docTheraScreen®: souprava k detekci mutací K-RAS
download 
Stížnost Transkript
TheraScreen®: souprava k detekci mutací K-RAS
TheraScreen®: souprava k detekci mutací K-RAS Pro detekci 7 typů mutací genu K-RAS K použití se systémem Roche LightCycler® 480 Real-Time PCR (Přístroj II) (katalogové číslo: 05015278001) a se systémem Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR (číslo části: 4351105) Včetně uživatelské příručky pro LightCycler® Adapt Software v1.1 společnosti Roche Diagnostics (katalogové číslo 05474914001) pro TheraScreen®: soupravu CE-IVD k detekci mutací K-RAS. Návod k použití Kódy produktů Velikost soupravy 20 reakcí 80 reakcí Kódy produktů DxS KR-21 KR-22 Objednací číslo Roche Diagnostics 05366216190 05366224190 Aktuální verze návodu k použití: DU001g Datum poslední revize: květen 2009 Uchovávejte při teplotě -18°C až -25°C. Strana 1 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Obsah 1. Doporučené použití / indikace k použití ................................................3 2. Souhrn a princip testu ............................................................................3 3. Technologické principy ..........................................................................4 4. Činidla .......................................................................................................6 5. VAROVÁNÍ A PREVENTIVNÍ OPATŘENÍ ...............................................7 6. Skladování, stabilita a přepravní podmínky .........................................9 7. Přístroj ......................................................................................................9 8. Vzorky .......................................................................................................9 9. Protokol detekce mutací genu K-RAS ................................................ 14 10. Omezení testu ..................................................................................... 25 11. Charakteristika vlastností testu ........................................................ 26 12. Technická podpora............................................................................. 34 13. Údaje o výrobci a distributorech ...................................................... 35 14. Datum vydání poslední revize ........................................................... 35 15. Literatura ............................................................................................. 36 Upozornění pro odběratele: .................................................................... 38 Strana 2 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS DŮLEŽITÉ: Pečlivě si pročtěte tyto pokyny a před použitím se dobře seznamte se všemi komponentami soupravy K-RAS. 1. Doporučené použití / indikace k použití Předpokládané použití Souprava pro analýzu mutací DxS TheraScreen® K-RAS (souprava K-RAS) je testovací souprava pro diagnostiku in vitro určená k detekci sedmi somatických mutací onkogenu K-RAS a poskytuje kvalitativní hodnocení stavu mutace. Souprava K-RAS je určena k použití kvalifikovanými laboratorními odborníky v biochemické laboratoři využívající vzorky DNA izolované z formalinem fixované kolorektální tkáně zalité v parafinu. Indikace k použití Výsledky testu K-RAS slouží v klinické praxi k identifikaci pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem, u kterých není předpoklad úspěchu biologické terapie protilátkami proti epidermálnímu růstovému faktoru (EGFR), jako jsou panitumumab nebo cetuximab. Souprava K-RAS není určena k diagnostice kolorektálního karcinomu. Je určena jako pomocný test doplňující ostatní příslušné prognostické faktory používané k výběru pacientů vhodných k aplikaci biologické terapie antiEGFR na základě analýzy typu mutace přítomné u nádorových buněk daného pacienta. Typ mutace je posouzen klinickým specialistou spolu s dalšími rysy onemocnění a je vytvořen léčebný plán. Léčebný plán u pacientů s karcinomem se nesmí opírat pouze o výsledek samotného testu mutace onkogenu K-RAS. 2. Souhrn a princip testu Souprava K-RAS je diagnostický prostředek se značkou CE v souladu se směrnicí Evropské unie o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro č. 98/79/ES. Mutace onkogenu K-RAS jsou často nalézány v lidských karcinomech (1-4). Přítomnost těchto mutací souvisí s nedostatečnou terapeutickou odpovědí na léčebné využití inhibitorů EGFR u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (5-10) (14-21). Detekce sedmi mutací v genu K-RAS je prováděna s využitím „divokého“ typu genomické DNA v PCR analýze v reálném čase založené na technologii DxS Scorpions. Tato metoda je vysoce selektivní za podmínky přítomnosti dostatečného počtu kopií DNA v testu a může detekovat přibližně již 1 % mutací na pozadí „divokého“ typu genomické DNA. Souprava K-RAS stanoví sedm mutací kodonů 12 a 13 onkogenu K-RAS – viz tabulka 1. Strana 3 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Tabulka 1: Mutace K-RAS detekované soupravou DxS COSMIC ID pochází z Katalogu somatických mutací v karcinomech (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ Mutace Gly12Ala Gly12Asp Gly12Arg Gly12Cys Gly12Ser Gly12Val Gly13Asp Změna bazí (GGT>GCT) (GGT>GAT) (GGT>CGT) (GGT>TGT) (GGT>AGT) (GGT>GTT) (GGC>GAC) Cosmic ID 522 521 518 516 517 520 532 3. Technologické principy Souprava K-RAS využívá k detekci mutací v reakcích PCR v reálném čase kombinaci dvou technologií, ARMS® a Scorpions® (11, 12, 13). ARMS Specifické amplifikace alely nebo mutace je dosaženo pomocí metody ARMS. Taq DNA polymeráza je mimořádně účinná při rozlišování mezi shodou a neshodou u 3’- konce PCR primeru. Specifické mutované sekvence lze selektivně amplifikovat, dokonce i v případech, kde většina sekvencí není nositelem mutací: • Pokud se primer zcela shoduje, amplifikace pokračuje s plnou účinností. • Pokud se 3’- báze neshoduje, probíhá pouze nízkoúrovňová nespecifická amplifikace v pozadí reakce. Scorpion Detekce amplifikace se vykonává použitím detekčních sond Scorpion. Sondy Scorpion jsou bifunkční molekuly obsahující PCR primer kovalentně vázaný na sondu. Fluorofor na sondě interaguje se zhášecí přísadou, rovněž připojenou k sondě, která redukuje fluorescenci. Během PCR reakce, kdy se sonda váže na amplikon, se fluorofor a zhášecí přísada oddělí. To vede ke zvýšení intenzity fluorescence v reakční zkumavce. Analýza dat: Metoda ∆Ct Analýza v reálném čase se sondami Scorpion je založena na počtu cyklů PCR potřebných k detekci fluorescenčního signálu nad úrovní signálu pozadí, jako míra cílových molekul přítomných na začátku reakce. Bod, při kterém je detekován signál nad úrovní fluorescence pozadí, se nazývá „práh cyklu“ (Ct). Strana 4 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Hodnoty ∆Ct vzorku se počítají jako rozdíl mezi Ct analýzy mutací a Ct analýzy kontroly u stejného vzorku. Vzorky jsou hodnoceny jako pozitivní pro mutaci, pokud dávají hodnoty ∆Ct menší než 1 % hodnoty ∆Ct pro tento test. Nad tuto hodnotu může tento vzorek obsahovat méně než 1 % mutace (mimo limit analýzy), nebo je vzorek negativní pro danou mutaci. Při použití primerů ARMS může nastat neúčelný priming, který se projeví pozdním Ct pozadí u DNA neobsahující mutaci. Všechny hodnoty ∆Ct vypočtené z amplifikace pozadí budou větší než 1 % ∆Ct. Takový vzorek je hodnocen jako negativní pro danou mutaci. Souprava K-RAS je diagnostický prostředek se značkou CE pro diagnostické použití in vitro buď se systémem Roche Diagnostics LightCycler® 480 Real-Time PCR (Přístroj II) (přístroj LightCycler® 480) s 96 jamkami, katalogové číslo součásti Roche: 05015278001 nebo se systémem Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR, katalogové číslo součásti 4351105 (ABI7500). V případě použití přístroje LightCycler® 480 je nutné soupravu K-RAS používat se softwarem LightCycler® Adapt v1.1 pro TheraScreen® soupravu CE-IVD k detekci mutací K-RAS (TheraScreen® K-RAS Mutation Kit CE-IVD, LightCycler® Adapt Software). Tento software byl vyvinut pro automatické vykreslení pozitivního nebo negativního amplifikačního diagramu a dokáže vypočítat příslušnou prahovou hodnotu, která slouží k získání hodnot Ct. Ty se používají k výpočtu hodnot ∆Ct vzorku, které se porovnávají s 1 % hraničními hodnotami. Software vykáže pozitivní nebo negativní výsledek pro mutaci a z analýzy vyloučí jakoukoli subjektivní interpretaci dat testovaných soupravou K-RAS. Formát soupravy K-RAS Souprava K-RAS je dodávána ve formátu osmi analýz. • Jedna kontrolní analýza. • Sedm analýz mutace. Všechny reakční směsi obsahují přidanou kontrolu testu (vnitřní kontrola) označenou HEX (monitorovanou detektorem barviva JOE v přístroji ABI7500). Slouží ke kontrole přítomnosti inhibitorů, které mohou způsobit falešně negativní reakci. Kontrolní analýza Kontrolní analýza, značená FAM, je použita k vyhodnocení celkového množství DNA ve vzorku. Tato kontrolní analýza amplifikuje oblast exonu 4 genu K-RAS. Primery a sonda byly navrženy tak, aby bylo možné eliminovat všechny známé polymorfismy genu K-RAS. Strana 5 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Analýzy mutace Každá analýza mutace značená FAM obsahuje jeden primer Scorpion plus jeden primer ARMS pro rozlišení mezi přirozenou DNA „divokého“ typu a mutantní DNA detekovanou analýzou PCR v reálném čase. 4. Činidla Tato souprava K-RAS obsahuje dostatečné množství činidel k provedení kvalitního vyhodnocení vzorků a k provedení testů K-RAS pro až 20 nebo 80 reakcí v závislosti na velikosti soupravy. Velikost Kódy produktů DxS Objednací číslo soupravy Roche Diagnostics 20 reakcí KR-21 05366216190 80 reakcí KR-22 05366224190 Počet vzorků, který lze testovat, závisí na velikosti dávky vzorků. Tabulka 2: Obsah soupravy K-RAS Dodávaná činidla Směs kontrolní reakce Reakční směs 12ALA Reakční směs 12ASP Reakční směs 12ARG Reakční směs 12CYS Reakční směs 12SER Reakční směs 12VAL Reakční směs 13ASP Směs standardu Taq DNA polymeráza 20 reakcí Objem 1300 µl 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl 300 µl 60 µl 80 reakcí Objem 5200 µl 2600 µl 2600 µl 2600 µl 2600 µl 2600 µl 2600 µl 2600 µl 1000 µl 240 µl Zkumavka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zařízení a činidla nedodávaná se soupravou K-RAS Uživatel testovací sady bude potřebovat následující zařízení a spotřební materiál: • Přístroj LightCycler® 480 nebo přístroj ABI7500 Real-time PCR, který dokáže provádět cykly podle specifikací uvedených v části 9 Protokol detekce mutací genu K-RAS. • Software LightCycler® Adapt v1.1 společnosti Roche Diagnostics (katalogové číslo 05474914001). • 0,2 ml destičky PCR bez DNA-ázy (LightCycler® 480 Instrument Multiwell Plate 96, katalogové číslo 04729692 001 nebo reakční destička ABI MicroAmp Optical s 96 jamkami, katalogové číslo 4306737, s adhezivním filmem MicroAmp Optical, katalogové číslo 4311971). • Sterilní zkumavky pro přípravu základních směsí. • Jednorázové pipety pro přípravu PCR směsi. Strana 6 ze 38 Pouze pro diagnostické užití • • TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Jednorázové pipety pro přidání vzorku DNA. Sterilní H2O (nesmí obsahovat nukleázu). 5. VAROVÁNÍ A PREVENTIVNÍ OPATŘENÍ Pouze pro diagnostické účely in vitro. Souprava K-RAS Kit není určena ke skríninku nebo k diagnostice jakéhokoliv typu karcinomu nebo kolorektálního karcinomu. Je určena k použití jako pomocná metoda ostatních prognostických faktorů aktuálně používaných k výběru těch pacientů, kteří by neměli prospěch z protinádorové léčby protilátkami anti-EGFR. Léčba pacientů se zhoubným nádorem by se neměla opírat pouze o samotný výsledek analýzy stavu mutace genu K-RAS. Klinický specialista musí posoudit charakter mutace u pacienta společně s ostatními faktory onemocnění. Obsah soupravy K-RAS může být opakovaně zmražen/rozmražen až 8krát bez negativního dopadu na kvalitu provedení analýzy. NEROZMRAZUJTE činidla soupravy K-RAS více než 8krát. Obecně platí, že vzorky nádorů jsou nehomogenní a naměřené údaje ze vzorku nádoru nemusí být shodné s ostatními částmi stejného nádoru. Vzorky nádoru mohou také obsahovat nenádorové tkáně. DNA z těchto nenádorových tkání nebude obsahovat mutace K-RAS detekované touto soupravou. Všechny analýzy v této soupravě K-RAS vytvářejí krátké produkty PCR. Ovšem souprava K-RAS nebude fungovat se vzorky silně fragmentované DNA. Analýza DNA by měla být provedena metodou PCR kvantifikace a může se lišit od kvantifikace založené na odečtených hodnotách optické hustoty. V soupravě se dodává navíc kontrolní reakční směs, která umožní posouzení kvality a kvantity DNA u vzorků před zpracováním testy mutace soupravy K-RAS. Činidla v soupravě K-RAS jsou optimálně naředěna. Další ředění činidel se nedoporučuje a může mít za následek zhoršení kvalitativních vlastností testu. Použití menšího reakčního množství než 25 µl se nedoporučuje pro nárůst rizika získání falešně negativních výsledků. Všechna činidla v soupravě K-RAS jsou zvlášť připravena pro použití v uvedených reakcích. K soupravě K-RAS, nebo k činidlům obsaženým v této soupravě, by se neměly přidávat žádné náhradní reagencie nebo pomůcky, pokud se mají zachovat optimální vlastnosti testu. K zajištění optimální kvality a účinnosti primerů by primery Scorpions (jako je tomu u všech fluorescenčně označených molekul) měly být chráněny před světlem, aby se zabránilo optickému vyblednutí molekul. Strana 7 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Buďte zvláště opatrní a zabraňte kontaminaci PCR reakcí se syntetickým kontrolním materiálem. Při přípravě reakčních směsí a přidávání vzorku DNA se doporučuje používat zvláštní jednorázové pipety. Příprava a rozdělení reakčních směsí by se měly provádět v prostoru odděleném od místa přidávání vzorku. Zkumavky by se po PCR reakcích nikdy neměly otevírat. Každý test, zahrnutý do soupravy K-RAS, má své vlastní charakteristiky. Výpočet výsledku se musí uskutečnit se zřetelem na správné parametry testu (viz oddíl Interpretace přehledů/dat) Ct pro vzorky mutace s hodnotou 38 nebo vyšší se vyhodnotí jako negativní nebo pod limity detekce soupravy. Testy obsahují navíc přidanou kontrolní reakci (vnitřní kontrola) (viz oddíl Technologické principy). Pokud oba testy selhaly, naměřené údaje se musí vyřadit, neboť mohou být v PCR reakci přítomny inhibitory, což by mohlo vést k falešně negativním výsledkům. Zředění vzorku může omezit účinek inhibitorů; je však třeba poznamenat, že by také došlo ke zředění vstupního množství DNA. Je potřeba dodržovat standardní laboratorní postupy, například: a) Nepipetujte ústy. b) Nekuřte, nejezte nebo nepijte v prostorech, kde se zachází se vzorky nebo činidly soupravy. c) Po provedení testu si umyjte ruce. Používejte pouze Taq polymerázu (Taq), která se nachází v soupravě, nemíchejte a neupravujte Taq z jiných souprav stejného nebo jiného typu nebo Taq od jiného dodavatele. Rozmrazujte pouze činidla, která se aktuálně používají pro jednotlivé kroky analýzy, nerozmrazujte pokaždé celou soupravu, aby se minimalizoval počet cyklů zmražení/rozmražení. Bezpečnostní informace Upozornění: Všechny chemické látky a biologický materiál by se měly považovat za potenciálně nebezpečné. Vzorky jsou potenciálně infekční a podle toho by se s nimi mělo zacházet. Soupravu K-RAS by měly používat pouze osoby, které byly vyškoleny v příslušných laboratorních technikách. Při práci s komponenty soupravy K-RAS vždy používejte vhodný laboratorní pracovní oděv, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Po použití by se měly komponenty soupravy K-RAS zlikvidovat jako infekční odpad. Strana 8 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 6. Skladování, stabilita a přepravní podmínky Skladování Veškerý obsah soupravy K-RAS by se měl okamžitě po přijetí uložit do mrazničky s konstantní teplotou -18 °C až -25 °C, v temnu. Vyvarujte se zbytečného zmrazování a rozmrazování obsahu soupravy K-RAS. Stabilita Nepoužívejte soupravu K-RAS po uvedené době expirace. Obsah soupravy K-RAS je stabilní až do data expirace, pokud se skladuje za doporučených podmínek a v původním balení. Obsah soupravy K-RAS může být opakovaně zmražen/rozmražen až 8krát bez negativního dopadu na kvalitu provedení analýzy. NEROZMRAZUJTE činidla soupravy K-RAS více než 8krát. Přepravní podmínky Obsah soupravy K-RAS se dodává na suchém ledu a při dodání by měl být stále ještě zmrzlý. Pokud není souprava K-RAS po dodání zmrzlá, během přepravy došlo k otevření vnějšího obalu, zásilka neobsahuje balicí list, návod k použití nebo činidla, kontaktujte pobočku Vašeho distributora výrobků společnosti Roche Diagnostics; kontaktní informace najdete v oddíle 12 – Technická podpora. 7. Přístroj Kompletní pokyny pro instalaci a používání přístroje pro PCR analýzu v reálném čase najdete v uživatelském manuálu přístroje. 8. Vzorky Materiál vzorků musí být lidská genomická DNA izolovaná z formalinem fixovaných vzorků tkáně kolorektálního karcinomu zalitých v parafinu. Odběr a příprava vzorku 1. Přeprava vzorku: Standardní patologická metodologie zajistí kvalitu vzorku. 2. Doporučený postup extrakce vzorku: Extrakce DNA pomocí soupravy pro extrakci DNA z tkáně Qiagen QIAamp® DNA FFPE (katalogové číslo 56404). Je nutné použít následující doplňky protokolu Qiagen: • Vzorky FFPE (formalinem fixované kolorektální tkáně zalité v parafinu) je nutné odebrat na skleněná sklíčka. • Nadbytečný parafín je nutné seškrábat z okolí tkáně pomocí nepoužitého sterilního skalpelu. • Materiál vzorku tkáně seškrábejte do zkumavek mikrocentrifugy. Pro každý extrahovaný vzorek použijte dosud nepoužitý sterilní skalpel. Strana 9 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS • Rozklad vzorku pomocí proteinázy K musí pokračovat až do úplného dokončení. To může trvat až 48 hodin. • Vzorky je nutné eluovat do 200 µl pufru ATE z extrakční soupravy Qiagen. Jakoukoli alternativní metodu přípravy vzorků musí koncový uživatel validovat. 3. Uchovávání izolované DNA: Před analýzou uchovávejte při teplotě –20 °C. Protokol pro vyhodnocení vzorků Pro vyhodnocení celkové DNA ve vzorku je nutné použít kontrolní reakční směs navíc. Tato kontrolní analýza amplifikuje oblast exonu 4 genu K-RAS. Vzorky je nutné testovat pouze pomocí této kontrolní analýzy a použít smíšený standard jako pozitivní kontrolu a vodu jako kontrolu bez vzorku. Je třeba poznamenat, že aby bylo možné optimálně využít činidla soupravy K-RAS, je vhodné vzorky zpracovávat v dávce. Veškerá zpracování musí obsahovat kontroly. Jestliže se vzorky testují jednotlivě, spotřebuje se více činidel a tak se sníží množství vzorků, které lze testovat pomocí soupravy K-RAS. Protokol pro vyhodnocení vzorků - uspořádání destičky 1. Při pokojové teplotě rozmrazte kontrolní reakční směs a smíšený standard ze soupravy K-RAS. Promíchejte každý roztok otočením každé zkumavky 10krát ihned po rozmražení, aby nedošlo k místním rozdílům v koncentraci solí. Připravte si dostatečné množství směsí pro vzorky DNA, jednu reakci smíšeného standardu a jednu reakci kontroly bez vzorku, plus navíc 2 reakce. 2. Pro přípravu základní směsi použijte takové množství činidel na každou reakci, jak je uvedeno v tabulce 3. Tabulka 3: Množství základní směsi kontrolního testu Analýza Kontrolní test Základní směs Reakční směs Taq (µl)x1 (µl)x1 19,8 0,2 3. NEPROMÍCHÁVEJTE Taq nebo jakékoliv reakční směsi obsahující Taq, může to způsobit inaktivaci enzymů. 4. Před použitím ponechte Taq temperovat při pokojové teplotě. Ampulku Taq krátce odstřeďujte, aby se veškerá Taq shromáždila na dně ampulky. Pak pipetujte umístěním špičky pipety těsně pod hladinu Taq, aby nedošlo k pokrytí vnější strany špičky pipety nadměrným množstvím Taq. 5. Opakovaným nasátím pipetou opatrně smíchejte základní směs. Strana 10 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 6. Okamžitě přidejte 20 µl kontrolní základní směsi do každé z reakčních jamek. 7. Okamžitě přidejte 5 µl testovaného vzorku, smíšeného standardu nebo vody (pro kontroly bez vzorku) do reakčních jamek. 8. Destička musí mít smíšený standard v jamce A1 a kontrolu bez vzorku (vodu) v jamce A2. Všechny ostatní jamky musí obsahovat vzorky. 9. Uzavřenou PCR destičku krátce odstřeďujte, aby se činidla usadila na dno jamek. 10. Postupujte podle nastavení přístroje pro příslušnou platformu. Protokol pro vyhodnocení vzorků – nastavení přístroje LightCycler® 480 1. Okamžitě vložte destičku do přístroje LightCycler® 480. 2. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru LightCycler® 480. Přihlaste se do aplikace a na obrazovce „Overview“ zvolte „New Experiment from Template“. Z uvedených templátů pro běh testů zvolte „K-RAS LC480II Run Template“. Tento templát bude mít následující parametry: 1. Formát detekce je „DxS IVD Assays“. 2. Reakční objem je 25. 3. Iniciální krok analýzy (hold step) při 95 °C 4 minuty. 4. Amplifikace ve dvou krocích pro 45 cyklů s denaturací při 95 °C po dobu 30 sekund a teplota temperování při 60 °C po dobu 1 minuty. Fluorescenční signál je jediná akvizice při 60 °C. 3. Zvolte záložku „Sample Editor“ a v „Step 1: Select Workflow“ zvolte zaškrtávací políčko „Abs Quant“. V části „Select Filter Combinations“ se ujistěte, že jsou zvoleny oba filtry (465-510 nm a 533-580 nm). V krocích 2 a 3 zvolte názvy vzorků. Pole Quantification Sample Type by mělo mít hodnotu „unknown“. Sloupec replikátů by měl zůstat prázdný. 4. Zvolte tlačítko „Experiment“ a klepněte na tlačítko „Start Run“, kterým uložíte test a spustíte cyklus. 5. Po dokončení běhu testu zvolte záložku „Analysis“ a v okně „Create New Analysis“ zvolte „Abs Quant/2nd Derivative Max“. Na obrazovce „Create New Analysis“ potvrďte výchozí hodnoty. Ujistěte se, že tlačítko „Filter Comb“ má hodnotu „465-510“ a zvolte tlačítko „Calculate“. Hodnoty Ct jsou zobrazeny v tabulce „Samples“. Strana 11 ze 38 Pouze pro diagnostické užití 6. TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Zvolte tlačítko „Filter Comb“ a změňte filtry na hodnotu 533-580 nm. Zvolte tlačítko „Calculate“ a získáte hodnoty Ct exogenních kontrol v tabulce „Samples“. Protokol pro vyhodnocení vzorků – nastavení přístroje ABI7500 1. Okamžitě vložte destičku do přístroje ABI7500. 2. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru systému 7500. V softwaru 7500 Sequence Detection, verze 1.4 otevřete v nabídce nový soubor běhu testu. 3. V „Assay“ zvolte „Standard Curve (Absolute Quantification)“. V „Run Mode“ zvolte „Standard 7500“. 4. Pomocí tlačítka „Next“ se přesuňte do okna nastavení detektoru. K seznamu detektorů přidejte detektory FAM a JOE, jako zhášecí přísady zvolte „none“. Jestliže tyto detektory ještě nejsou definovány, zvolte tlačítko „New Detectors“ a u detektorů FAM a JOE nastavte zhášecí přísady na „none“. 5. Nastavte „Passive Reference“ na „None“ a zvolte tlačítko „Next“. 6. Zvolte celou destičku a zaškrtněte políčka detektorů FAM a JOE, aby tak byly monitorovány obě barviva ve všech jamkách. Zvolte tlačítko „Finish“. 7. Na záložce „Instrument“ nastavte cyklování podle tabulky 4. Tabulka 4: Parametry cyklů ABI7500 Teplota Fáze 1 95 oC Fáze 2 95 oC 60 oC Čas Cykly 4 min 1 30 sek 1 min 40 Sběr dat FAM, JOE 8. Zvolte tlačítko „Start“, kterým uložíte test a spustíte cyklus. 9. Po dokončení běhu testu zajistěte, aby na zobrazovacím panelu jamek byla nastavena pasivní reference na „none“. Na záložce Amplification Plot vyberte všechny používané jamky a z rozbalovací nabídky detektoru vyberte JOE dye (barvivo JOE). 10. Zkontrolujte signál JOE každého vzorku a porovnejte ho se signálem JOE jamky NTC (kontroly bez vzorku). Všímejte si vzorků, které mají pozdní amplifikační křivku nebo neúspěšnou amplifikaci u exogenní kontroly ve srovnání s kontrolou bez vzorku. Strana 12 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 11. Na záložce Amplification Plot vyberte všechny používané jamky a z rozbalovací nabídky detektoru vyberte FAM dye (barvivo FAM). Použijte automatické nastavení základní úrovně a manuální Ct a pak pomocí logaritmické stupnice pro osu Y ručně nastavte práh uprostřed exponenciální fáze, jak je popsáno v uživatelské příručce k přístroji ABI7500. 12. Tlačítkem „Analyse“ získáte hodnoty Ct. Interpretace vyhodnocení vzorků Vyhodnoťte hodnoty Ct u kontrol bez vzorků a ujistěte se, že nedošlo ke kontaminaci, která by vykazovala amplifikaci na kanálu FAM (Ct méně než 40) nebo že nedošlo k neúspěšné reakci exogenní kontroly na kanálu HEX (žádná hodnota Ct), což by znamenalo problém v nastavení. Smíšený standard by měl v přístroji ABI7500 vykazovat hodnotu Ct u kontrolního testu (kanál FAM) 26-29 a v přístroji LightCycler® 480 by tato hodnota měla být ≤ 29. Údaje se nesmí používat, jestliže alespoň jedna z těchto dvou kontrol byla neúspěšná. Kontrolní test dává hodnotu Ct 29-35: Interpretujte opatrně, protože mutace s nízkou citlivostí nemusí být možné detekovat. Kontrolní test dává hodnotu Ct 35-38: Ve vzorku je přítomno jen málo amplifikovatelných exemplářů DNA a mutace jsou detekovatelné pouze tehdy, pokud je většina exemplářů mutovaná. Kontrolní test dává hodnotu Ct ≥ 38: Vzorek odmítněte, protože je ve vzorku minimální množství DNA a souprava K-RAS nebude schopna detekovat mutace. Pamatujte na to, že jestliže bude vzorek vykazovat pozdní hodnotu Ct u kontrolního testu, hodnoty Ct exogenní kontroly u testování vzorku je nutné porovnat s exogenní kontrolou bez vzorku. Jestliže exogenní kontrola u testování vzorku je zpožděná nebo negativní (ve srovnání s kontrolou bez vzorku, může být přítomen inhibitor. Ředěním vzorku je možné snížit účinek inhibitoru, i když tímto zároveň dojde k ředění DNA. Ředění vzorku: Hodnota Ct u kontroly < 24 povede k inhibici reakce z důvodu vysokého vstupního množství DNA v testu mutace. Vzorky s hodnotou Ct u kontroly < 24 se musí ředit. Je nutné zmínit, že u přístroje LightCycler® 480 mohou být hodnoty Ct získané 2. derivativní metodou mírně odlišné, než hodnoty získané ze softwaru LightCycler® Adapt. Je doporučeno, aby koncentrované vzorky byly naředěny, aby byly v rozmezí >24 a < 29 (hodnoty Ct založené na softwaru 7500 Sequence Detection nebo softwaru přístroje LightCycler® 480). Vycházejte z předpokladu, že naředění ½ zvýší hodnotu Ct o 1. Strana 13 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 9. Protokol detekce mutací genu K-RAS Pečlivě si pročtěte tyto pokyny a před použitím se dobře seznamte se všemi komponentami soupravy K-RAS. Abyste mohli efektivně využít soupravu K-RAS, vzorky je nutné uspořádat do sad po 10 (a vyplnit tak destičku s 96 jamkami). Jestliže by byly sady menší, znamenalo by to, že pomocí soupravy K-RAS zpracujete menší množství vzorků. Nastavení přístroje LightCycler® 480 Pro každý vzorek DNA je třeba provést kontrolní test a test na přítomnost mutace ve stejném běhu PCR reakce, aby byly vyloučeny rozdíly jednotlivých provedení testu. 1. Při pokojové teplotě rozmrazte reakční směsi a smíšený standard ze soupravy K-RAS. Promíchejte každý roztok otočením každé zkumavky 10krát ihned po rozmražení, aby nedošlo k místním rozdílům v koncentraci solí. Připravte si dostatečné množství směsí pro vzorky DNA, smíšený standard a kontroly bez vzorku, plus navíc 2 reakce na každou sestavu jako rezervu, jak je uvedeno v tabulce 5. Tabulka 5: Množství základní směsi soupravy K-RAS Analýza Reakční směs (µl)x1 Základní směsi Reakční směs (µl) Taq (µl)x1 na destičce (x14) Taq (µl) na destičce (x14) Kontrolní analýza 19,8 0,2 277,2 2,8 Analýzy mutace 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NEPROMÍCHÁVEJTE Taq nebo jakékoliv reakční směsi obsahující Taq, může to způsobit inaktivaci enzymů. 3. Před použitím ponechte Taq temperovat při pokojové teplotě. Ampulku Taq krátce odstřeďujte, aby se veškerá Taq shromáždila na dně ampulky. Pak pipetujte umístěním špičky pipety těsně pod hladinu Taq, aby nedošlo k pokrytí vnější strany špičky pipety nadměrným množstvím Taq. 4. Opakovaným nasátím pipetou opatrně smíchejte základní směsi. 5. Okamžitě přidejte 20 µl základní směsi do každé z reakčních jamek. 6. Okamžitě přidejte 5 µl testovaného vzorku, smíšeného standardu nebo vody (pro kontroly bez vzorku) do reakčních jamek. Každý vzorek DNA musí být testován pomocí obou analýz - kontrolní i mutační. Uspořádání destičky je v tabulce 6. Strana 14 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Tabulka 6: Uspořádání destičky soupravy K-RAS Uspořádání s 96 jamkami Analýza A Kontrola B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) 7. Uzavřenou PCR destičku krátce odstřeďujte, aby se činidla usadila na dno jamek. 8. Okamžitě vložte destičku do přístroje LightCycler® 480. Nastavení přístroje LightCycler® 480 1. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru přístroje LightCycler® 480. Přihlaste se do aplikace a na stránce s celkovým přehledem zvolte „New Experiment from Template“. 2. Ze seznamu Run Templates vyberte „K-RAS LC480II Run Template“ (podrobnosti viz oddíl vyhodnocení vzorků v přístroji LightCycler® 480). 3. Zvolte záložku „Sample Editor“ a v „Step 1: Select Workflow“ zvolte zaškrtávací políčko „Abs Quant“. V části „Select Filter Combinations“ se ujistěte, že jsou zvoleny oba filtry (465-510 nm a 533-580 nm). V krocích 2 a 3 zvolte názvy vzorků. Ve sloupci 1 musí být název vzorku smíšený standard. Ve sloupci 2 musí být název vzorku NTC. Do sloupců 3-12 napište názvy vzorků. Názvy musí být stejné pro všechny jamky v 1. sloupci. Pole Quantification Sample Type by mělo mít hodnotu „unknown“. Sloupec s replikáty by měl zůstat prázdný, protože replikáty nebere software LightCycler® Adapt v úvahu. 4. Zvolte tlačítko „Experiment“ a klepněte na tlačítko „Start Run“, kterým uložíte test a spustíte cyklus. Strana 15 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Analýza vzorků v přístroji LightCycler® 480 1. Po dokončení běhu testu přístroje LightCycler® 480 pomocí okna pro navigaci exportujte testy (soubor .ixo) na vhodné místo, kam může přistoupit software LightCycler® Adapt. 2. DŮLEŽITÉ: Software LightCycler® Adapt je validován pro použití na jednom počítačovém systému, jenž je definován jako jedna kontrolní jednotka (pracovní stanice), kterou dodává společnost Roche Diagnostics a která slouží k práci s jedním přístrojem LightCycler® 480 II. Tato validace softwaru LightCycler® Adapt v současné době platí pouze pro kontrolní jednotku, která je jako samostatný počítač (tj. není součástí sítě). Použití jakéhokoli jiného počítače je zakázáno, protože software v takovém případě nemusí správně fungovat. 3. Spusťte software LightCycler® Adapt klepnutím na ikonu softwaru LightCycler® Adapt na ploše pracovní stanice a do políčka zadejte přihlašovací jméno. Toto jméno bude sloužit jako jméno autora přehledu výsledků testů. 4. V hlavním okně zvolte pomocí tlačítka prohlížeče jeden soubor běhu testu pro přístroj LightCycler® 480 (Budete-li chtít tento výběr zrušit, budete muset software ukončit a znovu spustit). 5. Zvolte formát přehledu (pdf nebo csv). Zvolíte-li csv, formát pdf se zvolí automaticky navíc také. 6. Volbou „Analyse“ vytvoříte přehled výsledků. Přehled se automaticky uloží do složky se souborem běhu testu a bude mít stejný název jako on. 7. Přehled se automaticky zobrazí. 8. Publikovatelný výsledek se zobrazí ve sloupci „Mutation Status“ v tabulce „Sample Result“. Interpretace přehledu ze softwaru LightCycler® Adapt 1. Přehled ze softwaru LightCycler® Adapt obsahuje všeobecné informace o analýze. 1.1. Autor přehledu výsledků je osoba, která spustila software a vytvořila přehled. 1.2. Datum a čas analýzy jsou dány. 2. Přehled výsledků poskytuje souhrn analýzy a uvádí název souboru běhu testu, soubor definice algoritmu a sekvenci algoritmu. Detaily algoritmu jsou dány a nelze je měnit. 3. Část s výsledky uvádí celý název a cestu souboru běhu testu přístroje LightCycler® 480 a následující podrobnosti: 3.1. Výrobní číslo přístroje LightCycler® 480. 3.2. Název přístroje – identifikátor přidělený přístroji LightCycler® 480 softwarem LightCycler® 480. Strana 16 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 3.3. Datum běhu testu – datum a čas běhu testu přístroje LightCycler® 480. 3.4. Laborant zpracovávající test – jméno osoby, která byla přihlášena v softwaru přístroje LightCycler® 480 v době běhu testu. 3.5. Název testu – název souboru běhu testu. 3.6. Verze softwaru – verze softwaru, kterou přístroj LightCycler® 480 používá. 3.7. Číslo šarže – používá se číslo z pole „Lot No“ v okně nastavení testu v softwaru LightCycler® 480. 4. V uspořádání destiček se používají názvy vzorků, které pocházejí z okna editoru vzorků softwaru přístroje LightCycler® 480. 5. Pod „Run Summary Result“ je uvedeno, zda je běh testu platný nebo neplatný. To závisí na kontrolách běhu testu ve sloupcích 1 a 2. 6. Kontroly běhu testu 6.1. Software LightCycler® Adapt automaticky vypočítá hodnotu ∆Ct smíšeného standardu pomocí vzorce: Ct analýzy vzorku s mutací – Ct analýzy kontroly = ∆Ct 6.2. Software LightCycler® Adapt srovná tyto hodnoty s očekávanými hodnotami podle tabulky 7. Tabulka 7: Očekávané hodnoty ∆Ct v softwaru LightCycler® Adapt Analýza ∆ Ct smíšeného standardu 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP -0,61 -0,61 0,34 -0,79 -0,13 0,1 -0,74 6.3. Jsou vykázány hodnoty Ct a ∆Ct. 6.4. Ve sloupcích 1 a 2 se u kontrol běhu testu mohou objevit tyto značky/varování: Strana 17 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Tabulka 8: Značky/varování softwaru LightCycler® Adapt u kontrol běhu testu Značky/varování CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL Význam DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID 6.4.1. Hodnota Ct FAM u kontroly testu je mimo rozsah U smíšeného standardu je exogenní kontrolní Ct<30 nebo je negativní, když je výsledek FAM negativní Hodnoty ∆Ct vzorku s mutací jsou mimo nastavený rozsah Došlo k neúspěšné reakci exogenní kontroly bez vzorku Reakce FAM má pozitivní hodnotu Ct u kontroly bez vzorku Význam značek/varování je podrobněji popsán níže: 6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE – Kontrolní test smíšeného standardu musí mít hodnotu Ct 26,60 ± 2. Jestliže je test mimo tento rozsah, zobrazí se tato značka/varování u všech jamek smíšeného standardu, protože hodnoty ∆Ct nejsou vypočítány a smíšený standard je neplatný. To znamená, že kontrolní test nefunguje správně. 6.4.1.2. EXO_FAIL – Tato značka/varování se zobrazí, když test exogenní kontroly u kterékoli jamky obsahující smíšený standard má hodnotu menší než 30, což může znamenat, že u této směsi došlo k PCR kontaminaci. Jestliže je test exogenní kontroly neúspěšný, když je neúspěšná reakce FAM u kterékoli jamky obsahující smíšený standard, zobrazí se značka/varování EXO_FAIL také. To znamená, že u tohoto testu došlo k problému, což může vést k falešně negativním výsledkům. Smíšený standard je již neplatný kvůli selhání FAM. 6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE – Jestliže hodnoty ∆Ct smíšeného standardu jsou v rozmezí ±2,00 hodnot uvedených v tabulce 7, software vykáže platný stav. Jestliže je hodnota ∆Ct mimo očekávaný rozsah, stav nebude platný a zobrazí se tato značka/varování. To znamená, že u testu došlo k problému, což může vést k falešným výsledkům. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID – V jamkách s kontrolami bez vzorku musí test exogenní kontroly dát pozitivní výsledek ve všech 8 jamkách (Ct < 41). Jestliže je výsledek negativní, zobrazí se tato značka/varování a stav testu je neplatný. To znamená, že u testu došlo k problému, což může vést k falešným výsledkům. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID – V 8 jamkách s kontrolami bez vzorku musí být výsledek FAM negativní (Ct > 38). Jakákoli amplifikace znamená kontaminaci. Pozitivní výsledek zobrazí značku/varování a kontrola bez vzorku bude neplatná. Strana 18 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 6.5. V případě neplatného stavu kterékoli jamky se smíšeným standardem nebo jamky s kontrolou bez vzorku bude ve sloupci Run Summary Result hodnota „Run Invalid” (Běh testu neplatný). V „Sample Result Table“ budou názvy vzorků a hodnoty Ct kontrol, ale stav mutace bude vyhodnocen jako „invalid“. Smíšený standard ukazuje, že všechny testy fungují správně. Jestliže tomu tak není, může docházek k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům vzorků s mutací. Kontrola bez vzorku ukazuje, že v základních směsích není žádná kontaminace a exogenní kontrola funguje tak, jak má. 6.6. V nepravděpodobném případě, kdy software LightCycler® Adapt vypíše chybové hlášení, si prostudujte oddíl 12, Technická podpora. 7. Výsledky vzorků 7.1. V tabulce „Sample Result Table“ najdete názvy vzorků, které pocházejí ze softwaru přístroje LightCycler® 480 a hodnoty Ct kontrolních testů. 7.2. Software LightCycler® 480 Adapt spočítá hodnoty ∆Ct a určí, zda vzorek je pozitivní nebo negativní pro mutaci na základě 1% hraniční hodnoty. Tabulka 9: 1% hraniční hodnoty softwaru LightCycler® Adapt Analýza 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 1% delta Ct 6,25 7,72 6,83 6,95 8,95 6,5 9,09 7.3. Pokud je hodnota ∆Ct vzorku s mutací menší než odpovídající hraniční hodnota pro 1 %, vzorek je klasifikován jako pozitivní pro mutaci. Software LightCycler® Adapt vyhodnotí, která mutace je přítomná, ale vyhodnotí pouze jednu mutaci. Jsou-li 2 pozitivní hodnoty ∆Ct, bude vykázána menší hodnota. Předpokládá se, že druhá hodnota vznikla díky zkřížené reakci primeru detekujícího danou mutaci vázajícího se a vytvářejícího priming s jinou mutací. Vzácně, když jsou přítomny dvojité mutace, klinické posouzení bude stejné, jako v případě přítomnosti jedné mutace. 7.4. Jestliže hodnoty ∆Ct vzorku jsou větší než hodnoty 1% ∆Ct, vzorek lze vyhodnotit jako negativní pro mutaci (může sice obsahovat mutaci, ale pouze úroveň, která je pod limity detekce soupravy). 7.5. Značky/varování 7.5.1. Software LightCycler® Adapt přiřadí vzorkům v tabulce „Sample Result Table“ značky/varování, které jsou vysvětlené v tabulce 10. Strana 19 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Tabulka 10: Značky/varování přiřazené vzorkům softwarem LightCycler® Adapt Značka/varování REP_DILUTION CONF_LEVEL LIMITED EXO_FAIL FAIL Význam Ct kontroly je menší než 24 Ct kontroly je větší než 28,9 není vyhodnocena žádná mutace Ct kontroly je větší než 35 Test exogenní kontroly nebyl úspěšný a reakce FAM v mutační reakci také nebyla úspěšná, nebo Ct exogenní kontroly je menší než 30. Software není schopen vykreslit křivku jako pozitivní nebo negativní 7.5.2. Význam značek/varování je podrobněji popsán níže: 7.5.2.1. REP_DILUTION – Ct kontroly < 24. Testy byly validovány na úrovni koncentrace DNA, která vykazuje Ct kontroly 24 nebo vyšší. Jestliže vzorek vykazuje nižší Ct kontrolního testu, je nutné ho zředit, aby byl v platném rozsahu. 7.5.2.2. CONF_LEVEL – Ct kontroly > 28,9. Značka/varování CONF_LEVEL se zobrazí u negativního vzorku s Ct kontroly > 28.9. Hodnoty Ct pro vzorky mutace s hodnotou 38 nebo vyšší se vyhodnotí jako negativní nebo mimo limity detekce soupravy. Je nutné dosáhnout hodnoty Ct kontroly 28,9 nebo nižší, aby bylo možné poskytnout dostatek DNA pro detekci 1% mutace za předpokladu 1% hraniční hodnoty a hraniční hodnoty Ct 38. Jestliže je Ct kontroly větší než 28,9 a došlo k detekci mutace, je zobrazena pozitivní mutace a tato značka/varování se nezobrazí, protože tento vzorek obsahuje jednoznačnou mutaci. Ale jestliže je Ct kontroly nad 28,9 a vzorek se zdá negativní pro mutaci, tato značka/varování se zobrazí, aby varovala, že mohlo dojít k nezachycení mutace s nízkou úrovní. Se zvyšováním Ct kontroly nad hodnotu 28,9 se snižuje senzitivita detekce mutace. 7.5.2.3. LIMITED – Ct kontroly > 35. To znamená, že je k dispozici velmi málo amplifikovatelné DNA, takže je možné detekovat pouze mutace přítomné ve velkém procentu. U vzorků LIMITED, jestliže pozitivní mutace bude mít hodnotu Ct < 38, bude stále mutaci přiřazen platný stav a vzorek bude vyhodnocen. Přítomnost mutace s nízkou úrovní ve vzorku s negativním výsledkem a se značkou/varováním LIMITED nelze nebrat v úvahu. Strana 20 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 7.5.2.4. EXO_FAIL – Software kontroluje amplifikaci exogenní kontroly, aby bylo možné stanovit, zda může být přítomen inhibitor, což by mohlo vést k falešně negativním výsledkům. Uvažujeme takto: a. Reakce exogenní kontroly bude vyhodnocena pouze v mutačních reakčních jamkách a ne v jamce kontroly, s výjimkou sloupců se smíšeným standardem a NTC (viz bod 6) nebo v případě, kdy hodnota Ct kontroly < 30. b. Jestliže je výsledek pozitivní pro mutaci, ale test exogenní kontroly v mutačně pozitivní jamce nebyl úspěšný, značka/varování EXO_FAIL se nezobrazí, protože by zde mohlo docházet ke kompetitivní inhibici z reakce FAM. Stav mutace je platný. c. Jestliže je pozitivní výsledek pro mutaci u vzorku v jedné mutační jamce a neúspěšný test exogenní kontroly v jiné mutační jamce u stejného vzorku, mutace v první jamce bude vyhodnocena a výsledek je platný. Značka/varování EXO_FAIL ale bude zobrazena. To znamená, že je problém v jamce, kde došlo k neúspěšnému testu exogenní kontroly a v této jamce mohlo dojít k nezachycení mutace. Je možné, že daná mutace je spíše vyvolána zkříženou reakcí mezi testy, než skutečnou mutací, kterou se nepodařilo zachytit. Stav mutace v testu, který byl pozitivní pro mutaci, zůstává v platnosti, protože je jasně přítomná mutace a klinické rozhodnutí zůstává stejné bez ohledu na to, která mutace je přítomná. d. Jestliže je vzorek klasifikován jako negativní pro mutaci, ale reakce exogenní kontroly nebyla úspěšná v žádném testu na přítomnost mutace, zobrazí se značka/varování EXO_FAIL a stav bude neplatný. Je možné, že došlo k nezachycení mutace. e. Jestliže je Ct testu exogenní kontroly < 30 v jakékoli z 8 jamek, zobrazí se značka/varování EXO_FAIL a stav bude neplatný. Je možné, že v tomto testu došlo ke kontaminaci produktem PCR. f. Je možné zkontrolovat soubor běhu testu pro přístroj LightCycler® 480 a zjistit možnou příčinu neúspěchu testu exogenní kontroly. Jestliže došlo k neúspěšným reakcím všech exogenních kontrol ve sloupci, je možné, že je přítomen inhibitor. Jestliže k tomu došlo jen v jedné jamce, může jít o problém s nastavením destičky. 7.5.2.5. FAIL – Značka/varování FAIL se zobrazí, když software nedokáže určit, zda je amplifikační křivka pozitivní nebo negativní; např. tehdy, když je tvar křivky abnormální. Strana 21 ze 38 Pouze pro diagnostické užití 7.5.3. TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Software LightCycler® Adapt kontroluje, zda název vzorku ve sloupci je identický, aby bylo možné zajistit, že hodnoty Ct mutace a kontrolního testu použité k výpočtu hodnot ∆Ct pocházejí ze stejného vzorku. Názvy vzorků pocházejí z editoru vzorků přístroje LightCycler® 480 v souboru běhu testu. Jestliže ve sloupci nedojde ke shodě, software vloží do sloupce s názvy vzorků v tabulce s výsledky vzorků hodnotu SAMPLE MISMATCH. V uspořádání destiček software vloží název vzorku a poté následuje hodnota (MISMATCH). Jestliže došlo k překlepu, název je možné opravit v souboru běhu testu přístroje LightCycler® 480 a data lze znovu analyzovat v softwaru LightCycler® Adapt. Nastavení ABI7500 Pro každý vzorek DNA je třeba provést kontrolní test a test na přítomnost mutace ve stejném běhu PCR reakce, aby byly vyloučeny rozdíly jednotlivých provedení testu. 1. Při pokojové teplotě rozmrazte reakční směsi a smíšený standard ze soupravy K-RAS. Promíchejte každý roztok otočením každé zkumavky 10krát ihned po rozmražení, aby nedošlo k místním rozdílům v koncentraci solí. Připravte si dostatečné množství směsí pro vzorky DNA, smíšený standard a kontroly bez vzorku, plus navíc 2 reakce na každou sestavu jako rezervu, jak je uvedeno v tabulce 11. Tabulka 11: Množství základní směsi soupravy K-RAS Analýza Kontrolní analýza Analýzy mutace Reakční směs (µl)x1 Základní směsi Reakční směs (µl) Taq (µl)x1 na destičce (x14) Taq (µl) na destičce (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NEPROMÍCHÁVEJTE Taq nebo jakékoliv reakční směsi obsahující Taq, může to způsobit inaktivaci enzymů. 3. Před použitím ponechte Taq temperovat při pokojové teplotě. Ampulku Taq krátce odstřeďujte, aby se veškerá Taq shromáždila na dně ampulky. Pak pipetujte umístěním špičky pipety těsně pod hladinu Taq, aby nedošlo k pokrytí vnější strany špičky pipety nadměrným množstvím Taq. 4. Opakovaným nasátím pipetou opatrně smíchejte základní směsi. 5. Okamžitě přidejte 20 µl základní směsi do každé z reakčních jamek. Strana 22 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 6. Okamžitě přidejte 5 µl testovaného vzorku, smíšeného standardu nebo vody (pro kontroly bez vzorku) do reakčních jamek. Každý vzorek DNA musí být testován pomocí obou analýz - kontrolní i mutační. Uspořádání destičky je v tabulce 12. Tabulka 12: Uspořádání destičky soupravy K-RAS pro ABI7500 Uspořádání s 96 jamkami Analýza A Kontrola B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) 7. Uzavřenou PCR destičku krátce odstřeďujte, aby se činidla usadila na dno jamek. 8. Okamžitě vložte destičku do přístroje ABI7500. Nastavení přístroje ABI7500 1. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru systému 7500. V softwaru 7500 Sequence Detection, verze 1.4 otevřete v nabídce nový soubor běhu testu. 2. V „Assay“ zvolte „Standard Curve (Absolute Quantification)“. V „Run Mode“ zvolte „Standard 7500“. 3. Pomocí tlačítka „Next“ se přesuňte do okna nastavení detektoru. K seznamu detektorů přidejte detektory FAM a JOE, jako zhášecí přísady zvolte „none“. Jestliže tyto detektory ještě nejsou definovány, zvolte tlačítko „New Detectors“ a u detektorů FAM a JOE nastavte zhášecí přísady na „none“. 4. Nastavte „Passive Reference“ na „None“ a zvolte tlačítko „Next“. 5. Zvolte celou destičku a zaškrtněte políčka detektorů FAM a JOE, aby tak byly monitorovány obě barviva ve všech jamkách. Zvolte tlačítko „Finish“. 6. Na záložce „Instrument“ nastavte cyklování podle tabulky 13. Strana 23 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Tabulka 13: Parametry cyklů ABI7500 Teplota Fáze 1 95 oC Fáze 2 95 oC 60 oC Čas Cykly 4 min 1 30 sek 1 min 40 Sběr dat FAM, JOE 7. Zvolte tlačítko „Start“, kterým uložíte test a spustíte cyklus. Analýza vzorku v přístroji ABI7500 1. Zajistěte, aby na zobrazovacím panelu jamek byla nastavena pasivní reference na „žádná“. 2. Zkontrolujte, zda každá jamka dává signál JOE při testu exogenní kontroly. a. Pokud test exogenní kontroly dává pozitivní výsledek, pokračujte v testování. b. Pokud test exogenní kontroly selhal, avšak reakce FAM silně amplifikovala, pokračujte v analýze, neboť reakce FAM kompetitivně potlačila reakci exogenní kontroly. c. Pokud obě reakce (FAM i kontrolní reakce) selhaly, údaje se musí vyřadit, neboť mohou být v reakci přítomny inhibitory. Tyto inhibitory mohou vést k falešně negativním výsledkům. 3. Na záložce Amplification Plot vyberte všechny používané jamky a z rozbalovací nabídky detektoru vyberte FAM dye (barvivo FAM). Použijte automatické nastavení základní úrovně a manuální Ct a pak pomocí logaritmické stupnice pro osu Y ručně nastavte práh uprostřed exponenciální fáze, jak je popsáno v uživatelské příručce k přístroji ABI7500. 4. Vyhodnoťte naměřené údaje a vypočítejte hodnotu ∆Ct takto: [Ct analýzy vzorku s mutací] – [Ct analýzy kontroly] =∆Ct Pro zjednodušení rozboru lze data exportovat do aplikace Microsoft Excel. Interpretace dat ABI7500 1. Hodnoty Ct u kontroly: 1.1. Hodnota Ct u kontroly musí být ≥ 24, aby nedošlo k inhibici reakce z důvodu vysokého vstupního množství DNA v testu. 1.2. Hodnota Ct u kontroly < 29: Souprava K-RAS je v těchto vzorcích schopná detekovat mutace s citlivostí záchytu 1 %. 1.3. Ve vzorcích s hodnotou Ct u kontroly ≥ 29: Souprava nebude detekovat s citlivostí záchytu 1 % mutací, bude však stále schopná detekovat vyšší procento mutací. Strana 24 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 1.4. Hodnota Ct u kontroly ≥ 35: Ve vzorku je přítomno jen málo amplifikovatelné DNA a mutace jsou detekovatelné pouze tehdy, pokud je většina z DNA molekul mutovaná. 1.5. Hodnota Ct u kontroly ≥ 38: množství DNA je limitující a data se nesmí použít. 2. Hodnoty ∆Ct smíšeného standardu 2.1. Hodnoty ∆Ct smíšeného standardu je uvedena v tabulce 14, může se však objevit odchylka ±2 v důsledku rozdílného nastavení prahu na různých přístrojích. Tabulka 14: Hodnoty ∆Ct smíšeného standardu a 1% hraniční hodnoty v přístroji ABI7500 Testy 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP ∆Ct smíšeného standardu -0,70 -1,04 -0,02 -0,98 0,02 -0,19 -1,12 Přijatelné rozmezí smíšeného standardu -2,70 až 1,30 -3,04 až 0,96 -2,02 až 1,98 -2,98 až 1,02 -1,98 až 2,02 -2,19 až 1,81 -3,12 až 0,88 ∆Ct 1 % vzorku 6,5 8 8 7 9 6,5 9 3. Hodnoty ∆Ct vzorku: 3.1. Pokud je hodnota ∆Ct vzorku větší než hodnota pro 1 % (uvedená v tabulce 14), vzorek DNA je klasifikován jako negativní na přítomnost mutace K-RAS nebo pod limity detekce soupravy K-RAS. 3.2. Pokud je ∆Ct vzorku menší než hodnota pro 1 %, vzorek DNA je klasifikován jako pozitivní pro mutaci K-RAS. 3.3. Ct pro vzorky mutace s hodnotou 38 nebo vyšší se vyhodnotí jako negativní nebo pod limity detekce soupravy. 10. Omezení testu Schopnost testu detekovat již 1 % mutaci na pozadí „divokého“ typu genomické DNA je podmíněna hodnotou Ct testu kontroly < 29 v přístroji ABI7500 a < 28,9 v přístroji LightCycler® 480. Testy nemohou detekovat 1 % mutací ve vzorcích, kde jsou hodnoty Ct kontroly vyšší. Sensitivita detekce mutace klesne, když se hodnota Ct kontroly zvýší nad tyto hodnoty. Hodnota Ct kontroly vzorku DNA je založena na stanovení koncentrace pomocí PCR. Hodnoty založené na odečtených hodnotách optické hustoty neodpovídají hodnotám Ct kontrolního testu ve vzorcích fragmentované DNA. Proto se v soupravě dodává navíc kontrolní reakční směs, která u vzorku umožní posouzení prahů cyklu Ct ještě před samotným zpracováním vzorku DNA v testu. Strana 25 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Pokud vzorek dává pozitivní výsledek tam, kde je Ct mutace ≥ 38, test se musí hodnotit jako negativní nebo pod limity detekce testu. Toto provádí automaticky software LightCycler® Adapt. Mezi reakcemi detekce mutací může docházet k určité zkřížené reakci. Například, pokud je patrná vysoká úroveň mutace 12ALA, některé z jiných typů mutace mohou vykazovat také pozitivní výsledek. To je důsledkem jevu, kdy ARMS primery detekují jiné mutace v rámci několika bazí navzájem. Při použití syntetického kontrolního materiálu představuje zkřížená reakce definovatelný vzor v přístroji ABI7500, který dovoluje, aby z několika signálů byl určen skutečně pozitivní signál (viz tabulka 15). Tabulka 15: Vzor zkřížené reakce v přístroji ABI7500 (syntetický kontrolní materiál) „Ano“ znamená skutečně pravý signál. Čísla udávají přibližný počet cyklů po tomto signálu, kde může být vidět signál zkřížené reakce. Více než 9 hodnot cyklů není uvedeno, protože tyto signály se již nacházejí v negativní zóně. Pozitivní vzorek 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP signál signál signál signál signál signál signál Ano 9 6 3 6 9 Ano Ano 7 4 Ano 9 6 9 Ano 8 4 Ano Ano Poznámka: Charakteristika zkřížené reakce může být rozdílná u vzorků DNA, např. v parafinu zalitých vzorcích DNA. Souprava K-RAS je navržena k detekci jedné mutace ve vzorku DNA. Pokud druhý test detekce mutace dává pozitivní výsledek, jedná se patrně o zkříženou reakci. Vzácně však lze pozorovat i dvojité mutace. Pokud charakter výsledků testu neodpovídá vzoru zkřížené reakce, je třeba provést další testování. 11. Charakteristika vlastností testu Vlastnosti testu byly charakterizovány pro soupravu K-RAS použitou s přístrojem ABI7500 a s přístrojem LightCycler® 480 (k získání hodnot Ct pomocí softwaru LightCycler® Adapt). Na každém přístroji bylo provedeno velké množství testů. Výsledky tohoto testování jsou shrnuty níže. Ověření platnosti 1 % hranice: Přístroj LightCycler® 480: Detekce 1 % mutace na pozadí vzorků DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace K-RAS byla určena testováním tří různých koncentrací DNA z buněčných linií ke stanovení hodnoty hranice ∆Ct pro každou mutační analýzu. Strana 26 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS V každém testu byly 1 % standardy testovány ve třech replikátech ve třech samostatných bězích testu jak pro mutační, tak i pro kontrolní test. Tento postup zopakovali tři různí laboranti. Hodnoty Ct byly získány ze softwaru LightCycler® Adapt. Hodnoty 1 % ∆Ct byly vypočítány ze všech kombinací mutací a hodnot Ct kontrol z replikátů v rámci běhu testu. Hraniční hodnoty ∆Ct byly stanoveny jako průměrná hodnota ze všech dávek a koncentrací. Výsledky tohoto testování jsou shrnuty v oddílu interpretace dat. ABI7500: V každém testu byly vzorky v 1 % zředění testovány ve třech replikátech pro tři šarže soupravy ve třech samostatných bězích testu a to jak pro mutační, tak i pro kontrolní test. Smíšený standard byl přidán ke každé destičce pro kontrolu splnění specifikovaných kritérií průběhu testů. Hodnoty 1 % ∆Ct byly vypočítány z průměrných hodnot Ct replikátů v rámci běhu testu a šarže. Hraniční hodnoty ∆Ct byly stanoveny jako průměrná hodnota (s přesností na 0,5) ze všech šarží, běhů testu a koncentrací, u nichž všechny replikáty dávaly výslednou hodnotu Ct. Výsledky tohoto testování jsou shrnuty v tabulce 16 níže. Tabulka 16: Výsledky validace hraničních hodnot 1 % v přístroji ABI7500 Analýza Průměr Hodnoty 1 % ∆Ct 12ALA 6,68 6,5 12ASP 8,2 8 12ARG 8,16 8 12CYS 6,94 7 12SER 8,83 9 12VAL 7,67 7,5* 13ASP 8,89 9 *Hranice 1 % pro 12VAL se na základě studie průlomu testu změnila na 6,5. Viz diskuze níže. Stanovení ∆Ct smíšeného standardu: Přístroj LightCycler® 480: Hodnoty ∆Ct smíšeného standardu jsou průměrné hodnoty z 50 běhů, ve kterých byl smíšený standard testován. Hodnoty Ct byly získány ze softwaru LightCycler® 480 Adapt. Očekávané hodnoty ∆Ct pro smíšený standard jsou uvedeny v oddíle interpretace dat. ABI7500: Hodnoty smíšeného standardu byly nastaveny jako průměr z 422 hodnot ∆Ct. Ty byly vypočítány z mnoha různých šarží soupravy a běhů testů. Očekávané hodnoty ∆Ct pro smíšený standard jsou uvedeny v oddíle interpretace dat. Strana 27 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Validace průlomu testu: Průlom je definován jako nespecifická amplifikace v průběhu testů na přítomnost mutace způsobená reakcí cílové DNA „divokého“ typu přítomné v daném vzorku. To způsobuje měřitelnou úroveň šumu pozadí. Průlom u nativní DNA byl hodnocen pro každý test mutace. Studie průlomu potvrdila, že dříve stanovené hodnoty 1 % hranice leží pod úrovní průlomu a zabrání výstupu falešně pozitivního výsledku testu. Přístroj LightCycler® 480: Deset vzorků DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace K-RAS v různých koncentracích, 5 vzorků FFPE negativních na přítomnost mutace K-RAS a 5 vzorků FFPE pozitivních na přítomnost mutace K-RAS bylo testováno v duplikátech na 5 destičkách. Vzorky pozitivní na přítomnost mutace byly pozitivní na jednu mutaci a další mutace byly použity k testu průlomu. Hodnoty Ct byly získány ze softwaru LightCycler® 480 Adapt a k výpočtu hodnot ∆Ct byly použity všechny kombinace hodnot Ct. Všechny výsledky ze vzorků DNA z buněčných linií a testy vzorků negativních na mutaci měly hodnoty ∆Ct, které ležely nad hodnotami pro hraniční hodnotu 1 % a ukázaly, že hraniční úroveň 1 % je robustní. Tabulka 17 ukazuje nejhorší průlomy z 5 běhů. Tabulka 17: Výsledky průlomu testu Analýza 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Hodnoty ∆Ct nejhorších průlomů 12,35 11,36 Nedošlo k průlomu Nedošlo k průlomu 11,74 12,29 11,29 ABI7500: Průlom byl vyhodnocen pomocí poolovaných vzorků DNA z buněčných linií z buněčných linií negativních na přítomnost mutace K-RAS se třemi různými úrovněmi DNA. Byly testovány tři stejné PCR destičky. Každá destička obsahovala 3 šarže činidel. Jako pozitivní kontrola byl použit smíšený standard. Navíc byly testovány pozitivní vzorky FFPE v duplikátech. Většina vzorků pozitivních na přítomnost mutace je pozitivní pouze na jednu mutaci. Další testy na přítomnost mutace lze použít k vyhodnocení průlomu (i když mezi některými testy a pozitivními mutacemi se očekává určitá zkřížená reakce. Vytvořený vzor zkřížené reakce je ale známý). Byly získány hodnoty Ct a ∆Ct a ty se porovnávají s 1 % hraničními hodnotami. Strana 28 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Všechna data ze vzorků DNA z buněčných linií a vzorky FFPE měly hodnoty ∆Ct, které ležely nad hodnotami pro hraniční hodnotu 1 %, kromě jednoho vzorku FFPE, který vykázal hodnotu ∆Ct těsně pod (6,84) hraniční hodnotu 7,5. Protože rozsah dat pro stanovení 1 % hraniční hodnoty zahrnoval i hodnotu 6,84, k eliminaci možnosti falešně pozitivního výsledku byla hodnota 1 % ∆Ct pro analýzu 12VAL změněna z 7,5 na 6,5. Tabulka 18 níže uvádí aktuální hodnoty 1 % ∆Ct založené na výsledcích validace průlomu testu. Tabulka 18: Výsledky validace průlomu testu Analýza 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Hodnoty 1 % ∆Ct 6,5 8 8 7 9 6,5 9 Validace přesnosti: Přístroj LightCycler® 480: Přesnost byla testována pomocí 1 % syntetických kontrol ve 3 různých koncentracích vzorků DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace K-RAS. V každém testu byla každá kontrola testována ve třech replikátech na destičce, která obsahovala i reakci smíšeného standardu v duplikátu a samostatnou NTC (bez vzorku), aby bylo zajištěno, že reakce probíhají podle specifikací. Test stejné destičky se opakoval 54krát během 6 dní. Při uvedených bězích testu byly použity 3 přístroje, 3 šarže činidel a zpracovávali je 3 laboranti. Hodnoty Ct byly získány ze softwaru LightCycler® 480 Adapt a k výpočtu hodnot ∆Ct byly použity všechny kombinace hodnot Ct. Všechny hodnoty ∆Ct, které třikrát překročily vnitřní kvartil rozsahu, byly pokládány za spadající mimo rozsah a byly vyřazeny z analýzy. Byly spočítány průměry, standardní chyby a standardní odchylky a data byla seskupena podle šarže soupravy, přístroje nebo laboranta, aby bylo možné zjistit, jaké odchylky tyto proměnné způsobily. Byla vyhodnocena i celková opakovatelnost testů. Data ukazují, že celková variabilita v rámci testů je nízká a 2 standardní odchylky blízké průměru jsou v rozsahu ±1,4 cyklu od průměru testu s maximální standardní odchylkou. U každého testu průměrná hodnota ∆Ct každého laboranta leží v rozsahu 0,15 cyklu celkového průměru všech dat. Rozdíly mezi laboranty nebyly větší než 0,2 Ct, což ukazuje, že odchylka mezi operátory není větší než odchylka v celém souboru dat a testy jsou dostatečně robustní na to, aby na ně odchylky zpracování způsobené různými laboranty neměly žádný vliv. Strana 29 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS U každého testu byl rozdíl mezi průměry u jednotlivých přístrojů a celkovým průměrem ±0,097 a rozdíl mezi průměry jednotlivých přístrojů nebyl horší než ±0,186. To ukazuje, že odchylka mezi přístroji není větší než odchylka v celém souboru dat a testy jsou dostatečně robustní na to, aby na ně odchylky zpracování způsobené různými přístroji neměly žádný vliv. U každého testu byl největší rozdíl mezi jednou šarží a jejich celkovým průměrem ±0,195 a nejhorší rozdíly mezi šaržemi byly ±0,38. To ukazuje, že odchylka mezi šaržemi není větší než odchylka v celém souboru dat a testy jsou dostatečně robustní na to, aby na ně odchylky zpracování způsobené různými šaržemi neměly žádný vliv. ABI7500: Testy byly provedeny za účelem stanovení přesnosti provedení každého testu tak, že se jedna destička PCR testovala pro každou ze 3 šarží činidel během dne, v různé dny, různými laboranty a různými přístroji a to se vzorky s vysokými a nízkými koncentracemi DNA a se vzorky s vysokými a nízkými úrovněmi mutace. K vyhodnocení variace mezi replikáty, šaržemi činidel, běhy testů v průběhu dne, dny testování, přístroji a laboranty byla použita jednocestná analýza variace ANOVA. Nulová hypotéza předpokládala, že průměrné hodnoty napříč kategoriemi jsou shodné. Pro hodnoty Ct se také vypočítaly celkové průměrné hodnoty, standardní odchylky SD a hodnoty koeficientu variace %CV. Žádný z těchto testů nevykázal na úrovni p=0,05 signifikantní odchylku od nulové hypotézy, kdy průměrné hodnoty napříč kategoriemi mají být shodné. To znamená, že testy jsou dostatečně robustní, aby na ně odchylky zpracování způsobené různými přístroji, laboranty, šaržemi, dny testování a běhy testu neměly žádný vliv. Validace správnosti testu: Přístroj LightCycler® 480: Správnost byla vyhodnocena pomocí 92 vzorků FFPE a 28 vzorků ředěných buněčných linií pozitivních na přítomnost mutace. Tyto vzorky byly testovány pomocí soupravy K-RAS a rovněž byly analyzovány pomocí sekvenční metody Sanger. Vzorky K-RAS s mutací byly porovnány 2 metodami a bylo 18 neshodných výsledků (5 FFPE a 13 z buněčných linií), kde metoda sekvencování vykázala negativní výsledky, ale při použití testu DxS byl vzorek pozitivní. Aby u těchto 18 vzorků bylo možné potvrdit přítomnost mutace, u každého vzorku byl naklonován region kolem mutace. K vyřešení neshody sloužila přítomnost klonu pozitivního na mutaci. ABI7500: Správnost testu byla hodnocena použitím syntetických kontrol rozředěných do 2 úrovní vzorků DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace K-RAS, aby vznikla 3 různá procentuální zastoupení mutací zahrnující jak pozitivní, tak i negativní výsledek detekce mutace. S každou mutací byly testovány tři identické destičky, každá se třemi šaržemi činidel. Strana 30 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Byly testovány úrovně mutace 25 %, 5 % a 0,5 %. (25% a 5% vzorky by měly mít výsledek pozitivní pro mutaci (∆Ct pod 1 % hraniční hodnotou); 0,5 % vzorek by měl mít výsledek negativní pro mutaci (∆Ct nad 1 % hraniční hodnotou). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 19 níže. Tabulka 19: Výsledky validace správnosti testu s přístrojem ABI7500 Analýza 25% 5% 0,5% Analýza 100% 100% 94% 12ALA 100% 100% 100% 12ASP 100% 100% 100% 12ARG 100% 100% 100% 12CYS 100% 100% 100% 12SER 100% 100% 100% 12VAL 100% 100% 100% 13ASP 100% 100% 100% Snížení správnosti testu 12ALA je zapříčiněno variací replikátů na stejné úrovni DNA. Validace linearity: Přístroj LightCycler® 480: Linearita každého testu byla vyhodnocena pomocí syntetických standardů při 100 %, 1 % a 0 % úrovni mutace. Aby byla zachována úroveň mutace a zároveň došlo ke snížení celkového množství DNA, bylo provedeno sériové ředění každého procentuálního zastoupení mutací. Každé ředění bylo testováno ve třech replikátech na třech replikovaných destičkách pro kontrolní test a relevantní test na přítomnost mutace. Následně byly vykresleny standardní křivky. Hodnoty Ct byly vytvořeny v softwaru LightCycler® Adapt. Pro každou mutaci byl vytvořen graf (data nejsou zobrazena), kam byly vůči sobě vyneseny hodnoty Ct kontrolního testu a Ct testu na přítomnost mutace a pro každou úroveň mutace byla vytvořena regresní křivka. Pro každou úroveň mutace byly vyneseny i 95% intervaly spolehlivosti. Při testování 0% zastoupení nebyly získány žádné hodnoty Ct pro vzorky mutace. Grafy 100% a 1% zastoupení ukázaly, že existuje jasné rozlišení mezi skupinami dat a sklony křivek byly v podstatě stejné, což znamená, že v celé škále koncentrací mutací je podobná účinnost amplifikace. ABI7500: Tato studie hodnotila účinnost každého testu mutace ve škále koncentrací mutované DNA na pozadí „divokého“ typu genomické DNA a vody. Každý test mutace by měl mít efektivitu 90 - 110 % (100 % ± 10 %). Standardní křivky byly vytvořeny pomocí 5-násobného sériového ředění a v každém testu byla použita jedna PCR destička obsahující tři dávky činidel soupravy. V každém z testů po ředění vodou bylo testováno 50 ng, 10 ng, 2 ng a 0,4 ng DNA 100 % mutační standardy. Strana 31 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Kvůli hodnocení efektu průniku byly testy na přítomnost mutace testovány i 5-násobným sériovým ředěním do roztoku 10 ng/µl DNA z buněčných linií. Pro každý test mutace byla vytvořena standardní křivka. Účinnost PCR reakce byla vypočítána pomocí rovnice: 100((10-1/sklon křivky)-1) Vyšší hladina průlomu u ředění roztoku 10 ng/µl DNA z buněčných linií vykazovala účinnost PCR reakce nad 100 %. Byla vypočítána celková účinnost mezi dávkami činidel. Všechny hodnoty byly podobné a byly v rozmezí 10 % účinnosti kontroly testu. Podobné standardní křivky mezi kontrolami testu a testy na přítomnost mutace znamenají, že metoda analýzy ∆Ct je vhodná pro použití. Linearita byla přijatelně zachována od úrovně 0,4 ng DNA do 50 ng DNA. Validace zkřížené reakce: Přístroj LightCycler® 480: Validace zkřížené reakce nebyla provedena, protože software LightCycler® Adapt vyhodnotí pouze jednu mutaci s nejmenším Ct. ABI7500: Protože se všechny mutace testované soupravou K-RAS vyskytují v oblasti 5 párových bazí, lze očekávat zkříženou reakci mezi primery. Tato studie stanovila charakteristiky zkřížené reakce soupravy K-RAS. Testování probíhalo s použitím syntetických mutačních kontrol ke stanovení počtu cyklů následujících po skutečně pozitivním signálu, po nichž se objeví signál vyvolaný zkříženou reakcí. Každá mutační reakční směs byla testována se šesti replikáty sedmi samostatných 100 % mutačních kontrol. Navíc byla každá kontrola analyzována s odpovídající reakční směsí a se všemi ostatními reakčními směsmi ve stejném běhu testu. Přítomnost zkřížené reakce byla stanovena výpočtem rozdílu mezi skutečnou amplifikační hodnotou Ct z označené kazety a signálem zkřížené reakce z každého dalšího primeru. Očekávaná charakteristika zkřížené reakce je uvedena v tabulce 20 níže. Charakteristika zkřížené reakce je konzistentní a umožňuje uživateli interpretovat průběh amplifikace s více než jedním pozitivním výsledkem a získat správný výsledek testu (tam, kde se objevuje více než jeden pozitivní výsledek mutace). Číslice v buňkách tabulky ukazují přibližný počet cyklů po skutečně pozitivním signálu, kdy může být zaznamenán signál ze zkřížené reakce. Hodnoty nad devět cyklů nejsou uvedeny, protože jsou považovány za výsledky negativní pro mutaci. Strana 32 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Tabulka 20: Výsledky validace zkřížené reakce s přístrojem ABI7500 Pozitivní vzorek 12ALA signál 12ASP signál 12ARG signál 12CYS signál 12SER signál 12Val signál 13ASP signál 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Ano 9 9 4 - 9 Ano 7 6 - Ano 4 9 - 6 Ano - 3 Ano - 6 Ano - 8 Ano Validace tolerance v cyklech: Přístroj LightCycler® 480: Tyto studie stanovily toleranci testů na přítomnost mutace k odchylkám v teplotě v cyklech testu. Teplota temperování reakční směsi byla proměnlivým parametrem, protože tato teplota je nejkritičtější veličinou, která ovlivňuje kvalitu provedení testu. Tolerance v cyklech testu byla vyhodnocena pomocí 1 % syntetických standardů při 3 různých úrovních koncentrace DNA. Pro každou mutaci byly tyto vzorky testovány třikrát spolu s reakcí smíšeného standardu v duplikátu a samostatnou NTC (bez vzorku), aby tak bylo zajištěno, že reakce probíhají podle specifikací. Každá destička byla testována při temperování na 59 °C, 60 °C a 61 °C. Optimální teplota pro běh testu je 60 °C, ale možná odchylka uvnitř či mezi bloky PCR znamená, že test musí být robustní v celém uvedeném rozsahu. Každá destička byla testována ve třech replikátech při každé teplotě. Hodnoty Ct byly získány ze softwaru LightCycler® Adapt a k výpočtu hodnot ∆Ct byly použity všechny kombinace hodnot Ct kontrol a vzorků pozitivních na mutaci. Všechny testy splňují kritéria pro přijetí, to znamená, že hodnoty při 59 °C a 61 °C se nesmí lišit od průměrné hodnoty při 60 °C ± standardní odchylka při 60 °C. To znamená, že testy jsou dostatečně robustní, aby odchylky zpracování způsobené odchylkou při temperování 1 °C neměly žádný vliv. ABI7500: Při každé teplotě temperování probíhaly testy tří identických PCR destiček obsahujících všechny 3 šarže činidel. Testován byl smíšený standard a také 50 ng poolovaných vzorků DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace. Protože doporučenou teplotou pro temperování je 60 °C, destičky byly testovány při 58 °C, 60 °C a 62 °C. Pokud by byly testy dostatečně odolné ke kolísání teploty temperování v tomto experimentu, měly by hodnoty ∆Ct smíšeného standardu ležet v rozmezí ±1,5 ke stanoveným hodnotám pro smíšený standard a hodnoty ∆Ct poolovaných buněčných linií by měly být nad body 1 % hraniční hodnoty. Strana 33 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Test 12ASP ukázal největší odolnost ke kolísání teploty; všechny tři testy při třech uvedených teplotách proběhly přijatelně a ukazují, že testy jsou dostatečně robustní, když probíhají při teplotách o 2 °C vyšších nebo nižších než optimální teploty temperování testu. Validace tolerance Taq: Přístroj LightCycler® 480: Tato studie určila toleranci testu přítomnosti mutace ke změnám v množství polymerázy Taq, které představuje potenciální možnost variací ze strany uživatele testu při přidávání Taq do reakční směsi. Tolerance testů vůči různým úrovním Taq byla vyhodnocena pomocí 1 % syntetických standardů se třemi různými hladinami DNA. Každý vzorek byl testován ve třech replikátech na vysokou, normální a nízkou úroveň Taq (vysoká hladina je 20 % Taq navíc, nízká hladina je 20 % Taq méně než normálně). Byla testována i reakce smíšeného standardu v duplikátu a jedna NTC, aby bylo zajištěno, že reakce probíhají podle specifikací. Každá destička byla testována ve třech replikátech a k testu byly použity tři různé šarže Taq. Hodnoty Ct byly získány ze softwaru LightCycler® Adapt a k výpočtu hodnot ∆Ct byly použity všechny kombinace hodnot Ct replikátů na destičce. Všechny testy splňují kritéria pro přijetí, to znamená, že průměry vzorků s vysokou a nízkou hladinou Taq se neliší od průměru vzorků s normální hladinou Taq o více než 1 standardní odchylku normálních dat Taq. ABI7500: Pro každý test mutace byly použity tři identické PCR destičky, z nichž každá obsahovala všechny 3 šarže reagencií, a polymeráza Taq byla přidána k reakční směsi v objemu pohybujícím se mezi +10 % a -10 % od doporučeného množství; zároveň bylo testováno doporučené množství. Byl testován smíšený standard a 1% standardy ve 2 hladinách koncentrace DNA a 50 ng DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace. Data získaná z testování byla zpracována a vypočteny hodnoty průměru, standardní odchylky a koeficientu variace. Výsledky ukázaly jen malou variaci (odpovídající standardní odchylce SD mezi testy %CV < 10 %) u výsledků testů, kde se rozdíly objemu Taq pohybovaly v rozmezí ±10 %, což naznačuje, že testy tolerují až 10 % rozdíl množství přidané Taq polymerázy. 12. Technická podpora Technickou pomoc a další informace Vám poskytne Váš distributor výrobků společnosti Roche. Seznam a kontaktní údaje hlavních distributorů výrobků společnosti Roche jsou uvedeny v oddíle 13. Strana 34 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 13. Údaje o výrobci a distributorech DxS Limited 48 Grafton Street, Manchester M13 9XX, Spojené království Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA Člen skupiny Roche SPOJENÉ KRÁLOVSTVÍ FRANCIE ŠPANĚLSKO Roche Diagnostics Charles Avenue Burgess Hill, West Sussex, United Kingdom RH15 9RY Roche Diagnostics S.A. 2 Avenue du Vercors BP 59, Meylan Cedex, 38240 Roche Diagnostics S.L. Av. de la Generalitat, s/n Sant Cugat del Valles Barcelona, E--08190 NĚMECKO Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstr. 116 Dept. VM-G Mannheim, D--68298, ŠVÝCARSKO Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestr. 7 Rotkreuz, CH--6343 Roche Diagnostics – Italy V. le G.B. Stucchi 110 Monza (MI), I--20052 ITÁLIE Pokud jste si zakoupili tuto soupravu v zemi, která se nenachází ve výše uvedeném seznamu adres poboček společnosti Roche, kontaktujte Roche Diagnostics, GmbH, v Mannheimu, Německo, na níže uvedené adrese. HLAVNÍ DISTRIBUČNÍ CENTRUM Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D--68305 Mannheim 14. Datum vydání poslední revize Datum poslední verze: únor 2009 Shrnutí změn: Změna hodnoty v tabulkách 5 a 11. Několik malých typografických změn. Strana 35 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 15. Literatura 1. R.A. Hilger, M.E. Scheulen, D. Strumberg. (2002). The Ras-Raf-MEKERK Pathway in the Treatment of Cancer. Onkologie 25: 511-518. 2. Pavan Bachireddy, Pavan K. Bendapudi, Dean W. Felsher. (2005). Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res 11(12):4278-4281. 3. Sae-Won Han, Tae-You Kim, Yoon Kyung Jeon, Pil Gyu Hwang, SeockAh Im, Kyung-Hun Lee, Jee Hyun Kim, Dong-Wan Kim, Dae Seog Heo, Noe Kyeong Kim, Doo Hyun Chung, Yung-Jue Bang. (2006). Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation, K-ras Mutation, and AKT Phosphorylation. Clin Cancer Res 12(8):2538-2544. 4. William Pao, Theresa Y. Wang, Gregory J. Riely, Vincent A. Miller, Qiulu Pan, Marc Ladanyi, Maureen SF. Zakowski, Robert T. Heelan, Mark G. Kris, Harold E. Varmus. (2005). KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib. PloS Medicine 2(1):57-61. 5. Astrid Lievre, Jean-Baptiste Bachet, Delphine Le Corre, Valerie Boige, Bruno Landi, Jean-Francois Cote, Gorana Tomasic, Christophe Penna, Michel Ducreux, Philippe Rougier, Frederique Penault-Llorca, Pierre Laurent-Puig. (2006). KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer. Cancer Res 66 (8): 39923995. 6. Silvia Benvenuti, Andrea Sartore-Bianchi, Federica Di Nicolantonio, Carlo Zanon, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Salvatore Siena, Alberto Bardelli. (2007). Cancer Res 67 (6): 2643-2648. 7. W. De Roock, J. De Schutter, G. De Hertogh, M. Jannsens, B. Biesmans, N. Personeni, K. Geboes, C. Verslyp, E. Van Cutsem, S. Tejpar. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4132. 8. G. Finocchiaro, F. Cappuzzo, P.A. Janne, K. Bencardino, C. Carnaghi, W.A. Franklin, M. Roncalli, L. Crino, A. Santoro, M. Varella-Garcia. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4021. 9. F. Di Fiore, F. Blanchard, F. Charbonnier, F. Le Pessot, A. Lamy, M.P. Galais, L. Bastit, A. Killian, R. Sesboue, J.J. Tuech, A.M. Queuniet, B. Paillot, J.C. Sabourin, F. Michot, P. Michel, T. Frebourg (2007). British Journal of Cancer 96: 1166-1169. 10. Shirin Khambata-Ford, Christopher R. Garrett, Neal J. Meropol, Mark Basik, Christopher T. Harbison, Shujian Wu, Tai W. Wong, Xin Huang, Chris H. Takimoto, Andrew K. Godwin, Benjamin R. Tan, Smitha S. Krishnamurthi, Howard A. Burris III, Elizabeth A. Poplin, Manuel Hidalgo, Jose Baselga, Edwin A. Clark, David J. Mauro. (2007). Journal of Clinical Oncology 25(22): 3230-3237. 11. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C et al. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res. 17 (7): 2503-16. 12. Whitcombe, D., Theaker J., Guy, S.P., Brown, T., Little, S. (1999). Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17: 804-807. Strana 36 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS 13. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection. Nucleic Acids Research 28(19): 3752-3761 14. De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, Janssens M, De Hertogh G, Personeni N, Biesmans B, Van Laethem JL, Peeters M, Humblet Y, Van Cutsem E, Tejpar S. KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol. 2007, Nov. 12. 15. Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F, LaurentPuig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66:3992-5. 16. Lièvre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, Ychou M, Bouché O, Landi B, Louvet C, André T, Bibeau F, Diebold MD, Rougier P, Ducreux M, Tomasic G, Emile JF, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 2008;26:374-9. 17. C. Bokemeyer et al., K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4000) 18. E. Van Cutsem et al., K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 2) 19. S. Tejpar et al., Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mCRC), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4001). 20. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, 2008. "KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care". Christos Karapetis et al. 21. Rafael G. Amado, Michael Wolf, Marc Peeters, Eric Van Cutsem, Salvatore Siena, Daniel J. Freeman, Todd Juan, Robert Sikorski, Sid Suggs, Robert Radinsky, Scott D. Patterson and David D, Chang. WildType KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1626-1634. Strana 37 ze 38 Pouze pro diagnostické užití TheraScreen: souprava k detekci mutací K-RAS Upozornění pro odběratele: Ani tento produkt, souprava pro detekci mutaci K-RAS TheraScreen®, ani žádná z jeho součástí nesmí být dále prodávána nebo jiným způsobem přenášena nebo upravována pro další prodej bez písemného schválení společnosti DxS Limited. TheraScreen® a Scorpions® jsou registrované obchodní známky společnosti DxS Limited. ARMS® je registrovaná obchodní známka společnosti AstraZeneca UK Limited. LIGHTCYCLER a ROCHE jsou obchodní známky společnosti Roche. ABI7500 je obchodní známka společnosti Applied BioSystems. Tento produkt je diagnostický prostředek se značkou CE v souladu se směrnicí Evropské unie „O diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro č. 98/79/ES“. Nákup tohoto produktu je spojen s omezenou, nepřenosnou licencí k používání technologií ARMS® a Scorpions®, pouze pro diagnostické použití in vitro. Systém ARMS® je chráněn US patentem 5,595,890 a EP 332435; Scorpions® US patentem 6,326,145 a EP1088102. Informace v tomto dokumentu se mohou měnit. DxS Limited nepřebírá odpovědnost za jakékoliv chyby, které se mohou vyskytnout v tomto dokumentu. V žádném případě není společnost DxS Limited jakýmkoliv způsobem (ať již smluvně, vzniklou újmou z nedbalosti) nebo jakkoli jinak) odpovědná za nároky vzniklé ve spojení s používáním nebo z používání tohoto produktu. Nic v tomto dokumentu nevylučuje ani neomezuje odpovědnost, jejíž vyloučení nebo omezení společností DxS Limited by bylo protiprávní. © Copyright 2009. DxS Limited. Všechna práva vyhrazena. DxS Limited, 48 Grafton Street, Manchester, M13 9XX UK www.dxsdiagnostics.com Strana 38 ze 38
