCCGATGAC CTGCAGAAGC GCCTGGCAGT
CGCGTTCGAC GCATTCGCCG AGGAGGCGCT ACGGCTACTG GACGTCTTCG CGGACCGTCA
180 Y Q A
G A R E
G A E
R G L
S A I R
E R L
4081 GTACCAGGCC GGGGCCCGCG AGGGCGCCGA GCGCGGCCTC AGCGCCATCC GCGAGCGCCT
CATGGTCCGG CCCCGGGCGC TCCCGCGGCT CGCGCCGGAG TCGCGGTAGG CGCTCGCGGA
200 G P L
V E Q G
R V R
A A T
V G S L
A G Q
4141 GGGGCCCCTG GTGGAACAGG GCCGCGTGCG GGCCGCCACT GTGGGCTCCC TGGCCGGCCA
CCCCGGGGAC CACCTTGTCC CGGCGCACGC CCGGCGGTGA CACCCGAGGG ACCGGCCGGT
220 P L Q
E R A Q
A W G
E R L
R A R M
E E M
4201 GCCGCTACAG GAGCGGGCCC AGGCCTGGGG CGAGCGGCTG CGCGCGCGGA TGGAGGAGAT
CGGCGATGTC CTCGCCCGGG TCCGGACCCC GCTCGCCGAC GCGCGCGCCT ACCTCCTCTA
240 G S R
T R D R
L D E
V K E
Q V A E
V R A
4261 GGGCAGCCGG ACCCGCGACC GCCTGGACGA GGTGAAGGAG CAGGTGGCGG AGGTGCGCGC
CCCGTCGGCC TGGGCGCTGG CGGACCTGCT CCACTTCCTC GTCCACCGCC TCCACGCGCG
260 K L E
E Q A Q
Q I R
L Q A
E A F Q
A R L
4321 CAAGCTGGAG GAGCAGGCCC AGCAGATACG CCTGCAGGCC GAGGCCTTCC AGGCCCGCCT
GTTCGACCTC CTCGTCCGGG TCGTCTATGC GGACGTCCGG CTCCGGAAGG TCCGGGCGGA
280 K S W
F E P L
V E D
M Q R
Q W A G
L V E
4381 CAAGAGCTGG TTCGAGCCCC TGGTGGAAGA CATGCAGCGC CAGTGGGCCG GGCTGGTGGA
GTTCTCGACC AAGCTCGGGG ACCACCTTCT GTACGTCGCG GTCACCCGGC CCGACCACCT
300
4441
4501
4561
4621
4681
4741
4801
4861
4921
4981
5041
5101
5161
5221
5281
5341
5401
5461
K V Q
GAAGGTGCAG
gccgaagcct
gcagcgggag
agattcacca
ctcagtttct
gtgtctgtgt
cacccaggct
caagcgattc
tttttgtatt
tgaccaagtg
tgcccggcct
cgccatcaca
cctcagcctt
ggtggtgtgt
ctcaagcgat
cacccagctt
tcaaacccct
catgggctcc
A A V G
GCTGCCGTGG
gcagccatgc
accctgtccc
agtttcacgc
ctttctgccc
gtatctttct
agagtgcagt
tgctgcctca
tttagtagag
atccacccgc
ctgcccctct
gctcactgca
tccagtagct
gtggagatgg
actcccacct
tttattatta
ggctcaagag
gagcggcctg
T S A
GCACCAGCGC
gaccccacgc
cgccccagcc
atctgctggc
acatactgcc
ctctgccctt
ggcacgatct
gtagctggga
acgagctttc
cggcctccca
ttctttttta
gcctccacct
gagactacag
ggtctggctt
tggcctcctg
tttgtagaga
atcctccgcc
cccaacttaa
A P V P
CGCCCCTGTG
caccccgtgc
gtcctcctgg
ctccccctgt
acacaattct
tttttttttt
tggctcactg
ttacaggctc
accatgttgg
aagtgctgag
gggggcaggg
cctggactca
gcgcatacca
tgttggccag
agtagctgag
caaggtctca
atcggcctcc
taatattgtt
S D N
CCCAGCGACA
ctcctgcctc
ggtggaccct
gatttcctct
cagccccctc
tagacggagt
caacctctgc
acaccaccac
ccaggcaggt
attacaggcc
aaaggtctca
agtgataagt
ctaggattaa
gctgatgtgg
actactggct
atatgttgcc
caaagtgctg
cctagagttg
H *
ATCACTGAac
cgcgcagcct
agtttaataa
aagccccagc
ctctccatct
ctggctctgt
ctcttgggtt
acccggctaa
ctcaaactcc
tgagccacca
ccctgtcacc
gatcctcccg
tttggggggg
aattcctggg
agcaccacca
caggctagtc
ggattccagg
cactc
110
Vysvětlivky:

Kódující sekvence s exony je vyznačena jako dsDNA

Sekvence aminokyselin je vyznačena nad kódující sekvencí v jednopísmenkovém
kódu.

Sekvence signálního peptidu (AA 1 – 18) je označena kurzívou.

Sekvence primerů jsou označeny podtrženě a kurzívou

Rekogniční místa HhaI jsou vyznačena v tmavých rámečcích (šedě – nepolymorfní
místa, černě – místa možných polymorfismů CGC->TGC (C->R)
Sekvenci genů naleznete na stránkách serveru NCBI (National Center for
Biotechnology
Information)
v databázi
nukleotidů
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi
1.1.1. PCR amplifikace fragmentu exonu 3 genu APOE
Pracovní postup:
– Sterilní 0,2 ml PCR zkumavku si na víčko označte uvedeným způsobem: např. A10; A
je amplifikace APOE, 10 je číslo vaší DNA.
– Do zkumavky napipetujte reakční směs dle tabulky 1: mastermix, 15 pmol každého ze
dvou primerů, 200 ng vaší DNA a doplňte ddH20 na celkový objem 20l.
Tabulka 1.
reakční směs
mastermix*
primer 1: 5'-GCGGACATGGAGGACGT-3' (5 M)
primer 2: 5'-GGCCTCCTACACTGCCAG-3' (5M)
DNA ( ____ mg/ml)
ddH20 ad 20 l
konečný objem
(l)
8
3
3
20
– Reakční směs zvortexujte a krátce zcentrifugujte.
– Zkumavku vložte do bloku cykleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program
“apo-E”
111
1.1.2. Elektroforéza PCR produktu
Pracovní postup:
– Označte sterilní 0,2 ml eppendorfku, na víčko dle instrukcí (např. AR10; AR je
restrikce APOE, 10 je číslo vaší DNA)
– Do zkumavky napipetujte 1 l modrého vzorkového pufru a 5 l vašeho PCR produktu.
Zvortexujte a krátce zcentrifugujte.
– Naneste celý objem vzorku (6 l) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně
s pufrem. Zaznamenejte si číslo jamky (zleva).
– Po nanesení všech vzorků připojte vanu na zdroj stejnosměrného proudu (7V/cm).
– Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu.
– Vyjměte gel a proveďte vyhodnocení po skupinách pod UV světlem.
1.1.3. Restrikční analýza PCR APOE
Pracovní postup:
– Označte 0,2ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní
6 l restrikční směsi a 6 l svého PCR produktu.
– Zvortexujte a krátce centrifugujte.
– Umístěte zkumavku do bloku cycleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program
“restrikce”. Inkubujte 2 hod při 37°C.
1.1.4. Elektroforéza restrikční reakce produktu PCR APOE
Pracovní postup:
– Označte 0,2 ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní
1 l modrého vzorkového pufru a 5 l neštěpeného PCR produktu.
– Do zkumavky s restrikční reakcí (12 l) přidejte 3 l nanášecího pufru.
– Obě zkumavky protřepejte na vortexu a krátce centrifugujte.
– Naneste celý objem vzorků (9 l a 15 l) na dno dvou sousedních jamek v agarosovém
gelu umístěném ve vaně s pufrem (1. jamka – neštěpený PCR produkt; 2. jamka –
produkt po restrikci).
– Zaznamenejte čísla jamek (zleva) a vašich vzorků.
– Po nanesení všech vzorků aplikujte stejnosměrný proud (7V/cm).
– Elektroforézu ukončete po 40 minutách.
– Vyjměte gel a vyhodnoťte jej po skupinách pod UV světlem.
112
Použité zkratky:
agaróza
bp
lineární polysacharid z D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-galaktózy
base pairs (páry bází)
komplementární jednořetězcová DNA, která vznikne reverzním přepisem
cDNA
mRNA.
ddH2O
redestilovaná sterilní voda
DMSO
dimethylsulfoxid
dNTP’s
dinukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
dsDNA
double-stranded (dvouřetězcová) DNA
EDTA
ethylendiaminotetraoctová kyselina
kbp
kilo base pairs
OD260nm
optická densita při 260 nm
pufr TAE pufr z TRIS – acetátu – EDTA
RT
room temperature (laboratorní teplota)
ssDNA
single-stranded (jednořetězcová) DNA
PSM
PCR-mediated site directed mutagenesis
PCR
polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce)
wt
wild type (zdravá alela)
113

práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem

Transkript

Podobné dokumenty

program kniha abstrakt - Institute of Experimental Botany AS CR

Příručka k soupravě therascreen® MGMT Pyro® Kit

Návod k použití - BAG Health Care GmbH

bi opr spect - Biotechnologická společnost

úloha 1. - Ústav biochemie a experimentální onkologie

QIAsymphony DSP DNA Kits: Charakteristika účinnosti

60 AKCÍ S NABÍDKAMI VÍCE NEŽ 433 VÝROBKŮ PRO

Laboratorní cvičení z biochemie - Department of Biochemistry

bílkoviny krevní plazmy

Návod k soupravě

Biochemici - severní Evropa

VYBRANÉ KAPITOLY Z CHEMIE

práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem

Teoretický úvod a návod - Ústav lékařské biochemie

Chemické testy a jejich význam v kontrole účinnosti sterilizace

Manuál Torrent EGFR NGS kit CJ

Teoretický úvod a návod - Ústav lékařské biochemie

SACHARIDY aldehydická skupina – Schiffovo, Tollensovo nebo

Manuál Torrent KRAS-NRAS NGS kit CJ

Stanovení glukosaminu ve výživových doplňcích pomocí kapilární

Sacharidy - HB CUKR

Téma: Plasmatická membrána