Diferenciální diagnostika stafilokoků součást cvičení 9, úlohy 13

Diferenciální diagnostika stafilokoků
součást cvičení 9, úlohy 13 – Základy identifikace bakterií
Stafilokoky jsou grampozitivní, nesporulující, nepohyblivé, neopouzdřené fakultativně
anaerobní koky. Většina zástupců tohoto rodu je nepatogenní a tvoří součást přirozené
mikroflóry kůže a sliznic člověka a zvířat, dále se vyskytují v půdě nebo v potravinách. Pro
člověka jsou klinicky nejvýznamější Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis a
Staphylococcus saprophyticus.
Druhová diagnostika stafylokoků se zakládá na zjišťování tvorby extracelulárně
produkovaných enzymů a detekci jejich biochemických vlastností, jako je schopnost štěpit
manitol, redukovat dusičnany a dekarboxylovat arginin. Dále je možné druhově odlišit
stafylokoky pomocí testu rezistence vůči antibiotiku novobiocinu difúzní agarovou metodou.
Materiál
Stafilokoková kultura č. 1, 2 a 3
Mueller-Hintonův agar (3 ks)
Bujón pro fermentaci cukrů s 1% manitolem (3 ks)
Zkumavky s bujónem obsahujícím dusičnan draselný (4 ks)
Roztok argininu
Roztok 1 (kyselina sulfanilová)
Roztok 2 (dimetyl-α-naftylamin)
Zinkový prach
Špachtle
Nesslerovo činidlo
Novobiocinové disky
Sterilní pinzeta
Sterilní vatová tyčinka (3 ks)
Automatické pipety
Sterilní špičky
Sterilní mikrozkumavky
Bakteriologická klička
Termoblok
Mikrozkumavky
Pracovní postup
1. Test rezistence na novobiocin
Na Mueller-Hintonův agar asepticky a velmi pečlivě rozetřete kulturu po celém povrchu.
Pracujte v laminárním boxu. Postupně naočkujte tímto způsobem všechny tři stafilokokové
kultury. Sterilní pinzetou poté vyjměte ze zásobní nádoby novobiocinový disk a jemně jej
přitlačte na povrch naočkovaného agaru. Inkubujte 24 hodin při 37°C.
2. Štěpení manitolu
Vyučující před začátkem cvičení přidá do zkumavek s bujónem asepticky roztok cukru
tak, aby koncová koncentrace manitolu byla 1%.
Pomocí kličky očkujte všechny stafilokokové bakteriální kultury do zkumavek s 1%
manitolem a inkubujte 24-48 hodin při 37°C.
3. Redukce dusičnanů na dusitany
Do 3 zkumavek s bujónem obsahujícím dusičnan draselný naočkujte 18-24 h staré
stafilokokové kultury. 4. zkumavka slouží jako kontrola. Následuje kultivace do příštího
cvičení při 37°C.
4. Dekarboxylace argininu
Do 3 mikrozkumavek napipetujte 0.3 ml roztoku argininu s acidobazickým indikátorem a
masivně naočkujte kličkou jednotlivé kultury. Následuje inkubace 2-3 hodiny při 37°C
v předehřátém termobloku.
Vyhodnocení výsledků
1. Test rezistence na novobiocin - po inkubaci změřte průměr inhibiční zóny a dle tabulky
zhodnoťte, zda je testovaný kmen rezistentní nebo citlivý k tomuto antibiotiku.
Inhibiční zóna
(mm)
Stafylokoky k novobiocinu
=< 16
> 16
Rezistentní
Citlivé
2. Štěpení manitolu – v pozitivním případě dojde ke změně červeného zbarvení na žluté.
3. Redukce dusičnanů na dusitany – po inkubaci přidejte do každé zkumavky 3-5 kapek
činidla 1 a 2, protřepejte a v pozitivním případě pozorujte vznik červenofialového zbarvení. Do
zkumavek s negativní reakcí přidejte nepatrné množství zinkového prachu, protřepejte a
pozorujte.
4. Dekarboxylace argininu - v pozitivním případě dojde ke změně žlutého zbarvení po
přídavku dvou kapek Nesslerova činidla.
Po vyhodnocení všech testů určete dle tabulky obsah stafilokokových kultur 1, 2 a 3.
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Manitol
+
+
KNO3
+
+
-
Arginin
+
+
+
Novobiocin
+
-