01_principy imunoanalytickych-metod

Imunoanalytické metody
a jejich využití v biomedicínském
výzkumu a klinické praxi
Kolektiv autorů
Editoři: Marie Karlíková, Ondřej Topolčan
Protilátka a antigen. Zdroj: www.scienceclarified.com
2
Autoři
Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D.
Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta Ostravské univerzity v Ostravě
RNDr. Marie Karlíková, Ph.D.
Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta v Plzni a Fakultní nemocnice
Plzeň
Doc. MUDr. Marie Ludvíková, Ph.D.
Ústav biologie LF UK Plzeň, Ústav patologie 1.LF a VFN Praha
RNDr. Martin Pešta, Ph.D.
Centrální radioizotopová laboratoř, Lékařská fakulta v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň
Doc. RNDr. Kristián Šafarčík, CSc.
Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta Ostravské univerzity v Ostravě
RNDr. Jindra Vrzalová, Ph.D.
Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta v Plzni a Fakultní nemocnice
Plzeň
3
Obsah
1.
ZÁKLADNÍ POJMY A PRINCIPY IMUNOANALÝZY ......................................................... 6
1.1
PROTILÁTKY ............................................................................................................................................ 7
1.2
REAKCE PROTILÁTKA-ANTIGEN ............................................................................................................. 15
1.3
LITERATURA 1 ....................................................................................................................................... 15
2.
IMUNOANALYTICKÉ METODY A TECHNOLOGIE ........................................................ 16
2.1
DĚLENÍ IMUNOANALYTICKÝCH METOD ................................................................................................. 17
2.2
RADIOIMUNOANALYTICKÉ METODY ..................................................................................................... 23
2.3
ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA ................................................................................................................ 24
2.4
LUMINISCENČNÍ IMUNOANALÝZA......................................................................................................... 28
2.5
FLUORESCENČNÍ IMUNOANALÝZA ........................................................................................................ 30
3.
NÁVAZNOST A STANDARDIZACE IMUNOANALYTICKÝCH METOD ............................. 37
3.1
NÁVAZNOST MĚŘENÍ ............................................................................................................................ 37
3.2
STANDARDIZACE METOD ...................................................................................................................... 39
4.
MULTIPLEXOVÁ IMUNOANALÝZA ............................................................................ 42
4.1
PLANÁRNÍ MIKROARRAYE – PROTEINOVÉ ČIPY ..................................................................................... 43
4.2
MULTIPLEXOVÉ REAKCE NA MIKROKULIČKÁCH (BEAD ARRAYS) ........................................................... 45
4.3
LABORATOŘ NA ČIPU (LAB-ON-A-CHIP)................................................................................................. 50
4.4
LITERATURA 4 ....................................................................................................................................... 51
4.
PREANALYTIKA ........................................................................................................ 52
5.1
BIOLOGICKÉ VLIVY ................................................................................................................................ 52
5.2
ODBĚR MATERIÁLU ............................................................................................................................... 55
5.3
SEPARACE A TRANSPORT ...................................................................................................................... 56
5.4
SKLADOVÁNÍ ......................................................................................................................................... 57
4
5.5
LITERATURA 5 ....................................................................................................................................... 58
5.
IMUNOANALÝZA A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE ........................................................... 59
6.1
ZÁKLADY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE ....................................................................................................... 61
6.2
PROČ VZNIKAJÍ A CO ZPŮSOBUJÍ MUTACE ............................................................................................ 62
6.3
ZÁKLADNÍ METODY PRÁCE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI ...................................................................... 67
6.4
LITERATURA 6 ....................................................................................................................................... 74
6.
IMUNOHISTOCHEMIE A JEJÍ VYUŽITÍ ........................................................................ 75
7.1
METODOLOGIE IMUNOHISTOCHEMIE ................................................................................................... 76
7.2
APLIKACE IMUNOHISTOCHEMIE ............................................................................................................ 80
5
1. Základní pojmy a principy
imunoanalýzy
Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš, Marie Karlíková
Imunoanalýza umožňuje citlivá stanovení nepatrných množství biomolekul, a to na základě
využití přirozených vlastností protilátek:
1/ schopnost protilátek vázat se na široké množství přirozených i umělých sloučenin, buněk i
virů, které se chovají jako antigeny. (Protilátky jsou proteinového charakteru a jejich velké
množství vazebných míst je odvozeno z obrovského počtu kombinací sekvencí aminokyselin.)
2/ specificita protilátky pro reagující látku. Tato vlastnost umožňuje stanovení velmi nízkých
(až pikomolárních, 10-12) koncentrací látek za přítomnosti dalších podobných sloučenin (např.
stanovení stopových množství hormonů ve vzorku krve).
3/ síla vazby protilátky s antigenem.
Využití reakce protilátka - antigen in vitro je základem imunochemických metod.
Imunoanalýza zahrnuje skupinu imunochemických metod, které k detekci využívají dobře
měřitelné značené látky – indikátoru a tím dosahuji vysoké citlivosti (detekční limity těchto
metod dosahují hodnot 10-15 až 10-20 mol/L). Indikátorem může být radioaktivní izotop
(radioizotopové metody) nebo jiná látka: enzym, fluorescenční značka, DNA, koloidní částice
a pod. Indikátor je obvykle navázaný na protilátku (imunometrická analýza), nebo na antigen.
6
Počátky imunoanalýzy spadají do 50. let 20. století, kdy fyzikové Rosalyn Yalowová a
Solomon
Berson
(pracovní
i
životní
partneři)
popsali
princip
kompetitivní
radioimunoanalýzy (RIA), s jejíž pomocí změřili do té doby nedetekovatelná množství
inzulinu v krvi. Yalowové a Bersonovi bylo jasné, že obdobné metody, založené na soutěži
značeného a neznačeného antigenu o vazebná místa, bude možné vypracovat i pro další
analyty, a tuto možnost chtěli poskytnout celému světu. Proto své poznatky uveřejnili bez
patentové ochrany. V roce 1977 obdržela R. Yalowová (S. Berson se toho již nedožil) za
vývoj radioimunoanalýzy pro peptidové hormony Nobelovu cenu. Později se hledaly i jiné
možnosti značení molekul tak, aby byla umožněna stejně citlivá detekce. V roce 1971 se
objevily metody, které místo radioizotopů využívaly enzymy. Jejich autory byli Eva
Engvallová s Peterem Perlmanem ze Švédska a Bauke van Veemen s Antonem Schuursem z
Holandska. Zatímco Holanďané svůj systém patentovali, Engvallová a Perlman věnovali
světu metodu ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) stejně velkoryse, jako to před
nimi s RIA udělali Rosalyn Yalowová a Solomon Berson. (převzato z Lapčík 2009).
1.1 Protilátky
Protilátky (angl. antibody, Ab) jsou proteiny produkované vyššími živočichy jako součást
imunitní odpovědi.
V imunoanalýze se využívá jedna nebo několik specifických protilátek k detekci žádaného
analytu. Analytem může být látka, která je přirozenou součástí organismu (např. hormony
štítné žlázy) nebo je v těle produkována, ale typicky přítomna není (např. tumorové markery)
nebo látky, které se v těle přirozeně nevyskytují (léky, drogy apod.)
Protilátky patří mezi glykoproteiny, které nazýváme imunoglubuliny. V živém organismu se
vyskytuje několik typů protilátek, které řadíme do tříd IgG, IgM, IgA, IgD nebo IgE.
V krevním séru jsou nejvíce zastoupeny imunoglobuliny třídy IgG a IgM, Ty je možné oddělit
od ostatních složek séra a získat tak směs imunoglobulinů. Pokud se oddělení imunoglobulinů
neprovede, hovoříme o séru obsahujícím protilátky (tzv. antiséru).
7
Všechny třídy imunoglobulinů mají podobnou strukturu, skládají se dvou lehkých řetězců (L)
a dvou těžkých řetězců (H). Lehké řetězce jsou vázány disulfidovými vazbami k těžkým
řetězcům, které jsou mezi sebou rovněž vázány disulfidovými vazbami (Obrázek 1.1).
Obrázek 1.1: Schematická struktura imunoglobulinu
Lehký řetězec má relativní molekulovou hmotnost asi 22500 a obvykle se skládá z 220
aminokyselin, těžký řetězec má relativní molekulovou hmotnost okolo 50000 a je většinou
tvořen 450 aminokyselinami. Lehké řetězce (L) mají variabilní (VL) a konstantní (CL) část.
Rovněž těžké řetězce (H) mají část variabilní (VH) a konstantní (CH). Variabilní části jsou
tvořeny vždy 100 až 110 aminokyselinovými zbytky na N-konci řetězců. Sekvence
aminokyselin ve variabilních částech lehkých řetězců určují specifitu protilátky a vytvářejí
vazebné místo pro určitou antigenní determinantu - paratop.
Hlavními charakteristikami protilátek jsou:
-
afinita
-
avidita
-
specifita pro určitý antigen
Afinita je energie vazby (síla vazby) protilátky s jednou antigenní determinantou antigenu. Je
mírou síly interakce antigen-protilátka a je ji možné kvantitativně vyjádřit pomocí asociační
konstanty (Kas) reakce. Kvalitní protilátky používané pro účely imunoanalýzy by měly mít K as
= 1010 - 1012 L.mol-1.
Avidita je vazebná energie mezi celou molekulou antigenu a protilátkou, neboť většina
antigenů je multivalentních, tj. má několik vazebných determinant pro různé protilátky.
8
Specifita protilátky je charakterizována minimální interferencí s jinými látkami, než je látka,
pro jejíž stanovení je určena. Mírou specifity protilátky je procento zkřížené reakce s látkou,
pro jejíž stanovení není určena.
Podle způsobu přípravy a charakteru dělíme protilátky do dvou základních skupin, na:
-
protilátky polyklonální
-
protilátky monoklonální
Polyklonální protilátky
Připravují se cílenou imunizací zvířat (Obrázek 1.2). Je to proces, kdy se vybranému zvířeti
aplikuje příslušný antigen v emulzi s tzv. “Freundovým adjuvans” (směs minerálních olejů,
vosků a neživých bakterií, která zvyšuje imunitní reakci na podaný antigen). Doba imunizace,
která je potřebná k tvorbě protilátek, je pro jednotlivé antigeny různá (2 až 6 měsíců). Během
této imunizace vzniká v krevním séru zvířete směs protilátek proti různým antigenním
determinantám použitého antigenu.
Pokud byl k imunizaci použit jeden antigen (např. jedna bílkovina), vytvářejí se
monospecifické protilátky (antisérum). Každý epitop v molekule antigenu stimuluje na
tvorbu protilátek jeden klon B-lymfocytů. Protože kompletní antigeny mají více epitopů,
aktivují několik klonů B-buněk. Proto imunizované zvíře syntetizuje směs monoklonálních
protilátek, lišících se tím, že jejich vazebná místa mají různou afinitu a tím i specifitu
k jednotlivým epitopům určitého antigenu, který vyvolal jejich tvorbu. Imunizace zvířat směsí
antigenů navozuje produkci polyspecifických protilátek, obsahující imunoglobuliny proti
většímu počtu antigenů (např. antisérum proti bílkovinám lidského séra používané při
imunoelektroforéze).
9
Obr. 2: Příprava polyklonálních protilátek. (zdroj: Zichová et al. 1993).
Polyklonální protilátka může obecně reagovat s několika antigenními determinantami.
Příprava polyklonálních protilátek je prakticky nereprodukovatelný proces, takže
opakováním nelze připravit identické antisérum.
Výhody polyklonálních protilátek:
Nevýhody polyklonálních protilátek:
vyšší citlivost
nutnost purifikace protilátky
vyšší avidita
velké rozdíly v kvalitě vlivem nestejné
(individuální) imunologické odpovědi
menší počáteční náklady
není interference HAMA
Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátky nejsou produkovány přímo organismem, ale buněčnou kulturou
(Obrázek 1.3). Způsob přípravy těchto protilátek byl roku 1975 publikován G. Köhlerem a C.
Milsteinem, kteří v roce 1984 spolu s N. K. Jernem získali Nobelovu cenu za fyziologii a
10
medicínu, a to za „ teorie pojednávají o specificitě ve vývoji a kontrole imunitního systému a za
objev principu produkce monoklonálních protilátek“.
Obrázek 1.3 Příprava monoklonálních protilátek. (Zdroj: Zichová et al. 1993)
Prvním krokem procesu je imunizace myši příslušným antigenem a následně se z její sleziny
získají lymfocyty produkující protilátky. Druhým krokem je jejich hybridizace s myelomovými
(nádorovými) buňkami, kdy dojde k fúzi obou typů buněk (tj. ke splynutí jader myelomové
buňky a lymfocytu) a vytvoření tzv. hybridomů. Syntéza protilátky pokračuje v hybridomu.,
což je dáno geny imunizovaného zvířete (“lymfoidního rodiče”). Po “myelomovém, rodiči”
získá hybridom “nesmrtelnost”, může se množit bez omezení po mnoho generací. Vhodnou
selekcí hybridomů (tzv. klonováním), lze pak vybrat ty klony, které produkují protilátky proti
vybrané antigenní determinantě antigenu. Protilátka syntetizovaná hybridomem je homogenní,
s jediným typem vazebného místa, je produktem jednoho klonu lymfocytů. Hybridomy lze
uchovávat za určitých podmínek (zmrazením na nízkou teplotu) a použít pro další produkci
protilátek.
Monoklonální protilátka tedy rozeznává jedinou antigenní determinantu, její příprava je, na
rozdíl od polyklonálních protilátek reprodukovatelná.
11
Monoklonální protilátky (zpravidla myší) jsou jedním z nejmodernějších a nejefektivnějších
způsobů diagnostiky i léčby rakoviny.
Použití myších protilátek k diagnostice nebo léčbě může u pacientů vyvolat imunitní odpověď produkci anti-myších neboli protilátek HAMA (Human-Anti-Mouse-Antibodies), která vede k
falešně pozitivním, případně falešně negativním výsledkům u imunoanalytických stanovení.
Nevýhody monoklonálních protilátek:
Výhody monoklonálních protilátek:
vyšší počáteční investice do výroby
vyšší čistota a specifita
nižší afinita
dlouhodobá
kontinuální
(nekončí smrtí zvířete)
dostupné ve velkém
nezměněné kvalitě
produkce
množství
možnost
HAMA
imunologické odpovědi
interference
v
lepší reprodukovatelnost výsledků
nejsou zkřížené reakce
rozeznávají pouze jeden epitop
Antigen
Antigeny jsou makromolekulární látky přirozeného nebo syntetického původu, které imunitní
systém rozeznává jako cizí. Jejich přítomnost v organismu stimuluje tvorbu protilátek, resp.
navozuje imunitní odpověď.
Vzhledem ke své funkci může být antigen
kompletní (imunogen), nebo
nekompletní (hapten).
12
Imunogen charakterizují dvě vlastnosti:
imunogenicita, neboli schopnost navodit imunitní odpověď (tvorba protilátek,
zapojení regulačních a výkonných lymfocytů), a
specificita, tj. schopnost s těmito lymfocyty a protilátkami reagovat. Imunogen
reaguje jen s těmi lymfocyty a protilátkami, jejichž tvorbu vyvolal.
Hapten má malou molekulu (Mr < 2000) a je schopen specifické vazby na protilátky, ale není
schopen vyvolat imunitní odpověď. Je tedy pouze součástí molekuly kompletního antigenu.
Typickými hapteny jsou některá léčiva, resp. jejich metabolity, nízkomolekulární hormony
nebo některé peptidy.
Každý imunogen
se
skládá
z
makromolekulárního
nosiče
a
nízkomolekulárních
determinantních skupin tzv. antigenních determinant neboli epitopů (Obrázek 1.4). Antigenní
determinanta je tvořena 5-8 aminokyselinami nebo monosacharidovými jednotkami, které se
strukturálně nacházejí blízko u sebe. Různé antigeny obsahují různé antigenní determinanty a
změna jedné aminokyseliny nebo monosacharidu dává vznik protilátce se zcela odlišnými
vlastnostmi. Schopnost protilátek rozlišovat i malé rozdíly epitopů je základem specifity
imunitních reakcí.
Obrázek 1.4 Antigen a různé epitopy s navázanými protilátkami.
(Zdroj: worldofbiology09.wikispaces.com.)
13
Imunogen musí splňovat určité fyzikální, chemické a biologické vlastnosti.
Z fyzikálních vlastností je to zejména
relativní molekulová hmotnost > 10 000,
rozpustnost
elektrický náboj.
tvar molekuly (konformační struktura)
dostupnost epitopů.
Z chemického hlediska mohou být imunogeny prakticky všechny biopolymery nacházející se
v živých systémech stejně jako řada syntetických antigenů. K nejsilnějším imunogenům se
řadí proteiny, následují polysacharidy. Čisté lipidy tvoří často pouze hapteny, jejich
imunogenicita stoupá vazbou s proteiny nebo polysacharidy.
Z biologických vlastností je třeba zmínit především genetickou vzdálenost. Čím větší bude
rozdíl mezi zdrojem antigenu a příjemcem, tím větší bude jeho imunogenicita.
Vzhledem ke svému původu můžeme antigeny dělit na
přirozené a
syntetické.
Přirozenými antigeny jsou nejčastěji cizorodé látky z vnějšího prostředí, tzv. exoantigeny,
které tvoří většinou mikroorganismy a jejich produkty. Jako alergen je pak označován
exoantigen, který je schopen u vnímavého jedince vyvolat patologickou (alergickou) reakci.
Autologní antigeny (autoantigeny) naopak pocházejí z organismu samotného a organismus je
všeobecně toleruje. Za určitých podmínek se však mohou stát imunogenními a mohou vyvolat
imunitní reakci proti strukturám vlastního organismu. V tom případě hovoříme o tzv.
autoimunitních nebo autoagresivních onemocněních, která jsou charakterizována tvorbou
autoprotilátek a přítomností autoreaktivních buněk .
Mezi nejdůležitější bakteriální antigeny patří makromolekulární sloučeniny obsažené v
bakteriální stěně. Tyto antigeny umožňují nejen sérologickou typizaci jednotlivých
bakteriálních druhů, ale podílejí se i na řadě biologických aktivit baktérií.
14
Syntetické antigeny představují polypeptidy, polysacharidy a některé polynukleotidy
připravené uměle v laboratoři. Zpravidla jsou tvořeny komplexy, které jsou složeny z
přirozeného nebo syntetického nosiče, na který jsou navázány chemicky definované
determinantní skupiny.
Míra imunitní odpovědi na podaný antigen závisí na dávce a způsobu podání. Stejné množství
antigenu, které je neúčinné při intravenózním podání, může vyvolat výraznou odpověď, je-li
podáno subkutánně. Vzrůstající dávky vedou k vyšší imunitní odpovědi, nejsou však přímo
úměrné zvýšené dávce imunogenu. Vzrůstající dávky mohou za určitých okolností stimulaci
tvorby protilátek nejen snížit, ale mohou vyvolat i specifickou neodpovídavost nebo dokonce
toleranci vůči danému imunogenu.
1.2 Reakce protilátka-antigen
Při reakci antigen-protilátka vzniká protilátkově-antigenní komplex (imunokomplex).
Ab + Ag
AbAg
Ab = protilátka, Ag = antigen, AbAg = imunokomplex
Reakce je reverzibilní. Vazba v imunokomplexu je nekovalentní, závisí na několika druzích
slabých sil, jako jsou hydrofobní vazby, vodíkové můstky, van der Waalsovy síly a interakce
iontů. O pevnosti vazby rozhoduje rovnovážná konstanta.
1.3 Literatura 1
1. Lapčík O. Od vyvrácené hypotézy k Nobelově ceně. Vesmír 2009:88, 704-707.
2. Zichová M., Šafarčík K., Hušák V. Vyšetřovací metody in vitro v nukleární medicíně. Institut pro další
vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1993, 124 p.
3. Wild D. (Ed.). The Immunoassay Handbook, 3rd Edition. Elsevier Ltd., 2005, 930 p.
15
2. Imunoanalytické metody a
technologie
Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš
Obecně lze imunoanalytické metody zařadit mezi analytické postupy založené na specifické
reakci ligandu (L) a vhodného vazebného reagens (VR) za vzniku komplexu (L-VR).
L + VR
L-VR
Odtud plyne nejobecnější označení těchto metod jako metody "ligandové analýzy".
Imunoanalytické metody, využívají reakci mezi antigenem a specifickou protilátkou, tedy
imunochemický princip. Protilátka musí být specifická, tzn. musí reagovat pouze s příslušným
antigenem.
Pro kvantitativní vyjádření výsledku analýzy je třeba, aby některá ze základních komponent
byla označena tzv. indikátorem, jehož přítomnost lze citlivě a dostupně měřit. K těmto účelům
byly nejprve využívány radionuklidy, např.
125
I (označení radioimunoanalýza nebo RIA). V
současné době jsou používány další substance různého charakteru: např. enzymy, fluorofory,
luminofory apod. (neizotopové varianty imunoanalýzy) (Obrázek 2.1).
Obrázek 2.1 Relativní velikosti látek k přípravě indikátorů
16
Další podmínkou sledování výsledku reakce je potřeba detekce pouze jedné části indikátoru
použitého v imunochemické reakci. Jeho celkové množství je v závislosti na průběhu reakce
rozděleno do tzv. volné frakce (F) a v imunokomplexu vázané frakce (B). K vyčíslení podílu
jedné z nich je obvykle nutno provést jejich separaci, tedy rozdělení vázané a volné frakce
indikátoru. Pro tyto účely byla a je používána řada separačních principů a tím i různých činidel.
Předností imunoanalytických metod je jejich vysoká citlivost a přesnost, dovolující v různých
materiálech
biologických
stanovovat
látky
obsažené
v
koncentracích
řádově
10-9 mol.l-1 až 10-15 mol.l-1 a to většinou bez předchozí úpravy vzorků (Obrázek 2.2). Moderní
metody jsou snadno proveditelné a automatizovatelné.
Obrázek
2.2
Charakteristické
citlivosti
imunoanalytických
metod.
ELISA
=
Enzyme
Linked
Immunosorbent Assay, FIA = fluorescenční imunoanalýza, RIA = radioimunoanalýza, LIA = Luminiscenční
imunoanalýza.
2.1
Dělení imunoanalytických metod
Existuje několik možností a kriterií, podle nichž lze imunoanalytické metody dělit a
charakterizovat:
a)
podle základního metodického principu,
b) podle nutnosti separace volné a vázané frakce indikátoru,
c)
podle druhu použitého indikátoru.
17
Kompetitivní a nekompetitivní princip imunoanalytické metody
Podle principu jsou imunoanalytické metody rozdělovány na metody kompetitivní a
nekompetitivní.
Kompetitivní metody
V případě kompetitivních metod je specifická protilátka (Ab), v reakci přítomna v
limitovaném (omezeném) množství. O její vazebná místa soutěží (kompetují) značený antigen
(Ag*) a stejný antigen (Ag) neznačený, který je přítomen v analyzovaném vzorku. Tím
dochází k saturaci vazebných míst protilátky oběma antigeny:
Ag + Ag* + Ab
Ag-Ab + Ag* Ab + Ag + Ag*
Při praktickém provádění této metody se do všech reakčních zkumavek pipetují konstantní
množství protilátky a značeného antigenu, přičemž jeho množství je vždy větší než množství
protilátky. Množství protilátky je ve všech případech nedostačující k navázání přítomných
antigenů, které se tak mohou vázat jen částečně. Výsledkem reakce je vznik dvou komplexů,
neznačeného (Ag-Ab) a značeného (Ag+-Ab), ve kterých jsou antigeny vázány na protilátku.
V reakční směsi zůstávají i antigeny nenavázané (Ag*, Ag), tj.volné. V rovnovážném stavu
reakční směsi je množství vznikajícího značeného komplexu (Ag*-Ab) nepřímo úměrné
množství přítomného neznačeného antigenu (Ag). Podíl značeného antigenu (indikátoru),
vázaného na protilátku (množství značeného komplexu), se obvykle označuje jako vázaná
frakce (B - “bound”). Jako volná frakce (F - “free”), pak množství nevázaného indikátoru. Pro
kvantitativní vyhodnocení je nutná vzájemná separace obou frakcí, která se provádí různými
fyzikálně-chemickými postupy. Po jejich oddělení je nutné změřit odezvu alespoň jedné z
frakcí. Podle druhu použitého indikátoru je měřenou odezvou radioaktivita, absorbance,
fluorescence, luminiscence apod.
18
Na základě analýzy kalibrátorů lze pak (z hodnot změřené odezvové veličiny a odpovídajících
známých koncentrací neznačeného antigenu v jednotlivých kalibrátorech) znázornit grafickou
závislost měřené odezvy (např. poměrů B/F - osa y) na koncentraci antigenu (osa x) a tak
sestrojit kalibrační závislost (Obrázek 2.3). V případě kompetitivních metod získáme v
lineárních souřadnicích křivku ve tvaru hyperboly. Jestliže se za stejných podmínek jako
kalibrátory analyzuje vzorek s neznámým obsahem antigenu, pak lze (po skončení reakce,
separaci a změření odezvy) určit z kalibrační závislosti jeho koncentraci.
Nekompetitivní metody
Nekompetitivní metody jsou charakterizovány tím, že specifická protilátka je v reakci
přítomna v nadbytku. S ní tentokrát reaguje antigen, který je určovanou látkou (Ag) a pro
kvantifikaci tentokrát slouží vhodně označená samotná specifická protilátka (Ab*). Průběh lze
opět zjednodušeně popsat vztahem:
Ag + Ab*
Ag-Ab* + Ab*
Množství komplexu [Ag-Ab*] je tentokrát přímo úměrné množství stanoveného antigenu.
Obrázek 2.3 Charakteristické kalibrační závislosti u kompetitivních a nekompetitivních metod
19
Nekompetitivní imunoanalytické metody jsou často označovány také jako metody
imunometrické. V praxi však není obvykle používán výše popsaný jednoduchý princip
reakce. Jeho nejužívanější modifikací je tzv. "two-site" imunometrická analýza, kdy vedle
ligandu (stanovovaného antigenu) do reakce vstupují jako vazebné reagencie dvě specifické
protilátky, obě jsou přítomné v nadbytku. Každá z nich je namířena proti jiné antigenní
determinantě stanovovaného antigenu, přičemž jen jedna je vhodným způsobem označena a
slouží tak jako indikátor průběhu reakce (signální protilátka). Neznačená protilátka
(vychytávací – „capture“) bývá většinou zakotvena na stěnu reakční zkumavky nebo na jinou
pevnou fázi (partikule, kuličky) a slouží k vychytání a připevnění komplexu antigen-značená
protilátka na tuto pevnou fázi, čímž podstatným způsobem usnadňuje separační krok metody.
V případě nekompetitivních imunometrických metod našly velké uplatnění tzv. monoklonální
specifické protilátky.
Schematicky je možno princip metody popsat pomocí vztahu:
Ab1 + Ag + Ab2*
Ab1-Ag-Ab2* + Ab1 + Ab2*
I v tomto případě je množství indikátoru konstantní (tentokrát jim však je signální protilátka),
a proměnlivé je množství stanovovaného antigenu (ve vzorcích nebo kalibrátorech). Pro
kvantifikaci analýzy je rovněž třeba separovat vázanou a volnou frakci indikátoru. Obvykle se
měří množství vzniklého značeného komplexu [Ab1-Ag-Ab2*], které, je přímo úměrné
množství určovaného antigenu. Nezreagovaná (přebytečná) signální protilátka je po ukončení
reakce odstraněna ze systému.
Kalibrační závislost získaná na základě analýzy kalibrátorů má stoupající charakter, který je v
určitém rozsahu koncentrací více či méně lineární.
20
Separační činidla a techniky
imunoanalytické metody
-
heterogenní
a
homogenní
Podle potřeby separace volné a vázané frakce indikátoru lze imunoanalytické metody rozdělit
na ty, které separaci vyžadují - metody heterogenní - a ty, které ji nevyžadují a kde je detekce
pouze jedné z frakcí zajištěna jiným způsobem – metody homogenní.
K separaci, tedy rozdělení vázané a volné frakce indikátoru byla a je používána řada principů
a tím i různých činidel. Od původně nespecifických metod používaných v počátcích
imunoanalýzy (spolusrážení polyethylenglykolem nebo adsorpce na povrchu aktivního uhlí)
přes specifičtější metody druhé protilátky (např. prasečí protilátka proti králičím
imunoglobulínům) až k současně nejužívanějším technikám, které využívají různé typy
pevných fází (stěny zkumavek nebo reakčních jamek, mikročástice, různé partikule apod.).
Každá separační technika má své výhody a nevýhody. Při jejím výběru je nutno přihlížet k
vlastnostem jednotlivých komponent přítomných v reakční směsi i k charakteru
imunochemické reakce.
Obecně lze shrnout, že všechny využívané separační techniky by měly splňovat několik
základních požadavků:
kvantitativní oddělení obou frakcí tak, aby jedna (případně obě) mohly být měřeny,
stejná účinnost pro kalibrátory i analyzované vzorky,
dobrá opakovatelnost (tj. přesnost v jednom stanovení) i reprodukovatelnost (mezi
jednotlivými analýzami),
rychlost, jednoduchost ekonomická únosnost.
Indikátory u imunoanalytických metod
Obecně se jedná o antigeny nebo protilátky, které jsou vhodným způsobem označeny a tak
umožňují monitorování průběhu imunoanalytické reakce. Tyto látky jsou schopny buď samy o
sobě produkovat detekovatelný signál (přímo, nebo po vhodné inicializaci), případně jeho
produkci zprostředkovaně vyvolat.
21
Základním problémem generování signálu a systému jeho detekce je především výběr
takového způsobu, který je co nejlépe rozlišitelný od šumu pozadí a přitom vykazuje
minimální nespecifické efekty. Imunoreaktivita značené látky má být identická s
imunoreaktivitou látky neznačené.
Jako první indikátory byly v imunoanalýze používány substance značené vhodným
radionuklidem. Nejčastějším radionuklidem využívaným k přípravě indikátorů pro účely
radioimunoanalýzy je 125I. Vedle něj se v praxi využívají i jiné radionuklidy, například 3H, 12C
nebo 57Co. Obecným požadavkem na radioindikátor je, aby byl radiochemicky čistý, tedy aby
obsahoval radionuklid vázaný pouze v jedné chemické formě.
Později (ve snaze o získání stabilnějších indikátorů s vyšší specifickou aktivitou) byly ke
značení využívány i neradioaktivní značky. Místo radionuklidů jsou používány především:
enzymy
látky, které přímo vykazují fluorescenci nebo luminiscenci
enzymy, které katalyzují vznik takovýchto látek
latexové částice
molekuly, které tvoří volné radikály
viry (bakteriofágy).
Tyto značky (enzymy, flourofory, luminofory a další) se však podstatně liší svou velikostí a
tím i možným vlivem na imunoreaktivitu značeného indikátoru.
Odlišné zdroje generování signálu vyžadují samozřejmě odlišný způsob jeho detekce. Místo
měření radioaktivity se tak užívá principů:
kolorimetrie - měření absorpce světla roztokem zbarveným po proběhlé enzymatické
reakci
fluorometrie - měření fluorescence indikátorů nebo vzniklého produktu enzymatické
reakce
luminometrie - měření produkce světelných kvant luminiscenční reakce
nefelometrie - měření rozptylu světelného záření na povrchu částic
turbidimetrie - měření zeslabení světelného záření vlivem zákalu roztoku
22
počítání částic - počítání částic určité velikosti poté, co proběhla imunochemická
reakce.
Dále v textu, jsou u některých typů imunoanalytických metod blíže vysvětleny principy
generovaní jejich signálu a detekce.
2.2 Radioimunoanalytické metody
Jako radioimunoanalytické metody jsou označovány ty metody, u kterých je pro přípravu
indikátoru imunochemické reakce použit vhodný radionuklid některého prvku. Základní
principy uplatňované u tohoto typu imunoanalýz jsou odpovídající modifikací těch variant,
které byly zmíněny v obecné části o imunoanalytických metodách. Pro kompetitivní metody
používáno označení "radioimunoanalýza" - RIA. Pro nekompetitivní metody bylo zavedeno
označení "imunoradiometrická analýza" a zkratka IRMA.
Postupem času byly vyvíjeny a aplikovány i jiné principy generování a detekce signálu,
potřebného pro kvantifikaci imunoanalytických metod, které nevyužívaly radioizotopy a
měření radioaktivity. Zavádění neizotopových technik bylo často zdůvodňováno především
snahou vyhnout se používání radionuklidů, které jsou obecně potenciálně ekologicky škodlivé
a navíc ohrožují do určité míry laboratorní pracovníky radiační zátěží. Je však nutno
konstatovat, že se ani některé neizotopové metody neobejdou bez užití potenciálně
kancerogenních, nebo jinak nebezpečných látek. Při splnění obecných podmínek pro práci s
otevřenými zářiči a likvidaci radioaktivních odpadů není riziko plynoucí z práce s
radionuklidy zásadně větší než při práci s neizotopovými metodami, a je převyšováno rizikem
plynoucím z práce s potenciálně infekčním materiálem (infekce HBV, HCV, HIV). Obdobně
přístrojové vybavení je zhruba přibližně stejně drahé.
Zásadním přínosem některých neizotopových imunoanalýz je skutečnost, že dosahují lepší
citlivosti stanovení. Byla využita celá řada látek, které teoreticky dosahují vyšší citlivosti
detekce než je měření radioaktivity a látky používané pro značení mohou generovat větší
množství signálu. Podstatnou výhodou neizotopových imunoanalýz je možnost jejich snazší
automatizace.
23
2.3 Enzymová imunoanalýza
Použití enzymu jako indikátoru připouští řadu možných varianty uspořádání imunoanalýzy.
Heterogenní enzymová imunoanalýza
Heterogenní enzymové imunoanalýzy jsou úplnou analogií izotopových imunoanalytických
metod. Enzym nahrazuje radionuklid s tím, že je chemicky (kovalentně) vázán buď na antigen
nebo protilátku. Uspořádání je možné jak kompetitivní tak nekompetitivní. Po proběhnutí
imunochemické reakce (inkubaci) je z reakční směsi obvykle odstraněna volná frakce
indikátoru většinou s využitím pevné fáze. Následuje přídavek enzymového substrátu a po
pevně určené době je reakce mezi enzymem a substrátem zastavena (např. přidáním "stop"
činidla) a spektrofotometricky je měřeno zeslabení monochromatického světla roztokem.
Pomocí kalibrační křivky lze poté odečítat koncentrace analyzovaných vzorků.
Homogenní enzymová imunoanalýza
Homogenní enzymové imunoanalýzy využívají efekty, které měření radioaktivity jako
detekčního signálu neumožňuje. Příkladem může být například situace, kdy lze vlivem
stérických podmínek během imunochemické reakce ovlivnit aktivitu enzymového konjugátu a
tím i rychlost přeměny enzymového substrátu na produkt. Vzorek obsahující stanovovanou
látku je v reakční směsi smíchán s indikátorem, kterým je konjugát vhodného enzymu se
stanovovaným antigenem. V kompetitivní reakci pak spolu oba soutěží o limitované množství
vazebných míst protilátky. Část enzymového konjugátu zůstává volná (její množství je závislé
na množství stanovované látky v analyzovaném vzorku) a může tak reagovat se substrátem.
Frakce konjugátu navázaná na protilátkou pak, vzhledem k zastínění aktivního centra enzymu,
enzymovou aktivitu nevykazuje (Obrázek 2.4).
24
Obrázek 2.4 Homogenní enzymová imunoanalýza - stínění aktivního místa enzymu
Enzymová aktivita je tedy tím vyšší, čím větší je množství stanovovaného antigenu v
analyzovaném vzorku, protože na protilátku se ho naváže více a naopak v nenavázané formě
zůstane více enzymového konjugátu. Enzymová aktivita v reakční směsi je tedy přímo úměrná
množství analyzovaného antigenu. Z hlediska provedení jsou homogenní EIA jednoduché,
avšak mnohem méně citlivé než metody heterogenní.
Enzymové konjugáty
Klíčovým problémem EIA je právě příprava vhodných enzymových konjugátů, tedy látek, kde
je enzym chemicky vázán na stanovovaný antigen nebo protilátku. Základní podmínkou
úspěšné EIA je rovněž výběr vhodného enzymu, který musí splňovat řadu obecných
podmínek:
musí mít vysoké číslo přeměny,
aktivita enzymu musí být přesně a snadno měřitelná
enzym musí zachovávat enzymovou aktivitu po vazbě na antigen nebo protilátku
(heterogenní EIA),
u homogenních EIA musí být enzymová aktivita výrazně modulována vazbou
konjugátu na protilátku
enzym musí být snadno dostupný
enzym se nesmí vyskytovat v tělní tekutině, ve které je prováděno vyšetření
25
U homogenních EIA se jako enzymy používají například glukozo-6-fosfátdehydrogenáza
nebo malátdehydrogenáza. Nejčastěji používanými enzymy v heterogenní EIA jsou křenová
peroxidáza nebo alkalická fosfatáza.
Křenová peroxidáza katalyzuje reakci peroxidu vodíku s vhodným substrátem, který se
oxiduje na barevný produkt. Substráty jsou například TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidin),
ABTS (2,2' azino-bis-(3-etylbenzthiazolin-6-sulfonát) nebo OPD (o-fenylendiamin).
Alkalická fosfatáza v enzymatické reakci štěpí esterickou vazbu kyseliny fosforečné (např.
štěpí bezbarvý para-nitrofenylfosfát na žlutý para-nitrofenol, fotometrická detekce při 420
nm). Štěpením umbelliferylfosfátu vzniká umbelliferon, který fluoreskuje a dá se měřit
fluorometricky.
Detekce enzymatických imunoanalýz
Kolorimetrická (fotometrická) detekce je nejrozšířenější typ detekce u klasických
enzymoimunoanalýz.
Principem
detekce
je
zeslabení
intenzity
světelného
toku
monochromatického světla zbarveným roztokem produktu enzymatické reakce. Přístroje pro
měření absorbance se nazývají spektrofotometry.
Nefelometrická detekce využívá enzym lysozym a jako substrát peptidoglykany. Jako
substrátu bylo využito fragmentů buněčných stěn bakterií Micrococcus luteus. Paprsek
monochromatického světla (např. laserového zdroje) je rozptylován tzv. Faraday-Tyndalovým
jevem v zakaleném roztoku částic. Míra rozptylu světla je úměrná množství částic, tedy
aktivitě
enzymu.
Moderní
nefelometry
jsou
vybaveny
laserovými
zdroji
přísně
monochromatického světla, což zjednodušuje další konstrukci přístrojů.
Fluorometrická detekce umožňuje dosažení vyšší citlivosti při použití stejného enzymu,
například díky opakovanému generování signálu v krátkém časovém úseku. Dosahovaná
citlivost metody je ovšem omezena fluorescenčním pozadím biologického materiálu v reakční
směsi. To je způsobeno přirozenou fluorescencí séra nebo plazmy (vlivem přítomností
sérových proteinů, nebo NADH a bilirubinu). Detekce emitovaného světelného záření může
26
být poznamenána i zhášením fluorescence vlivem přítomností některých molekul, které
absorbují záření (excitační nebo emitované).
I v homogenních EIA byly využity fluorogenní substráty. Např. redukcí vzniklý NADH
emituje fluorescenční záření mezi 450 až 470 nm.
Tento nebo obdobný princip detekce je využíván v celé řadě analytických systémů, například
technologie MEIA na analyzátorech IMx a AxSYM firmy Abbott.
Luminometrická detekce enzymo- imunoanalytických metod je odvozena od principu
bioluminiscence, která je vždy s nějakou enzymatickou reakcí spojena. V tomto případě se
však jedná o chemiluminiscenci, kdy je světelné záření produkováno vlivem průběhu
chemické reakce iniciované působením enzymu. V praxi jsou i pro tyto účely
nejpoužívanějšími enzymy alkalická fosfatáza a křenová peroxidáza. Pro první z nich jsou
jako substrát využívány např. látky na bázi adamantyl 1,2 dioxetan arylfosfátů. Ty po
odštěpení fosfátové skupiny vytvářejí nestabilní anion, který se stabilizuje vyzářením světla.
Tento princip je využíván například u analyzátorů řady IMMULITE firmy DPC nebo
analyzátorů Access firmy Beckman - Coulter.
Při použití enzymu křenové peroxidázy, dochází v přítomnosti peroxidu vodíku k oxidaci
luminolu. Při reakci je však produkce světelného záření slabá. Byla ale objevena řada látek,
které zesilují a prodlužují produkci světelných kvant této oxidační reakce. Takovým
zesilovačem je např. luciferin nebo benzthiazoly, které mají ještě vyšší kvantové výtěžky.
Reakce dává s použitím těchto zesilovačů kontinuální výstup světelného signálu. Signál tak
může být měřen i s časovým odstupem. Tyto metody jsou pak označovány jako zesílená
chemiluminiscence "enhanced chemiluminescence". Tento systém byl propracován firmou
Amersahm a byl dodáván na trh pod označením Amerlite. Nyní tento princip využívá
analyzátor Vitros ECi firmy Ortho-Clinical Diagnostics.
27
2.4 Luminiscenční imunoanalýza
Luminiscence
Luminiscence je fyzikální jev, kdy látka, označovaná jako luminofor, je schopná produkovat
světelné záření. Toto generování světelných záblesků je obvykle iniciováno změnou vnějších
podmínek (pH, teploty, elektrického potenciálu apod.), která ovlivní fyzikálně-chemické
vlastnosti některých molekul luminoforu. Dříve stabilní látka se tak dostane do energeticky
nestabilního stavu s přebytkem vnitřní energie, kterou samovolně uvolňuje vyzářením
elektromagnetického záření o vlnové délce v oblasti viditelného světla. Tímto procesem se
molekula látky opět stabilizuje, i když v pozměněné podobě.
K měření luminiscence slouží přístroje nazývané luminometry. Jak vyplývá z podstaty jevu,
nevyžaduje měření luminiscence žádný excitační zdroj záření, měří se pouze světlo
produkované luminoforem.
Jako luminoimunoanalytické metody lze označit ty metody, u kterých je pro značení
indikátoru imunochemické reakce použit luminofor. Jak bylo uvedeno výše, jsou však mezi
luminoimunoanalýzy často zahrnovány rovněž enzymové imunoanalýzy s luminometrickou
detekcí. Imunoanalýzy zakončené detekcí luminiscenčního záření lze tedy rozdělit na dvě
kategorie:
enzymové imunoanalýzy se substrátem produkujícím luminiscenční záření
imunoanalýzy s luminiscenčním indikátorem
Základní principy uplatňované u LIA jsou modifikací těch, které byly zmíněny v obecné části
o imunoanalytických metodách. Z hlediska použitého luminoforu je možno LIA metody
rozdělit na metody bioluminiscenční a chemiluminiscenční.
28
Bioluminiscenční metody
Bioluminiscenční metody používají luminofory biologického původu. Vzhledem k tomu, že
většinou využívají k inicializaci enzymatické reakce, je možno zařadit je mezi EIA s
luminiscenční detekcí.
Chemiluminiscenční metody
Chemiluminiscenční metody využívají jako luminofory různé látky, které jsou k produkci
světelného záření iniciovány na základě průběhu chemické reakce. Produkce světla chemickou
reakcí je časově omezena a je proto nezbytné, aby měření proběhlo v určitém definovaném
okamžiku.
Mezi látky, které vykazují luminiscenci, patří např. již zmíněný luminol, izoluminol,
lucigenin, sulfonamidy nebo estery akridinových barviv. Luminiscence umožňuje detekci
látek v koncentraci do 10 18 mol.L
-1
. V praxi je tento princip uplatněn v analyzátoru
ACS:180 původní firmou Ciba Corning, nyní je dodáván firmou Bayer ve variantě ACS:180
SE nebo automat ADVIA Centaur a systému Architect firmy Abbott.
Elektrochemiluminiscenční metody
K vybuzení chemiluminiscnece indikátoru je u těchto metod používán elektrický impuls.
Příkladem může být indukce luminescence rutheniových iontů, komplexně vázaných v
tris(bipyridylu), která probíhá na povrchu platinové elektrody (Obrázek 2.5). Molekulová
hmotnost rutheniového komplexu (pod 1 kDa) umožňuje přípravu indikátoru, který
neovlivňuje interakci protilátka-antigen. Tento princip využila například firma Roche u svých
analyzátorů řady Elecsys nebo Modular.
Imunoanalytická reakce probíhá na pevné fázi, která je tvořena magnetickými mikročásticemi
s navázaným streptavidinem. Na něj se váže biotinylovaný antigen nebo vychytávací
29
protilátka (v závislosti na kompetitivním nebo nekompetitivním typu reakce). Detekční
protilátka je označena rutheniovým komplexem. Po proběhlé imunochemické reakci je reakční
směs nasáta do měřící buňky, kde jsou magnetické částice přichyceny permanentním
magnetem a promyty pufrem.. Na elektrody měřící buňky je přiveden budící elektrosignál a
nastartována elektrochemická reakce. Během ní dochází k oxidaci iontů Ru+2 na Ru+3 a
následně jejich opětovné redukci na energeticky excitované ionty Ru+2, které se přebytečné
energie zbavují emisí luminiscenčního záření o vlnové délce 620 nm. Cyklická reakce je
podmíněna oxidací a následnou redukcí přítomného tripropylaminu (TPA). Celý cyklus je
vratnou reakcí a může tak být několikanásobně opakován, čímž se produkce luminiscenčního
záření podstatně zvyšuje. Chemiluminiscence je přímo úměrná množství analytu tvořícího
imunokoplex v rozmezí téměř 6 řádů.
Obrázek 2.5 Elektrochemiluminiscence - generování a detekce signálu
2.5 Fluorescenční imunoanalýza
Fluorescence a její detekce
Fluorescence je fyzikální jev, kdy látka - fluorofor - je schopna absorbovat energii dodávanou
ve formě elektromagnetického záření, (tzv. excitační záření), a následně vyzařovat
elektromagnetické záření o jiné vlnové délce (emisní záření). Energetická spektra excitačního
i emisního záření úzce souvisí se základní strukturou látky, přičemž emisní spektrum je
30
posunuto do oblasti vyšších vlnových délek než spektrum excitační. Fotony absorbované
souborem molekul jsou totiž z části degradovány na tepelnou energii, z části jsou vyslány jako
fotony o nižší energii (vyšší vlnové délce), než jakou měl foton původní. Rozdíl maxim
excitačního a emisního fluorescenčního spektra se nazývá Stokesův posun. Podíl počtu
emitovaných fotonů k počtu fotonů absorbovaných se nazývá kvantový výtěžek fluorescence
(n) a může nabývat hodnot 0 1.
Požadavky na fluorescenční indikátor vhodný pro použití ve FIA lze shrnout do tří podmínek:
vysoká molární absorbance
vysoký kvantový výtěžek
velký Stokesův posun
Nejužívanějším fluorescenčním indikátorem je fluorescein. Exitační maximum má při 490 nm
a emisní maximum při 520 nm. Některé sérové komponenty, (např. albumin-bilirubinový
komplex), při těchto vlnových délkách interferují. Interference při měření biologických
materiálů se mohou silně projevovat také rozptylem záření nebo jeho zhášením. Proto je
měření fluorescence silně ovlivňováno prostředím, ve kterém se provádí. Klasická
fluorescence vykazuje po krátkém excitačním osvitu určitou dobu dosvitu fluorescenčního
signálu, která je rozdílná pro různé látky. Tento fluorescenční dosvit se u látek běžně
vyskytujících v séru pohybuje v rozmezí 1 – 20 ns. U běžně používaných fluorescenčních
indikátorů se pohybuje rovněž v řádu nanosekund (fluorescein 4,6 ns). Emisní spektra z
různých fluorescenčních zdrojů séra tak mohou interferovat s emisním spektrem indikátoru
nejen vzhledem k podobné vlnové délce svých píků, ale překrývají se rovněž časově a nedají
se prakticky rozlišit.
Zcela zásadní přínos pro měření fluorescence má technika zvaná časově modulovaná detekce
fluorescence (“time resolved fluorescence measurement“ - TR fluorescence), založená na
použití nových fluorescenčních indikátorů - lanthanidových chelátů - zejména europia,
samaria, terbia nebo thulia (Obrázek 2.6).
31
Obrázek 2.6 TR-fluorescence - časový průběh měření
Jejich zavedením se podařilo překonat problém fluorescenčního pozadí média, ve kterém se
fluorescence měří. Jedná se o indikátory s velmi dlouhou fluorescencí, přičemž její detekce je
časově modulovaná. Krátký světelný impuls ze světelného zdroje (xenonové výbojky) nebo
pulzního laseru slouží jako excitační zdroj a fluorescence je pak měřena s určitým časovým
odstupem.
Dosvit fluorescenčního indikátoru na bázi chelátů vzácných zemin je mezi 10 – 1000 µs.
Excitační spektrum má velmi široký pík, emisní pík pak velmi úzký. Navíc Stokesův posun
proti běžným fluorescenčním indikátorům je mnohem větší, pík emisního spektra je posunut
až do červené oblasti viditelného spektra. Měření fluorescence, po časové prodlevě v intervalu
400 až 800 µs po osvitu, oddělí parazitní fluorescenci sérových komponent, které mají
podstatně kratší dosvit. Excitační osvit se opakuje tisíckrát za sekundu. Problematikou TR
fluorescence a její aplikací v imunoanalýze s využitím lantanidových chelátů jako indikátorů
se velmi široce zabývala firma Wallac (ve spojení s firmami LKB a Pharmacia). Byl vyvinut
imunoanalytický systém DELFIA, později využitý i u automatického analyzátoru
AutoDELFIA. Tímto systémem ke možno v běžné reakční směsi detekovat koncentrace 10 -17
mol.L-1 Eu3+, což vysoce převyšuje detekční mez běžných fluorescenčních měření bez časové
modulace (10 -11 - 10 -12 mol.l -1).
32
Imunoanalýzy s detekcí emisního fluorescenčního záření lze opět rozdělit na dvě kategorie:
enzymové imunoanalýzy se substrátem produkujícím fluorescenční záření
imunoanalýzy s fluorescenčním indikátorem
Základní principy uplatňované u FIA jsou modifikací těch, které byly zmíněny v obecné části
o imunoanalytických metodách.
Heterogenní fluoroimunoanalýza
Výhodou heterogenních metod je oddělení sérové komponenty reakční směsi před měřením
fluorescence, což zlepšuje odstup signálu od šumu a zlepšuje tím citlivost metody. Mohou být
realizovány jak v kompetitivním, tak v nekompetitivním uspořádání. Jako pevné fáze pro
separaci jsou užívány např. polyakrylamidové kuličky, na něž jsou kovalentně vázány
příslušné specifické protilátky nebo antigeny. Specifická hustota kuliček je blízká jedné i
refrakční index je blízký indexu vody, a proto rozptyl světla na nich je zanedbatelný.
Prakticky se stanovení provádí smícháním vzorků séra s antigenem značeným (např.
fluoresceinem nebo 7-hydroxykumarinem) a přidáním ke kuličkám s navázanou protilátkou.
Po inkubaci a oddělení volné frakce se kuličky resuspendují v pufru a měří se fluorescence.
Homogenní fluoroimunoanalýza
Jedním z příkladů této realizace imunoanalytických metod je Fluorescence Polarization
Immunoassay – FPIA (Obrázek 2.7). Tato kvantitativní analytická metoda využívá kombinace
dvou principů - kompetitivní imunochemické reakce mezi stanovovaným analytem a
vhodným indikátorem o vazebná místa na specifické protilátce a měření vertikálně
polarizovaného fluorescenčního záření emitovaného po excitaci vzorku rovněž polarizovaným
světlem.
Tato technologie je použitelná pro určení koncentrace malých molekul. Ty se totiž v roztoku
otáčejí velkou rychlostí. Pokud je molekula označena vhodnou fluorescenční látkou
33
(fluoresceinem) a je excitována polarizovaným světlem vhodné vlnové délky, emituje
fluorescenční záření do mnoha směrů. Detekce ve stejné polarizované rovině naměří jen
malou část fluorescence. Pokud tato malá molekula obsadí vazebné místo na protilátce, dojde
k vytvoření komplexu (velké molekuly), která se otáčí pomalu, což má za následek zvýšení
fluorescence detekované v polarizované rovině.
V kompetitivním uspořádání metoda poskytuje možnost stanovit koncentrace analytu bez
nutnosti separace volné a vázané frakce fluorescenčního indikátoru. Postup byl vyvinut firmou
Abbott a je využíván v přístrojích TDx, IMx nebo AxSYM.
Obrázek 2.7 Princip kompetitivní FPIA
Mezi nejpokročilejší technologie homogenní imunoanalýzy patří technologie TRACE (Time
Resolved Amplified Cryptate Emission) vyvinutá firmou CIS (Obrázek 2.8). Jako
fluorescenční indikátory se používají kryptáty vzácných zemin, které vykazují dlouhotrvající
fluorescenci v řádu 10
- 1000 µs, což umožňuje použití časově modulované detekce
fluorescence. Ion europia (Eu+3) je inkorporován do kavity makropolycyklické sloučeniny
(trisbypyridine diaminu). Tato sloučenina je velmi stabilní a vykazuje výhodné fluorescenční
vlastnosti. Sloučeninu je možno excitovat světlem vlnové délky 307 nm, přičemž emisní
spektrum vykazuje píky i v oblasti červeného světla (od 550 do 720 nm).
34
Obrázek 2.8 Metoda TRACE
Kryptáty vzácných zemin je možno kovalentně vázat buď na antigen, nebo na specifickou
protilátku. K detekci imunochemické reakce v homogenním uspořádání je kromě fluorescence
využíván přenos energie mezi donorem a akceptorem světelného signálu. Transfer energie
mezi donorem a akceptorem se děje neradiativním transferem energie na krátkou
mezimolekulární vzdálenost (FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer) (Obrázek
2.9).
Obrázek 2.9 FRET -resonanční přenos energie fluorescence
35
Akceptor byl vybrán mezi rostlinnými proteinovými barvivy červených řas. Je jím
alophykocyanin o relativní m.h. 105 000 s maximální absorpcí světla mezi 600 a 650 nm. Při
dostatečném přiblížení donoru a akceptoru na vzdálenost pod 7,5 nm dochází k přenosu
energie z excitovaného donoru (kryptátu europia) na akceptor (alophykocyanin - XL 665). K
takovému přiblížení akceptoru a donoru dojde například při vytvoření komplexu obou
protilátek s antigenem během sandwichové metody se dvěma protilátkami, kdy je jedna
protilátka označena kryptátem a druhá alophykocyaninem. Charakteristika přenesené energie
je stejná jakou vykazuje donor. Přenáší se tedy dlouhotrvající charakteristika fluorescence
donoru a akceptor fluoreskuje rovněž v intervalu 10 - 1000 µs.
Měření fluorescence lze uspořádat tak, aby se začalo měřit v intervalu 50 - 400 µs od
excitace, a tím se vyhnout parazitním fluorescencím pocházejícím z matrice vzorku. Problém
zeslabení fluorescenčního signálu matricí vzorků se řeší měřením dvojice vlnových délek a to
fluorescence donoru při 620 nm a akceptoru při 665 nm. Signál kryptátu Eu+3 slouží jako
vnitřní standard pro korekci absorbance reakčního media v reálném čase. Simultánní měření
obou signálů umožňuje vypočítat poměrový signál 665/620 nm. Množství analytu v reakční
směsi určí, kolik molekul analytu se naváže mezi obě protilátky s navázaným akceptorem a
donorem. Intenzita poměrového signálu 665/620 nm je pak přímo úměrná množství měřeného
analytu ve vzorku. Systém je chráněn i pro případ vysokých koncentrací analytu ve vzorku,
neboť poměrový signál je měřen kineticky od zahájení analytické reakce (tzn. že je sledován
poměr 665/620 nm jako funkce času). Kinetické měření je citlivější, přesnější a umožňuje
přerušit měření v případě příliš velké rychlosti reakce (vysoké koncentrace analytu) a zahájit
nové měření po zředění vzorku. Systém tak představuje univerzální homogenní imunoanalýzu.
Aplikovatelné jsou jak kompetitivní, tak nekompetitivní metody. Díky stabilitě indikátoru,
kryptátu Eu+3, detekci dvou nezávislých signálů detekovaných časově modulovou
fluorescencí, z nichž jeden signál koriguje optickou transparenci reálného vzorku, kinetickému
způsobu měření a homogennímu formátu s minimálním počtem pipetovacích kroků, pracuje
systém s maximální přesností a robustností. Pro praktické provádění imunoanalýz
využívajících tento originální princip homogenní FIA byl vyvinut analyzátor KRYPTOR
dodávaný nyní firmou B.R.A.H.M.S.
36
3. Návaznost a standardizace
imunoanalytických metod
Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš
3.1 Návaznost měření
Obdobně jako v každé oblasti aplikované metrologie je i v případě provádění
imunoanalytických kvantitativních měření různých veličin (analytů) základním požadavkem
zajištění jednotnosti a správnosti měření. Důsledkem tohoto požadavku pak je dosažení
smysluplné úrovně vzájemné srovnatelnosti výsledků a to jak mezi výsledky měření stejné
veličiny prováděnými v jedné laboratoři ale v různém čase, tak také při měřeních
realizovaných v různých laboratořích.
Předpokladem pro dosažení takového stavu je, aby různé rutinní postupy používané k měření
určité veličiny měly vazbu na mezinárodně uznávaný a platný referenční materiál. Tato vazba
je založena na neporušené hierarchii měřicích postupů a kalibrátorů, směřující od primárního
referenčního materiálu nejvyššího metrologického řádu ke kalibrátorům řádů nižších. V této
nepřerušené posloupnosti je tak hodnota veličiny referenčního materiálu pomocí
odpovídajících měřicích procedur postupně přenášena na kalibrátory nižšího řádu a končí až
na úrovni měřicího postupu, určeného k rutinnímu měření běžných vzorků. Hodnota
primárního standardu je pomocí primární referenční metody odvozena přímo od odpovídající
jednotky SI. Současně s přenosem hodnot kalibrátoru je na každém stupni stanovena nejistota
těchto hodnot, která se postupně, směrem ke kalibrátorům nižšího řádu, zvyšuje. Existence
výše popsané posloupnosti je základem vlastnosti, označované pojmem metrologická
návaznost. Ve smyslu definice podle mezinárodního metrologického slovníku (VIM ) se
metrologickou návazností rozumí vlastnost výsledku měření nebo hodnoty etalonu, která
37
umožňuje určit jejich vztah k uvedeným referencím, zpravidla národním nebo mezinárodním
etalonům, a to pomocí nepřerušeného řetězce porovnávání, jejichž nejistoty jsou uvedeny.
Schematicky je model hierarchie kalibrací a návaznosti na jednotku SI zobrazen na Obrázku
3.1.
Obrázek 3.1 Hierarchie kalibrace a metrologická návaznost na SI. (převzato podle ČSN EN ISO
17511:2004; CGPM – Všeobecná konference pro váhy a míry, BIPM – Mezinárodní úřad pro váhy a
míry, NMI – národní metrologický institut, ARML – akreditovaná referenční měřicí laboratoř, ML –
laboratoř výrobce)
Bohužel v případě měření, která bývají realizována pomocí imunoanalytických metod, je
prokázání návaznosti často velmi problematickou úlohou. V praxi je stanovováno mnoho
veličin (analytů), pro které nejsou dostupné certifikované primární referenční materiály ani
měřící postupy. Díky tomu nemohou být tyto veličiny ani „kompletně“ návazné až na
jednotku SI a jejich návaznost končí v hierarchii kalibrací na některém z nižších stupňů. Těmi
mohou být referenční materiály konvenčně přijaté nějakou obecně uznávanou autoritou
(například organizací WHO), nebo v horším případě jen pracovní kalibrátory výrobce IVD.
38
Problematikou zajišťování návaznosti měření v oblasti laboratorní medicíny se zabývá Joint
Commitee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM), fungující na základě společné
deklarace tří mezinárodních organizací – CIPM, IFCC a ILAC. Cílem JCTLM je podpořit
dosažení srovnatelnosti a standardnosti výsledků měření v laboratorní medicíně v zájmu
naplnění požadavků směrnice Evropské komise 98/79/EC (EC IVDD). Jedna ze dvou
pracovních skupin JCTML-WG1 „Referenční materiály a referenční postupy“ poskytuje
přehledy, seznamy, charakteristiky a literární informace o existujících referenčních
materiálech a metodách. V databázi přístupné na stránkách JCTLM
jsou k dispozici
informace o referenčním materiálech a referenčních metodách [http://www.bipm.org/jctlm/].
3.2 Standardizace metod
Standardem se obecně rozumí určovaná látka (analyt) s deklarovanou koncentrací. Musí jít o
čistý, homogenní, stabilní preparát analyzované látky, který má v ideálním případě
definovanou strukturu a molekulovou hmotnost. Tato podmínka však v mnoha případech v
praxi nemůže být splněna. Lze proto hovořit o dvou skupinách standardů v závislosti na
vlastnostech látek, ze kterých jsou připravovány a pro jejichž stanovení jsou používány.
Do první skupiny patří látky se známým složením (tím i strukturou a molekulovou hmotností),
které mohou být produkovány chemickou syntézou s velmi vysokou čistotou (99,9%).
Příkladem mohou být jednodušší biologicky aktivní látky, jako jsou steroidy, thyreoidální
hormony nebo léky, které jsou komerčně dostupné v čisté formě. Tyto látky mohou sloužit pro
i přípravu primárních standardů nejvyšší metrologické kvality. Pracovní roztoky standardů
(kalibrátory pro měřicí metodu) je možno připravit rozpuštěním přesné navážky standardu v
přesně známém objemu vhodného rozpouštědla.
Do druhé skupiny patří látky, jejichž struktura naopak není úplně jednoznačně definovatelná.
Tyto látky není možné připravit chemickou syntézou a získávají se tak jinými postupy,
například izolací z biologických materiálů, často s obtížným zajištěním reprodukovatelnosti
výsledku. U těchto preparátů mohou nastávat problémy s homogenitou, znečištěním látkami s
příbuznými vlastnostmi, prekursory a metabolity. Takovéto látky nemohou být dostatečně
39
definovány chemickými a fyzikálními metodami, takže u nich není možné zajistit návaznost
na jednotku SI a pro numerické vyjadřování velikosti odpovídajících veličin jsou pak
používány mezinárodně dohodnuté jednotky (IU). Tak je tomu např. u řady složitějších
biologicky aktivních látek jako například proteinových či peptidických hormonů, nádorových
markerů bílkovinné povahy apod. Ze skutečnosti, že se v těchto případech nejedná o
adekvátně definované analyty pak vyplývá i fakt, že pravá hodnota měřené veličiny je v těchto
případech tudíž reálně neznámá.
Z hlediska použití standardu v imunoanalytické metodě je rovněž nutným požadavkem, aby se
jednalo o preparát, který je v maximální míře imunochemicky shodný s určovanou látkou.
Standardizace imunoanalytických metod
Pro analyty, které bývají stanovovány imunoanalytickými metodami, jsou referenční metody a
primární referenční materiály zatím dostupné pro měření koncentrací velmi omezeného počtu
látek nepeptidické povahy, jako jsou například:
celkový tyroxin (T4 celkový)
aldosteron
testosteron
17-β-estradiol
progesteron
kortizol
Pouze u těchto látek tak existuje předpoklad pro zajištění návaznosti jejich měření až na
jednotku SI. V ostatních případech (bez takovéto návaznosti) nelze dosáhnout dostatečné míry
jednotnosti a vzájemné porovnatelnosti výsledků měření. I když byly pro některé z těchto
látek připraveny a schváleny mezinárodní referenční materiály, není tato skutečnost vzhledem
k charakteru analytu automatickým předpokladem zajištění vzájemné porovnatelnosti
výsledků měření.
Vedle problémů spojených jednoznačným definováním stanovovaného analytu jako
chemického individua existují rovněž problémy spojené s přípravou vhodných pracovních
40
kalibrátorů a kontrolních materiálů a s jejich komutabilitou, projevující se například rozdílnou
imunoreaktivitou referenčních materiálů nebo kalibrátorů a měřených nativních vzorků.
Kalibrační materiály jsou často připravovány izolací z produkčních žláz a tkání a nejsou
například glykosylovány, zatímco zkoušené biologické materiály ano. Purifikace analytů po
jejich izolaci může vést k částečné nekontrolovatelné degradaci. I látky připravované
rekombinantními technikami, "pozměňují" často svoji strukturu, a v důsledku toho se zvyšuje
pravděpodobnost výrazných vlivů matrice.
Významnou roli pro zhoršenou porovnatelnost výsledků imunoanalytických metod sehrávají
rovněž skutečnosti vyplývající z přímé podstaty imunochemické reakce, tedy vazby specifické
protilátky a antigenu, ovlivněné nejen charakterem stanovovaného analytu, ale i vlastnostmi
použitých protilátek. Ovlivňujícími faktory mohou být například:
orientace protilátek k epitopům, nacházejícím se v málo stabilních oblastech
proteinových molekul, například v oblastech podléhajících proteolýze v podmínkách
in-vitro,
orientace protilátek k oblastem, které nejsou nositeli specifických fyziologických
vlastností molekul (hCG, TSH)
používání protilátek, které nejsou schopné reflektovat různý stupeň glykosylace, ale i
syalilace, sulfatace, degradace či agregace imunochemických analytů
různá úroveň glykosylace často typická pro specifické chorobné stavy a projevující se
často také přítomností různých izoforem imunochemického analytu (použité
analytické systémy nejsou obvykle schopné postihnout ani základní poměr
jednotlivých izoforem).
Konečně průběh imunochemické reakce může být poměrně zásadním způsobem ovlivněn také
samotnými reakčními podmínkami, jako jsou například pH, iontové síly, přítomnost
detergentů apod. Tyto vlivy nejsou někdy dostatečně známy a respektovány.
Ve svém důsledku jsou uvedené skutečnosti důvodem vysoké závislosti výsledků
imunochemických měření na použitém analytickém systému (kombinace použitých protilátek,
podmínky imunochemické reakce apod.). Z hlediska praktické aplikace tak u těchto metod
neexistují předpoklady pro obecně akceptovatelné jednotné hodnoty referenčních intervalů a
diagnostických rozhodovacích limitů.
41
4. Multiplexová imunoanalýza
Jindra Vrzalová
Multiplexové měření – tedy měření více analytů zároveň - je logickým řešením pro popis
komplexním fyziologických a patofyziologických dějů, kde nezáleží pouze na absolutní
koncentraci jednotlivých členů, ale na poměrech agonistů a antagonistů, faktorů a jejich
inhibitorů. Příkladem velmi komplexních regulací jsou cytokiny a růstové faktory. Cílem
multiplexových analýz je
popis zastoupení jednotlivých proteinů (deskriptivní proteomika),
studium vzájemných vztahů proteinů,
vyhledávání a validace biomarkerů,
vyhledávání cílů terapie a
klinická diagnostika.
Přínosem multiplexového typu měření je
finanční efektivita,
redukce potřebného času a práce pro analýzy,
snížení objemu vzorku a
validita dat při porovnávání poměrů hladin jednotlivých proteinů.
Multiplexové analytické technologie v oblasti proteinů jsou založeny na třech principech:
imunoanalýza,
separační technologie (chromatografie nebo 2D elektroforéza) a
hmotnostní spektrometrie
nebo na jejich kombinacích.
V následujícím textu se budeme zabývat pouze multiplexovými přístupy založenými na
imunoanalytických postupech. Představené technologie mají sloužit jako přehled principů,
zvláštní pozornost je věnována technologii xMAP. Konkrétní chemikálie, reagencie a přístroje
42
jsou dosažitelné od mnoha výrobců, jejich spektrum se stále vyvíjí a nejsou zde proto
uváděny. Multiplexové měření je dnes nedílnou součástí mnoha výzkumů a v některých
oblastech se začíná uplatňovat i v klinické rutinní praxi.
Obrázek 4.1 Srovnání několika typů multiplexových metod.
4.1 Planární mikroarraye – proteinové čipy
Proteinové čipy se vyvinuly z technologií připravených původně pro analýzu DNA. Protilátky
nebo antigeny jsou naspotovány na planární povrch – silikonových čipů nebo skleněných
sklíček s nitrocelulózovou membránou (FAST slides). Čipy jsou tedy prostorově uspořádané
reagencie na pevném povrchu, v připadě imunoanalýzy obsahuje každá oblast neboli spot
definovanou protilátku (antibody microarrays) nebo antigen. Přesná pozice (spot) specifické
protilátky/antigenu na čipu definuje typ analytu, který je stanovován. Studované proteiny jsou
kvantifikovány díky různým principům vytvářejícím signál a jeho zesílením – kolorimetricky,
radioaktivitou, fluorescencí, chemiluminiscencí, enzymovými reakcemi atd. – a intenzita
signálu je měřena určeným typem scanneru nebo kamery. Vyhodnocení vyžaduje speciální
43
software, který vyhodnotí intenzitu signálu v daném spotu a porovná ji s kalibrační křivkou,
pozitivní a negativní kontrolou popř. alespoň s ostatními spoty na čipu.
Čipové technologie můžou být rozděleny podle jejich filozofie přístupu:
přímé technologie (forward phase arrays),
reverzní technologie
čipy pro studium proteinových interakcí.
Na čipech přímé technologie je inkubován vždy jeden vzorek na čipu, takže může být
současně stanoveno větší množství proteinů. Na reverzních čipech je imobilizováno větší
množství různých vzorků. V jednom kroku tak může být stanoven jeden konkrétní protein ve
velkém množství vzorků zároveň. Tato technika je také používána s malými kousky tkání
nebo kousků tkání získaných mikrodisekcí.
Obrázek 4.2 Protilátkové mikroarraye
44
Arraye na mikrotitračních destičkách
Jsou přímou modifikací ELISové technologie. V každé jamce destičky je na dně naspotováno
až několik specifických protilátek, které vyváží sledované proteiny ze vzorku proteiny a na
principu sandwichové reakce je umožněna chemiluminiscenční nebo fluorescenční detekce.
Zástupcem je např. Thermo Scientific SearchLight Protein Array technologie, která umožňuje
z 50 µl vzorku zachytit až 16 různých analytů, které jsou detekovány přidáním biotinylované
protilátky, následované přidáním křenové peroxidázy a chemiluminiscenčního substrátu.
Produkce světla je detekována CCD kamerou a analyzována pro každý spot speciálním
softwarem. (www.piercenet.com/products; Moody M.D., 2001).
4.2 Multiplexové reakce na mikrokuličkách (Bead
Arrays)
Mikrokuličky jsou velmi zajímavou alternativou k planárnímu uspořádání čipů. Používají
detekci průtokovou cytometrií a jsou vhodné především pro projekty, kde je již studováno
měnší množství proteinů – tedy pro studie více cílené než studie na proteinových čipech.
Výstupem těchto stanovení je skutečně kvantitativní určení koncentrace proteinu, na rozdíl od
čipů, kde jsou výsledky často pouze kvalitativní nebo semikvantitativní.
Technologie FlowCytomix
Technologie Flow Cytomix je založena na sadě mikrokuliček o dvou velikostech (4 μm & 5
μm). Každá ze dvou velikostí mikrokuliček je dále rozlišena různými intenzitami
fluorescenčního barviva. Na každé sadě mikrokuliček je navázána specifická protilátka, druhá
protilátka je značená fykoerytrinem. Měření probíhá na běžném průtokovém cytometru a data
se vyhodnocují speciálním programem. Toto uspořádání umožňuje stanovit zároveň
koncentrace 20 analytů.
45
Technologie xMAP
Princip technologie xMAP
Multi-analyte profiling technologie (xMAP) je založena na sadě 5,6 μm polystyrenových
mikrokuliček. V této sadě je 100 populací mikrokuliček, které se liší vnitřním spektrálním
kódem vytvořeným kombinací dvou fluorescenčních barviv v různém poměru. Multiplexová
analýza je založena na specifických protilátkách navázaných na jednotlivé populace
mikrokuliček. Protože jsou mikrokuličky rozlišené spektrálním kódem můžou být
kombinovány v analýze a umožnují tak stanovení teoreticky až 100 analytů v jedné reakční
jamce. Množství stanovovaného proteinu je určeno na základě druhé protilátky značené
fluorescenční molekulou. Reakce tedy probíhá na principu sendviče.
Obrázek 4.3 Rozlišení mikrokuliček pro xMAP technology (zdroj: www.panomics.com)
Měření probíhá na speciálním průtokovém cytometru - přístroj Luminex. Mikrokuličky z
reakční jamky jsou nasáty do přístroje, kde protékají v nosném proudu jedna za druhou
mezi dvěmi lasery. Fluorescenční signál po excitaci prvním laserem určuje spektrální kód
kuličky – tedy druh měřeného analytu – a fluorescenční signál po excitaci druhým laserem
určuje množství druhé protilátky, tedy množství analytu.
46
Obrázek 4.4 Princip xMAP měření ( zdroj obrázku www.panomics.com)
Pro imunochemickou reakci se používají mikrodestičky s filtračním dnem. Nenavázané
látky se z reakce odmývají dnem destičky přes filtry, které udržují mikrokuličky s
navázanými proteiny v jamce. Koncentrace jednotlivých analytů je vypočtena na základě
kalibračních křivek zkonstruovaných pro každý měřený protein.
Všechny další imunoanalytické přístupy jsou také použitelné na xMAP platformě např.
kompetitivní imunoanalýza, receptor-ligandová analýza nebo pro stanovení protilátek
antigen navázaný na mikrokuličky. Kromě imunoanalytických stanovení umožňuje tato
platforma také analýzu DNA nebo RNA molekul, které jsou přímo nebo po jejich
amplifikaci multiplexově detekovány specifickými sondami vázanými na mikrokuličky.
Obrázek 4.5 Protilátky navázané na mikrokuličky s vyvázanými proteiny ze vzorku a po přidání
značené druhé protilátky (zdroj obrázku www.rndsystems.com)
47
Obrázek 4.6 Příklad z měření xMAP technologií – Multiplexová analýza 10 cytokinů
Obrázek
4.7
Kalibrační
křivky
pro
13-plex
panel
lidských
http://www.biotek.com/resources/articles/workflows-luminex-xmap-assays.html)
48
hormonů
(Zdroj:
Reagencie pro xMAP technologii
xMAP je otevřená technologie a v současnosti lze nakoupit reagencie pro imunoanalýzu od
mnoha světových výrobců. Bohužel pro společné stanovení nelze kombinovat látky, které
mají velmi odlišné biologické koncentrace, pokud jejich protilátky vykazují zkříženou
reaktivitu a pokud mají příliš rozdílné požadavky na preanalytickou fázi.
Obrázek 4.8 Přístroj Luminex 100 (zdroj: www.luminexcorp.com)
Obrázek 4.9 Princip přímé kvantifikace RNA na multiplexovém principu na Luminexové platformě
(zdroj obrázku -www.panomics.com)
49
Nové typy technologie xMAP
V současnosti jsou již k dispozici reangencie pro Luminexovou platformu obsahující
magnetické mikrokuličky (MagPlex®), což umožňuje jednodušší separaci během reakčních
kroků a především jejich automatizaci na jednoduchých promývacích stanicích nebo jako
součást pipetovacích automatů.
FlexMAP technologie jako další generace multiplexových přístrojů od fy. Luminex umožňuje
přidáním třetí rozlišovací barvy do mikrokuliček měření až 500 analytů zároveň v jedné
analýze, což při použití 96-jamkové mikrotitrační destičky znamená možnost až 64000 testů
za 45 minut.
Zcela novým konceptem od fy. Luminex je přístroj MAGPIX. Ten umožní měření až 50 testů
současně v jednom reakčním objemu a měření na tomto přístroji je založeno na principu CCD
zobrazovací technologie na rozdíl od přístrojů řady Luminex xMAP.
4.3 Laboratoř na čipu (Lab-on-a-chip)
S tlakem na vývoj point-of-care testů dochází k stále vyšší míře miniaturizace laboratorních
technologií. Miniaturizace vede k finančním úsporám, šetří životní prostředí a vede k vyšší
dostupnosti a mobilitě technologií. Miniaturizace vyžaduje úplnou integraci všech kroků v
imunoanalytickém stanovení a její budoucnost je v kombinaci s multiplexovými
technologiemi. Laboratoř na čipu (LOC) je zařízení, které integruje laboratorní postupy na
ploše o velikosti milimetrů nebo několika málo čtverečných centimetrů. Často je využívána
tzv. mikrofluidika
neboli pohyb kapalin v prostorách mikro čipu. Aby mohl být
mikrofludický obvod na čipu použit pro analýzu, musí obsahovat: mikroskopicky malé ventily
(rozváděcí nebo uzavírací), mixéry pro míchání tekutin, mikroreaktory, senzory, oscilátory a
výměníky tepla. Princip laboratoře na čipu je dnes aplikován pro miniaturizaci imunoanalýz,
biochemických reakcí i PCR a dalších genetických technologií. Cílem miniaturizace je tzv.
µTAS (micro total analysis system) – to je systém, který by integroval odebrání vzorku,
50
transport a před analytickou úpravu vzorku, chemickou reakci a separaci i detekci reakce na
jednom čipu .
Větším kolegou těchto technologií je systém Avantra, který umožňuje sendvičovou
imunoanalýzu 40 analytů v jednom vzorku. Základem je běžný čip s naspotovanými
protilátkami, který je ale uzavřen uvnitř plastické schránky/čipu (MAX BIOCHIP®)
obsahujícího vše potřebné k analýze: kanálky, senzory, komory pro reagencie („Suché“
biotinylované protilátky, streptavidin, promývací pufr). Max biochip je vložen do přístroje a
poté je nastříknut vzorek – samotným přístrojem neprotéká žádná tekutina, celá reakce
probíhá uvnitř max biochipu. Vyhodnocení reakce probíhá CCD kamerou detekující signál ze
spotů na čipu.
4.4
Literatura 4
1. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody
arrays: Nature Reviews Drug Discovery 5 (4), pp. 310-320, 2006
2. Moody, M.D., Van Arsdell S.W., Murphy K.P., Orencole S.F.,. Array-based ELISAs for high throughput
analysis of human cytokines: BioTechniques (31)1, pp. 186-195, 2001
3. Stoll D., Bachmann J., Templin M.F., Joos T.O., Microarray technology: an increasing variety of screening
tools for proteomic research, Drug discovery today: Targets 3 (no.1), pp. 24-31, 2004
4. Zhu H, Snyder M. Protein chip technology. Curr Opin Chem Biol. 2003 Feb;7(1):55-63. Review. PubMed
PMID: 12547427.
5. Poetz O., Schwenk J.M., Kramer S., Stoll D. et al., Protein microarrays: catching the proteome, Mechanisms
of Ageing and Development 126, pp. 161-167, 2005
6. http://www.raybiotech.com/protein_array.asp#3
7. http://www.whatman.com/FASTQuant.aspx
8. http://www.aushon.com/SearchLight-Immuno-Assay-Kits.php
9. http://www.rndsystems.com/product_detail_objectname_multiplex_assay_product.aspx
10. Kellar K.L., Iannone M.A., Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays, Exp Hematol 30 (11)
pp. 1227-37, 2002
11. http://www.luminexcorp.com/
12. http://www.millipore.com/drugdiscovery/dd3/map_portfolio
13. http://www.invitrogen.com/
14. http://www.bendermedsystems.com/flowcytomix--47
15. http://www.biotek.com/resources/articles/workflows-luminex-xmap-assays.html
51
16. Lim C.T. et Zhang Y., Bead-based microfluidic immunoassays: the next generation: Biosensors and
bioelectronics 22, pp.1197-1204, 2007
17. www.gene-quantification.de/ lab-on-chip.html
18. časopis Lab on a chip dostupný na http://pubs.rsc.org/en/Journals/JournalIssues/LC
19. Sista RS, Eckhardt AE, Srinivasan V, Pollack MG, Palanki S, Pamula VK., Heterogeneous immunoassays
using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 2008 Dec;8(12):2188-96. Epub 2008
Oct 14. PubMed PMID: 19023486; PubMed Central PMCID: PMC2726047.
20. http://www.avantrabio.com/
21. Tomoya Tachi, Noritada Kaji, Manabu Tokeshi and Yoshinobu Baba, Microchip-based homogeneous
immunoassay using fluorescence polarization spectroscopy Lab Chip, 2009, 9, 966-971
5. Preanalytika
Jindra Vrzalová
Preanalytická část je nedílnou součástí laboratorního vyšetření a lze ji rozdělit na část, která
probíhá mimo laboratoř a na část, která probíhá uvnitř laboratoře před samotným měřením.
Pokud posuzujeme frekvenci chyb ve výsledku laboratorního vyšetření vzniká jejich
nadpoloviční většina již ve fázi preanalytické a je proto nutné se jí stále důkladněji zabývat.
Součástí preanalytiky jsou na jedné straně vlivy biologické ovlivňující hladinu měřené látky a
na druhé straně vlivy mechanické a tepelné při odběru, separaci, transportu a skladování, které
můžou změnit studovanou hladinu v biologickém materiálu. V preanalytické fázi dochází k
prolínání těchto faktorů.
5.1 Biologické vlivy
Biologické vlivy lze rozdělit na ty, které můžeme ovlivnit, a na faktory neovlivnitelné, které
nezměníme, ale musíme je zaznamenávat a vzít v úvahu při interpretaci výsledku třeba
odlišnými normálními rozmezími v rutinní praxi nebo rozdělením studované kohorty při
statistickém hodnocení výzkumu. Mezi neovlivnitelné faktory patří pohlaví, věk, etnická
52
příslušnost vyšetřovaného a také genetické predispozice. Všechny ostatní preanalytické
faktory můžeme, alespoň částečně, ovlivnit; budeme se jimi zabývat v následujícím textu.
Součástí přípravy vyšetřovaného je jeho dieta před odběrem. Přinejmenším by se měl pacient
před odběry vyvarovat velmi tučných jídel, což způsobuje chylozitu séra, která často
interferuje během stanovení. Existuje ovšem mnoho studií, kde je ukázán vliv složení stravy
na hladiny biomarkerů, známý je např. posun v hladinách u přísných vegetariánů a souvisí
s jejich pozměněným metabolismem. Vliv diety se do změn koncentrací analytů může
promítnout různými mechanismy:
vyplavení hormonů a enzymů před příjmem potravy ,během jídla a bezprostředně po
jídle
metabolismus potravou přijatých látek a zvýšení koncentrací metabolitů
sekundární důsledky vyplavení hormonů
interference látek přijatých potravou s analytickou metodou o nižší specifičnosti (např.
vanilin u stanovení katecholaminů)
vliv alkoholu
vliv kouření
leukocytóza po jídle
Sledovat můžeme u výzkumů spíše extrémy, ale ostatní změny jsou z našeho pohledu
součástí biologické variability, standardem by však měl být pokud možno odběr na lačno. Je
nutné brát v úvahu, že starší pacienti nebo onkologičtí pacienti můžou často trpět podvýživou.
Užívané léky můžou ovlivnit hladiny stanovovaných látek třemi způsoby:
působí na metabolismus stanovované látky
ovlivňují vazbu sledované látky na transportní bílkoviny (změna volné frakce)
lék interferuje v analytické reakci
53
Ideálem by bylo před odběry vysadit veškeré léky, ale to není v praxi obvykle možné. Je
nutné znát alespoň interference léků a vámi studovaného parametrua to zohlednit ve statistice
nebo při zařazování pacientů do studie. Bohužel u většiny nových biomarkerů není taková
informace vůbec k dispozici.
Hladinu mnoha biomarkerů ovlivňuje psychika a především stres pacienta – nervozitou nebo
strachem jsou především stresové hormony např. kortizol, katecholaminy, interleukin 6, je
tedy nutné před odběrem co nejvíce vyšetřovaného uklidnit a snažit se zamezit tzv. syndromu
bílého pláště. Hladinu látek v krvi také ovlivňuje poloha pacienta při odběru – tedy zda je
odebírán vleže (často u pacientů na lůžkových odděleních) nebo v sedě
(nejčastěji u
ambulantních pacientů). Pro výsledné hodnoty stanovení je rozhodující také fyzická činnost
vyšetřovaného před náběrem – zda vyběhl do druhého patra před odběrem po schodech
(zvýšené hodnoty stresových hormonů, některých interleukinů…) nebo jel výtahem, zda přijel
na kole/na koni (zvýšené hodnoty PSA), zda neuběhl den před odběrem maratón atd.
Mnoho látek cirkulujících v lidském oběhu podléhá biorytmům neboli cyklickým variacím:
●
cirkadiánní – v rámci 24 hodin
●
ultradiánní – s periodou mnohem kratší než jeden den
●
infradiánní – s periodou delší než jeden den
●
cirkanuální – s periodou přibližně 1 rok
Důsledkem jsou změny koncentrací látek v denním, ročním, u žen menstruačním cyklu a
v průběhu těhotenství, některé látky jsou vyplavovány v pulzech. Hormony jsou často
ovlivněny variacemi jiných látek/hormonů, které jsou nadřazeny při regulaci jejich uvolňování
v organismu (nejznámějším příkladem je regulatorní osa ACTH pro kortizol). Základní
přehled o konkrétních příkladech můžete získat např. v Encyklopedii laboratorní medicíny
pro klinickou praxi, pro nově studované markery ale tyto údaje často nejsou k dispozici. Ve
výzkumu je z těchto důvodů často důležité provádět náběry v definovanou denní dobu –
standardně mezi 7-9 hod. ranní, v definovanou fázi menstruačního cyklu pokud je jím
studovaná látka ovlivněna a provádět např. statistické zhodnocení korelace data náběru a
54
naměřené hodnoty pro poznání sezónních vlivů. Tento problém se řeší dále opakováním
odběrů nebo různými inhibičními nebo stimulačními testy, to však probíhá především
v rutinní praxi.
5.2 Odběr materiálu
Nejčastějším odběrem biologického materiálu je odběr periferní krve z kubitální žíly. Pro
tento odběr existují tři základní pravidla, která je nutno dodržet:
nezaškrcovat paži během odběru,
nechat oschnout dezinfekci v místě vpichu před odběrem (jinak dochází k hemolýze) a
neprovádět odběry ze stejné ruky, kde pacient dostává infuzi.
Pokud je prováděn odběr z trvale zavedené kanyly, je nutné nejprve 5 ml krve vyhodit a pak
teprve brát krev pro stanovení. Stěžejním pro laboratorní vyšetření je výběr odběrové
zkumavky. Je nutné zohlednit, zda je třeba k vyšetření sérum (odebírá se krev srážlivá, ve
zkumavce proběhne koagulace) nebo zda je třeba plazma (krev je odebrána do zkumavky
obsahující protisrážlivé činidlo). Zkumavky pro odběry plazmy se liší použitým
antikoagulačním činidlem- heparinát, citrát, EDTA soli. Pro imunoanalýzu se nejčastěji
používají odběry s EDTA, ale laboratoř by měla pro každé vyšetření i výzkumné stanovit
přesně požadavek na odběrové zkumavky, protože hladiny mezi sérem a plazmou se pro
některé analysy můžou výrazně lišit. Pro tvorbu biobank by měly být skladovány jak
plazmové tak sérové alikvoty a v publikacích by měl být vždy jasmě specifikován typ
použitého biol. materiálu a nejlépe i odběrových zkumavek.
Samozřejmostí je nutnost bezchybného a bezpodmínečného označení biologického materiálu
– jak primárního materiálu tak skladovaných alikvotů po separaci – aby se předešlo jakýmkoli
záměnám, co se týče pacienta i typu materiálu. V případě speciálních odběrů – např.
netradičních míst odběru nebo testů v čase – je nutné jednoznačné rozlišení jednotlivých
odběrů př. číslicemi nebo písmeny na zkumavkách i na žádankách.
55
V biologickém materiálu dochází k degradací proteinů proteolytickou aktivitou některých
enzymů. Tato aktivita negativně ovlivňuje stanovitelnost proteinů především v homogenátech
tkáňových vzorků, ale může být nezanedbatelná i pro imunoanalytická stanovení proteinů
v plazmě nebo séru. Proteolýze můžeme předejít přidáním specifických inhibitorů proteáz
nebo jejich koktejlů ke vzorku ihned po odběru u krevních derivátů nebo při homogenizaci (u
tkáňových vzorků). Inhibitory proteáz můžeme rozdělit do skupin podle několika kritérií:
dle typu inhibovaných enzymů
podle živočišného druhu/rostliny
podle typu analýzy, která bude prováděna
podle typu biologického materiálu
Speciálním typem inhibitorů jsou inhibitory fosfatáz, které je nutné využívat při studiích
monitorujících stav fosforylace některých proteinů v signálních drahách.
5.3 Separace a transport
Při transportu a skladování je nutné se vyvarovat teplotních extrémů – v létě přehřátí vzorku,
v zimě jeho zmrznutí – používáním transportních boxů. Některé analyty vyžadují speciální
teplotu transportu, např. transport v ledové tříšti, což je směs vody a ledu v poměru jedna ku
jedné: led ve vodě postupně odtává, což umožňuje udržet delší dobu vzorek při teplotě těsně
nad bodem mrazu. Naopak některé látky při vystavení chladu můžou měnit své hladiny ve
směru falešně pozitivního i negativního výsledku. Chybou je vždy zmrznutí zkumavky
s odebranou krví před separací séra/plazmy od krevních buněk, protože to vede k hemolýze.
Také vystavení vzorku nadměrnému světlu – např. ponechání vzorku na okně při silném
slunečním svitu – může způsobit degradaci fotolabilních látek. Zkumavky s náběry pro měření
látek velmi citlivých na světlo by měly být transportovány např. obalené v alobalu. Vždy by
mělo být zamezeno třepání a prudké pohyby se zkumavkami s krví před separací, nadměrná
mechanická zátěž vede nejčastěji k hemolýze.
56
Důležitým krokem v přípravě biol. materiálu z krve je centrifugace – separace séra nebo
plazmy od krevních buněk. Jednotlivé laboratoře se liší používanými podmínkami – vždy by
měla být uváděna doba centrifugace a použitá centrifugační (odstředivá) síla g (uvádění
v otáčkách za minutu rpm je chybné neboť nezahrnuje velikost rotoru, která ovlivňuje
odstředivou sílu). Tato odlišnost je jednou z příčin nestejných výsledků mezi jednotlivými
laboratořemi. Speciální nastavení je třeba např. při požadavku na tzv. bezdestičkovou plazmu
pro studium některých analytů, aby nedocházelo k ovlivnění měřené hladiny vyplavením
intracelulárních komponent z trombocytůSeparace zajišťuje i zamezení vyplavování látek
např. interleukinů z aktivovaných leukocytů. Sérum by mělo být před separací ponecháno
srážet alespoň 30 min. po odběru. Naopak plazma může být separována ihned.
5.4 Skladování
Biologický materiál pro výzkumné účely by měl být skladován v alikvotech odpovídajících
množstvím potřebám analýzy a při dlouhodobém skladování v teplotách pod -70oC. Moderní
analytické postupy vyžadují poměrně malé množství materiálu a je tedy výhodnější skladovat
více alikvotů s menším objemem. Zamezí se tak opakovanému rozmrazování, které je
nežádoucí. U některých biomarkerů např. cytokeratinů víme, že opakované rozmrazování
nezmění výsledek, ale u většiny nových biomarkerů nemáme tušení a proto se tzv.
opakovaným freeze/thaw cyklům vyhýbáme. Důležitý je i správný výběr zkumavek pro
dlouhodobé uskladnění – musí být vyrobeny z plastů odolávajícím nízkým teplotám a musí
mít víčka dostatečně zamezující odpařování. Dále je nutné si uvědomit, že materiál nemůže
být skladován nekonečně dlouho. Maximální doba skladování se liší pro jednotlivé analysy,
jejich hladiny se v průběhu let/měsíců mění. Ve výzkumu je proto důležité zvážit, zda bude
vhodné jednorázové vyšetření biologického materiálu až po kompletním ukončení sběru (celé
kohorty) nebo zda je výhodnější periodické zpracování např. vždy jednou za půl roku nebo
dokonce kontinuální zpracování na rutinních analyzátorech, kde ale zase hrozí změna použité
metodiky.
57
Samotná preanalytická fáze začíná již správným výběrem – indikací laboratorního vyšetření ,
v případě výzkumných projektů výběrem studovaného biomarkeru. Je nutné nejprve zjistit, co
nejvíce o preanalytických podmínkách, které jsou nezbytné, a poté jim přípravu pacientů,
odběry a nakládání s biologickým materiálem co nejlépe přizpůsobit. Velkým problémem
většiny studií zůstává nestejné zacházení s náběry tzv. kontrolních skupin. Náběry jsou často
zpracovávány v jiných laboratořích (např. transfůzní stanice), za jiných podmínek (doba a
nastavení centrifugace), náběry jsou prováděny v jiných denních dobách (např. pouze
ambulantní náběry v kontrolní skupině x celodenní náběry z lůžkových oddělení v cílové
skupině). Velkou neznámou, co se týče jednotnosti podmínek a popisu preanalytické fáze,
zůstávají velké biobanky, kde jsou pro jednotlivé diagnózy často dlouhodobě skladovány
biologické materiály získané buď z mnoha pracovišť za kratší časový úsek, nebo naopak
z jednoho pracoviště za velmi dlouhé časové období. Při studiích používajících takovýto
biologický materiál by mělo být vždy součástí statického hodnocení zda výsledek neovlivňuje
stáří náběru a jeho původ (tedy zda se neliší výsledky náběrů získaných různými pracovišti).
5.5 Literatura 5
1. Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi – verze 9, (prosinec 2009) dosažitelné 9.12.2010 na
www.sekk.cz
2. Picotte M, Campbell CG, Thorland WG. Day-to-day variation in plasma interleukin-6 concentrations in older
adults. Cytokine. 2009 Sep;47(3):162-5.
3. Arvidson NG, Gudbjörnsson B, Elfman L, Rydén AC, Tötterman TH, Hällgren R. Circadian rhythm of serum
interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 1994 Aug;53(8):521-4.
4. Shand B, Elder P, Scott R, Frampton C, Willis J. Biovariability of plasma adiponectin. Clin Chem Lab Med.
2006;44(10):1264-8. PubMed PMID: 17032140.
5. Flower L, Ahuja RH, Humphries SE, Mohamed-Ali V. Effects of sample handling on the stability of
interleukin 6, tumour necrosis factor-alpha and leptin. Cytokine. 2000 Nov;12(11):1712-6. PubMed PMID:
11052823.
6. Thavasu PW, Longhurst S, Joel SP, Slevin ML, Balkwill FR. Measuring cytokine levels in blood. Importance
of anticoagulants, processing, and storage conditions. J Immunol Methods. 1992 Aug 30;153(1-2):115-24.
PubMed PMID: 1381403.
4. Steptoe A, Willemsen G, Owen N, Flower L, Mohamed-Ali V. Acute mental stress elicits delayed increases
in circulating inflammatory cytokine levels. Clin Sci (Lond). 2001 Aug;101(2):185-92. PubMed PMID:
11473494.
58
5. Venkatraman JT, Pendergast D. Effects of the level of dietary fat intake and endurance exercise on plasma
cytokines in runners. Med Sci Sports Exerc. 1998 Aug;30(8):1198-204. PubMed PMID: 9710857.
6. Venkatraman JT, Feng X, Pendergast D. Effects of dietary fat and endurance exercise on plasma cortisol,
prostaglandin E2, interferon-gamma and lipid
7. peroxides in runners. J Am Coll Nutr. 2001 Oct;20(5):529-36. PubMed PMID:
8. Rai AJ, Gelfand CA, Haywood BC, Warunek DJ, Yi J, Schuchard MD, Mehigh RJ, Cockrill SL, Scott GB,
Tammen H, Schulz-Knappe P, Speicher DW, Vitzthum F, Haab BB, Siest G, Chan DW. HUPO Plasma
Proteome Project specimen collection and handling: towards the standardization of parameters for plasma
proteome samples. Proteomics. 2005 Aug;5(13):3262-77. PubMed PMID: 16052621.
9. Protease & Phosphatase Inhibitors & Proteases, A handbook & selection guide for inhibitors of protease &
phosphatases & for proteases & assays dosažitelné 9.12.2010 na http://www.gbiosciences.com/
10. Inhibitory proteáz Calbiochem dosažitelné 9.12.2010 na http://www.merck-chemicals.com/
11. Racek J., Preanalytické vlivy na výsledek laboratorního vyšetření v Racek J., Klinická Biochemie, druhé
vydání, 2006, Galén
12. Zima T., Obecný úvod k laboratornímu vyšetření, v Zima T. , Laboratotní diagnostika, 2002, Galén
13. Wilde C.: Subject Preparation, Sample Collection and Handling v The Immunoassay Handbook, Third
Edition, D. Wild (Editor), 2005, Elsevier
6. Imunoanalýza a molekulární
biologie
Martin Pešta
Můžete si položit otázku: co má imunoanalýza a molekulární biologie společného? Vždyť
molekulární biologie používá jiné metody, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR) nebo
elektroforetická separace DNA či proteinů. Spojení imunoanalýzy s molekulární biologii však
bylo způsobeno vývojem v oblasti přístrojového vybavení. Multiplexová technologie, která se
v současnosti používaná v imunoanalýze, umožňuje řešit i otázky, které byly donedávna
vyhrazeny metodám molekulární biologie. Jsou to:
1, genotypizace a stanovení bodových mutací
2, kvantifikace exprese mRNA.
59
Jako příklad zde uvádím onemocnění a vyšetření, na které jsou komerčně dostupné soupravy
pro genotypizaci a stanovení bodových mutací na přístroj Luminex (xMAP-based assay)
(Tabulka 6.1).
Tabulka 6.1.
aplikace:
analyzované geny:
výrobce:
Genetická onemovnění,
Cystic fibrosis: 25mutací,
Ambion Diagnostic
screning
6 polymohismů
(Austin, TX)
Ashkenazi Carrier Panel:
23 mutací v 8 genech
SNP genotyping
Y chromozom, SNPs
Marlingen Biosciences, Inc
Mitochondriální DNA
(Ijamsville, USA)
polymorfismus
HLA DNA typizace
Infekční onemocnění
HLA DNA typizace
HLA A, B, C, DRB1, DRB3,4,5,
One Lambda, Inc
DQB1
(Canoga Park,USA)
Panel akutních respiračních infekcí: Proactive Medical
SARS-CoV, Influenza A and B
Technologies, Inc
Parainfluenza 1 and 3RVS
(Austin, USA)
HLA A, B, C, DRB, DQB
Tepel Lifecodes
(Stamford, USA)
SNP genotyping
Cytochrom P450: CYP2C19,
Tm Bioscience
CYP2C9, CYP2D6
(Toronto, Kanada)
Genetický screning
Factor V, Factor II, MTHFR677,
tromboflních stavů
MTHFR1298
60
Populační genetika
Y-SNP identifikace
Luminex Corporation
(Austin, United States)
Genetika virů
HPV genotyping (Human)
Tag-It® Mutation Detection
50 SNP včetně Factor V, Factor II,
Kit, Genetický screning
MTHFR677, MTHFR1298
tromboflních stavů
Signet™ Genotyping Panel detekce mutací ovlivňujících zdravotní rizika srdce, kostí,
odezity, detoxikačních funkcí antioxidantů, inzulinové
senzitivity, zánětu, obezity Alzheimerovi choroby.
6.1 Základy molekulární biologie
Základem molekulární biologie, disciplíny zabývající se studiem buněčných procesů na jejich
molekulární úrovni, je tzv. centrální dogma molekulární biologie. To říká, že genetická
informace je realizována ve směru z nukleových kyselin do proteinů. To znamená, že změna
fenotypu (organismu) je možná pouze změnou genotypu (genetické informace), ne naopak,
jak ukazuje Obrázek 6.1
GENOTYP
REPLIKACE
FENOTYP
TRANSKRIPCE
DNA DNA 
TRANSLACE
RNA
protein
RNA do DNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE (retroviry)
Obrázek 6.1 Vztah genotyp – fenotyp.
61
replikace - vytvoření kopie původní molekuly dvoušroubovice DNA (templát) vznikem dvou
shodných molekul dvoušroubovic DNA (replik) např. při mitóze buňky
transkripce - přepis genetické informace uchovávané v řetězci DNA do řetězce RNA
translace - genetická informace je přeložena z RNA do sekvence aminokyselin (proteinu),
následně je vytvořením struktur (buněčných) a funkcí realizován fenotyp - živý organismus
Původní předpoklad jeden gen - jeden enzym (protein), bylo nutno upravit. Vlivem
alternativního sestřihu RNA může vznikat více podobných proteinů. RNA, vzniklá v procesu
transkripce se skládá z kódujících sekvencí (exonů) a nekódujících sekvencí (intronů).
Odstraněním intronů v procesu sestřihu RNA mohou za určitých okolností, kombinací exonů,
vznikat podobné proteiny.
6.2 Proč vznikají a co způsobují mutace
Během života je genetická informace (DNA) v lidských buňkách vystavena různým vlivům,
které mohou měnit její primární strukturu (pořadí nukleotidů). Změny nukleotidového složení
DNA (mutace) vznikají vlivem fyzikálních mutagenů (UV), chemických mutagenů (alkylační
činidla) či biologických mutagenů (některé viry), ale také prostřednictvím chyb při replikaci.
Mutace, které nemají patologický projev, vedou pouze vzniku polymorfismu (např.
jednonukleotidový polymorfismus - SNP). Mutace ale mohou také způsobit, že genetická
informace se projeví ve změně produkovaného proteinu, která vede k poruše jeho funkce. To
může způsobit vznik méně či více závažných onemocnění.
Změny primární struktury DNA můžeme rozdělit na:
1, Genové mutace
A- Bodové mutace (mutace postihující jen jeden nukleotidový pár)
B- Změny rozsáhlejších oblastí:
1) inzerce 2) delece 3) duplikace
(detekcí těchto mutací se zabývá molekulární biologie)
2, Chromozómové aberace (delece, translokace, inverze)
62
(tyto mutace detekuje cytogenetika, mohou být nalezeny i metodami molekulární biologie)
3, Genomové mutace (aneuploidie, polyploidie)
(tyto mutace opět detekuje cytogenetika, mohou být však také nalezeny i metodami
molekulární biologie)
Leidenská mutace
Jako příklad mutace s jasným klinickým projevem si uveďme Leidenskou mutaci (G1691A) –
mutaci faktoru V koagulačního systému. Tato mutace zvyšuje riziko trombofilního stavu a to
již při mutaci jedné ze dvou alel – tzn. v heterozygotním stavu.
Leidenská mutace - bodová mutace - 10. exon - G1691A → vede ke záměně argininu za
glutamin → změna struktury proteinu FV → APC-R (rezistence na aktivovaný protein C;
prokoagulační stav)
Autosomálně dominantní onemocnění - riziko trombotických komplikací se zvyšuje již
při mutaci jedné z obou alel genu
Incidence této mutace v populaci je 4,2-7%
Význam stanovení Leidenská mutace
Prevence tromboembolické choroby v rizikových situacích: operace, trauma, úraz,
imobilizace, při indikaci HAK a HRT
Zjištění mutace má význam nejen pro probanda, ale i pro příbuzné - děti, sourozenci,
rodiče .
Stanovení Leidenské mutace na přístroji Luminex – princip stanovení
A, Jednoduší metodou stanovení je přímá DNA hybridizace. Té předchází amplifikace
(namnožení) úseku DNA pomocí polymerázová řetězová reakce (PCR). (Obrázek 6.2)
Podle typu detekovaných kuliček určíme, zda je mutace přítomna či nikoli.
63
SNP resp.
mutace
1. PCR amplifikace se značenými primery úseku
Amplifikace
DNA obsahujícího mutaci
DNA
2. Denaturace produktů PCR – oddělení
Denaturace
vláken DNA
3. Hybridizace na „kuličku“ příslušné specifity
Hybridizace
(wild typ X mutace)
4. Detekce na přístroji Luminex
Detekce
Obrázek 6.2 Přímá DNA hybridizace s detekcí na přístroji Luminex.
B, Druhá, komplikovanější metoda je tzv. kompetitivní DNA hybridizace. Princip metody
spočívá v zablokování přítomné mutace resp. wild (normální) sekvence florescenčně
značeným kompetitorem a následné detekci kuličky, hybridizované s kompetitorem, který
se nenavázal. Tzn. že zjišťujeme, která alela není přítomna, a z toho odvozujeme, která
přítomna je.
Jednotlivé kroky testu jsou:
1. PCR amplifikace úseku DNA obsahujícího mutaci
64
2. Denaturace + kompetitivní prehybridizace se značenou sondou (zablokují se sondy s
příslušnou specifitou (wild typ X mutace)
3. Hybridizace s „ kuličkami“ příslušné specifity
4. Detekce na přístroji Luminex
Vše dále zobrazuje Obrázek 6.3:
Cílová sekvence
není přítomna
prehybridizace
hybridizace
detekce
Cílová
sekvence
je přítomna
prehybridizace
hybridizace
detekce
Obrázek 6.4 Kompetitivní DNA hybridizace s detekcí na přístroji Luminex.
65
Stanovení Leidenské mutace – ASA PCR
Jako příklad stanovení Leidenské mutace pomocí PCR uvádíme alelově specifickou PCR ASA PCR . U každého probanda jsou provedeny dvě PCR, jedna zjišťující přítomnost Wild
alely a druhá zjišťující přítomnost mutované alely. Na následujícím schématu vidíte, jak
vypadá záznam elektroforetické separace DNA fragmentů po PCR dvou probandů a
vyhodnocení. PCR je doplněna o amplifikaci faktoru IX (kontrola proběhnutí PCR) a
stanovení protrombinové mutace(faktor II).
Schéma záznamu ASA PCR dvou probandů: u každého proband - 2 PCR – pro normální a pro
mutovanou alelu (w, m), přítomnost amplikonu ukazuje přítomnost dané alely.
1
| 2
|
3 | 4
Obrázek 6.5 Fotografie stanovení protrombinové mutace a Leidenské mutace čtyř probandů metodou
ASA PSR.
Interpretace výsledku elektroforetického gelu:
1, normální genotyp protrombin
heterozygot faktoru V (LM)
2, normální genotyp protrombin
normální genotyp faktoru V
3, normální genotyp protrombin
normální genotyp faktoru V
4, heterozygot protrombin (mutace)
heterozygot faktoru V
66
6.3 Základní metody práce s nukleovými kyselinami
Prvním úkolem při práci s nukleovými kyselinami je jejich izolace. Až na výjimky izolace NK
předchází všechny analýzy. Ve speciálních případech je možno použít přímo buněčné
sespenze.
Izolace DNA
Pro většinu genetických testů je třeba nejprve izolovat DNA. Platí to například jak pro
metodiky PCR tak pro stanovení genotypu na přístroji Luminex xMAP technologií. Metody
izolace jednotlivých typů nukleových kyselin (DNA, RNA) z různých organismů a tkání jsou
v podstatě vždy posloupností těchto základních kroků:
1. Získání biologického materiálu, ze kterého se nukleové kyseliny izolují (plná krev,
tkáň, buněčná suspenze)
2. Uvolnění nukleových kyselin z biologického materiálu
3. Oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur
4. Purifikace nukleové kyseliny
5. Zakoncentrování izolovaných nukleových kyselin
Krok 2 je obvykle realizován v roztocích o nízké osmolaritě v kterém buňky popraskají.
Uvolnění obsahu protoplastů lze docílit detergenty - SDS, Triton X-100, degradace proteinů
proteinázou. Oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur, proteinu a
purifikace nukleové kyseliny precipitací proteinů je docíleno vysokou koncentrací solí. Např.
Vysolovací metoda podle Millera (NaCl, popř. chloroform, odstranění proteinů a
makromolekulárních struktur, membrán) → precipitace DNA etanolem → rozpuštění DNA v
H2O. Stejného výsledku je možno docílit Fenolchloroformovou extrakcí (pH 8, - odstranění
proteinů a makromolekulárních struktur, membrán) → precipitace DNA etanolem →
rozpuštění DNA v H2O.
Krok 3, oddělení jednotlivých fází je docíleno centrifugací, po které se svrchní, vodná fáze
obsahuje rozpuštěnou DNA.
67
Krok 4, odebere se vodná fáze a přidá se 2,5násobek 96% alkoholu → dojde k precipitaci
DNA. Ta je z roztoku přenesena do nové zkumavky, vysušena a rozpuštěna ve vodě.
Skladovat DNA lze krátkodobě při 4OC, dlouhodobě při -20OC.
Problém při izolaci DNA – enzymy DNázy – degraduji DNA → jejich inaktivace je docílena
sterilizací plastů a chelatačními činidly, např. EDTA
Izolace RNA
Přestože izolace RNA je v principu stejná jako DNA, liší se v několika bodech. Pro izolaci
RNA je nezbytná inhibice RNáz (enzymů štěpících RNA) - guanidinium isothiokyanátem.
Fenolchloroformová extrakce probíhá při odlišném pH 4-5, to zajistí kromě odstranění
proteinů a makromolekulárních struktur, membrán také odstranění DNA. Vzorek RNA se při
izoloze snažíme neustále chladit. Následuje precipitace RNA etanolem nebo izopropanolem (20OC, 1/2h) a rozpuštění RNA v H2O. Skladovat RNA lze krátkodobě při - 20OC, ale ideální
je teplota -70OC.
PCR – polymerázová řetězová reakce
Pro analýzu konkrétních genů je často nutné získat daný úsek DNA ve velkém množství kopií,
tak aby mohla být provedena následná analýza. Množení vybraných úseků dvouřetězcové
DNA umožňuje právě polymerázová řetězová reakce. Byla vyvinuta Kary Mullisem v
laboratoři H. Ehrlicha u firmy Cetus Corp. (Kalifornie, USA) a poprvé publikována v r. 1985
Saikim a Mullisem. Stala se nepostradatelnou metodou v každé laboratoři používající techniky
molekulární biologie. Princip PCR je množení vybraných úseků dvouřetězcové DNA
(dsDNA), kdy je vybraný úsek DNA ohraničen párem primerů, každý z nich se připojí k
jednomu z individualizovaných řetězců DNA (po denaturaci, zvýšenou teplotou) a stane se
startovacím očkem pro syntézu nového řetězce. Tento cyklus je zobrazen na následujícím
obrázku.
68
Množení konkrétních úseků DNA pomocí PCR spočívá v cyklickém opakování 3 základních
kroků a to:
1. denaturace DNA (rozestoupení vláken dvoujšroubovice při 95OC)
2. nasednutí primerů (startovacích úseků pro syntézu druhého vlákna) při 60
O
C na
komplementární sekvenci
3. polymerace – vytvoření druhého (komplementárního) řetězce při při 74OC.
Jak vyplývá z předchozích řádků, „hnacím motorem“ PCR je pravidelné střídání teplot.
Grafický sled všech kroků ukazuje Obrázek 6.6.
Obrázek 6.6 Schéma reakce PCR
Pro realizaci PCR jsou potřebné: „předloha“ - templát DNA, „stavební kameny“- dNTP,
startovací očka pro nové vlákna - primery (oligonukleotidy cca. 20-timery), polymeráza
(termostabilní), pracovní pufr a samozdřejmě přístroj umožňující rychlou změnu teploty ve
zkumavkách – thermo cycler.
69
Na Obrázku 6.7 jsou termální cyklátory pro end point analýzu (neumožňují real-time
kvantifikaci), Techne Progene a MJ Research PTC-200
Obrázek 6.7 Termální cyklátory
V některých případech je nutno určit přesný počet kopií určitého úseku DNA (resp. RNA) –
kvantifikovat DNA (expresi mRNA). Jedna z oblastí výzkumu využívající kvantifikaci je
sledování exprese genů na úrovni transkripce (mRNA) nebo např. kvantifikace množství
přitomného patogenu (např. viru). Kvantifikaci dnes umožňuje řada metodik.
Zde uvádím metodiku novou, založenou na xMAP technologii přístroje Luminex a „tradiční“
tzv. real-time PCR.
Kvantifikace mRNA pomocí xMAP technologie na přístroji Luminex
Princip stanovení exprese genů, tzn. určení množství mRNA ve vzorku, je znázorněn na
Obrázku 6.8.
70
streptavidin-fykoerytrin
amplifikátor signálu
mRNA
sekvence specifická pro
cílovou mRNA
Obrázek 6.8 Princip stanovení exprese genů (QuantiGene® Plex Assay)
kulička, procházející
Na povrchu kuličky, detekované přístrojem, jsou ukotveny sekvence komplementárně
kapilárou
přístroje
odpovídající námi sledovanému genu
např. VEGF.
Během přípravné fáze se RNA izolovaná
s příslušné tkáně hybridizuje s těmito sekvencemi a dojde k navázání mRNA genu pro VEGF
na tyto sekvence sekvence. Dále se se s molekulou mRNA spojí další molekuly které vytvoří
zdroj signálu, svědčící o přítomnosti sledované mRNA a také o jejím počtu (velikost signálu).
Kuličky procházejí kapilárou přístroje Luminex, který detekcí barvy kuličky získá informaci,
kterou mRNA právě měří a detekcí signálu z molekul navázaných na mRNA na kuličce
zjišťuje počet navázaných molekul.
Ukázka souprav firmy Panomics (Austin, United States) se seznamem genů, jejichž expresi je
možno stanovit, je na Obrázku 6.9.
71
Obrázek 6.9
Kvantifikace mRNA metodou real-time PCR
Umožňuje stanovení počtu kopií konkrétní mRNA (cDNA). Principem metody je
monitorování signálu z PCR reakce po každém cyklu (třech krocích PCR), odtud název realtime.
Průběh PCR je monitorovén po každém cyklu:
1. pomocí chromoforu SybrGreen (interkaluje se do dvouvláknové DNA – měření po
proběhnutí kroku polymerace)
2. pomocí sondy (specifické k amplifikované sekvenci) obsahující chromofor a zhášeč –
větší přesnost monitorace
Jak ukazuje Obrázek 6.10, v exponenciální fázi PCR je odečteno tzv. Ct, které nám říká
v kolikátém cyklu daný PCR vzorek dosáhl dané úrovně fluorescence (zde 10). Čím více je
kopií je ve vzorku, tím nižší Ct je odečteno.
72
B
A
CtB
CtA
Obrázek 6.10 Monitorování signálu z PCR
Z Obrázku 6.10 je možno odvodit, že ve zkumavce B je více sledované sekvence DNA než ve
vzorku A.
Výsledky jsou uváděny jako:
• Absolutní hodnoty
-
kvantifikace byla provedena absolutně, za použití klonovaných
fragmentů o známé koncentraci jako standard (např. počet kopií molekul/ 3 µg RNA).
• Normalizované hodnoty - výsledky jsou uváděny jako poměr sledovaného genu a GAPDH
(př. MMP-9/GAPDH).
GAPDH je tzv. housekeeping genem (referenčního gen)
Luminex (QuantiGene® Singleplex Assay) X real time PCR
V současnosti umožňuje řada různých metodik provádět stanovení stejných molekul a je třeba
důkladně zvážit jaké přístupy vybrat. V rozhodování hraje roli cena za stanovení, rychlost,
přesnost ale i laboratorní náročnost provedení. Zde se pokusíme porovnat výše zmíněné
metodiky.
73
Porovnání xMAP (Luminexu) a real-time PCR
časová
náročnost
rozsah užití
technologie
cena
xMAP, Luminex
finančně náročné rychlé
stanovované
kity
kvantitativní
geny – limitace
stanovení
nabídkou firem
velkého počtu
genů
Real-time PCR
cenově
dostupnější
další vlastnosti
není tak náchylný na
degradaci
mRNA
(vyplývá z technologie)
není tak náchylný na
kontaminaci (neobsahuje
amplifikační krok)
časově
„Stavebnicový
možno ovlivnit
náročnější,
systém“ – možno parametrů
v jedné
stanovit expresi
zkumavce lze téměř jakéhokoli
stanovit
genu
maximálně 4
geny
řadu
6.4 Literatura 6
1. Metody molekulární biologie: Jan Šmarda, Jiří Dostál, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana
Koptíková. nakl.: MU Brno, 1. vyd., 2005
2. Základy biologie a genetiky: Berta Otová, Romana Michalová, Jiří Vymlátil. Karolinum, Praha, 2. vydání.,
2006¨
3. Dunbar SA. Applications of Luminex xMAP technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid
detection. Clin Chim Acta. 2006 Jan;363(1-2):71-82.
74
7. Imunohistochemie
využití
a
její
Marie Ludvíková
Jak název napovídá, imunohistochemie (IHC) je, stejně jako imunoanalytické metody,
založena na imunologickém principu - reakci antigen-protilátka.
Imunohistochemie je nepostradatelným laboratorním vyšetřením v patologii. Do rutinního
patologického vyšetření u nás byla postupně začleňována od začátku 90. let minulého století.
Zavedení nových sofistikovaných metod a technologií znamená určitý milník pro každou
oblast života, tím více pak pro jednotlivé obory medicíny. Prvním takovým milníkem
v patologii bylo zavedení mikroskopu do zkoumání lidských tkání německým patologem
Rudolfem Virchowem (1821-1902), což otevřelo široké možnosti rozvoje buněčné patologie.
Metodologický arzenál v patologii byl pak po dlouhou dobu poněkud tradiční. Patologie vždy
hledala způsoby, jak validovat morfologické nálezy. Aby bylo usnadněno pozorování a
porovnávání buněk a tkání, byly vyvinuty speciální barvící metody – většina těchto metod
byla založena na chemické reakci buněčných a tkáňových komponent ve zmrazeném
materiálu (histochemie). Na základech histochemie pak vyrostla imunohistochemie. V roce
1941 Coons a spolupracovníci poprvé úspěšně realizovali imunohistochemickou reakci, při
níž uskutečnili vazbu fluorescenčně označené protilátky s odpovídajícím antigenem na
tkáňovém řezu. Tato nová metoda se záhy
ukázala velice slibnou pro experimentální
patologii, avšak její využití pro rutinní praxi bylo značně omezeno právě použitím
fluorescenčního značení, což vyžadovalo nefixovanou tkáň a speciální fluorescenční
mikroskop. Další převratná změna ve využití imunohistochemie nastala v roce 1974, kdy
Taylor a Masson prezentovali enzymatické značení protilátek. Výsledný produkt vazebné
reakce mezi takto označenou protilátkou a příslušným antigenem tak mohl být snadno
75
detekován
ve
světelném
mikroskopu,
což
později
umožnilo
postupně
zavádět
imunohistochemii do běžné bioptické praxe. Tento fakt znamenal skutečně revoluční předěl ve
vývoji patologické anatomie do té doby založené téměř výhradně na morfologickém přístupu
ke studiu buněk a tkání. O další rozvoj imunohistochemie se přičinili Köller a Milstein, kteří
vypracovali a rozvinuli hybridomovou techniku pro produkci monoklonálních protilátek.
Postupně tak byly a stále jsou představovány nové a nové protilátky umožňující studium
vysoce specifických tkáňových markerů.
7.1 Metodologie imunohistochemie
Předností imunohistochemie (ve srovnání s dalšími přístupy využívajícími imunologický
princip) je zejména přesná lokalizace antigenu ve tkáni.
Antigeny přítomné ve tkáních mohou být:
-
Endogenní (cytoskeletální, membránové, produkty onkogenů apod.)
-
Exogenní (např. bakteriální a virové)
Je-li antigenní determinanta, proti níž je specifická protilátka namířena, ve tkáni přítomna,
dojde k vazbě mezi determinantou a vazebnou částí příslušné protilátky. Výsledná vazebná
reakce musí být snadno detekovatelná v mikroskopu.
Další velkou výhodou IHC je možnost jejího provádění na fixovaném a v parafínu zalitém
materiálu. Tento fakt umožňuje široké využití zmíněné metody nejen v běžné rutinní
diagnostice a v prospektivních studiích, ale rovněž ve studiích retrospektivních. Archivní
materiál tak představuje bohatý zdroj k provádění výzkumů, které jsou v souladu se
současnými poznatky vědy a sledují faktory, jež nebylo možno dříve detekovat. IHC se tudíž
stala nepostradatelnou součástí diagnostické patologie a doplňkem histologických,
histochemických a elektronmikroskopických metod. Spolu s metodami biochemickými
a molekulárně genetickými se etablovala jako důležitý přístup nejen v diagnostice
nejrůznějších patologických změn, ale i v předpovídání průběhu a odpovědi na léčbu
nádorových onemocnění.
76
Přehled imunohistochemických metod
Základním principem imunohistochemie je specifická vazba tkáňového antigenu s příslušnou
protilátkou. Po návázání protilátky na tkáňový antigen je nutné výslednou vazebnou reakci
vizualizovat, což může probíhat několika způsoby. Rozlišujeme dva základní typy IHC metod
dle značení zvolené protilátky – imunofluorescenční a imunoenzymatické.
Podstatou imunofluorescenčního typu IHC je označení protilátky (antiséra) fluorochromem.
Jde o přímou metodu, která vyžaduje po inkubaci s protilátkou bezprostřední vyšetření tkáně
fluorescenčním mikroskopem. Její nevýhodou je nestálost výsledného efektu a chybění
morfologických detailů. Tato metoda se aplikuje zejména na nativních tkáních. V rutinní
bioptické diagnostice se nyní používá přímé imunofluorescence minimálně, a to při hodnocení
renálních a kožních punkcí či biopsií. Původní IHC metoda popsaná Coonsem spočívala ve
značení protilátek právě fluorescenčními barvivy.
Typ imunoenzymatický
je nejrozšířenějším typem IHC a je charakterizovaný značením
reakčních substancí jednou nebo více molekulami zvláštního enzymu. Tyto enzymy jsou buď
přímo vázány na určitou protilátku nebo jsou do reakce vneseny nepřímo pomocí haptenu,
např. biotinu. Nejdůležitější předností imunoenzymatických značení je snadná vizualizace
s použitím běžného světelného mikroskopu a stálost výsledné reakce.
Nejvíce užívanými enzymy v imunoenzymatických metodách jsou peroxidáza a alkalická
fosfatáza. Peroxidáza je izolována z kořenů křene (název křenová peroxidáza, angl.
horseradish peroxidase, HRP) a je vázána kovalentní nebo nekovalentní vazbou na protilátku
nebo biotin. Je dostupná v čisté formě, má antigenní účinky a při dodání substrátu a
chromogenu umožňuje generovat lokální barevnou reakci. Substrátem je H2O2, který je
katalyzován, aby poskytnul kyslík elektronovému donoru - chromogenu k vytvoření
barevného produktu. Jako chromogen pro peroxidázu se užívají zejména 3,3 diaminobenzidin
tetrahydrochlorid (DAB) s hnědým reakčním produktem a aminoethylocarbazol (AEC)
s červeným výsledným produktem. Vzhledem k minimálnímu výskytu vlastní peroxidázy ve
většině tkání, je efekt falešné pozitivity při použití HRP zanedbatelný. Tkáňová peroxidáza
77
může být před imunoreakcí snadno blokována. Alkalická fosfatáza z telecího střeva se užívá
hlavně při vyšetření tkání s vysokou endogenní peroxidázovou aktivitou. Jako substrát pro
alkalickou fosfatázu se používají naftol-fosfáty, jako chromogeny Fast Red a Fast Blue. Ze
všech imunohistologických technik doznaly imunoenzymatické procedury
největšího
rozšíření v diagnostické patologii (Tabulka 7.1).
Tabulka 7.1 Přehled enzymů používaných v IHC
Enzym
Substrát
Chromogen
Výsledný produkt
Peroxidáza
H2O2
3,3diaminobenzidin
hnědý
tetrahydrochlorid (DAB)
aminoethylocarbazol
červený
(AEC)
Alkalická fosfatáza
Naftol-fosfáty
Fast Red
červený
Fast Blue
modrý
Imunoenzymatické metody IHC se dále rozvíjely zaváděním imunoperoxidázových
přemosťovacích metod a nepřímé matody PAP komplexu. V roce 1981 se objevila nová
generace imunohistochemických avidin-biotinových metod, které jsou široce užívány dodnes.
Tyto metody spočívají v silné afinitě avidinu nebo streptavidinu k vitaminu biotinu. Limitací
těchto straptavidin-biotinových metod je přítomnost endogenního biotinu v některých tkáních,
což může vést k nespecificky zabarvenému pozadí. Ve zmražených řezech biotinová aktivita
dokonce stoupá. Nutností je tedy blokáda endogenního biotinu. Proto byly představeny nové
polymerové imunohistochemické metody spočívající v unikátní technologii založené na
mnohotné vazbě protilátek (primárních nebo sekundárních) s molekulami enzymu na
polymerovou kostru (např. dextranový polymer EnVision firmy DAKO).
Imunohistochemická vyšetření k lokalizaci antigenu mohou být prováděna různými postupy,
které se navzájem liší zejména počtem stupňů reakce a vazbou příslušného enzymu. V IHC
78
technikách je využit fakt, že každá IG molekula může sloužit zároveň jednak jako protilátka
(váže specifická místa na antigenu), jednak jako antigen prezentující antigenní determinantu
pro sekundární protilátku. Výběr vhodné metody závisí na možnostech každé laboratoře, na
typu vyšetřovaných tkání, na požadované senzitivitě reakce a na časových a finančních
hlediscích.
V přehledu uvádíme schemata vybraných imunohistochemických metod užívaných ve
světelné mikroskopii (Obrázky 7.1-7.4):
Obrázek 7.1 Přímá metoda. Enzymem značená primární protilátka reaguje s tkáňovým antigenem (Zdroj:
archiv autora)
Obrázek 7.2 Nepřímá metoda (dvoustupňová). Enzymem značená sekundární protilátka reaguje
s primární protilátkou vázanou na tkáňový antigen (Zdroj: archiv autora)
79
Obrázek 7.3 Avidin biotinová metoda Enzymaticky značený avidin (LAB metoda) (vlevo) nebo avidinbiotinový
komplex
(vpravo)
s enzymaticky
značeným
avidinem
(SABC
metoda)
reaguje
s biotinylovanou sekundární protilátkou (Zdroj: archiv autora)
Obrázek 7.4 Dvoustupňová polymerová metoda (Zdroj: archiv autora)
7.2 Aplikace imunohistochemie
Imunohistochemie
získala
dominantní
postavení
mezi
vyšetřovacími
metodami
v histopatologii. Výhody jsou zřejmé: značná senzitivita a specificita, použitelnost na rutinně
zpracovávaný materiál (dokonce i na dlouhodobě archivované vzorky v podobě parafínových
80
bločků) a přesná korelace s tradičními morfologickými parametry. Modifikované metody
mohou být použity pro vyšetření cytologické nebo elektronmikroskopické. IHC tak
redukovala nebo zcela nahradila mnoho dříve používaných konvenčních speciálních barvení a
do určité míry i elektronovou mikroskopii (např. v diagnostice glomerulonefritid). Počet
antigenů, které mohou být zjišťovány imunohistochemicky, je velmi vysoký a stávající
spektrum se neustále rozšiřuje. Teoreticky každá substance je antigenní a její antigenicita
alespoň částečně zachovaná ve tkáních může být imunohistochemicky prokázána. Největší
předností IHC metod ve srovnání s ostatními imunoanalytickými metodami je průkaz
sledovaného antigenu in situ, tj. v buňkách, v tkáňových kulturách a řezech z tkáňových
bloků.
Ačkoliv základem pro histopatologickou diagnostiku je morfologie, v menším, ale přesto
nezanedbatelném počtu případů nemůže být diagnóza stanovena pouze na základě
morfologických kritérií. Za těchto okolností pak plní nezastupitelnou roli IHC a vzájemně se
s morfologickým obrazem vhodně doplňují. IHC je třeba vždy využívat selektivně. Použití
imunohistochemie v bioptické diagnostice na rutinních parafínových řezech je limitovano
jednak možnostmi čistě morfologické diagnózy, jednak existencí detekovatelných markerů.
Výběr vhodného markeru v procesu diferenciální diagnózy závisí na množství faktorů jako
jsou klinická manifestace, histologický vzhled patologické léze, dostupnost markeru-antigenu
ve vyšetřované tkáni a existence odpovídající protilátky. IHC našla své uplatnění jak
v nenádorové, tak především v nádorové patologii.
Nenádorová diagnostika má poměrně limitované využití imunohistochemie a uplatňuje se
zejména v oblasti renálních, svalových, střevních a kožních biopsií či v průkazu
extracelulárních substancí (např. kolagenu, amyloidu) a specifických infekčních agens (HPV,
CMV apod.)
Nádorová patologie se opírá z velké části o imunohistochemii, která v onkopatologii plní
funkci diagnostickou, prognostickou a/nebo prediktivní. Diagnostický význam IHC spočívá
v průkazu diagnostických nádorových markerů, které slouží k diferenciální diagnostice
nediferencovaných (anaplastických) nádorů, k subtypizaci epitelových a mezenchymových
nádorů, ke klasifikaci hematologických malignit (leukémií a maligních lymfomů), ke
81
klasifikaci ostatních nádorů či jejich odlišení od nenádorových reaktivních změn apod.
V poslední době stoupá prognostická a prediktivní role IHC u zhoubných nádorů, která
spočívá v detekci proliferačních markerů, proteinů buněčného růstu, receptorů růstových
faktorů a hormonálních receptorů aj. v závislosti na tom, jakou roli hraje prokazovaný antigen
v patologické tkáni. U nádorů jako karcinom prsu se stala IHC nutnou součástí kompletního
patologického vyšetření, které je vyžadováno onkology pro stanovení stagingu a výběr vhodné
cílené léčby. Často je nezbytné doplnění IHC vyšetření analýzou molekulárně genetickou.
V následujícím oddíle uvádíme vybrané příklady využití IHC v onkopatologii.
A: Diagnostická funkce IHC
Diagnostická patologie skýtá doposud nejširší prostor pro uplatnění imunohistochemie. Pro
představu uvádíme příklad z diferenciální diagnostiky prostatických lézí.
Prostatické žlázky jsou vystlány dvěma vrstvami epitelových buněk – bazálních a
sekretorických (Obrázek 7.5).
bazální buňky
luminální buňky
Obrázek 7.5 Epitelová výstelka prostatických žlázek (Zdroj: archiv autora)
Bazální buňky lze spolehlivě verifikovat IHC průkazem vysokomolekulárního cytokeratinu
CKHMW
(který
je
negativní
v buňkách
luminálních).
V reaktivně
proliferujících
prostatických žlázkách zůstává vrstva bazálních buněk zachována, zatímco v neoplastické
proliferaci žlázek tato vrstva chybí. Diferenciální diagnostika mezi oběma zmíněnými lézemi
82
prostaty bez IHC vyšetření bazálních buněk v mnoha případech není možná (Obrázky 7.6A,B;
7.7A,B)
Obrázek 7.6: Hyperplastická proliferace žlázek prostaty
A (barvení H&E); B (IHC pozitivita bazálních buněk) (Zdroj: WebPathology.com)
A
A
B
B
Obrázek 7.7 Hyperplastická žlázka prostaty (nahoře) a karcinom prostaty (dole)
A (barvení H&E); B (IHC pozitivita bazálních buněk nenádorové žlázky, negativita (chybění)
bazálních buněk v nádoru) (Zdroj: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1092913410001863)
83
B: Prognostická a prediktivní funkce IHC
V poslední době se stále více uplatňuje prognostická a prediktivní role IHC, zejména
v souvislosti s rozvojem cílené terapie nádorů. Prediktivní využití je založeno na detekci
přítomnosti určitého biomarkeru v nádorových buňkách, který může předurčovat senzitivitu
vůči konkrétnímu léku. Rutinně se detekují např. receptory pro steroidní hormony (estrogenní
a progesteronové) (Obrázek 7.8) a receptorová tyrosinkináza HER2/neu (cerb2) v buňkách
karcinomu prsu (Obrázek 7.9; Tabulka 7.2).
ER
Obrázek 7.8 Invazivní duktální karcinom prsu. (Zdroj: archiv autora)
IHC: jaderná pozitivita estrogenového receptoru (ER) v nádorových buňkách.
Skore 0
Skore 1+
84
Skore 3+
Obrázek
Skore 4+
7.9
Detekce
receptorových
tyrozinkináz
HER2/NEU
v
ca
prsu-IHC
(Zdroj:
http://www.dako.com/)
Tab. 2: IHC hodnocení receptorové tyrosinkinázy HER2/neu v ca prsu
Skore
0
Hodnocení
IHC vzhled
negativní
1+
negativní
2+
slabě pozitivní
3+
silně pozitivní
Neg/membránová pozitivita u <10%
nádorových bb.
Inkompletní membránová pozotivita u
>10% nádorových buněk
Kompletní membránová pozitivita
slabá u >10% nádorových buněk
Kompletní membránová pozitivita silná
u >10% nádorových buněk
Závěrem lze konstatovat, že stojíme na začátku nové éry terapie zhoubných nádorů – tzv.
cílené terapie, ve které bude v daleko větší míře než doposud hrát roli prediktivní
imunohistochemie a molekulární diagnostika. Patolog tak musí být ještě aktivnějším
partnerem
klinického týmu, neboť se přímo podílí a nadále bude podílet na volbě
nejvhodnější personalizované terapie.
85