Cvičení z rostlinolékařské bakteriologie

Ústav molekulární biologie rostlin BC AV ČR
České Budějovice
Oddělení rostlinné virologie
CVIČENÍ
Z ROSTLINOLÉKAŘSKÉ BAKTERIOLOGIE
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
1
Téma: PŘÍPRAVA ŢIVNÉHO MÉDIA PRO BAKTERIE, AUTOKLÁVOVÁNÍ, ODBĚR
PLETIV K IZOLACI BAKTERIÁLNÍCH KULTUR, OČKOVÁNÍ BAKTÉRIÍ DO
TEKUTÉHO MÉDIA.
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Příprava a autoklávování materiálu (zkumavky, zátky, pinzety, skalpely atd.).
Příprava ţivného média – masopeptonového agaru s glukosou (MPAg) pro baktérie.
Masopeptonový agar s glukosou (MPAg) - mnoţství pro 250 ml půdy
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Živný agar č. 2
Kvasničný autolyzát (bacto yeast extract)
Glukosa (nebo sacharosa)
- 10,0 g
- 1,3 g
- 2,5 g
Upravit pH pomocí 1 N NaOH na hodnotu 7,2
agar
- 5,0 g (1 - 2%)
Autoklávovat 20 min. při 121 0C.
Nejvhodnějším místem pro odběr pletiv k izolaci baktérií je rozhraní mezi nekrotickým a
živým pletivem (v těchto místech nekrogenní fytopatogenní baktérie nejlépe přežívají). Na
v plameni vyžíhaném hodinovém sklíčku ve sterilní destilované vodě pomocí dvou skalpelů
rozmacerujeme (rozdrtíme) rostlinné pletivo (list, kůra, květ atd.) předtím omyté ve vodě a
lihu a poté tuto suspenzi vysejeme na bakteriální živnou půdu (MPAg) v Petriho misce.
Inkubujeme v termostatu při 21 – 24 0C po dobu 24 – 48 hod.
Výroba zátek.
Zásady a pravidla při práci ve flow boxu.
Očkování bakteriálních kultur do tekutého živného média (C-medium), kultivace na
třepačce při pokojové teplotě (cca 24 hodiny) pro následné zamražení v eppendorfkách v - 60
0
C s přídavkem glycerolu (15% objemových - např. 850 ul media s bakt. kulturou + 150 ul
autoklávovaného - sterilního glycerolu).
Nalévání Petriho misek, rovných a šikmých agarů ve zkumavkách.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
2
Téma: OČKOVÁNÍ BAKTÉRIÍ, ZPŮSOBY UCHOVÁVÁNÍ BAKTÉRIÍ, LYOFILIZACE,
LYOFILIZAČNÍ PŘÍSTROJ.
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Příprava tekutého C-média pro lyofilizaci.
C - médium (Dreier et al., 1995) pro koryneformní baktérie - množství pro 250 ml půdy
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Trypton (pepton, bactopepton)
Kvasničný autolyzát
NaCl
glukosa
agar
- 2,50 g
- 1,25 g
- 1,25 g
- 1,25 g
- 5,00 g (1 - 2%) - nepřidáváme
Upravit pH pomocí 1 N NaOH na hodnotu 7.2, autoklávovat 20 min. při 121 0C.
Příprava ampulek pro lyofilizaci (autoklávování, výroba popisek).
Rozpipetování narostlé bakteriální kultury v tekutém médiu (cca 850 ul) z minulého cvičení
do eppendorfek, přidání 15% objemových sterilního glycerolu (cca 150 ul) a zamražení v - 60
0
C v mrazicím boxu.
Zásady a pravidla při očkování bakteriálních kultur na živná média ve flow boxu.
Očkování bakteriálních kultur na Petriho misky (plošný roztěr, křížový roztěr, hady), na
šikmé a rovné agary ve zkumavkách.
Způsoby uchovávání bakteriálních kultur (Petriho misky, šikmé a rovné agary ve
zkumavkách, zamražení v - 60 0C v tekutém médiu s 15% glycerolu, kryozkumavky s
korálky, lyofilizace).
Příprava bakteriální kultury pro lyofilizaci - naočkování Petriho misek – plošný roztěr.
Lyofilizace je vymrazování, pochod při němž se materiál zmrazí a ve vakuu se z něj odpařuje
voda. Používá se k sušení kávy, mléka, masa nebo zeleniny, ale i k uchování biologických
materiálů (tkání).
Příprava lyofilizačního přístroje, vysvětlení funkce, obsluha přístroje.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
3
Téma: LYOFILIZACE BAKTERIÁLNÍCH KULTUR, PŘÍPRAVA TZV. VKLÁDACÍHO
PUFRU PRO NANÁŠENÍ VZORKŮ NA AGAROSOVÝ GEL PŘI
ELEKTROFORESE, DOPLNĚNÍ GLYCEROLU NA ROVNÉ AGARY VE
ZKUMAVKÁCH
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Příprava lyofilizačního přístroje. Viz podrobný návod u lyofilizátoru.
Příprava bakteriální kultury k lyofilizaci – smytí baktérií tekutým C-médiem z misek se
živným médiem do lyofilizačních ampulí, zamražení v -60 0C po dobu 1 hod.
Vlastní lyofilizace bakteriálních vzorků. Lyofilizace bakterií probíhá přibližně po dobu 24
hodin.
Příprava tzv. Loading Buffer (vkládacího pufru) pro elektroforesu.
Na 10 ml vkládacího pufru smíchat 3 ml glycerolu, 200 l 0,5% Bromphenol Blue, 200 l
0,5% Xylen Cyanol a doplnit pufrem 1 x TE (lze zakoupit již hotový 100 x TE Buffer, pH
8.0, a následně vhodným naředěním získáme pufr o požadované koncentraci) do objemu 10
ml. Do 0,5 ml této směsi přidat 0,5 l barviva Sybr Green (Sigma Aldrich), kterým se
zviditelňuje DNA. Takto připravený vkládací pufr lze uchovávat v lednici v dobrém stavu
přibližně jeden týden. Po této době je potřeba připravit pufr nový.
Doplnění sterilního glycerolu na rovné agary ve zkumavkách po nárůstu bakteriální kultury.
Glycerol se doplní do vrstvy o výšce cca 15 - 20 mm, hrdlo zkumavky i uzávěr se ožehnou
před uzavřením v plameni nad kahanem.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
4
Téma: LYOFILIZACE BAKTÉRIÍ – POKRAČOVÁNÍ,
KONTROLA RŮSTU BAKTÉRIÍ
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Zatavování lyofilizačních ampulí nad sklářským kahanem.
Kontrola – otevření zatavené lyofilizační ampule, přidání 1 ml fyziologického roztoku
(0.85% NaCl), výsev na MPAg misky, po 2 - 4 dnech kontrola nárůstu bakteriálních kultur na
miskách.
Kontrola nárůstu bakteriálních kultur naočkovaných na MPAg misky ze zamrazeného
ţivného média s přídavkem glycerolu.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
5
Téma: RŮZNÉ ZPŮSOBY POUŢITÍ BAKTERIÁLNÍ KULTURY (CELÉ BUŇKY,
BAKTERIÁLNÍ LYZÁT, DNA), IZOLACE GENOMOVÉ DNA Z BAKTERIÁLNÍ
KULTURY
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Pro další práci lze použít bakteriální kulturu ve 3 různých variantách:
1) Bakteriální kulturu bez jakýchkoliv úprav odebranou z misky sterilním párátkem nebo
kličkou přidat přímo do namíchané PCR reakce.
2) Bakteriální kulturu lyzovat pomocí NaOH, získaný bakteriální lyzát použít v PCR.
3) Použít vyizolovanou genomovou (bakteriální) DNA
V současné době existuje více možností pro izolaci genomové (bakteriální) DNA z bakteriální
kultury. Izolaci můžeme provést pomocí kitů - např. Wizard SV Genomic DNA Purification
System, InstaGene Matrix aj.
Pro izolaci bakteriální DNA z čerstvého nebo sušeného rostlinného materiálu existuje
rovněž několik kitů - např. DNeasy Plant Mini Kit, Nucleo Spin Plant II aj.
Po izolaci bakteriální DNA je vhodné zkontrolovat výsledný stav (množství získané DNA) na
elektroforetickém gelu s následnou dokumentací - vyfocením.
Izolace genomové (bakteriální) DNA z bakteriální kultury za pouţití InstaGene Matrix
1) Odebrat z misky párátkem bakteriální kulturu, resuspendovat
párátkem v eppendorfce v 1 ml sterilní destilované vody.
2) Centrifugovat cca 1 min. při 15.000 g.
3) Vylít vodu.
4) K sedimentu přidat 200 ul InstaGene Matrix, resuspendovat na
vortexu.
5) Eppendorfky umístit na heat blok při 56 °C na dobu 15 - 30 min.
6) Vortexovat silně 10 sec.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
6
7) Eppendorfky dát na 8 min. do vodní lázně nebo na heat blok při teplotě 100 °C.
8) Vortexovat silně 10 sec.
9) Centrifugovat cca 3 min. při 15.000 g.
10) Použít 20 ul vzniklého supernatantu pro 50 ul PCR reakci (tj. cca 6 ul supernatantu pro
15 ul PCR reakci).
11) Před novým použitím supernatantu zopakovat kroky 8) a 9).
12) Supernatant nutno zamrazit a skladovat v -20 °C.
Nebo lze pouţít postup
Izolace bakteriální (genomové) DNA z bakteriální kultury pomocí kitu Wizard SV
Genomic DNA Purification System (s centrifugou)
1) Odebrat párátkem minimální množství bakteriální pasty, přenést do 500 µl 1x TE
(v případě potřeby přidat 100 µl roztoku lysozymu – zásobní roztok pro 10 vzorků připravit
smísením 0,03 g lysozymu + 1000 ul sterilní destilované vody - vţdy připravovat čerstvý).
2) Inkubovat při 20°C po dobu 10 min.
3) Centrifugovat 2 min. při 15000 RPM, supernatant odebrat (vylít, odpipetovat).
4) Přidat 150 µl Lysis Buffer, dát na 5 min. na heat blok při 55°C.
5) Suspenzi zvortexovat a přenést do kolonek.
6) Nasadit kolonky na 2 ml eppendorfky dodávané s kitem a centrifugovat 30 sec. při 15000
RPM, vylít, co proteklo.
7) Napipetovat 800 µl Wash Solution, centrifugovat, vylít, co proteklo (zopakovat 4x).
8) Po posledním promytí centrifugovat 2 min. při 15000 RPM, vylít, co proteklo.
9) Nasadit kolonku na novou 1,5 ml eppendorfku, napipetovat 250 µl Nuclease Free Water,
počkat 2 min. a centrifugovat 2 min. při 15000 RPM.
10) Proteklý eluát s DNA zamrazit a skladovat v -20 °C.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
7
Téma: IZOLACE BAKTERIÁLNÍ DNA Z ROSTLINNÉHO PLETIVA POMOCÍ KITU
DNEASY PLANT MINI KIT
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
1) Přidat 400 ul pufru AP1 a 4 ul RNase A (koncentrace 100 mg/ml) k maximálně 100 mg
rozdrceného vlhkého (100 ul macerátu) nebo ke 20 mg vysušeného rostlinného pletiva a
silně vortexovat.
Nemíchat pufr AP1 a RNase A před pouţitím.
2) Inkubovat vzniklou směs 10 min. při 65 0C. Během inkubace 2 - 3x obrátit zkumavku
dnem vzhůru.
Během tohoto kroku se lyzují buňky.
3) Přidat 130 ul pufru AP2 k lyzátu, zamíchat a inkubovat 5 min. na ledu.
V tomto kroku se sráţí proteiny a polysacharidy. Moţno centrifugovat lyzát 5 min. při
20.000 g (cca 14.000 RPM) - dobrovolně.
4) Přemístit lyzát do QIA shredder Mini Spin Column (kolonek) umístěných ve 2 ml
sběracích eppendorfkách a centrifugovat 2 min. při 20.000 g (14.000 RPM).
5) Přemístit proteklou frakci z kroku 4) do nové eppendorfky (není dodávána) bez porušení
rozbitého buněčného sedimentu.
6) Do pufru AP3/E přidat před použitím etanol. Přidat 1,5 objemu (V) pufru AP3/E, lyzát
se vyjasní a vzniklou směs ihned promíchat pipetováním.
7) Dát 650 ul vzniklé směsi včetně precipitátu (který se může utvořit) z kroku 6) do DNeasy
Mini Spin Column - kolonek - umístěných ve 2 ml sběracích eppendorfkách (dodávány).
Centrifugovat 1 min. při minim. 6.000 g (8.000 RPM pro většinu mikrocentrifug) a odstranit
- vylít - co proteklo. Ponechat si sběrné eppendorfky.
8) Opakovat krok 7) se zbylým vzorkem. Vylít opět vodnou fázi - to co proteklo - a vyhodit
sběrné eppendorfky.
9) Do pufru AW nutno přidat etanol. Umístit DNeasy Mini Spin Column (kolonky) do
nových 2 ml sběrných eppendorfek (dodávány), přidat 500 ul pufru AW do kolonek a
centrifugovat 1 min. při minim. 6.000 g (minim. 8.000 RPM). Vyhodit proteklou vodnou
fázi a opět pouţít sběrací eppendorfky v kroku 10).
10) Přidat 500 ul pufru AW do kolonky a centrifugovat 2 min. při 20.000 g (cca 14.000
RPM) až do vysušení membrány v kolonce.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
8
11) Přendat kolonku do 1,5 nebo 2,0 ml eppendorfky (nedodávány) a napipetovat 100 ul
pufru AE přímo na membránu v kolonce. Inkubovat 5 min. při pokojové teplotě (15 až 25
0
C) a potom centrifugovat 1 min. při minim. 6.000 g (cca 8.000 RPM) až do vyprázdnění
kolonky.
12) Opakovat krok 11). Do 1,5 ml eppendorfky by nemělo vytéci více neţ 200 ul, jinak by
kolonka přišla do kontaktu s eluátem.
13) Získaný eluát naředit 100 x, 1 ul 100 x naředěného eluátu dát do reakce PCR.
14) Eluát - vyizolovanou DNA nutno zamrazit a skladovat v -20 °C.
Nebo lze pouţít postup
Izolace bakteriální DNA z rostlinného pletiva pomocí kitu Nucleo Spin Plant II
Před začátkem izolace nahřát eluční pufr PE ve vodní lázni nebo inkubátoru na 65 °C,
před samotnou elucí ustálit na teplotě 70 °C.
1) Přidat 400 ul pufru PL1 k maximálně 100 mg rozdrceného vlhkého (100 ul macerátu)
nebo ke 20 mg vysušeného rostlinného pletiva a důkladně vortexovat.
Lyzují se buňky.
2) Přidat 10 ul RNase A roztoku a vzorek důkladně zamíchat.
3) Inkubovat vzniklou směs 10 min. při 65 0C.
Pro některý rostlinný materiál je výhodné zvýšit dobu inkubace na 30 - 60 min.
4) Přemístit NucleoSpin Filter (fialové kroužky) do nové 2 ml sběrací eppendorfky
(Collection Tube) a vylít lyzát do kolonky. Centrifugovat 2 min. při 11.000 g (14.000 RPM),
uchovat, co proteklo a vyhodit NucleoSpin Filter.
Pokud přes filtr neproteklo vše, opakovat tento krok.
5) Je-li v eluátu viditelný sediment, přenést čistý supernatant (vodnou fázi) do nové 1,5 ml
eppendorfky (není dodávána).
6) Přidat 450 ul PC pufru a důkladně zamíchat pomocí nasátí pipetou (5x) nebo
vortexováním.
7) Umístit NucleoSpin Plant II column (zelený kroužek) do nové 2 ml sběrací
eppendorfky a nalít maximálně 700 ul vzorku. Centrifugovat 1 min. při 11.000 g (14.000
RPM), vyhodit, co proteklo.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
9
8) Přidat 400 ul PW1 pufru do NucleoSpin Plant II column. Centrifugovat 1 min. při
11.000 g (14.000 RPM), vyhodit, co proteklo.
9) Ujistit se, zda byl přidán etanol do koncentrátu pufru PW2. Přidat 700 ul pufru PW2
do NucleoSpin Plant II column. Centrifugovat 1 min. při 11.000 g (14.000 RPM), vyhodit,
co proteklo.
10) Přidat dalších 200 ul pufru PW2 do NucleoSpin Plant II column. Centrifugovat 2 min.
při 11.000 g (14.000 RPM), vyhodit, co proteklo a vysušit kompletně silikonovou
membránu.
11) Umístit NucleoSpin Plant II column do nové 1,5 ml eppendorfky (nedodávána). Na
membránu napipetovat 50 ul pufru PE (ohřátý na 70 °C). Inkubovat NucleoSpin Plant II
column 5 min. při teplotě 70 °C. Centrifugovat 1 min. při 11.000 g (14.000 RPM). Pufr
s DNA uchovat.
12) Opakovat krok 11) s dalšími 50 ul pufru PE (70 °C) a slít do eppendorfky
z předchozího kroku s 50 ul pufru PE s DNA. Máme tedy celkem 100 ul vyizolované
DNA.
13) Eluát - vyizolovanou DNA nutno zamrazit a skladovat v -20 °C.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
10
Téma: PŘÍPRAVA AGAROSOVÉHO GELU PRO ELEKTROFORESU, HORIZONTÁLNÍ
VERTIKÁLNÍ ELEKTROFORESA (ELFO), VYSVĚTLENÍ PRINCIPU ELFO,
ZAPOJENÍ ELFO, PŘÍPRAVA PUFRU PRO ELFO.
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Příprava vzorků a agarosového gelu pro elektroforesu.
Jeden l směsi vkládacího pufru (příprava viz cvičení č. 3) se Sybr Green smícháme s
příslušným množstvím vyizolované genomové DNA (dle použitého izolačního kitu) a
nanášíme na zpravidla 1 % agarosový gel umístěný v horizontální elektroforese. Pro
přípravu agarosového gelu používáme agarosu SeaKem LE Agarose. Velikost hřebenů a
agarosového gelu volíme dle počtu analyzovaných vzorků. Příslušné množství agarosy
s vhodným pufrem (např. TBE, TE aj.) rozvaříme v mikrovlnné troubě. Orientace běhu
vzorků na gelu je od minus pólu k plus pólu. Pufr pouţívaný v elektroforese jako
elektrolyt (např. 1x TE) musí být shodný s pufrem pouţitým pro přípravu agarosového
gelu.
Jako marker pro zjištění velikosti amplifikátů používáme v tomto případě tzv. stovkový
velikostní standard (marker) - 100 bp DNA Ladder, který nanášíme v množství 1,0 - 1,5 l
ve směsi s 1 l vkládacího pufru se Sybr Green.
Pro každou elfo (dle velikosti gelu, množství elektrolytu) používáme již odzkoušenou velikost
napětí a proudu, kterou nastavíme na napájecím zdroji. Rovněž je nutné dodržet dobu běhu
(čas) vzorků, aby nedošlo k vyputování analyzovaných vzorků z gelu.
Vysvětlení činnosti a ovládání dokumentačního přístroje, kontrola gelu s vyizolovanou
bakteriální DNA po ukončení běhu na elfo na dokumentačním UV přístroji, zhotovení
dokumentačních fotografií získaných výsledků.
Objednávání primerů (oligonukleotidů) pomocí internetu.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
11
Téma: PŘÍPRAVA BAKTERIÁLNÍHO LYZÁTU, PCR S POUŢITÍM CELÝCH
BAKTERIÁLNÍCH BUNĚK, BAKTERIÁLNÍHO LYZÁTU A VYIZOLOVANOU
GENOMOVOU DNA, POROVNÁNÍ DOSAŢENÝCH VÝSLEDKŮ
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Bakteriální lyzát se připraví následujícím způsobem:
 Připravit čerstvý 50 mM NaOH
 Sterilní kličkou o objemu 1 l přenést 24 hodinovou bakteriální kulturu
kultivovanou při cca 28 0C (platí pro gram negativní bakterie) do 1,5 ml
eppendorfky se 100 l čerstvě připraveného 50 mM NaOH a řádně
vortexovat
 Směs na heat bloku zahřívat 5-10 min. (gram negativní bakterie) při 100 0C,
pak rychle zchladit na ledu
 K tomuto alkalickému lyzátu přidat 900 l sterilní destilované vody a
vortexovat
 Bakteriální lyzát uchovávat na ledu
 Přidat 1 l lyzátu do namíchané PCR reakce
Při kaţdé nové přípravě bakteriálního lyzátu je nutné připravit nový 50 mM NaOH.
PCR (polymerázová řetězová rekace, Polymerase Chain Reaction)
Princip polymerázové řetězové reakce (PCR)
PCR je metoda, která umožňuje amplifikaci specifických DNA sekvencí in vitro bez
klonování. Součástí reakce jsou 1) oligonukleotidové primery, které se po denaturaci DNA
specificky připojí ke komplementární sekvenci ohraničující amplifikovanou oblast a
2) termostabilní polymeráza, která v přítomnosti volných dNTP katalyzuje syntézu podle
templátového řetězce.
Primery jsou orientovány tak, že každý na opačném vlákně je prodlužován směrem
k druhému. Opakování cyklu: 1. denaturace templátu, 2. připojení primerů, 3. syntéza
nových řetězců DNA vede k exponenciální amplifikaci oblasti mezi primery.
PCR je dosud nejcitlivější detekční metoda, vzhledem k tomu, že lze teoreticky z jediné
molekuly DNA namnožit řádově nanogramová množství čisté DNA během několika hodin.
Primery jsou syntetické oligonukleotidy a jejich připojení ve druhém kroku PCR cyklu závisí
na komplementaritě vazeb v oblasti primer – templát. Hybridizační teplotu pro
přisedání primeru k templátovému jednořetězci DNA je možné přibližně určit podle vzorce:
Tan = 4(G + C) + 2(A + T) - 5
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
12
Čím vyšší je teplota annealingu, tím je PCR reakce zpravidla specifičtější.
Polymeráza. Automatizaci PCR umožnilo použití termostabilního enzymu izolovaného
z extrémně termofilních baktérií. Nejčastěji je používána Taq DNA polymeráza získaná
z bakterie Thermus aquaticus. Optimální polymerázovou aktivitu má při 72 oC, poločas
inaktivace při 95 oC je cca 60 min.
Reakční směs PCR. PCR reakci zcela postačuje provádět v celkem 15 l reakční směsi.
Místo jednotlivých komponentů (polymeráza, nukleotidy, pufr, MgCl2 aj.) je vhodné
používat tzv. PPP Master Mix, kde jsou výše zmiňované komponenty vyváženě
zastoupeny.
Používané primery skladujeme obvykle jako zásobní roztok v koncentraci 200 pmol/l
v mrazícím boxu při teplotě - 20 0C, před použitím je pak ředíme 10x, tj. na koncentraci 20
pmol/l . Tyto zbylé naředěné primery skladujeme co nejkratší dobu opět v mrazícím boxu.
Používané balení PPP Master Mix skladujeme v lednici, ostatní balení v zásobě pak
v mrazícím boxu také při teplotě - 20 0C.
Příprava amplifikační směsi s primery pEa1 a pEa2 s pouţitím PPP Master Mix
PPP Master Mix
Primer pEa1 (20 pmol/ul)
Primer pEa2 (20 pmol/ul)
Bakteriální DNA
Sterilní destilovaná voda
Celkem
7,5 ul
0,5 ul
0,5 ul
1,0 ul
5,5 ul
15,0 ul
Příklad PCR programu pro primery pEa1, pEa2







Úvodní denaturace: 5 min. - 95 0C (1)
Denaturace: 1 min. - 94 0C (2)
Doba a teplota annealingu: 40 sec. - 58 0C (3)
Syntéza DNA: 1 min. - 72 0C (4)
Krok (2) až (4) opakovat 35x (5)
Syntéza řetězce: 15 min. - 72 0C (6)
Chlazení při 4 0C (7)
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
13
Nested a seminested PCR (hnízdové)
Pouţití více neţ 2 ks primerů. Modifikace PCR, která značně zvyšuje citlivost reakce a
může eliminovat její nespecifické produkty. První dvojice primerů ohraničuje větší oblast
DNA, která je amplifikována jako první za standardních podmínek. Následně je přidán primer
nebo primery hybridizující „uvnitř“ té části DNA, která byla amplifikována první dvojicí
primerů.
Varianta seminested PCR - do druhé amplifikace je přidán jen jeden vnitřní primer (často
používáno pro metodu „gene walking“, když je známa sekvence templátové DNA pouze
k jednomu z primerů).
Zásady při navrhování primerů, ukázka navrhování primerů na PC.
Primery by měly:
1) Obsahovat alespoň 50% zastoupení G a C vzhledem k větší „pevnosti“ vazby páru
G – C než A – T.
2) Mít na 3´ - konci poslední 2 nukleotidy G nebo C.
3) Být bez sekundárních struktur (palindromy) a netvořit navzájem dimery.
4) Mít délku alespoň 15 nukleotidů.
5) Rozdíl Tan obou primerů by měl být nejvýše 5 oC, při větších rozdílech
v hybridizačních teplotách primerů je vhodné použít v cyklu dvě různé Tan.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
14
Téma: REP-PCR (REPETITIVE SEQUENCE BASED PCR)
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Konzervované repetitivní elementy (ERIC, BOX, REP). Jsou to vysoce konzervativní
repetitivní sekvence vyskytující se v mnoha kopiích v genomech většiny gram-negativních
a několika gram-pozitivních bakterií. Tyto sekvence byly rozděleny do třech skupin. Jsou
to 35-40 bp dlouhé repetitivní extragenické palindromické (REP) sekvence, 124-127 bp
velký enterobakteriální repetitivní intergenový consensus (ERIC) a 154 bp velké BOX
elementy. Od těchto úseků odvozené primery jsou používány při metodách tzv. genomického
fingerprintingu založených na PCR (rep-PCR). Pomocí nich lze odlišit prokaryotní
organismy aţ na úroveň bakteriálních kmenů.
Metoda rep-PCR je založena na amplifikaci úseků mezi konzervativními repetitivními
oblastmi pomocí dvou různých dvojic primerů (REP, ERIC) a jednoho samostatného
primeru (BOX), které byly na jejich základě odvozeny. Výsledkem reakce je pro danou
bakterii specifické spektrum PCR produktů tvořené současně rozdílnou velikostí
jednotlivých amplifikačních produktů i jejich celkovým počtem. Po elektroforetickém
rozdělení těchto fragmentů získáme vysoce specifické tzv. DNA otisky. Tyto otisky se dále
za účelem přesné identifikace organismu porovnávají s databází a na základě
vzájemných podobností jsou vyhodnoceny. Otisky se ale mohou také porovnávat přímo
mezi sebou. To se provádí zejména v případech, kdy je potřeba zjistit genetickou příbuznost
v určité skupině izolátů nebo u vyšších taxonomických stupňů.
Příprava amplifikační směsi pro rep-PCR s primerem BOXA1R
PPP Master Mix
Primer BOXA1R (20 pmol/ul)
Bakteriální DNA (bakteriální kultura)
Sterilní destilovaná voda
Celkem
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
7,5 ul
2,0 ul
1,5 ul
4,0 ul
15,0 ul
15
Příprava amplifikační směsi pro rep-PCR s primery ERIC 1R, ERIC 2 a primery REP
1, REP 2
PPP Master Mix
Primer ERIC 1R resp. REP 1(20 pmol/ul)
Primer ERIC 2 resp. REP 2 (20 pmol/ul)
Bakteriální DNA (bakteriální kultura)
Sterilní destilovaná voda
Celkem
7,5 ul
2,0 ul
2,0 ul
2,0 ul
1,5 ul
15,0 ul
Příklad PCR programu pro rep PCR s primery BOXA1R a ERIC 1R, ERIC 2







Úvodní denaturace: 5 min. - 95 0C (1)
Denaturace: 1 min. - 94 0C (2)
Doba a teplota annealingu: 1 min. - 50 0C (3)
Syntéza DNA: 2,5 min. - 72 0C (4)
Krok (2) až (4) opakovat 35x (5)
Syntéza řetězce: 15 min. - 72 0C (6)
Chlazení při 4 0C (7)
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
16
Téma: VYSVĚTLENÍ PRINCIPU DOT BLOT A S - BLOT HYBRIDIZACE, POUŢITÝ
MATERIÁL A PŘÍSTROJE, DEMONSTRACE S - BLOT HYBRIDIZACE
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Podstatou dot blot hybridizace je hybridizace (párování) komplementárních
jednovláknových úseků DNA. K detekci komplementárních úseků DNA testovaného
(cílového) organismu se používá tzv. molekulární sonda (probe). Sondou je různě dlouhá
molekula značené dsDNA, ssDNA nebo RNA o známé sekvenci. Je to definovaný, čili známý
oligonukleotid nebo polynukleotid připravený z DNA známého definovaného kmene
bakterie.
Sonda hybridizuje pouze s denaturovanými řetězci nukleové kyseliny, které jsou
komplementární. Hybridizace je omezena jen na ty oblasti, kde DNA sondy a DNA
testovaného vzorku sdílejí homologní pořadí nukleotidů.
Hybridizaci sond DNA s fragmenty testované DNA lze detekovat autoradiograficky na
rentgenovém filmu v případě použití radioaktivníhch sond, nebo pomocí kolorimetrických
nebo chemiluminiscenčních systémů při použití neradioaktivně značených sond
(digoxigenin, biotin).
Přenos podle Southerna - S blot hybridizace. Slouží k přenesení molekul DNA z gelu na
membránu, ke které je pak lze různými způsoby přichytit. Jde o velmi jednoduchý postup,
používající kapilárního vzlínání tzv. přenosového pufru. Membrána je přiložena na horní
plochu gelu, dolní plocha gelu je prostřednictvím houby nebo jiného savého materiálu spojena
se zásobníkem přenosového pufru. Horní plocha membrány je poté pokryta větším množstvím
buničité vaty nebo jiného savého materiálu. Pro lepší kontakt všech vrstev je soustava
přiměřeně zatížena závažím. Přenosový pufr vzlíná kapilární silou ve směru šipek na obrázku
nahoru přes houbu, gel a membránu do buničité vaty. Přitom vymývá z gelu molekuly DNA a
přenáší je na membránu. Ta je pro molekuly DNA nepropustná, takže tyto ulpí na dolní ploše
membrány, přiléhající ke gelu, v přesně stejných polohách, v jakých se nacházely v gelu po
roztřídění gelovou elektroforézou. Přenosový pufr obsahuje chemikálie, které narušují
stabilitu vodíkových můstků v molekule DNA, takže dochází k její denaturaci (tzv.
denaturační pufr). DNA je proto během přenosu denaturována (je jednovláknová) a
připravená k hybridizaci se sondou. Přenos podle Southerna (angl. Southern blot) byl nazván
podle výzkumníka, který ho vyvinul. Postup byl později upraven pro přenos molekul RNA a
jako slovní hříčka nazván Northern blot. Analogický postup pro přenos bílkovin z gelu byl
nazván Western blot.
Pro S -blot lze rovněž použít vertikální elektroforetický přístroj - vertikální elektroforesu
(používaná v laboratoři oddělení rostlinné virologie ÚMBR), kde přenos DNA z gelu na
membránu je zajištěn tokem elektrického proudu v elektrolytu od minus k plus polu.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
17
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
18
Téma: PŘÍPRAVA NERADIOAKTIVNĚ ZNAČENÉ SONDY (DIGOXIGENINEM) PRO
DOT BLOT (S - BLOT) HYBRIDIZACI
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
1) 18 ul vyizolované bakteriální DNA (popř. amplifikátu - příprava v předchozích cvičeních)
denaturovat 10 min. při 100 oC.
2) Ochladit na ledu s NaCl po dobu cca 10 min.
3) Do eppendorfky s DNA na ledu přidat:
4 ul hexanucleotide mixture
4 ul dNTP mixture, doplnit objem do 38 ul sterilní redestil. vodou (12 ul)
2 ul Klenow enzyme
4) Opatrně centrifugovat a inkubovat minim. 60 min. při 37 oC (delší inkubace do 20 hod.
může zvýšit výtěžek značené DNA).
5) Přidat 4 ul roztoku 0,2 M EDTA, pH 8,0 k zastavení reakce.
6) Precipitace (srážení) značené DNA s 5 ul 4 M LiCl a 150 ul předchlazeného 96% etanolu
(-20 oC), řádně promíchat.
7) Uložit na minim. 30 min. do -70 oC nebo na 2 hod. do -20 oC.
8) Centrifugace při 12.000 ot./min., 4 oC po dobu 30 min.
9) Peletu (sediment) promýt v 50 ul chladného 70% etanolu a následně (po vylití etanolu)
vysušit ve vakuu.
10) Promytou a vysušenou peletu rozpustit v 50 ul 1 x TE pufru.
11) Připravenou sondu skladovat 24 hod. v lednici, pak zamrazit v -20 oC.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
19
Téma: DOT
BLOT HYBRIDIZACE
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Postup při dot blot hybridizaci (viz samostatný podrobný návod)
A: Nakapání vzorků v blotovacím zařízení na nylonovou membránu
B: Odsátí vody z membrány pomocí vývěvy
C: Fixace vzorků na membráně teplem (v peci), popř. pomocí UV
D: Prehybridizace
E: Denaturace sondy
F: Vlastní hybridizace
G: Navázání antičástic (Anti – Digoxigenin – AP - Konjugát)
H: Vymytí nenavázaných antičástic (antičástice – konjugát)
I:
Inkubace membrány se vzorky v NBT/BCIP roztoku do vývoje barevné reakce
J:
Promytí membrány se vzorky ve stabilizačním pufru
K: Vyhodnocení barevné reakce na membráně se vzorky
L:
Uložení a skladování membrány
Dot blot hybridizace - podrobný návod
1) Nylonová membrána (cca 7 x 5 cm) napuštěná pufrem 2 x SSC se umístí do bloku na dot
blot hybridiazci. žlutá houbička se rovněž napustí pufrem 2 x SSC. Podle plánku se nakapou
vzorky DNA po 15 ul, pak se pomocí vodní vývěvy odsaje vlhkost (cca 30min).
2) Zorientovat nylonovou membránu (šipky) a dát na 30 min do pece – fixace vzorků na
membránu při teplotě 120 °C.
3) Prehybridizace ve 20 ml hybridizačního pufru (bez formamidu) 1 hod při 68 °C.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
20
4) Denaturace 15 цl sondy cca 5-10 min při 95 -100 °C, pak rychle zchladit ve směsi ledu s
NaCl po dobu cca 5-10 min. 15 цl sondy denaturované přidat do 7 ml hybridizačního pufru.
Hybridizovat přes noc (nejméně 6 hod) při 68 °C (bez formamidu).
5) Po hybridizaci filtr promývat 2 x 5 min při pokojové teplotě v minimálně 50 ml 2 x SSC
pufru (na 100 cm2 filtru) a 2 x 15 min při 68 °C v 0,1 x SSC pufru.
Krok 6) a 7) se provádí pouze při přerušení postupu – filtr nesmí oschnout
6) Filtr vysušit mezi dvěma filtračními papíry a dát do igelitového sáčku uzavřeného,
skladovat v lednici při cca 4 °C.
7) Při oživení filtru je membrána ponořená asi 10 min v 50 ml 0,1 x SSC pufru při pokojové
teplotě.
8) Filtr pak promývat 1 min v pufru 1 + Tween 20 (promývací pufr) při pokojové teplotě na
třepačce.
9) Inkubace 30 min ve 100 ml pufru 2 na třepačce při pokojové teplotě.
10) Anti-Digoxigenin-AP-Konjugát (lahvička 3 v DIG Nucleic Acid Detection Kitu) rozředit
v poměru 1:5000 v pufru 2 (2 цl konjugátu přidat do 10 ml pufru 2). Tyto částice jsou stabilní
v roztoku jen asi 12 hod při 4 °C.
11) Filtr inkubovat 30 min v 10 ml tohoto roztoku (antičástice – konjugát) na třepačce při
pokojové teplotě.
12) Nenavázané částice (antičástice-konjugát) vymýt po dobu 2 x 15 min ve 100 ml pufru 1
při pokojové teplotě na třepačce.
13) Membránu stabilizovat promytím ve 20 ml pufru 3 po dobu 2 min při pokojové teplotě na
třepačce.
14) Připravit barvivo – musí být vždy čerstvé: smíchat 45 цl NBT roztoku (lahvička 4) a 35 цl
X fosfát roztoku (lahvička 5) s 10 ml pufru 3. Odměrný válec zabalit do alobalu – citlivé na
světlo.
15) Filtr inkubovat v 10 ml barevného roztoku v uzavřené mýdelnici, která je ještě uzavřena v
igelitovém sáčku v temnu, v klidu, bez třpání. Vývoj barev se ukončí během 1 dne
(postačující jsou i 2 hodiny).
16) Když je vývoj barev ukončen (doty - tečky jsou jasně rozeznatelné na membráně),
promývat membránu v 50 ml pufru 4 (ustalovací pufr) po dobu 5 min.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
21
17) Možnost scanování membrány v průhledných omyvatelných deskách na počítači. Pak
vysušit membránu při pokojové teplotě nebo při 80 °C. Pak je možné membránu uložit.
18) Při opětovném použití nylonové membrány - filtru s analyzovanými vzorky, je vhodné
filtr namočit do pufru 4, dojde tak ke zvýraznění barev.
Téma: SEKVENOVÁNÍ, VYSVĚTLENÍ PRINCIPU, UKÁZKA AUTOMATICKÉHO
SEKVENÁTORU ABI 3130
Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc., Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Amplifikace - PCR - genomové (bakteriální) DNA - viz cvičení č. 8.
Přečištění PCR produktu pro sekvenační PCR pomocí Gen Elute PCR Clean - Up Kit
popř. Gen Elute Minus EtBr Spin Columns.
Sekvenační PCR - sloţení sekvenační PCR reakce, program pro sekvenační PCR.
Přesráţení PCR produktu po sekvenační amplifikaci pomocí izopropanolu.
Vlastní sekvenování - metoda dle Sangera (1977), sekvenátor ABI 3130 s kapilárou 50
cm (součástí vybavení ÚMBR, laboratoře genomiky, použit ABI PRISM Big Dye Terminator
1.1 Cycle Sequencing Kit a sekvenační polymer POP 7).
Cvičení zajišťováno ve spolupráci s pracovníky laboratoře genomiky, ÚMBR BC AV ČR.
Elektronový a rastrovací mikroskop, vysvětlení činnosti, příprava vzorků, pozorování
částic v mikroskopu.
Cvičení zajišťováno ve spolupráci s pracovníky oddělení rostlinné virologie ÚMBR a
laboratoře elektronové mikroskopie PAÚ BC AV ČR.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
22