Analýza růstu a invazivity nádorových buněk in vitro

Analýza růstu a invazivity nádorových
buněk in vitro
Skriptum metodických materiálů
Autoři: Radek Fedr, Belma Skender, Iva Jelínková, Karel Souček
Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost Obsah
1.
NEINVAZIVNÍ ZPÙSOBY DETEKCE CYTOKINETIKY BUNÌÈNÝCH POPULACÍ ................... 3
1.1
ÚVOD............................................................................................................................................................ 3
1.2
PRINCIPY A OBLASTI UŽITÍ .......................................................................................................................... 3
1.2.1
Migrace, proliferace a invazivita bunìk ............................................................................................ 3
1.2.2
Kokultivace bunìk............................................................................................................................... 6
1.3
ZPÙSOBY DETEKCE ...................................................................................................................................... 7
1.3.1
Kokultivace ......................................................................................................................................... 7
1.3.2
Migrace bunìk..................................................................................................................................... 8
1.3.3
Invazivita bunìk ............................................................................................................................... 10
1.4
2.
FAKTORY MAJÍCÍ VLIV NA VÝSLEDEK MIGRAÈNÍ A INVAZNÍ ANALÝZY .................................................. 10
ANALÝZA PROLIFERACE, VIABILITY A BUNÌÈNÉ SMRTI ...................................................... 12
2.1
TYPY BUNÌÈNÉ SMRTI A ZPÙSOB JEJICH ROZPOZNÁNÍ ............................................................................. 12
2.2
ELISA METODA ......................................................................................................................................... 14
2.2.1
Obecný úvod ..................................................................................................................................... 14
2.2.2
Princip ELISA ................................................................................................................................... 15
CELL DEATH DETECTION ELISA PLUS KIT OD FIRMY ROCHE................................................. 16
3.
3.1
POPIS A CHARAKTERISTIKA KITU ............................................................................................................. 16
3.2
PRINCIP A POSTUP „CELL DEATH DETECTION ELISA PLUS KIT“............................................................. 17
3.3
VÝHODY KITU ........................................................................................................................................... 18
4.
ZPÙSOB HODNOCENÍ KONCENTRACE BUNÌK A JEJICH PRINCIP ...................................... 18
5.
CASY MODELTT – CELL COUNTER AND ANALYZER............................................................... 19
5.1
APLIKACE ................................................................................................................................................... 19
5.2
PRINCIP....................................................................................................................................................... 20
5.3
POSTUP ....................................................................................................................................................... 21
6.
REFERENCE....................................................................................................................................... 23
7.
PODÌKOVÁNÍ ................................................................................................................................... 24
2 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 1. NEINVAZIVNÍ ZPŮSOBY DETEKCE CYTOKINETIKY BUNĚČNÝCH POPULACÍ
1.1 Úvod
V různých oborech nejen buněčného výzkumu dochází k vývoji systémů pro sledování
cytokinetiky buněčných populací. Migračních schopnosti, invazivita, proliferace buněk a vzájemné
buněčné interakce hrají významnou roli již od počátku vývoje organismu v období embryogeneze, tyto
schopnosti buněk jsou důležité mimo jiné také při udržování homeostáze v organismu (hojení ran
apod.). Na druhou stranu se setkáváme i s negativními dopady takových procesů při patologických
stavech, kterými může být nádorové bujení a tvorba metastáz. Studium a možnosti ovlivňovat
cytokinetické procesy vedou k vývoji uživatelsky přívětivých systémů pro jejich detekci. Spojení
s dalšími oblastmi výzkumu můžeme nalézt například v odvětví vývoje nových léčiv, kde se využívá
právě sledování toxických účinků agens u buněčných populací a kde mají tyto systémy nezastupitelnou
roli.
1.2 Principy a oblasti užití
1.2.1 Migrace, proliferace a invazivita buněk
Migrace je schopnost přemístit buňku nebo populaci buněk. Hraje významnou roli během
embryogeneze, kdy v průběhu gastrulace buňky migrují ve vrstvách a vytváří tři zárodečné listy
endoderm, ektoderm a mezoderm. Tyto tři listy obsahují prekurzorové buněčné typy, které dále
migrují do cílových míst, kde dále diferencují a dávají vznik odlišným tkáním a orgánům. Speciálním
typem migrace při vývoji organismu, ale také během jeho pozdějšího růstu je prodlužování neuritů.
Vrcholek vyvíjejícího se neuritu - růstový vrcholek, sdílí mnoho společných vlastností s migrujícími
buňkami.
Schopnosti migrovat využívají také buňky imunitního systému při udržování homeostáze. Jako
příklad lze uvést proces hojení ran, při kterém migrují leukocyty z krevního oběhu do okolních tkání,
kde pohlcují bakterie.
Mnoho patologických stavů s sebou nese specifické chování buněk, u nádorového bujení je to
nekontrolované dělení a zvýšená schopnost proliferace. Utváření a růst nádorové masy je doprovázen
tvorbou nové cévní sítě uvnitř nádoru, které se neobejde bez migrace endoteliálních buněk z dříve
existujících cév do nádoru, kde tyto buňky proliferujía vytvářejí v procesu zvaném angiogeneze novou
soustavu cév. Migrační schopnosti vlastních buněk nádorové masy stojí v pozdějším období
po rozvinutí nemoci za vznikem metastáz v organismu.Principem tvorby metastáz je invaze
nádorových buněk z primárního nádoru (ložiska) do krevního oběhu, ze kterého se posléze dostanou
do nového místa v těle. Hranice bazální membrány nádoru jsou navíc porušené (obsahují trhliny)
3 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost a „invazivní“ buňky se tak mohou dostat do cévního a lymfatického systému snáze tak dochází
k metastazování.
Společným jevem v období dospělosti při normálních i patologických stavech je migrace
prekursorových buněk z bazální vrstvy do epidermis, tento proces funguje průběžně při obnově
pokožky a ve zvýšené míře při růstu melanomu.
Migrace je vícekrokový proces. Jedná se o buněčnou odpověď na externí signál, při které se buňky
polarizují a prodlužují ve směru pohybu. Buňky vytváří adhezní komplexy a těmi se vážou a stabilizují
k substrátu. Kontrakce poté pohne tělem buňky směrem dopředu a současně dochází k uvolnění
vazných míst buňky v zadní části.
Mnoho odlišných molekul slouží jako externí agens, která iniciují a podporují migraci. Některé
z těchto molekuly podněcují migrační fenotyp přímo (chemokinezi), jiné spočívají v rozpustném
gradientním stavu (chemotaxe) a některé zůstávají v gradientu v substrátu (haptotaxe), což vede
k přímému pohybu buňky. Tyto molekuly a jejich receptory jsou dobře prozkoumány u leukocytů. Bílé
krvinky jsou citlivé na přítomnost i pouze malého množství molekul v gradientu, jakmile je takový
signál buňkou zaznamenán, dochází k polarizaci a migraci buňky právě v tomto směru. Polarita je
pro jednotlivé typy buněk specifická, projevuje se i pokud se v původním směru snižuje již
zmiňovaných gradient, leukocyty se raději celé stáčí, než aby svůj tvar protáhly do novém směru do
jiné oblasti. Fibroblasty jsou v tomto směru více plastické a umí prodloužit své membránové výčnělky
z kteréhokoli místa buňky v momentě změny směru. Adhezní spoje, které podporují buněčný pohyb
jsou místa uchycení buňky k extracelulární matrix (ECM). Skládají se z mnoha proteinů, zahrnující
rodinu integrinových transmembránových receptorů, kináz, spojovacích a strukturálních molekul.
Integriny slouží jako funkční spojení mezi extracelulární matrix a aktinovým cytoskeletem. Malé
GTPázy, Rac, indukují tvorbu malých spojů (srůstů) s ECM na čelní straně pohybující se buňky. Tyto
spoje slouží jako trakční body a přenášejí silné hnací síly, které posouvají tělo buňky dopředu. Růst
a vývin těchto malých spojů do větších, více organizovaných struktur pak naopak migraci inhibuje.
Na pohybu vpřed se podílí také aktino-myosinová kontrakce. Uvolnění adhezních spojů v koncové
části buňky (bráno ve směru pohybu buňky) a stažení koncové části buňky jsou také ovlivněny
působením myosinu. Prostorová a časová regulace Rho GTPáz řídí tyto procesy pomocí efektorů, jako
jsou např. Rho kinázy, které také řídí aktino-myosinovou kontrakci. Právě tyto kinázy jsou spojovány
s uvolněním koncové části buňky pomocí regulace myosinu II. Mezi další molekuly podílející
se na rozvolnění vazeb buňky se substrátem patří proteáza calpain a fosfatáza calcineurin. Mikrotubuly
se také podílejí na rozvolňování spojů, pravděpodobně pomocí modulace Rac aktivity.
Stres způsobený otíráním povrchu luminální vrstvy endoteliální buňky je zaznamenán buněčnou
membránou a příslušnými receptory, a je přenesen pomocí mezibuněčných vazeb a vazeb buňky
4 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost s extracelulárním prostředím. Tento stres způsobuje přímou migraci endoteliálních buněk pomocí
lamellipodií a tvorby fokálních adhezí ve směru posunu buňky a rušením těchto vazeb na opačné
straně buňky. Trvalá endoteliální migrace může být hnána polarizovanou aktivací signálních molekul
a pozitivní zpětnou vazbou z tvořených mikrotubul, Rac a integrinů v přední části buňky. Současně
prodlužování mikrotubul v přední části aktivuje Rac, který řídí aktinovou polymerizaci a lamellipodia
a aktivuje intergriny pro tvorbu fokálních adhezí. Integriny aktivují Rac a tvoří tak přímou zpětnou
vazbu mezi Rac a integriny. Rac podporuje prodlužování mikrotubulů a přímou zpětnou vazbu mezi
Rac a mikrotubuly. Další membránové receptory (např. G proteiny) mohou způsobovat také aktivaci
Rac. V zadní části buňky dochází ke zkracování mikrotubul a membránové receptory
(např. G proteiny) mohou aktivovat Tho-p160ROCK cestu a způsobovat aktino-myosinovou
kontrakci, která způsobuje odpojení fokálních adhezí. Celý proces podporuje vlna Ca2+ iontů
vyplavených z kaveol v důsledku stresu způsobeného otěrem v zadní části buňky a podporuje funkci
p160ROCK při aktino-myosinových kontrakcích a aktivuje calpain, který lokálně také degraduje
fokální adheze.
Migraci lze rozdělit do několika typů:

Migrace jedné buňky: Vyžaduje symetrickou organizaci buněčné aktivity. Stabilizovaný směr
pohybu zajišťují externí podněty, které aktivují intracelulární signalizaci a ta řídí polarizaci
a buněčný pohyb. Malé GTPázy - Rac a CDC42, hrají důležitou roli při regulaci tohoto
procesu.

Migrace vrstvy buněk: K této migraci dochází, jak bylo popsáno výše, během embryogeneze.
Mnoho buněk nemigruje jednotlivě, ale jako vrstvy nebo jako buněčné shluky spojené slabými
vazbami. Škrábnutí nebo poničení buněk rostoucích ve vrstvě v in vitro podmínkách vyvolá
synchronizovaný pohyb celé vrstvy buněk. Stejně jako při migraci jedné buňky i migrace celé
vrstvy buněk má určitý směr a polarizuje se. Mezibuněčné vazby buněk v migrující vrstvě
s okolními buňkami poskytují další podněty buňkám vrstvy. Regulace tohoto pohybu probíhá
stejně jako u jedné buňky pomocí Rho GTPáz. Rac a CDC42 jsou v tomto procesu esenciální.
Zvláště některé z nádorových buněk sdílí tento způsob migrace. Primární melanomové
explanty migrují v kolagenových gelech jako více-buněčné shluky, které jsou polarizované
s jasně vymezenou vedoucí a koncovou hranou.
Způsoby migrace a buněčná morfologie se v 3D prostředí může významně odlišovat
od disociovaných buněk migrujících v rovinném (2D) substrátu. Za účelem simulace migrace in vivo
se používá kultivace buněk na 3D matrix. Dalším ze způsobů, který napodobuje tkáňové prostředí je
kultivace buněk mezi dvěmi vrstvami poddajného polyakrylamidového substrátu. U takové kultury lze
pozorovat zvýšené adhezivní a migrační schopnosti. Fokální adheze u buněk kultivovaných ve 2D
5 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost podmínkách mají oválný tvar, v kontrastu k tomu adheze buněk kultivovaných na 3D matrix jsou delší
a protáhlejší. V kultuře kultivované v plátech mají myogenní prekurzorové buňky dlouhé, značně
polarizované a stabilní výběžky, které nejsou obvyklé u migrujících buněk na plochém a pevném
substrátu.
1.2.2 Kokultivace buněk
Kokultivace různých buněčných typu slouží ke studiu mezibuněčných vazeb a interakcí. Vzájemné
buněčné ovlivňování reguluje růst a časný vývoj buňky, diferenciaci kmenové buňky, regeneraci tkání,
hojení ran, interakce buněk imunitního systému a proliferaci nádorových buněk. Technik kokultivace
se nejčastěji využívá ve výzkumu rakoviny např. při parakrinní stimulaci proliferace nádorových
buněk fibroblasty. Dalé v imunologii při výzkumu imunoregulace a interakcí buněk imunitního
systému. V oblasti výzkumu zánětlivých stavu je takto testován efekt buněk imunitního systému
na endoteliální buňky. Svoje uplatnění tato metoda nalézá i při studiu proliferace a diferenciace
kmenových buněk za přítomnosti stimulujících buněk. V oboru toxikologie lze takto sledovat toxicitu
agens u buněk a v mikrobiologii je zkoumáno působení bakteriální a virální patologie na endoteliální
buňky. Sledování interakce mezi buňkami imunitního systému a endoteliálními buňkami se využívá
ve výzkumu transplantací tkání. V neurologii lze tuto metodu využít pro určování cytotoxicity
a sledování diferenciace buněk. V neposlední řadě lze sledovat i bariérových funkcíve výzkumu
hematoencefalické bariéry.
Technika společné kultivace smíchaných buněčných typů in vitro, umožňuje použít a sledovat
synergické působení nebo antagonistické vlivy buněk. Kokultivaci lze použít u různých buněčných
typů, tkání nebo orgánů vzniklých v přirozeném (wild-type), transgenním nebo mutagenním prostředí
za fyziologických i patologických podmínek.
Mezibuněčné interakce lze rozdělit a pozorovat:

Přímé mezibuněčné interakce, kdy probíhá kultivace dvou různých buněk v jedné jamce

Nepřímé mezibuněčné interakce, kdy probíhá kultivace dvou různých buněk v jedné jamce
oddělených membránou
Výhodou druhé zmiňované metody je přístup k oběma typům buněk nezávisle. Lze snadno
vyměnit efektorové buňky za jiné a testovat jinou variantu a buňky našeho zájmu je možné lehce
izolovat, jelikož neexistuje přímá mezibuněčná vazba mezi buňkami. Navíc lze takto jednoduše
identifikovat molekuly způsobující sledovanou buněčnou odpověď [1].
6 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 1.3 Způsoby detekce
1.3.1 Kokultivace
Pro sledování nepřímých mezibuněčných interakcí lze použít systém RTCA (ACEA Biosciences)
s využitím E-plate inzertů (obr. 1). Tento systém měří v reálném čase velikost impedance na dně každé
jamky více-jamkové desky. Pro možnost kokultivace se do každé jamky vkládá inzert, jak je ukázáno
na schématu níže. Rychlost růstu cílových buněk po dně jamky je ovlivněna uvolňováním a působením
signálních molekul z efektorových buněk. Odpor jednotlivých buněk na dně zvyšuje celkovou
měřenou impedanci, kterou systém normuje a přepočítává na tzv. „cell index“ (buněčný index).
Zvýšení „cell indexu“ proto odpovídá nárůstu počtu buněk v jamce. Výhodou tohoto systému je
i snadná manipulace s buňkami a absence nutnosti jakkoli buňky značit [2].
Porózní membrána inzertu
Efektorové buňky
Signální molekuly
Cílové buňky
Dno jamky s elektrodami
Obrázek 1 Schéma jamky s E-plate inzertem systému RTCA
Obrázek upraven a poskytnut se svolením Roche. Zdroj: ROCHE.XCELLigence System: E-Plate Insert RealTime Co-Culture Experiments. Penzberg, 1998.
7 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 1.3.2 Migrace buněk
Buněčná polarizace a migrace vyžaduje koordinovanou regulaci signálních a efektorových
molekul na specifických místech v buňce. Tyto vlastnosti vyžadují vývoj sond pro přesné měření
aktivace těchto klíčových regulujících molekul v živých buňkách v čase a prostoru. GFP-tagované
senzory, které se váží na takto aktivované molekuly lze použít za účelem jejich určení polohy
a monitorovat pomocí zobrazovacích metod. Jiné sondy byly vytvořeny za účelem detekce přímé
interakce mezi regulujícími molekulami a efektory vazné domény při užití fluorescenčně rezonančního
přenosu energie (FRET – Fluorescence resonance energy trasfer).
Pro měření migračních schopností buněk lze použít systém RTCA DP (ACEA Biosciences)
s využitím CIM plate desky. Tento systém využívá obdobné principy měření impedance, jak bylo
zmíněno v předchozí části (kokultivace), nicméně impedance resp. „cell index“ je měřen na spodní
straně porózní membrány, která je potažená elektrodami. Ve spodní části jamky je umístěn atraktant,
který působí na vyseté buňky v horní části, které v důsledku působení chemoatraktantu prostupují
membránou a porůstají ji ze spodní strany.
Analýza Boydenovou komorou (obr. 2) byla představena roku 1962 pro sledování chemotaxe
leukocytů. Tento systém se skládá z komory složené ze dvou částí naplněných médiem, které jsou
od sebe odděleny mikroporózní membránou. Metoda je vhodná ke kvantitavnímu měření odlišné
migrační odpovědi při chemotaxi, haptotaxi a chemokinezi. Do spodní části komory je přidán
atraktant při sledování chemotaxe nebo haptotaxe. Při měření chemokineze je do obou komor přidáno
stejné množství agens.
Obrázek 2 Boydenova komora
Neuro Probe Boyden Chemotaxis Chamber.Neuro Probe [online]. 2011 [cit. 2013-02-04]. Dostupné
z: http://www.neuroprobe.com/products/boyden.html
8 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost Analýza hojení ran („Wound-Healing“) je jednou z prvních (r. 1965) vyvinutých metod
pro sledování buněčné migrace. Metoda je založená na pozorování migrace buněk do „rány“ (rýhy),
která je vytvořena ve vrstvě buněk. Analýza je vhodná pro sledování usměrněné migrace a její regulace
pomocí vazby mezi buňkami a extracelulární matrix a mezibuněčnými vazbami. Tuto metodu lze
kombinovat s mikroinjekcí nebo trasfekcí buněk.
Dunnova komora se využívá k analýze chemotaxe. Skládá se ze dvou koncentrických kruhů
umístěných na podložním skle. Prstencová hrana (most) tak odděluje 2 jamky od sebe. Most je snížen
oproti hraně obklopujícího podložního skla. Vnější jamka obsahuje chemoatraktant, zatímco vnitřní
jamka ne. Lineární gradient chemoatranktu je vytvořen difúzí přes most mezi těmito dvěmi jamkami.
Buňky vyseté na krycí sklíčko jsou posléze obráceny nad komoru a jsou to tyto buňky, které leží přesně
nad mostem, které jsou sledovány při analýze.
Analýza buněčného rozptylu se používá k popisu migrace jednotlivých buněk (rozptylu)
z kompaktních kolonií epiteliálních buněk indukovanou rozpustnými faktory jako jsou růstové
faktory, cytokiny a forbolové estery. Metoda byla původně popsána pro detekci faktorů způsobující
migraci přítomných v kultivačním médiu u linie MRC-5 - lidské embryonální ledviny (MDCK).
Rozptyl buněk byl zaznamenán při působení hepatocytárního růstovém faktoru (HGF). U mnoha
dalších buněk – keratinocyty, BSLC opičí ledvinné buňky, endoteliální buňky, krysí jaterní epiteliální
buňky a buňky z nádoru močového měchýře, lze působením hepatocytárního růstového faktoru
vyvolat taktéž migraci.
Kultivace buněk na 3D matrix je další metodou pro sledování změn migrace u některých typů
buněk. Fibroblasty jsou nepolární buňky, nicméně jejich kultivace na 2D substrátu vedet k tvorbě
umělé polarity. Morfologie a schopnost migrace se u těchto buněk liší, pokud jsou kultivovány v 3D
matrix.
Analýza migrace pomocí metody „Stripes“ (proužky) z mnoha metod, vyvinul ji Walter et al.
a opublikoval v r. 1987. Membránové fragmenty o dvou různých složeních jsou uspořádány do vrstvy,
ve které se pravidelně střídají v úzkých pruzích. Axony rostoucí na těchto pruhovaných vrstvách jsou
simultálně konfrontovány s dvěma různými substráty na rozmezí každého z pruhů. Pokud axony
preferují růst na některém ze substrátu, orientují svůj růst ve směru pruhů a rostou v liniích
preferovaného substrátu. Tento preferenční růstu vzniká v důsledku afinity k faktorům obsaženým
v substrátu nebo v důsledku vyhýbání se růstu na druhém substrátu v důsledku odpuzujících faktorů
obsažených v druhém substrátu.
9 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 1.3.3 Invazivita buněk
Monitorovat buněčnou invazivitu lze s využití CIM Plates desek zmiňovaných výše. Pomocí
RTCA systému lze získat migrační křivku pro jednotlivé testované linie v jamkách, současně se dá určit
aktivita chemoatraktantu. „Cell index“ je měřen přibližně každých 15 minut, před jeho prvním
změřením je změřena impedance pozadí.
Nejčastěji používanou metodou je modifikovaná analýza za užití Boydenovy komory, u které je
připravena základní membránová matrix např. z Matrigel™ materiálu nebo kolagenu, a kultivačního
média, jakožto chemoatraktantu. Poprvé byla tato metoda použita v r. 1987 a byla tak ověřena silná
korelace mezi invazivním chováním nádorových buněk in vivo a jejich schopností invaze in vitro
za použití této metody.
Kruhová analýza invazivity (CIA – circular invasion assay) a Kruhová analýza hojení rány (CWA
– circular wound-healing) je připravena pomocí tlaku „vrtáku“, což je rotující hrot potažený
silikonem, k vytvoření standardizované kruhové „rány“ (rýhy) do uniformní narostlé vrstvy buněk
kultivovaných v Petriho misce. Na rozdíl od CWA metoda CIA využívá vrstvu z materiálu Matrigel™,
která tvoří bariéru extracelulární matrix, která umožňuje buňkám invadovat za podobných podmínek
jako tomu je v in vivo podmínkách. Tato přidaná vrstva umožňuje detekci různého stupně buněčné
invazivity v průběhu času, měření buněčné migrace (nebo motility) je taktéž zaznamenána.
Kvantifikace zarůstání rány (rýhy) se učiní srovnáním velikosti rýhy po příslušné době inkubace
s původní velikostí rýhy na počátku experimentu. Výsledek lze odečítat pomocí částečné automatizace
s využitím softwaru jako např. ImageJ [1].
1.4 Faktory mající vliv na výsledek migrační a invazní analýzy
Analýzu invazivity ovlivňují zejména následující podmínky:

Koncentrace gelu

Délka polymerizace

Teplota při polymerizaci

Počet buněk

Příprava buněk (např. Trypsinizace vs. EDTA)
Analýzu migrace ovlivňují zejména následující podmínky:

Potahování (coating) povrchu extracelulární matrix

Podmínky při pokrývání (coating) jako např. koncentrace, teplota, doba)
10 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 
Počet buněk

Příprava buněk (např. Trypsinizace vs. EDTA)

Použití bezsérového média vs. použití média se sérem
11 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 2. ANALÝZA PROLIFERACE, VIABILITY A BUNĚČNÉ SMRTI
2.1 Typy buněčné smrti a způsob jejich rozpoznání
Pro správnou funkčnost organizmu je nutné zajistit rovnováhu mezi buněčným růstem
a programovanou buněčnou smrtí. Odumírání buněk organizmu zajišťují dva hlavní typy buněčné
smrti – apoptóza a nekróza. Je důležité je od sebe odlišit a správně definovat. V průběhu nekrózy
dochází ke spuštění rychlých dějů s fatálními následky na metabolismus a jednotlivé komponenty
buňky.
Dochází
k porušení
buněčné
membrány,
která
se
stává
propustnou,
což
má
za následek narušení rovnováhy uvnitř buňky. Celkový objem buňky roste, dochází k bobtnání jak
cytoplazmy, tak některých organel což vede k rozpadu membrán a následné lýzi buňky. Zároveň
dochází k uvolňování buněčného obsahu do okolí a ke vzniku zánětu[3].
Nekróza
Mitochondriální změny
Rozpad membrány
Zachován chromatin. pattern
Normální buňka
Vratné natíkání
Nevratné natíkání
Desintegrace
Apoptóza
Intaktní membrány
Mitochondr. struktury zachovalé
Apoptická tělíska
Změny v jádře
Normální buňka
Kondenzace
Fragmentace
Sekundární nekróza
Obrázek 3 Srovnání apoptózy a nekrózy
Obrázek převzat se svolením z http://www.roche-applied-science.com/sis/apoptosis/index.jsp?id=slide001&
fol=scientific_information&pageid=slide013 a upraven.
Apoptóza je narozdíl od nekrózy dobře organizovaná forma buněčné smrti, řízená geneticky. Je to
přísně řízený proces, nedoprovázený specifickými morfologickými a biochemickými změnami.
Nejdříve dochází k přerušení buněčných spojení a ztrátě specializovaných membránových struktur.
Dojde ke smrštění buňky, ztrátě intracelulární vody, kondenzaci chromatinu a změnám na
úrovnibuněčných membrán. Jaderná DNA je degradována pomocí endonukleáz za vzniku
12 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost specifických fragmentů, které slouží jako jeden z možných znaků apoptózy (obr. 4). Nakonec dochází
ke vzniku membránou ohraničených útvarů známých jako apoptotická tělíska[4].Vzniklá apoptotická
tělíska lze použít jako specifický znak odlišující apoptózu od nekrózy [5]. Imunitní systém tato tělíska
rozpozná a jsou fagocytována makrofágy bez poškození okolní tkáně a vyvolání zánětlivé odpovědi.
Histonový oktamer
nukleozomálního
jádra
Vzdálenost mezi střihy =
vícero 180 bazických páru
Spojka DNA
Endonukleáza
DNA podrobená
gelové elektroforéze
Páry
bází
Obrázek 4 Fragmentace DNA při indukci apoptózy
Převzato se svolením z http://www.roche-applied-science.com/sis/apoptosis/index.jsp?id=slide001&fol=scie
ntific_information&pageid=slide017 a upraveno.
Jsou dvě základní dráhy apoptózy – vnější a vnitřní. Tyto dráhy nejsou izolované a může docházet
k jejich vzájemnému propojení. Vnější dráha je spuštěna po navázání specifického ligandu
na odpovídajícíc receptor. Následně dochází k formování signálního komplexu indukujícího smrt
buňky (DISC). Součástí tohoto komplexu je adaptorová molekula FADD (Fas-associated death
domain), díky které dochází k navázání prokaspázy-8. Oligomerizací prokaspázy-8 na DISC dochází
k její autokatalytické aktivaci za vzniku její aktivní formy - kaspázy-8. Takto aktivovaná kaspáza
následně aktivuje efektorové kaspázy-3, -6 a -7.
Vnitřní dráha se označuje také jako mitochondriální. Při její aktivaci dochází ke štěpení proteinu
Bid, který se nachází v cytozolu buňky. Štěpený protein tBidse pak přesouvá k mitochondriím
a indukuje oligomerizaci proapototických proteinů Bax a Bak. Následkem toho dojde k vylití
cytochromu c a dalších proapoptotických proteinů z mitochondrie do cytoplazmy. Uvolněný
cytochrom c pak společně s Apaf-1 a prokaspázou-9 vytvoří komplex apoptosom, ve kterém dojde
13 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost k aktivaci prokaspázy-9. Následně je aktivována kaskáda efektorových kaspáz a štěpení jejich
substrátů, kdy nakonec buňka podléhá apoptóze.
2.2 ELISA metoda
2.2.1 Obecný úvod
Imunochemické metody jsou založeny na použití protilátek jako specifickýchvazebných činidel.
Pomocí těchto metod lze v biologickém vzorku stanovit celou řadu látek cizorodých, tělu vlastních,
infekčního původu a protilátky imunitního systému.Makromolekulární látky buď přirozeného, nebo
umělého původu, které jsou rozpoznány imunitním systémem a následně vyhodnoceny jako tělu cizí
se označují jako antigeny. Po vnesení antigenů do vhodného organismu stimulují tvorbu protilátek,
lymfokinů, regulačních a výkonných T-lymfocytů a navození imunitní odpovědi.
Nekompletní antigen se označuje také jako hapten, kompletní pak jako imunogen.Imunogen lze
charakterizovat schopnostívyvolat a stimulovat tvorbu protilátek, narozdíl od antigenu, který se pouze
specificky vážena protilátku bez toho, že by vyvolal tvorbu protilátek. K vyvolání tvorby protilátek
dojde až po navázání haptenu na makromolekulární molekulu (nosič), kdy vznikne imunogenní
konjugát.Antigenní determinanta haptenu je pak jednou z determinant na struktuřekonjugátu.
Specificitou reakce antigen-protilátka se rozumí míra afinity vazebného místaprotilátky vůči
určitému vlastnímu epitopu na molekule antigenu. Afinita vyjadřuje energiivazby mezi jedním
vazebným místem na protilátce a příslušným epitopem na antigenu.Celková afinita vazby je dána
součtem všech odpudivých a přitažlivých sil (van der Waalsovy síly,vodíkové můstky, hydrofobní
interakce aj.) mezi dvěma komplementárními strukturami.Avidita vyjadřuje celkovou energii vazby
mezi protilátkou a antigenem a je dánasoučtem vazebných afinit všech jednotlivých vazebných míst na
protilátce se všemiodpovídajícími epitopy na antigenu.
Imunitní odpověď hostitele na imunogen vyvolá stimulaci lymfocytů, které po diferenciaci
produkují plazmatické buňky schopné sekretovat protilátky. Komplexní antigen může vyvolat
produkci celé řady protilátek s různou specifitou, které jsou produkty různých buněčných linií
plazmatických buněk. Tyto protilátky se označují jako polyklonální a mohou reagovat s
různýmiepitopy imunogenu.Naproti tomu monoklonální protilátka je produktem jediného klonu
plazmatické buňky.
Hybridní buněčné linie (hydridomy) vznikají fúzí imunizacísenzitizovaných myších lymfocytů
ze sleziny s nesmrtelnou linií myšího myelomu. Výsledkem této fúze je hybridomová buňka. Tato
buňka si zachovala nesmrtelnost myelomové linie aschopnost produkovat protilátku díky slezinné
buňce.Monoklonální protilátky mohou reagovat pouze s jedním epitopem namultivalečním antigenu,
14 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost což způsobuje, že většina monoklonálních protilátekneprecipituje makromolekulární antigeny.
Z tohoto důvodu semonoklonální protilátky nemohou používat při tradičních precipitačních
metodách. Naproti tomuimunosaturační metody založené na kotvené protilátce na pevné fázi
většinouvyužívají protilátky monoklonální [6].
2.2.2 Princip ELISA
ELISA je metoda je založená na vysoce specifické vazebné reakci mezi antigenem a protilátkou.
Pro tuto metodu je typické:
a) značení detekčních protilátek pomocí enzymů, které katalyzují přeměnu substrátu na barevný
produkt;
b) adsorpce či kovalentní navázání protilátek na vhodný nosič (zkumavka, jamka mikrotitrační
destičky, atd.), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul.
Jako přístup vhodný pro vyhodnocení této metody lze označit vizuální a spektrofotometrické
metody. Výhodou testů ELISA je vysoká specifita, lze je využít pro dektekci specifických
mikroorganismů, proteinů anebo toxinů.
Schéma – hlavní kroky metody sendvičové ELISA:
Krok 1
Krok 2
Na povrch testovací jamky jsou adsorbovány
protilátky specifické pro cílový antigen.
Do jamky přidáme pomnožený vzorek.
Cílové antigeny se vážou na specifické protilátky.
Následným promýváním odstraníme zbytky vzorku
a nenavázaný antigen.
Krok 3
Krok 4
15 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost Do jamky přidáme enzymaticky značené protilátky.
Protilátky se váží na antigen a vytváří „sendvič“.
Následným promýváním odstraníme nenavázané
značené protilátky.
Do jamky přidáme substrát.
Enzym katalyzuje přeměnu substrátu na barevný
produkt.
Následuje vyhodnocení výsledků.
(Zdroj: McMEEKIN, TA. Detecting pathogens in food. 1st ed. Abington: Woodhead Publishing Limited,
2003, 370 p.)
3. CELL DEATH DETECTION ELISA PLUS KIT OD FIRMY ROCHE
3.1 Popis a charakteristika Kitu
ELISAPLUS Kit je klasická kvantitativní sendvičová enzymatická imonoassay, která využívá myší
monoklonální protilátky vázající se přímo na DNA a histony. To zaručuje její vysokou specificitu
při určování mono- a oligonucleosomů v cytoplazmatické frakci buněčného lyzátu. Provedení testu
je velice rychlé(3-4 hodiny). Součástí každého kitu jsou veškeré reagencie potřebné pro její provedení:
1. Anti-histon-biotin (clone H11-4)
2. Anti-DNA-POD (clone MCA-33)
3. Pozitivní kontrola
4. Inkubační pufr 10x
5. Lyzační pufr, 10x
6. Substrátový pufr
7. ABTS tablety
8. ABTS Stop roztok
9. Mikrodestička (potažená streptavidinem), 10 modulů
10. Lepícífolie
16 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 3.2 Princip a postup „Cell Death Detection ELISA Plus Kit“
Buňky se vysejí na mikrodestičku v odpovídající hustotě a nechají přisednout. Poté se buňky
ovlivní látkou indukující buněčnou smrt (1–24 hod). Jako negativní kontrola se používají neovlivněné
rostoucí buňky (bez látek indukujících buněčnou smrt). Následně se deska centrifuguje (200g, 10min,
RT) a odsaje se supernatant, který si schováme pro pozdější detekci nekrózy (obr. 5). K buňkám
se přidá lyzační pufr (obr. 6A) a nechá lyzovat (30 min, RT) (obr. 6B).
Obrázek 5Detekce nekrotické DNA
A)
B)
Obrázek 6Detekce apoptotických nukleosomů
Alikvot lyzátu (apoptóza), supernatantu (nekróza) a příslušných kontrol (jako pozitivní kontrola
slouží komplex DNA-histon) se přenese na koutovanou mikrodesku a nechá inkubovat společně
s immunoreagentem (anti-histon-biotin a anti-DNA-POD, 2h, RT). Anti-histon reaguje s histony H1,
H2A, H2B, H3 a H4 různého původu (člověk, myš, potkan, křeček, kráva, vačice, Xenopus). Anti-DNA
17 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost váže jedno- a dvou-vláknovou DNA. Deska se pak třikrát promyje inkubačním pufrem a přidá
se substrát (ABTS roztok, 15 min, RT). Po odpovídající době se přidá ABTS stop roztok pro ukončení
reakce. Měří se absorbance při 405 nm proti blanku (ABTS roztok + ABTS stop roztok) (obr. 7).
Streptavidin
Anti-histon
biotin
Stěna mikrodestičky
Vzorek obsahující
nukleozomy
Anti-DNA-peroxidáza
ABTS substrát
Obrázek 7Schéma metody
Převzato a upraveno se svolením od Roche.
3.3 Výhody Kitu

Jednokroková ELISA

Vysoká citlivost (5 x 102 buněk/ml)

Rychlé a jednoduché provedení

Kit zahrnuje pozitivní kontrolu

Nevyžaduje barvení buněk
4. ZPŮSOB HODNOCENÍ KONCENTRACE BUNĚK A JEJICH PRINCIP
Určování koncentrace, velikosti a objemu částic se stalo základem v biologických vědách jako
jedna z primárních fyzikálních charakteristik. Povaha částic, které jsou měřeny by se neměla v průběhu
pozorování měnit, ať už jde o jejich velikost či objem. Klíčem pro správné a přesné měření je volba
vhodného přístroje. Přístroje, které se běžně používají k počítání částic by se daly rozdělit do dvou
skupin: Hemacytometr je speciální sklíčko, které v sobě má vrytou síť mřížek.Buňky se počítají
pro určitý daný objem. Tento způsob je levný a přenosný. Na druhou stranu je nutné mít i světelný
mikroskop. Metoda není automatická a je závislá na přesnosti dotyčné osoby, která počítá [7].
Druhou možností jsou Coulter Counter. Ve srovnání s Hemacytometrem, Coulter Counter
automaticky počítá částice, které prochází zónou s elektrickým senzorem. Counter počítá hustotu
18 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost částic na základě dvou faktorů: (1) počet buněk procházející skrz zónou s elektrickým senzorem
za jednotku času; (2) objem průtoku. Měření koncentrace buněk se počítá na základě objemu, který
prochází měřící zónou. Přesnost měření je závislé na objemu průtoku kontroly. Tato metoda vyžaduje
přesný fluidní kontrolní systém, který může být drahý a náročný na prostor[7].
Proto se v poslední době přechází na CASY Technologie (obr. 8). Ta je určena pro vysoce
standardizované počítání buněk a přesné měření buněčné viability (životaschopnosti), agregace
a buněčného objemu. Tato metoda v sobě kombinuje měření elektrické zóny a vyhodnocení signálu
na základě pulzní plochy.
Zkumavka
Měřící kapilára
Elektrody
Měřící pór
Roztok elektrolytu (CASY ton) se suspenzí
buněk
Obrázek 8 Ukázka Principu meření a přístroj CASY TT
Převzato se svolením z http://www.roche-applied-science.com a upraveno.
5. CASY MODELTT – CELL COUNTER AND ANALYZER
5.1 Aplikace

optimalizace práce s buněčnými kulturami

(kvantitativní kontrola kvality s vysokou opakovatelností)

měření cytotoxicity

kontrola objemu
19 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 
spontánní mutace standardních buněčných linií

diferenciace buněk

analýzy virové infekce
Příkladem aplikace může být stanovení viability buněk (obr. 9). Živé buňky mají intaktní
membránu, která zabraňuje průchodu elektrického proudu. Na druhou stranu mrtvé buňky mají
rozrušenou membránu, které je pro elektrický proud propustná.
Živá buňka
Mrtvá buňka
Obrázek 9 Stanovení viability buněk
Převzato a upraveno se svolením od Roche.
5.2 Princip
Buňky, které jsou rozsuspendované v roztoku CASY®ton jsou nasávány měřícím pórem. Buňky
procházejí mezi platinovými elektrodami zajišťující stabilitu prostředí elektrolytu. Každá buňka/částice
procházející pórem generuje individuální elektrický puls (obr. 10). Počet pulsů odpovídá počtu
buněk/částic. Velikost elektrického pulsu je přímo úměrná objemu buňky.
20 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost Zbytky
Mrtvá
buňka
Živá buňka
Agregované buňky
Obrázek 10 Distribuce buněk podle velikosti
Převzato a upraveno se svolením odRoche.
5.3 Postup
1. Dříve než začnete

Přístroj je dodaný s nainstalovanou 150μm kapilárou. V případě, že Vaše aplikace vyžaduje
kapiláru jiné velikosti, musíte ji vyměnit.

Vždy zkontrolujte odpadní i CASYton lahvičku.
Obrázek 21 CASY ModelTT
2. Zahájení práce

Na zadním panelu přepněte zelený vypínač ON/OFF.

Příprava vzorků a přístroje 
21 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost o
Pečlivě nastavte nastavení přístroje.
o
Příprava a pipetování vzorku musí být co nejpřesnější (standardizace postupu).
o
Připravujte vzorek těsně před měřením.
o
Zabraňte sedimentaci buněk jemným promícháváním.
o
Pro správné měření nesmí finální koncentrace vzorku překročit maximální hodnotu, která
závisí na velikosti použité kapiláry.
3. Měření

Umístěte novou zkumavku s CASYton roztokem pod kapiláru a spusťte 3 čistící cykly

Zkontrolujte pozadí a ujistěte se, že nepřekračuje povolený limit

Vytvořte vhodné nastavení pro analýzu objektů nebo načtěte již uložené nastavení ze systému

Umístěte novou zkumavku s CASYton roztokem a buňkami pod kapiláru.

Stiskněte START na kontrolním panelu.

Po ukončení měření se na obrazovce objeví výsledková obrazovka

Je doporučeno proměřit nejméně 1 000 objektů v případě vyhodnocení buněčné suspenze
bez korekce agregace. V případě analýzy agregujících vzorků s použitím korekce agregace je
jich třeba proměřit nejméně 2 000.
4. Vypnutí přístroje

Umístěte novou zkumavku s CASYton roztokem pod kapiláru a spusťte 3 čistící cykly

Zkontrolujte pozadí a ujistěte se, že nepřekračuje povolený limit

Je-li pozadí přijatelné, nechte zkumavku CASY cup použitou pro měření pozadí pod kapilárou

Ujistěte se, že je kapilára ponořená v roztoku CASY ton (nedojde k vyschnutí interního
fluidního systému)

Vypněte přístroj – spínačem ON/OFF na zadním panelu.
22 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 6. REFERENCE
1.
BOUZIOUKH, Farima. ROCHE DIAGNOSTICS. Self-learning: Cell Invasion and Migration.
2002.
2.
ROCHE DIAGNOSTICS. XCELLigence System E-Plate Insert Real-Time Co-Culture
Experiments. Penzberg. 1998.
3.
Alberts B., Bray Denis, Johnson A.,Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Zaklady
buněčnebiologie (uvod do molekularni biologie).Espero publishing. 1998
4.
Milan A., Huerta S. Apoptosis-Inducing Factor and colon cancor. Journal of
SurgicalResearch, 151, 163-170. 2009
5.
Potten Ch., Wilson J. Apoptosis: The Life and Death of cells. Cambridge University
Press.2004
6.
ZAJONCOVÁ, Ludmila. UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Imunochemické
metody. Olomouc, 2009. Dostupné z:
http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/kbc/Imunochemicke_metody.pdf
7.
Schapiro Howard M. Practical Flow cytometry 4th Edition, Published by John Wiley and Sons
Inc. New Jersey, 2005, 736p.
23 Projekt: OrganoNET – partnerství pro vzdělávání a výzkum v oblasti zobrazování tkání a orgánů Registrační číslo: CZ.1.07/2.4.00/31.0245 Operační program: Vzdělávání pro konkurenceschopnost 7. PODĚKOVÁNÍ
Autoři by tímto rádi poděkovali Ing. Viktoru Horváthovi, Ph.D. ze společnosti Roche s.r.o. za
poskytnuté materiály (reference 1, 2), které sloužili jako podklady k napsání těchto skript.
24