Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve výrobním prostředí

Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve výrobním prostředí

Hygiena potravin
Mikrobiální kontaminace
JUT a pohyb bakterií ve
výrobním prostředí
J. BRYCHTA,T. BRYCHTA, H. BULAWOVÁ, E. KLÍMOVÁ
MVDr. Josef
Brychte, Ph.D.,
vedoucí oddělení
hygieny potravin,
SVÚ Jihlava
Státní veterinární ústav Jihlava
SOUHRN
Brychta J., Brychta T., Bulawová H., Klímová E. Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve
výrobním prostředí. Veterinářství 2014;64:875-883.
Změny senzorických vlastností masa a jeho kažení mají přímou souvislost s kvalitou jatečného opracování, ale především s povrchovou kontaminací jatečně upraveného těla (JUT) na jatkách. Rychlost
projevu změn závisí, kromě podmínek skladování a manipulace s masem, také na spektru bakterií, které
se na kontaminaci JUT podílejí, a na jejich aktivitě. V rámci úřední kontroly kontaminace JUT bylo na SVÚ
Jihlava vyšetřeno 263 destruktivních stěrů z prasat. Při hodnocení CPM byly tři vzorky bez mikrobiologického nálezu (1,3 %); 63 vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (26,7 %); 72 vzorků bylo hodnoceno
jako přijatelné (30,5 %) a 98 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (41,5 %). Při hodnocení zjištěného
počtu Enterobacteriaceae bylo 96 vzorků bez mikrobiologického nálezu (40,7 %); 18 vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (7,6 %); 47 vzorků bylo hodnoceno jako přijatelné (19,9 %) a 75 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (31,8 %). Dále bylo vyšetřeno 155 destruktivních stěrů z JUT skotu. Při hodnocení CPM bylo osm vzorků bez mikrobiologického nálezu (5,2 %); 39 vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (25,2 %); 34 vzorků bylo hodnoceno jako přijatelné (21,9 %) a 74 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (47,8 %). Při hodnocení zjištěného počtu Enterobacteriaceae bylo 59 vzorků bez mikrobiologického nálezu (38,1 %); pět vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (3,2 %); 24 vzorků bylo hodnoceno
jako přijatelné (15,5 %) a 67 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (43,2 %).
SUMMARY
Brychta J., Brychta T., Bulawová H., Klímová E. Microbial contamination of carcass and movement
of bacteria in a production environment. Veterinářství 2014;64:875-883.
Changes of sensory properties of meat and its possible spoilage have direct connection with
surface contamination of carcases with bacteria at slaughterhouses. Speed of these changes is
linked to the way the meat is treated, storage conditions, and contaminating bacteria species –
especially their activity. 263 destructive samples of swine carcasses were tested at SVI Jihlava during
state control of surface contamination. Considering aerobic colony counts 3 samples contained no
bacteria (1.3 %), 63 samples (26.7 %) were satisfactory, 72 samples (30.5 %) were acceptable and 96
samples (41.5 %) were unsatisfactory. In case of Enterobacteriaceae 96 samples (40.7 %) contained
no bacteria, 18 samples (7.6 %) were satisfactory, 47 samples (19.9 %) were acceptable and 75
samples (31.8 %) were unsatisfactory. 155 destructive samples from cattle carcasses were tested at
SVI Jihlava during state control. Considering aerobic colony counts 8 samples (5.2 %) contained no
bacteria, 39 samples (25.2 %) were satisfactory, 34 samples (21.9 %) were acceptable, and 74 samples
(47.8 %) were unsatisfactory. In case of Enterobacteriaceae 59 samples (38.1 %) contained no
bacteria, 5 samples (3.2 %) were satisfactory, 24 samples (15.5 %) were acceptable, and 67 samples
(43.2 %) were unsatisfactory.
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
875
Hygiena potravin
Úvod
Ztráty potravin v průběhu jejich produkce (od vidlí po
vidličku) až do okamžiku jejich konzumace jsou celosvětově velmi vysoké. Odhaduje se, že asi 1,3 miliardy tun
celosvětově vyrobených potravin podléhá každoročně
zkáze. V Evropě se odhaduje množství zkažených potravin na 90 milionů tun za rok. Tato čísla je potřeba brát
jako orientační, protože ve zprávě je odhad zkažených
potravin mezi 50–20 % z celkového množství v Evropě
vyrobených potravin (ANON 16).
Co se masa týká – v Evropě se odhad ztrát z celkové
produkce masa pohybuje do 25 %. Není zcela jasné, kolik
procent z celkového množství ztrát je přičítáno následkům bakteriálního kažení. Je však nad míru jasné, že to
bude většina z konzumace vyřazených surovin a potravin (ANON 18).
O bakteriích se většinou ví pouze to, že jsou původci
různých onemocnění, že kazí potraviny apod. Málo se
však ví například o tom, jak probíhá jejich šíření ve
výrobním prostředí, v surovině či potravině.
Současný stav
Provozovatelům potravinářských podniků (PPP)
a jejich zaměstnancům se většinou dostanou do rukou
pouze údaje o posouzení výsledků laboratorních vyšetření. Z protokolu vyplývá, že v jejich výrobku byly nebo
nebyly prokázány patogenní bakterie, nebo že výskyt
kontrolovaných bakterií vyhovuje/nevyhovuje stanoveným limitům platné legislativy. V tomto případě se
poskytuje údaj o množství kolonii tvořících jednotek/
/KTJ/CFU apod. Tento údaj však v žádném případě není
roven počtu jednotlivých bakterií, které se nacházejí
v jedné kolonii. Jak vypadá jedna KTJ, například L. monocytogenes na Petriho misce, je vidět na obrázku 1. Jak
vysoký počet bakterií se nachází v jedné kolonii, je patrné na roztěru z jedné KTJ pod mikroskopem (obr. 2).
Jak z obrázků vyplývá, jedna KTJ je složená z milionů
až miliard jednotlivých bakterií. Navíc bakteriální kolonie
není žádné náhodné seskupení bakterií, ale dobře organizované společenstvo, které si musí zajistit dobré zásobování živinami a odvádění produktů bakteriálního
metabolismu. Kolonie je protkána „tunely“, které jsou
naplněny vodným roztokem s živinami či odpadními
látkami bakteriálního metabolismu, případně látkami
enzymatických aktivit, jako jsou enzymy, metabolity,
toxiny a jiné látky (obr. 3).
Jednotlivé kolonie bakterií vidíme především na živných médiích, která se v laboratořích používají k izolaci
a diagnostice jednotlivých rodů a druhů bakterií. Ve
skutečnosti se na potravinách vyskytují spíše v jiné
formě. V koloniích je vidíme například na povrchu výrobků, kdy jsou původcem především barevných senzorických změn. Podobně je tomu i u kolonií plísní. To ale
neplatí pro plísňové sýry, jako je Niva apod., kde naopak
jejich přítomnost, viditelnost vyžadujeme. Ve výrobním
prostředí nejsou bakterie pouze ve statické formě, jak by
876
Obr. 1– Rostoucí kolonie Listeria monocytogenes na Petriho misce,
ALOA agar
(Foto. SVÚ Jihlava)
se dalo předpokládat, ale jsou v pohybu (pasivní/aktivní)
nebo tvoří biofilmy.
Svalovina, získaná ze zdravého zvířete, které je poraženo
předepsaným způsobem, by neměla obsahovat žádné
bakterie ani plísně. Jakmile jsou zvířata poražena a pokračuje jatečné opracování, je maso vystaveno možné kontaminaci. Pro dobrou údržnost a kvalitu masa je bezpodmínečně nutné udržet v provozu co nejvyšší úroveň hygieny
a sanitace. Proto celkový počet bakterií, které mohou kontaminovat maso ve výrobním prostředí, musí být co možná
nejnižší. Je to klíčový faktor pro stanovení doby spotřeby,
potažmo pro údržnost masa ve vysoké kvalitě. Na povrchu
jatečně upraveného těla (JUT), krátce po vykolení, můžeme zjistit různou úroveň kontaminace. Ta se může pohybovat v širokém rozmezí, a to od desítek KTJ na 1 cm2 až po
hodnoty 107 KTJ/cm2, výjimečně i vyšší. Většina těchto
bakterií patří do skupiny psychrotrofních, která může mít
podíl 35–93 % z celkové kontaminace JUT.15
Zastoupení jednotlivých bakteriálních rodů se kvalitativně mění od počáteční kontaminace až do nástupu
kažení. Mezi dominující bakterie, které se uplatňují
v procesu kažení, patří například Pseudomonas spp.,
Brochothrix thermosphacta, Serratia spp., Enterobacter spp.,
Hafnia spp., Clostridium spp., Bacillus spp., Photobacterium
phosphoreum, bakterie mléčného kvašení, kvasinky, plísně (ANON 19).
Tab. 1 – Stimuly a následné reakce bakterií
Stimul
reakce na stimul
Chemický
Chemotaxis
Elektrický
Galvanotaxis
Gravitace
Geotaxis nebo gravitaxis
Světlo
Magnetické pole
Fototaxis
Magnetotaxis
Směr proudu tekutiny
Rheotaxis
Osmotický tlak
Osmotaxis
Teplota
Termotaxis
Dotyk
Thigmotaxis
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
Hygiena potravin
je v přepočtu 14násobek buněčné délky/s. Listeria monocytogenes je poněkud pomalejší, dosahuje rychlosti asi
6 μm/min, což je v přepočtu trojnásobek buněčné
délky/min.2
Veškerý pohyb bakterií je však závislý především na
teplotě okolí, koncentraci bakterií, dostupné atmosféře,
výživě, pH prostředí apod. Teplota, stejně jako jiné inhibující faktory, je u většiny pohyblivých bakterií limitujícím faktorem jejich šíření v prostředí.
Obr. 2 – Roztěr L. monocytogenes pod mikroskopem, barvení podle
Grama29
Bakteriální pohyb
Sledování pohybu bakterií je umožněno díky elektronové mikroskopii a rozvoji různých skenovacích metod.
Probíhá především v laboratořích, kde se dají dobře
modelovat a důsledně sledovat vlivy různých prostředí
a stresů na chování bakterií, včetně zmíněného pohybu.
Ovlivnění
pH: má zásadní vliv na pohyb bakterií po povrchu
agaru. Bylo prokázáno, že bakteriální expanze do okolí se
výrazně snižuje při pH 3–4. Pro pohyb bakterií bylo zjištěno jako nejvhodnější pH 5–9. Hodnota pH nad 9
pohyb opět výrazně zpomaluje.1
Teplota
Při teplotě <28 °C expandují kolonie pomalu, stejně
jako při teplotě >37 °C. To však neplatí všeobecně, například u Campylobacter jejuni byla zjištěna vyšší pohybová
aktivita při 42 °C než při 37 °C.1,4
Vlhkost
Obr. 3 – Vnitřní struktura bakteriální kolonie
Psychrotrofní bakterie mají oproti mezofilním kratší
lag fázi, což znamená, že se rychleji přizpůsobují okolnímu prostředí. Většina bakterií, které způsobují kažení
masa a masných výrobků, je schopna přímo tvořit nebo
se podílet na tvorbě biofilmů ve výrobním prostředí.
Je známo, že biofilmy jsou také významným zdrojem
infekcí. V USA bylo prokázáno, že asi 80 % perzistentních
infekcí člověka má přímou souvislost s bakteriálním biofilmem.12
Při tvorbě biofilmu se významně uplatňuje schopnost
bakterií vykonávat aktivní pohyb. Bylo zjištěno, že například bakterie E. coli se pohybují rychlostí asi 30 μm/s při
aktivním plavání (swiming motility) a 2–10 μm/s při plazivém pohybu (swarming motility). V přepočtu to znamená, že bakterie E. coli překoná během sekundy vzdálenost, která se rovná až 15 násobku délky vlastní buňky.
Podobnou rychlostí se může pohybovat také S. typhimurium, která je schopna vyvinout rychlost až 28 μm/s, což
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
Při zjišťování vlivu relativní vlhkosti (RV) prostředí na
expanzi bakteriálních kolonií bylo zjištěno, že hodnota
<35 % RV zpomaluje pohyb až dvacetkrát oproti 90 % RV. 1
V tabulce 1 uvádíme základní druhy bakteriálních
pohybů a jejich aktivátorů (ANON 22).
Všechny uvedené pohyby jsou aktivovány jedním
nebo více stimuly.
Aktivní pohyb bakterií umožňují
především jejich povrchové organely
A. Bičíky
Jedná se o tzv. motor bakterií/nanomotor. U většiny
bakterií se tvoří dva různé druhy bičíků, a to polární
bičíky umožňující (swimming motility) plavání v tekutém prostředí a laterální bičíky pro (swarming motility)
plazivý pohyb na povrchu potraviny, zařízení nebo tkáně,
kde se bakterie nacházejí. Geny pro tvorbu laterálních
bičíků se vyskytují přibližně u 60 % izolovaných bakte-
877
Hygiena potravin
Obr. 4 – Bakteriální bičíky a pili/fimbrie 28
Zdroj: https://www.google.cz/search?sourceid=navclient&hl=cs&ie
=UTF-8&rlz=1T4LENP_csCZ539CZ539&q=flagella+pili+picture
riálních kmenů a k jejich expresi dochází při růstu bakterií na pevném povrchu.
B. Fimbrie (pili) obr. 4
Jsou vláknité struktury na povrchu bakteriální buňky.
Skládají se z molekul bílkoviny zvané pilin, které jsou uspořádány do tvaru spirály. Rozlišují se dva základní morfologické typy. Krátké, tzv. rigidní pili a delší vlnité, tzv. flexibilní pili. Krátká rigidní vlákna jsou hlavním typem fimbrií,
jež se vyskytují asi u 95 % bakteriálních kmenů. Tato rigidní
vlákna umožňují adhezi (přilnutí/přilepení) buňky k různým povrchům, ale tvoří se i při různých růstových podmínkách okolního prostředí. Naproti tomu exprese flexibilních pili je ovlivňována především fyzikálními a chemickými podmínkami prostředí, kde se bakterie nacházejí.10
U pohyblivých bakterií můžeme pozorovat několik
druhů pohybů, které souvisejí s podněty z okolního prostředí. Bakterie tyto podněty vyhodnocují jako vhodné či
nebezpečné pro jejich další životaschopnost a poté
následuje (kromě jiného) pohyb bakterií do vhodného
prostředí.
Jedná se například o:
1) Swimming – plovoucí pohyb způsobený pohyby
bičíků především v tekutinách. Buňky se pohybují individuálně a náhodně. Nejčastějším způsobem pohybu je
pohyb pomocí rotace bičíku. Rotace bičíku, vnější organely, která slouží jako lodní šroub, poskytuje sílu pro
relativně rychlý pohyb bakterie – až 30 buněčných délek
za sekundu (20–60 μm/s). Jsou popsány různé typy
pohybů pomocí bičíku závislé jednak na počtu bičíků
a dále jejich umístění na povrchu buňky. Některé druhy
bakterií (Pseudomonas, Spirillum, Chromatium,
Halobacteria) jsou schopny pouze pohybu vpřed a vzad.
Změna směru je pasivní, je závislá na tzv. Brownově
pohybu. Naopak jiné druhy (Escherichia, Salmonella,
Sinorhizobium, Rhodobacter, Agrobacterium) se pohybují
v přímé linii, s občasnou aktivní změnou směru.
2) Swarming – bakterie vykonávají plazivý pohyb po
povrchu prostředí, na kterém se nacházejí. „Swarming“
by však neměl být chápán jako úzký termín používaný
k popisu pohybu bakterií. Spíše než o pouhý pohyb se
totiž jedná o širší způsob organizace bakteriálního společenství, jehož součástí je i společný pohyb. 2,11
878
Při pozorování mikrostruktury jsou bakterie při tomto
druhu pohybu vysoce organizované ve formacích, které
vypadají jako víry nebo pruhy. Pohyb je plynulý a výhradně podél dlouhé osy buněk, které jsou během pohybu
spojené ve svazcích (obr. 5, 6).
Během plazivého pohybu vznikají dlouhé, mnohojaderné a vysoce pohyblivé buňky se zvýšeným množstvím bičíků, které rychle a koordinovaně (jako populace) migrují. Pohyb bakterií po povrchu může pomoci
patogenním druhům v migraci, adhezi a rozšiřování se
z místa infekce. Swarming může chránit patogeny například před makrofágy, a to tak, že zvyšuje odolnost bakterií proti jejich pohlcení makrofágem. Také sekrece bakteriálních toxinů je většinou spojena se souběžným řízením pohybu.7
Bylo prokázáno, že tato organizace bakterií (resp. diferenciace buněk v rámci tohoto společenstva, např.
u Salmonella enterica sérovar Typhimurium) vykazuje
zvýšenou rezistenci na různá antibiotika. Swarming je
značně závislý na hustotě bakteriálních buněk, dostupnosti živin a vlhkosti povrchu. Mezi nejrychlejší bakterie
patří například Proteus mirabilis, B. megaterium,
Clostridium bifermentans, Bacillus alvei, B. cereus.8
Některé bakterie produkují ve vysokém množství
povrchové surfaktanty (povrchově aktivní látky –
sliz/hlen), které redukují tenzi mezi povrchem a bakteriemi pro umožnění klouzavého pohybu. Tento jev je
běžný například u některých kmenů E. coli a salmonel, ne
však u všech izolátů. Předpokládá se, že surfaktanty produkující kmen absorbují vodu a potřebné látky z povrchu (například masa) pod bakteriální vrstvou, a tak
umožňují vznik fluidní podvrstvy umožňující zrychlení
pohybu.2,7
Buňky s plazivým pohybem mají vyšší šanci vyvolat
u hostitele onemocnění (viz obr. 7). Např. Proteus mirabilis
může migrovat močovým traktem a způsobit infekci ledvin. Studie „swarm motility“ různých bakterií jsou orientovány především do zdravotnictví, kde tento jev představuje vysoké riziko pro rozvoj onemocnění i při léčbě
pacienta, a může se výrazně uplatnit i při sekundární
kontaminaci nástrojů a zařízení. Sledováním stejného
problému ve výrobě potravin se zabývá velmi málo studií. 2,11 Každý bakteriální rod má určité specifické projevy
pohybu. Například důležitým aspektem při růstu a šíření
kolonií rodu Proteus je cykličnost. Každý cyklus může být
rozložen na čtyři části: 1) diferenciace buněk do formy
Obr. 5 – Bakteriální „Swarm“ forma – nadměrná flagelace celého
povrchu buňky.30 Typický zástupce může být: E. coli, S. typhimurium,
Serratia marcescens, Proteus mirabilis
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
Hygiena potravin
Obr. 6 – Kolektivní plazivý pohyb bakterií (S. marcescens) na
povrchu Virgin agaru9
Vysvětlivky: Front of surfactant layer – čelo mukózní (slizovité)
vrstvy
Surfactant layer – mukózní (slizovitá) vrstva
Front of swarming bacteria – čelo plazivě se pohybujících bakterií
Zdroj: Avraham Be’er and Rasika M. Harshey. 2011
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21889437
plazivé; 2) lag fáze buněk, která předchází aktivnímu
pohybu; 3) migrace buněk; 4) slučování (buňky se přestávají pohybovat a rediferencují, což se projeví ve změně
jejich morfologie zpět na plovoucí formu). Během fáze
migrace se plně diferencované buňky naráz pohybují do
všech směrů od původního místa po dobu několika
hodin. Cyklus plazivého pohybu a slučování je několikrát
opakován, až nakonec na agarové půdě vznikají typické
koncentrické prstence a linie, tvořené ve fázi slučování,
které prstence ohraničují.7 (obr. 3).
Jak již bylo řečeno, bičíky nejsou využívány pouze pro
swimming, ale uplatňují se i při swarmingu, který je
závislý na velkém počtu bičíků a mezibuněčné komuni-
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
kaci. Tento druh organizovaného pohybu byl prokázán
jak u gramnegativních, tak i grampozitivních bakterií.
Například bakterie, jako jsou E. coli nebo S. typhimurium – tedy s velmi dobrým plavacím (swiming) typem
pohybu, pokud jsou na tvrdém povrchu, jsou schopny
diferenciace na vláknité (až 50 μm dlouhé) mnohojaderné buňky se zvýšeným počtem bičíků, které se po povrchu přemisťují spolu jako celá kolonie. Často je tento
pohyb přirovnáván k pohybu včelího roje, hejna ptáků či
ryb. Bakterie jsou organizované tak, že se vnější část
kolonie pohybuje jako vír směrem ven (od středu) a uvolněné místo ve středu je pak zaplňováno nově narostlými
bakteriemi. Výsledkem je rychlá expanze kolonií – až do
3 μm/s nebo 1 cm/h. Je vhodné připomenout, že při
tomto přesunu bakterií musí docházet k intenzivní mezibakteriální komunikaci (Quorum sensing), která je pro
swarming i jiné druhy pohybu nezbytná..8
3) Gliding – jedná se o klouzavý pohyb po povrchu,
vyskytující se pouze u nebičíkatých bakterií. V mnoha
směrech je shodný s plazivým pohybem. Podle rychlosti
pohybu se dají bakterie rozdělit na pomalé a rychlé (slow
a fast gliders).
Pomalé (slow gliders) – nejvíce studovanou skupinou
jsou myxobakterie, gramnegativní půdní bakterie.
Klouzavý pohyb (gliding) je u nich velmi pomalý (1–20
μm/min). Rychlost je závislá na vzdálenosti mezi jednotlivými buňkami – čím větší vzdálenost, tím menší rychlost
pohybu. Například u bakterií Myxococcus xanthus se rozlišuje klouzání sociální a klouzání samostatné. Při samostatném pohybu/klouzání jsou bakterie schopny pohybovat se jednotlivě. Zdrojem tohoto pohybu je tvorba
a mohutné vypuzování slizu. Při sociálním (společném)
pohybu/klouzání spolu více bakterií vytvoří jakéhosi „slimáka“ a pohybují se spolu pomocí pilí typu IV.
Rychlé (fast gliders) – jedná se například o cyanobakterie. Tyto bakterie se pohybují rychlostí asi 1–10 μm/s.
4) Twitching – je to trhavý druh pohybu, který lze pozorovat jak u nebičíkatých, tak bičíkatých bakterií, ale nesouvisí s pohyby bičíku. Buňky se pohybují převážně jednotlivě,
shluky bakterií nejsou vyloučeny. Pohyb se jeví jako nesouvislý a trhavý, nesleduje dlouhou osu buňky.
5) Swirling – vířivý pohyb. Charakteristické je kroužení, točení, víření bakterií.
6) Flocking – je koordinovaný pohyb milionů až miliard buněk v prostředí, podobný vodní vlně, nebo hejnu
ptáků, rybímu hejnu apod.
7) Tumbling – kotoulový pohyb. Lze ho charakterizovat jako chaotické otáčení, tápání (buňky vyhledávají/
/detekují lepší životní podmínky).
8) Sliding – klouzavý pohyb je druh pohybu, způsobený expanzivními silami v rostoucí kultuře v kombinaci se
speciálními povrchovými vlastnostmi buněk, plynoucích
z redukce tření mezi buňkou a substrátem. Při pozorovaní mikrostruktury jsou bakterie při tomto druhu pohybu
slité v uniformní povlak úzce svázaných buněk v jedné
vrstvě. Vrstva se pohybuje pomalu a jednotně.
9) Darting – míhavý pohyb je druh pohybu, způsobený expanzivními silami vyvinutými v agregátu buněk
potažených povlakem a plynoucí z „vystřelení“ buněk
879
Hygiena potravin
Tab. 2 – Destruktivní a nedestruktivní stěry z JUT – rok 2013 – nákup služeb (SVÚ Jihlava)
Počet kolonií aerobních mikroorganismů
JUT
Hodnota Vyhovující
Metoda odběru:
0
Summ.
Prasata
destruktivní
Prasata
236
Enterobacteriaceae
Přijatelné
Nevyhovující
hodnoty
hodnoty
hodnoty
n
%
n
%
n
%
n
%
3
1,3
63
26,7
72
30,5
98
41,5
Hodnota Vyhovující
0
Summ.
n
%
Nevyhovující
hodnoty
n
%
n
%
n
%
7,6
47
19,9
75
31,8
236
96 40,7
18
75
Přijatelné
hodnoty
hodnoty
nedestruktivní
24
1
4,2
15
62,5
4
16,7
4
16,7
24
18
0
0
3
12,5
3
12,5
Skot
destruktivní
155
8
5,2
39
25,2
34
21,9
74
47,8
155
59 38,1
5
3,2
24
15,5
67
43,2
Skot
nedestruktivní
17
5,9
5,9
8
47
4
23,5
4
23,5
17
16 94,1
0
0
1
5,9
0
0
Vysvětlivky: nákup služeb = státní kontrola
z tohoto agregátu. Při pozorování mikrostruktury jsou
bakterie při tomto druhu pohybu náhodně rozložené do
agregátů s volnými územími agaru. Ani buňky, ani agregáty se nehýbou, s výjimkou vystřelení, které je pod
mikroskopem pozorováno jako záblesk (ANON 22, 23).
Tvorba biofilmu
Pohyb bakterií má přímou souvislost nejen s šířením
bakterií v prostředí, ale také s tvorbou biofilmu. Například
bakterie P. aeruginosa vykazují tři typy pohybu – swarming, twitching a sliding, přičemž bylo prokázáno, že
twitching a swarming jsou přímo spojeny s tvorbou
biofilmu a patogenezí.5
Odhaduje se, že až 99 % všech mikroorganismů na
Zemi existuje ve formě biofilmu. Bakteriální biofilm
může být vytvářen v prostředí nemocnic, potravinářské
výroby, na potravinách, na zubech apod. Obsahuje bakterie, které jsou až tisíckrát odolnější k antimikrobiálním
látkám či jiným nepříznivým faktorům (výživa, vlhkost,
nedostatek kyslíku, pH, salinita apod.) než volné bakterie. Byla prokázána i zvýšená bakteriální rezistence proti
hostitelskému imunitnímu systému (ANON 25).
Tvorba biofilmu je běžná také u psychrotrofních bakterií, které jsou spojovány s kažením masa. Nejčastěji jsou
zmiňovány bakterie rodu Pseudomonas, které se běžně
podílejí na kažení masa a jsou často dominantní kontaminující (psychrofilní/psychrotrofní) mikroflórou na
mase, které je uchováváno v teplotách 2–8 °C .16
Tyto bakterie jsou schopny přežívat i při nízkých hladinách
O2 (0–5 %) a jsou zjišťovány i u vakuově baleného masa.13,15
Výsledkem masivní kontaminace masa i výrobního
prostředí nemůže být nic jiného než rychlé kažení například výsekového masa a také masných výrobků, které
jsou z vysoce kontaminovaného masa vyrobeny.
Specifické problémy se objevují při výrobě fermentovaných trvanlivých masných výrobků, jejichž výsledná
kvalita je přímo závislá na mikrobiologické čistotě masa.
Vliv mikrobiologické
kontaminace na kažení masa
Jak již bylo zmíněno výše, u chlazeného masa se výrazně prosazují psychrofilní bakterie, které při vyšší povrcho-
880
vé kontaminaci na cm2 začnou působit organoleptické
změny včetně osliznutí, změny barvy a vůně. Zpočátku
bývají dominantní bakterie rodu Pseudomonas a mikrokoky. Během skladování a rozvíjejícího se kažení se začínají
prosazovat jiné bakteriální rody. Je to výsledek konkurenčního boje mezi bakteriemi o ovládnutí prostředí.
Kromě vlastních bakteriálních produktů, jako jsou například bakteriociny, závisí konkurenční výsledek i na dostupnosti kyslíku, pH, vlhkosti, teplotě apod. Dále je to i otázka
složení masa (libové x tučné, hovězí x vepřové atd).
Vysoká úroveň povrchové mikrobiální kontaminace
představuje mimořádnou zátěž nejen pro maso, ale i pro
technologické zařízení a výrobní prostředí. Manipulací
s vysoce kontaminovaným masem vzniká přenesení
bakterií (otisk) na kontaktní i nekontaktní plochy a tato
kontaminovaná místa se poté stávají zdrojem sekundární kontaminace „čistého“ masa, kterému se tak výrazně
snižuje možnost udržet si kvalitu až do konce data spotřeby. Je prokázáno, že počáteční kontaminace na úrovni
1.105/cm2 a skladování při 5 °C způsobuje osliznutí masa
již po šesti dnech. Na druhé straně při kontaminaci masa
na úrovni 102/cm2 a shodné teplotě skladování, se osliznutí projeví až po 12 dnech (ANON 26).
Existuje celá řada studií, které se zabývají problematikou kolonizace masa bakteriemi. Byla objasněna biokinetika, chemické a fyzikální podmínky při probíhající
kontaminaci masa (pozitivní chemotaxe), stejně jako
připravenost a vybavenost bakterií k adherenci na biotické či abiotické povrchy. Byla prokázána skutečnost, že
G- bakterie (E. coli, Pseudomonas spp. apod.) vykazují
rychlejší adherenci k povrchům než G+ (laktobacily, stafylokoky apod.).
Jak již bylo zmíněno výše, maso získané ze zdravých
zvířat je mikrobiologicky čisté. Toto “tvrzení“ je vyvozováno ze zkušeností dlouhodobě prováděné veterinární
prohlídky a laboratorního ověřování kontaminace masa
zdravých zvířat v rámci „sebekontroly“ provozovatele.
Avšak podmínky pro možnou prvotní kontaminaci masa
se někdy splňují již během vyskladňování „potravních
zvířat“ ze stájí, jejich transportu, ustájení před porážkou
apod. Stres u těchto zvířat může způsobovat vyšší vylučování střevních bakterií (včetně patogenních) do vnějšího prostředí..3
Samozřejmě, že nejvyšší riziko kontaminace vyplývá ze
špatně provedené porážky, nedbalém stažení kůže
a prodlevě či nedokonale provedeném vykolení. Stejně
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
Hygiena potravin
Tab. 3 – Logaritmické hodnoty pro vyhodnocení vyšetření na celkový počet aerobních mikroorganismů
a Enterobacteriaceae (Metodický návod SVS ČR 2004/29/HYGI ze dne 2. 1. 2005 – v platném znění, stanovující pravidla
pro pravidelné kontroly všeobecné hygieny, prováděné provozovateli v podnicích)
Denní průměr logaritmických hodnot
vyhovující hodnoty
≤m
přijatelné hodnoty
>m ale ≤M
nevyhovující hodnoty
>M
Skot/
ovce/
kozy/
koně
Prasata
Skot/ovce/
kozy/ koně
Prasata
Skot/ovce/
kozy/ koně
Prasata
Počet kolonií
aerobních mikroorganismů (log)
<3,5
<3 160
CPM
<4,0
<10 000
CPM
3,5 až 5,0
3 160–100 000
CPM
4,0 až 5,0
10 000–100 000
CPM
>5,0
>100 000
CPM
>5,0
>100 000
CPM
Enterobacteriaceae
Celkový počet
<1,5
<30
<2,0
<100
1,5 až 2,5
31–320
2,0 až 3,0
100–1 000
>2,5
>320
>3,0
>1 000
jak se na pokračující kontaminaci masa může podílet
zastaralá technologie, tak se negativně projeví i špatné
pracovní a hygienické návyky zaměstnanců, včetně znečištěného výrobního prostředí.
Masivní kontaminace masa je ireverzibilní (nevratná),
lze ji pouze částečně napravit za použití dalších technologických postupů, které znamenají vícenáklady, a při
silné kontaminaci masa je výsledek velice nejasný. Nelze
opomenout ani legislativu, která povoluje, respektive
zakazuje některé způsoby ošetření JUT (především chemickými látkami) či vybouraného masa.
Metodika odběru
vzorků JUT prasat a skotu
V laboratořích SVÚ Jihlava se běžně vyšetřují destruktivní
i nedestruktivní stěry jatečně upravených těl (JUT) prasat
a skotu. Vyšetření se provádí podle platné legislativy – nařízení Komise (ES) 2073/2005 a metodického návodu SVS ČR
č. 3/2011 (v aktuálním znění). Provozovatel potravinářského podniku musí podle nařízení Komise (ES) č. 2073/2005
provádět mikrobiologickou kontrolu JUT, masných polotovarů, zejména mletého a strojně odděleného masa a čerstvého drůbežího masa, a to nejméně jednou týdně.
Stěry z JUT jsou odebírány buď PPP, nebo inspektory
státního veterinárního dozoru (státní objednávka/zakázka).
1) Destruktivní metoda
Pro stanovení počtu KTJ čeledi Enterobacteriaceae
a počtu kolonií aerobních mikroorganismů se z jatečně
opracovaného těla skotu, prasat, ovcí, koz a koní po
konečné úpravě před začátkem chlazení odebírají čtyři
vzorky tkáně o celkové ploše 20 cm2 (vzorek à 5 cm2).
Kousky tkáně se z jatečně opracovaného těla získávají
buď pomocí sterilního korkovrtu (průměr 2,5 cm) nebo
odříznutím plátku o velikosti 5 cm2 a tloušťce max. 5 mm
s použitím sterilního nástroje. Vzorky z jednoho kusu
jatečně opracovaného těla musejí být na jatkách asepticky vloženy do vzorkovnice nebo plastového ředicího
sáčku a přepraveny k dalšímu zpracování do laboratoře.
Vzorky se uchovávají při teplotě 2–4 °C.
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
2) Nedestruktivní metoda
Vyšetření na počet kolonií aerobních mikroorganismů
a Enterobacteriaceae – stěrová metoda.
Plocha stěru by měla mít velikost nejméně 100 cm2
(50 cm2 u jatečně upravených těl drobných přežvýkavců) na jedno vzorkované místo. K vlastnímu odběru se
použije celkem osm tampónů (čtyři navlhčené a čtyři
suché). Každé odběrové místo je nejdříve setřeno navlhčeným tampónem a poté suchým. Každý suchý a navlhčený tampon z jednoho místa stěru se označí místem
odběru. Všechny popsané stěry (osm kusů) se vloží do
jednoho sterilního obalu a tím tvoří soubor stěrů z jednoho vzorkovaného jatečného kusu.
Výsledky vyšetření JUT prasat a skotu
Výsledky (SVÚ Jihlava) vyšetření dodaných vzorků
z JUT prasat a skotu (ze státní zakázky) a jejich hodnocení jsou shrnuty v tab. 2 a 3.
Z tabulky vyplývá, že úroveň kontaminace JUT není
nijak uspokojivá a my bychom rádi upozornili na několik
aspektů.
1) Je zde patrný výrazný rozdíl výtěžnosti bakterií při
použití destruktivní a nedestruktivní stěrové metody.
2) Je poněkud překvapivé, že jsme „schopni vyrobit“
JUT s nulovou mikrobiologickou kontaminací. Počet
stěrů bez nálezu (nulová hodnota) CPM u prasat byl
1,3 % u destruktivních stěrů, u nedestruktivních stěrů to
bylo 4,2 %. Při hodnocení CPM ze stěrů z JUT skotu je
situace obdobná, i když procenta „čistých stěrů“ jsou 5,2
pro destruktivní a 5,9 % pro nedestruktivní stěry.
Při hodnocení celkových počtů Enterobacteriaceae
u JUT prasat jsou hodnoty výrazně odlišné. U 40,7 %
destruktivních stěrů z JUT prasat nebyly tyto bakterie
prokázány vůbec, u nedestruktivních stěrů to bylo
dokonce 75 % „čistých“ stěrů. Při hodnocení bakterií
čeledi Enterobacteriaceae u destruktivních stěrů ze skotu
jsou hodnoty negativních výsledků na úrovni 38,1 %
a u nedestruktivních je to až 94,1 %.
3) Spíše než nulové hodnoty jsou alarmující výsledky
u nevyhovujících hodnot CPM. Příliš vysoké hodnoty
881
Hygiena potravin
kontaminace JUT prasat pro CPM byly na úrovni 41,5 %
pro destruktivní a 16,7 % pro nedestruktivní stěry. U JUT
skotu byly nevyhovující hodnoty pro CPM zjištěny na
úrovni 47,8 % pro destruktivní stěry a 23,5 % pro nedestruktivní.
Pro Enterobacteriaceae u prasat byly nevyhovující hodnoty na úrovni 31,8 % pro destruktivní stěry a 12,5 % pro
stěry nedestruktivní. U skotu byly nevyhovující hodnoty
Enterobacteriaceae zjištěny u 43,2 % destruktivních stěrů,
u nedestruktivních stěrů nebyly žádné nevyhovující
hodnoty prokázány. Pouze 5,9 % stěrů bylo hodnoceno
jako přijatelné hodnoty.
4) Úroveň bakteriální kontaminace JUT jak prasat, tak
i skotu, je příliš vysoká na to, aby bylo možné garantovat
dobrou kvalitu výsekového masa či jiných výrobků po delší
dobu. Takto vysoce kontaminované maso bude určitě zdrojem kontaminace technologie při bourání masa a získané
výsekové maso se může začít velmi rychle kazit.
Je nutné si uvědomit, že každá manipulace se syrovým
masem během zpracování, transportu na místo prodeje,
při skladování v obchodě a vlastním prodeji, včetně
transportu do domácnosti, napomáhá penetraci bakterií
do hlubších vrstev masa.
Diskuse
Celkový počet mikroorganismů
Celkový počet mikroorganismů (mezofilních) je na
jedné straně velmi významný a výhodný ukazatel (indikátorový ukazatel) pro odhad kvality a údržnosti masa.
Mohl by být do jisté míry ukazatelem pro odhad kvality
sanitace a hygienických návyků personálu. Na druhé
straně ho nelze využít jako indikátorový ukazatel pro
přítomnost či nepřítomnost patogenních bakterií.
Bohužel v průběhu několika let se význam tohoto limitního ukazatele bezpečnosti pro maso a masné výrobky
ve vyhláškách zeslaboval, až z naší (po vzoru evropské platné legislativy) vymizel úplně.
Bakteriální kolonizace povrchu masa probíhá stejně jako
osídlování povrchu jakéhokoli výrobního zařízení. Množství
vznikajících mikrokolonií je závislé na síle kontaminace.
Mikrokolonie se rozrůstají, během několika hodin expandují do okolí, až se následně spojí do kontinuální bakteriální
(biofilmové) vrstvy, která se projeví osliznutím povrchu
masa a dalšími senzorickými změnami. Jakmile se vytvoří
spojení mezi bakteriemi a povrchovou vrstvou masa, jedná
se již o nevratnou/ireverzibilní vazbu, která se nedá odstranit. Tato vazba je tvořena bakteriálními extracelulárními
polysacharidy, nazývá se glycocalyx a je základní stavební
deskou pro vznik biofilmu. Na osliznutí masa se nejčastěji
podílejí rody Pseudomonas, Lactobacillus, Enterococcus,
Weissella, Brochothrix (Narendran, 2003).
Enterobacteriaceae
Bakterie čeledi Enterobacteriaceae jsou běžné kontaminanty masa a masných výrobků a podílí se významnou měrou na jejich kažení. Kromě toho čeleď
Enterobacteriaceae zahrnuje jak řadu obligátně patogen-
882
Obr. 7 – Proteus spp. Inkubace: 30 °C, 2 dny, 1% glukózový agar
(Foto: SVÚ Jihlava, Brychta, T.)
ních rodů – Salmonella (břišní tyfus, paratyfus a salmonelózy), Shigella (bacilární úplavice) a Yersinia (mor, střevní infekce), tak i řadu potenciálně patogenních rodů –
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus,
Providencia, Morganella, Citrobacter a další. Růst a s ním
spojená metabolická aktivita těchto mikroorganismů
způsobuje enzymatický rozklad bílkovin. S tím souvisí
výrazné negativní změny vůně, barvy a další výrazné
senzorické defekty. U balených výrobků se projeví i tvorba plynu, který může až výrazně páchnout po H2S, NH3
a indolu (ANON 27).
Do této čeledi je zahrnut také významný indikátorový
ukazatel, na který by se nemělo zapomínat. Jsou to koliformní bakterie. Dříve se více prosazoval názor, že ukazatel koliformní bakterie je indikátorem fekálního znečištění. I tento koncept je často napadán například proto, že
ne všechny prokázané koliformní bakterie jsou fekálního
původu. Za typické zástupce koliformních a zejména
fekálních koliformních bakterií byly považovány příslušníci rodů Citrobacter, Enterobacter, Escherichia a Klebsiella.
Dnes se název a hodnocení této skupiny bakterií mění na
„fekální (nebo přesněji termotolerantní) koliformní bakterie“. Jsou to koliformní bakterie, které si ponechaly
svoje růstové a fermentační vlastnosti i ve 44 °C.
Některé bakterie z této čeledi jsou, kromě jiného,
významnými producenty biogenních aminů. Biogenní
aminy jsou, jednoduše řečeno, produkty jejich metabolické enzymatické činnosti, které se podílejí na rozpadu
bílkovin a aminokyselin masa. Některé z aminů mohou
být nebezpečné především pro alergiky. Kromě toho
mohou biogenní aminy způsobovat migrény, bolesti
hlavy, žaludeční a střevní potíže, včetně dalších pseudoalergických reakcí.
Proto je potřebné na ně pohlížet jako na látky nebezpečné pro zdraví konzumenta a také je možné tyto metabolity posuzovat jako indikátory nízké kvality syrového
masa. Mezi významné producenty například histaminu
patří E. coli, Morganella morgani, Proteus mirabilis. Vysoká
produkce putrescinu byla zjištěna u bakterií Citrobacter
freundii, Enterobacter spp., Serratia grimessii, Proteus spp.
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
Hygiena potravin
apod. Bylo opakovaně prokázáno, že E. coli, častý kontaminant masa a masných výrobků, silně produkuje i jiné
aminy, jako jsou cadaverin, putrescin, tyramin apod.9
9.
10.
11.
Závěr
12.
13.
• Bakterie jsou schopny šířit se po mase, potravinách
a výrobních zařízeních vlastní aktivitou.
• Bakterie jsou schopny vytvářet biofilmy v jakémkoli
prostředí a mohou být výrazným zdrojem sekundární
kontaminace jak výrobního zařízení, tak vyráběných
potravin.
• Je prokázán výrazný rozdíl ve výtěžnosti bakterií
z destruktivních a nedestruktivních stěrů z JUT skotu
a prasat.
• U JUT prasat jsme zjistili, že asi 39 % JUT vykázalo nevyhovující hodnoty pro CPM (destruktivní + nedestruktivní stěry). Pro parametr Enterobacteriaceae to bylo 30 %.
• U JUT skotu jsme zjistili, že asi 45 % JUT vykázalo nevyhovující hodnoty pro CPM (destruktivní + nedestruktivní stěry). Pro parametr Enterobacteriaceae to bylo 43 %.
• Silně bakteriálně kontaminované maso vykazuje
známky kažení již po několika dnech. Počínající senzorické změny masa jsou spojovány až s hraniční mikrobiologickou kontaminací na úrovni 107/cm2.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
Literatura:
1.
Be'er, A. – Strain, S. K. – Hernández, R. A. – Ben-Jacob, E. – Florin, E. L.
Periodic reversals in Paenibacillus dendritiformis swarming. J Bacteriol
2013;195 (12) :2709-17.
2.
Darnton, N. C. - Turner, L. - Rojevsky, S. - Berg, H. C. Dynamics of bacterial
swarming. Biophysical Journal 2010;(98)10:2082-2090.
3.
Fenlon, D. R., Wilson, J., Donachie, W. The incidence and level of Listeria
monocytogenes contamination of food sources at primary production and
initial processing. Journal of Applied Bacteriology 1996;81: 641-650.
4.
Hazeleger, W. C. - Wouters, J. A. - Rombouts, F. M. – Abee, T. Physiological
Activity of Campylobacter jejuni Far below the Minimal Growth Temperature.
Applied and Environmental Microbiology. 1998;( 64)10: 3917-3922.
5.
Hewitt, J. L. A comparative Study of Pseudomonas aeruginosa Strains.
A Thesis for the Degree of Master of Science in Bioengineering. University
of Notre Dame. Indiana. 2010: 1-59.
6.
Huijing Du, H. - Xu, Z. - Anyan, M. - Kim, O. - Leevy, W. M. – Shrout, J. D. –
Alber, M. High Density Waves of the Bacterium Pseudomonas aeruginosa
in Propagating Swarms Result in Efficient Colonization of Surfaces.
Biophysical Journal 2012;103:601-609.
7.
Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews
Mikrobiology 2010;8:634-644.
8.
Overhage, J. – Bains, M. – Brazas, M.D. – Hancock, R.E.W. Swarming of
Pseudomonas aeruginosa Is a Complex Adaptation Leading to Increased
Production of Virulence Factors and Antibiotic Resistance. Journal of
Bacteriology. 2008;(8)190:2671-2679.
VETERINÁŘSTVÍ 11/2014
26.
27.
28.
29.
30.
31.
Özkaya, F. D. – Ayhan, K. – Vural, N. Biogenic amines produced by
Enterobacteriaceae isolated from meat products. Meat Science 2001;58:163 – 166.
Pospěchová, P. Klinický význam rodu Aeromonas. Bakalářská práce. Brno:
Masarykova univerzita v Brně 2009: 1-55.
Sharma, M. – Anand, S. K. Swarming: A coordinated bacterial aktivity.
CURRENT SCIENCE, 2002;Vol. 83, No. 6, p. 707-715.
Srey, S. - Jahid, I. K. - Sang-Do Ha. Biofilm formation in food industries:
A food safety concern. Food Control 2013;31: 572-585.
Robertson, M. - Hapca, S. M. – Moshynets, O. – Spiers, A. J. Air–liquid interface biofilm formation by psychrotrophic pseudomonads recovered from
spoilt meat. Antonie van Leeuwenhoek 2013;103:251-259.
Roy, S. – Babic, I. – Watada, A. E. – Wergin, W. P. Unique advanteges of using
low temperature scanning electron microscopy to observe bacteria.
Protoplasma 1966;195: 133 – 143.
Stokes, J. L. – Redmond, M. L. Quantitative Ecology of Psychrophilic
Microorganisms. Applied Microbiology 1966;(14) 1:74-78.
Narendran, V. Bacterial Attachment to Meat Surfaces. A thesis for the
degree of Doctor of Philosophy in Food Technology at Massey University,
Palmerston North, New Zealand 2003:1-280.
ANON. http://www.futuredirections.org.au/publications/food-and-water-crises/315-on-overview-of-global-food-losses-and-waste.
html
ANON. http://www.crosswordnexus.com/word/SWARMINGMOTILITY
ANON. http://www.fao.org/docrep/014/mb060e/mb060e00.htm
ANON. http://fri.wisc.edu/docs/pdf/FRI_Brief_Microbial_Food_
Spoilage_7_07.pdf
ANON.
https://www.google.cz/search?sourceid=navclient&hl=cs&ie=UTF-8&rlz=1T4LENP_csCZ539CZ539&q=l.monocytogenes+picture
ANON. http://www.weizmann.ac.il/plants/Milo/images/cell%20
motility%20speed121208Clean(1).pdf
ANON. http://web.natur.cuni.cz/filosof/images/stories/knihovna/
morfogeneze_bakterialnich_kolonii.pdf
ANON. http://www.microbiologytext.com/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=65
ANON. https://www.amherst.edu/users/D/ndarnton/research/swimming
ANON. http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/
id/26447
ANON. http://epubs.surrey.ac.uk/2212/1/233122.pdf
M http://www.ilsi.org/Europe/Documents/EP%20Enterobacteriaceae.
pdf
ANON. http://cronodon.com/BioTech/Bacteria_pili.html
ANON. Obr. č. 2. http://textbookofbacteriology.net/Listeria.html
ANON. Obr. č. 5. https://www.google.cz/search?q=bacterial+flagella+fimbriae+photo+picture+ gallery&hl=cs&rlz=1T4LENP_csCZ539C
Z539&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ei= nQc0U6W1KMLoswab94HIBg&ved=0CGkQ7Ak&biw=1322&bih=657
Adresa autora:
MVDr. Josef Brychta, Ph.D.
NRL pro maso a masné výrobky,
Státní veterinární ústav Jihlava,
Rantířovská 93,
Jihlava 586 05
E-mail: [email protected]
883