Untitled

Obsah
Fermentační část .............................Chyba! Záložka není definována.
BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ ...................... 4
Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů............. 4
Bioreaktor ....................................................................................... 4
Klasifikace typů bioreaktorů ...................................................... 5
Kultivace SSC a SLC ..................................................................... 6
Ideální bioreaktor ....................................................................... 7
Submerzní kultivace v kapalném médiu .................................... 8
Speciální bioreaktory ................................................................. 8
Míchání bioreaktorů ...................................................................... 9
Pneumatické míchání bioreaktorů ............................................ 9
Bioreaktory s fluidním ložem ................................................... 10
Mechanicky míchané bioreaktory ........................................... 10
Základní typy míchadel ............................................................ 12
Přestup tepla ................................................................................ 13
Aerace a přestup kyslíku .............................................................. 14
Kultivační půdy – média ............................................................... 15
Příprava inokula ........................................................................... 16
Sterilizace u bioreaktorů .............................................................. 16
Hodnocení sterility ................................................................... 17
Sterilizace vzduchu a odplynů ................................................. 17
Inokulace ...................................................................................... 17
Základní typy kultivačních procesů.............................................. 18
2
Vsádková kultivace (batch) ...................................................... 18
Přítokovaná kultivace (fed-batch) ........................................... 20
Strategie řízení přítokování ..................................................... 20
Kontinuální kultivace ................................................................ 20
Optimalizace bioprocesu.............................................................. 21
Optimalizace složení média ..................................................... 21
Optimalizace kultivačních parametrů...................................... 22
Monitoring a automatizace...................................................... 22
Kultivace rekombinantních mikroorganismů .............................. 23
Prokaryotní expresní systém – E. coli ...................................... 23
Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris .......................... 23
Použité zdroje ............................................................................... 24
Doporučená literatura .................................................................. 24
Internetové zdroje ........................................................................ 25
3
BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ
Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů
Základem pilotních a průmyslových biotechnologických procesů jsou kultivace a
biotransformace v bioreaktorech. Jednoduchým bioreaktorem je jakýkoli uměle
vymezený prostor, kde bioprocesy mohou probíhat. Například třepaná baňka je
jednoduchým bioreaktorem.
Bioreaktor
Bioreaktor je zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze
substrátu na jeden či více produktů. V moderním a širším slova smyslu není vždy nutné,
aby se procesu zúčastnily buňky, i např. Enzymové biotransformační reaktory můžeme
nazvat bioreaktory.
Bioreaktory můžeme klasifikovat podle různých hledisek, ale výše zmíněná
třepaná baňka zůstává prototypem transportních procesů, které jsou pro bioproces
nezbytné (Obr. 3.1).
Obrázek 3.1. Transport živin a metabolitů.
Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance, 1. mezifázové rozhraní plyn-kapalina,
2. transport v kapalině, 3. kapalina-pevná fáze, 4. transport aglomerátem, 5. transport přes
biologické membrány.
4
Klasifikace typů bioreaktorů
Bioreaktory rozdělujeme podle různých hledisek, základní dělení je podle fáze:
Submerzní – nositelé bioprocesu (buňky, enzymy, agregáty, imobilizáty) se volně
vznášejí v kapalné fázi živného média,
Na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a nositelé bioprocesu
tvoří povlak čí nárůst; i tady se zpravidla tvoří mezistrukturní vrstvičky kapaliny,
Imobilizované – nositelé procesu jsou nějakým způsobem ukotveni v pevné struktuře.
Obrázek 3.2. Některé typy submerzních bioreaktorů
1. mechanicky míchaný tank, 2. průtočný s nepohyblivou
náplní, 3. kombinovaný pro bioplyn, 4. enzymový
membránový, 5. pneumatický, 6. s pevnou fází
5
Jiné dělení může být podle objemu procesu:
Měřítko:
•
•
•
•
Laboratorní (do 30 l)
Čtvrtprovozní (do 100 l)
Poloprovozní (do 5000 l)
Provozní (nad 5000 l)
Charakter pohybu média i nositelů procesů zakládá dělení podle operačního módu:
•
•
•
Vsádkový (batch) - všechny živiny jsou vloženy do procesu již na počátku,
metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ procesu,
Přítokovaný (fed-batch) – k základnímu objemu v bioreaktoru přitéká další médium s
novými živinami, metabolity se opět hromadí,
Kontinuální – existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou zadržováni, nebo odtékají.
Další základní dělení je na aerobní (za přístupu kyslíku), mikroaerobní
(minimální přístup kyslíku, zpravidla množství, které se rozpustilo a absorbovalo před
uzavřením reaktoru) a anearobní (přístup kyslíku je zamezen).
Neméně důležité dělení je podle konstrukce bioreaktorů, pro ilustraci Obr. 3.2:
•
•
•
•
•
Míchání
▪ Mechanické, pneumatické nebo hydraulické
Fluidní vrstva
Náplňové
Speciální
Membránové, fotobioreaktory, reaktory pro kultivace na pevném substrátu, atd.
Kultivace SSC a SLC
Tyto podivné zkratky znamenají dva základní typy kultivací v klasifikaci podle
provedení, které mají zásadní vliv na typ použitého bioreaktoru. Jsou to kultivace na
pevném substrátu (SSC – solid-solid-cultivation) a submerzní kultivace v kapalině (SLC
– solid-liquid-cultivation). Toto pojmenování označuje pevnou fázi buňky versus pevnou
nebo kapalnou fázi substrátu.
Mezi rozdíly mezi SSC a SLC patří:
6
! Gradient živin
� U SSC přístup k povrchu buňky je omezen, živiny v bezprostředním okolí jsou
vyčerpávány a další musí k buňkám difundovat. SLC – v ideálně míchaném
reaktoru gradient neexistuje.
! Vrstva substrátu
� SSC - pro omezený transport ve vlhkém, ale pevném prostředí nemá smysl
používat silnou vrstvu substrátu. Kapalného média bývá přebytek.
! Limitace transportu tepla a živin
� SSC - je dána omezenou difuzí, u SLC je přístup k buňkám dokonalý (pokud se
jedná o volné buňky) a je dána transportními procesy přes buněčné stěny a
membrány.
! Fáze
� SSC - třífázový systém pevná – kapalina – plyn, SLC – pouze dvoufázová systém
kapalina – plyn.
! Dodávka kyslíku
� SSC - kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze, což je problematičtější, SLC –
rozpuštěný kyslík z kapaliny a zároveň mezifázový přechod kyslíku z plynu do
kapaliny.
! Teplo
� SSC – teplo se odvádí plynou fází, SLC – kapalina je chlazena externím médiem
– nákladnější, ale mnohem účinnější.
! Sledování (monitoring) a řízení procesů
� SSC – velmi obtížné až nemožné, SLC – standardní postupy.
! Charakter růstu
� SSC – povrchový, SLC – submerzní.
! Koncentrace produktu
� Zde významná výhoda SSC – zpravidla vyšší koncentrace produktu ve srovnání
se SLC.
! Zvětšování měřítka procesu (scale-up)
� U SSC špatně definovatelné, u SLC standardní metodika.
Celkově spočívají výhody SSC pouze v jednoduchosti a nenáročnosti na strojní
vybavení, ve vyšší objemové koncentraci produktů a tím efektivnější izolaci, jednodušší
inokulaci a menším objemu odpadů. Dále v tom, že některé organismy se v submerzním
prostředí kultivují obtížně, nebo netvoří žádané produkty (např. Některé vláknité
mikroorganismy).
Ideální bioreaktor
Ideální bioreaktor má rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace,
nízké provozní náklady. Zpravidla se jedná o submerzní bioreaktor, ale to závisí na
7
charakteru nositele procesu a procesu samém.
Bioreaktor je proto nutné vybírat, případně konstruovat, s přihlédnutím k těmto
parametrům procesu:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Přestup kyslíku
Přestup tepla
Přestup hmoty
Požadavky na míchání
Nároky na energie
Citlivost kultury ke střižným silám
Reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné
síly)
Minimalizace odparu kapaliny
Tlaková odolnost
Sterilita operace
Čištění bioreaktoru
Bezpečnost
Účelová flexibilita a kompatibilita
Cena zařízení a jeho provozu
Přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up
Submerzní kultivace v kapalném médiu
Nadále se budeme věnovat submerzní kultivaci v kapalném médiu s volně
pohyblivou pevnou fází, jakožto typickému příkladu bioreaktorových aplikací. Tyto
kultivace se vyznačují několika charakteristickými parametry. Míchání – zajišťuje
homogenitu vsádky, ideální přístup živin a odvod metabolitů, odvod tepla. Regulace
teploty, pH a v případě aerobních procesů průtoku vzduchu nebo obohaceného vzduchu
představují další základní parametry, které musí aerobní míchaný bioreaktor zajišťovat.
Poslední parametr, ne vždy využitý, je přítokovací systém.
Speciální bioreaktory
Mezi speciální bioreaktory řadíme například fotobioreaktory, zařízení různé
konstrukce umožňující přístup světla k rostoucím fotosyntetizujícím kulturám, např.
Jednobuněčným řasám, cyanobakteriím.
Další velkou skupinou jsou bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi, o které bylo
stručně pojednáno výše. Konstrukce jsou opět různé, podle charakteru organismu a jeho
růstu. K těmto reaktorům se řadí i zařízení pro povrchový nárůst na kapalných médiích.
Bioreaktory pro kultivaci živočišných či rostlinných buněk – tkáňových kultur
8
přesahují rovněž rozsah tohoto textu.
Míchání bioreaktorů
Nejčastějšími způsoby míchání bioreaktorů jsou pneumatické, s fluidním ložem a
zejména mechanické.
Pneumatické míchání bioreaktorů
Nejznámějšími zástupci jsou bublané kolony a air-lift reaktory. Charakterizovat je
lze takto:
! Probublávané reaktory (kolony)
� Cylindrická nádoba, poměr průměru k výšce 1:2 (kolona)
� Rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru
� Nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb
� Přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění vzduchu a rheologií kapaliny
� Maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 m/s
� Nevýhoda – obvykle malý přestup kyslíku
• Relativně malé mezifázové rozhraní
• Bubliny postupem vzhůru koaleskují (spojují se)
! Air-lift reaktory (s vestavbami)
� Vestavby – zarážka, cirkulační trubka
� Funkce vestaveb:
• Dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování mezifázového povrchu
– zvyšuje přestup kyslíku
• Organizování toku fází
• Zvýšení doby prodlení plynu
• Zvýšení mikroturbulence
� Air-lift reaktory lze vybavit cirkulační trubkou nebo vnější cirkulací.
Princip bublané kolony a air-lift reaktoru s centrální cirkulační trubkou je patrný na
Obr. 3.3.
Obrázek 3.3. Pneumaticky míchané bioreaktory
9
a) bublaná kolona, b) air-lift reaktor s cirkulační trubkou.
Bioreaktory s fluidním ložem
V reaktorech s fluidním ložem proudí kapalina směrem vzhůru a nadnáší –
suspenduje částice pevné fáze. Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované
mikroorganismy nebo enzymy. V horní rozšířené části se snižuje rychlost proudění a tím i
suspendace – dochází k separaci částic od kapaliny, která může opustit reaktor. Tyto
reaktory mohou být i aerované, většinou probubláváním.
Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované mikroorganismy nebo enzymy.
Samotné buňky jsou příliš lehké, špatně sedimentují a jsou nevhodné pro cirkulaci ve
fluidním loži. Uspořádání je kontinuální, živiny proudí přes náplň, metabolity a produkty
odváděny. Prostředí je nehomogenní, koncentrace živin se mění s výškou náplně, gradient
pH, špatné promíchávání. Tyto reaktory se využívají např. Při inhibice produktem
(rozdílná koncentrace produktu podél náplně).
Mechanicky míchané bioreaktory
V mechanicky míchaných submerzních bioreaktorech se procesu opět účastní
třífázový systém, plyn-kapalina-pevná fáze, kde plynem je zpravidla vzduch, kapalinou
médium a pevnou fází nositelé procesu, buňky, flokuláty, aglutináty atd. Účelem míchání
je opět homogenizace, transport živin a tepla a v aerobních procesech dispergace bublin
aeračního plynu. Při míchání mechanickými míchadly vzniká střihové napětí, které
způsobuje rozbíjení bublin a tím zvětšuje mezifázovou plochu. Střihové napětí však
rovněž působí negativně na pevnou fázi, zvláště na nepevné struktury, například vláknité
mikroorganismy.
10
Pro mechanicky míchané systémy je charakteristická vysoká turbulence a rychlý
přestup látky a tepla. U kyslíkově nenáročných, pomalých procesů a střihově citlivých
organismů se ale naopak používají nízké rychlosti otáčení, větší plochy míchadel a jejich
speciální tvary omezující střižné síly. Mechanické míchání je vždy kompromis mezi
maximální dodávkou kyslíku a homogenizací a velikostí střihových sil.
Obrázek 3.4. Aerovaný míchaný bioreaktor
1 - nádoba bioreaktoru
2 - plášť
3,4 - izolace
5 – přívod inokula
6 – porty pro pH elektrody
7 - míchadlo
8 – aerační věnec
9 – ucpávka
10 - převodovka
11 – motor
12 – vypouštěcí otvor
13 – chlazení pláště
14 – vzorkovací otvor s připojením páry
15 – prosklená plocha (pozorování obsahu)
16 – přívod roztoků na úpravu pH a
odpěňovadla
17 – vstup vzduchu
18 – víko
19 – přívod média
20 – odvod vzduchu
21 – porty pro senzory
22 – rozbíječ pěny
23 – přívod páry
24 – tryska
Základním systémem pro malé rigidní buňky s vysokou spotřebou kyslíku
(bakterie, kvasinky) je však mechanické míchadlo typu disková turbína, 4-6 listů, d
(průměr míchadla) asi 0.3 dT (průměr nádoby). Aby docházelo k co největší dispergaci,
je aerační věnec umístěn pod nejspodnějším míchadlem. Naopak, aby nedocházelo ke
vzniku středového víru a zvýšila se turbulence, je nádoba bioreaktoru vybavena
11
míchacími narážkami, což jsou podélné obdélníkové vestavby, zpravidla umístěné
pravidelných vzdálenostech po vnitřním obvodu nádoby. Narážky (zarážky) pro
optimální promíchávání se umisťují v počtu 4-8, d (šířka narážky) asi 0.1 dT.
Typická konstrukce aerovaného míchaného bioreaktoru (CSTR – continuous stirred tank
reactor) je na Obr. 3.4.
Základní typy míchadel
Základní typy míchadel jsou vrtulové, vyznačující se vysokou čerpací kapacitou,
menšími střižnými sílami, axiálním tokem čerpané suspense a turbínové, kde vysoké
střižné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin a dělicí kotouč zabraňuje
zkratovému toku vzduchu kolem hřídele. Čerpací kapacita je omezená. Na Obr. 3.5 a 3.6
jsou základní tvary míchadel.
Obrázek 3.5. Turbínová míchadla s různým tvarem a sklonem lopatek.
Obrázek 3.6: Míchadla
a) vrtulové, b) diskové turbínové s narážkami, c) diskové turbínové bez narážek.
12
CSTR standardního tvaru je vybaven obvykle více míchadly na společném hřídeli,
což výrazně zlepšuje homogenizace tanku, vzdálenost míchadel 1-1.5 D (průměr
nádoby), nejčastější počet je tři. Rychlost míchání je často omezena pouze konstrukčním
a materiálovým provedením bioreaktoru, avšak maximalizace otáček není efektivní ani
pro homogenizaci a provzdušnění.
Velikost míchadla se volí D/DT = 0.4-0.5 (průměr míchadla/průměr tanku), počet
narážek je čtyři a jejich šíře 0.1 DT. Vzdušnění (aerace) podporuje míchání a snižuje
míchací příkon. Poměr mezi příkonem aerovaného tanku (PG) a neaerovaného tanku (P)
vyjadřuje vztah:
VG je průtok aeračního plynu, n otáčky míchadla a d jeho průměr. Příkon
míchadel (P) je možno počítat pro newtonské kapaliny podle vztahů:
kde P0 – příkonové číslo, ρ – hustota, n – otáčky, d – průměr míchadla, µ – dynamická
viskozita.
Přestup tepla
V aerobních míchaných bioreaktorech vzniká teplo exotermickou činností
mikroorganismů nebo exotermickými reakcemi, dále třením při míchání a aeraci.
Množství uvolněného tepla u aerobních procesů je proporcionální spotřebovanému
kyslíku,
Q (kj/m3.s) = 0.12 . Ocr (mmol o2/m3.s)
kde Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol
utilizovaného O2. U submerzních kultur to bývá 3-15 kJ/m3.s.
Odvod tepla je realizován prostřednictvím aktivního chlazení přes externí plášť či
interní vestavby. Při zvětšování měřítka (scale-up) si přestup kyslíku a tepla zaslouží
zvláštní pozornost - větší objem znamená menší chladicí plochu.
13
Aerace a přestup kyslíku
Aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace vyváří
relativně velké mezifázové rozhraní. Hodnotí se pomocí tzv. Stupně dispergace a:
kde Db – průměr bublin (ideálně 2-3 mm), ε – plynová zádrž.
Celkový průtok vzduchu bioreaktorem se nejčastěji klasifikuje jako hodnota vvm
– volume/volume/minute:
Kde vg – průtok vzduchu (aeračního plynu), vr – objem reaktoru.
Přestup kyslíku je základní parametr, který charakterizuje aerobní bioreaktor. Je
obvykle vyjádřen koeficientem přestupu hmoty kla, který je konstantou úměrnosti mezi
rychlostí přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (OTR – oxygen transfer rate) a
gradientem koncentrací:
kde C*,C – rovnovážná a aktuální koncentrace kyslíku. Rychlost spotřeby kyslíku
mikroorganismy nebo biotransformační reakcí je charakterizována vztahem:
kde X – koncentrace biomasy, qo2 – specifická respirační rychlost, µ – specifická růstová
rychlost, Yx/o – výtěžnost biomasy na kyslík.
Rovnovážnou koncentraci kyslíku ovlivňují především fyzikální vlastnosti média
- teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita). Aktuální koncentraci pak
geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a velikost míchadla, příkon, zarážky,
aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, způsob operace, vlastnosti kapaliny
(morfologie a koncentrace mikroorganismů, odpěňovací činidla). Ve velkých
fermentorech (>5000 L) bývá OTR < 300 mmol/L.h.
Zvyšování přestupu kyslíku (OTR) se provádí zvýšením průtoku vzduchu,
zvýšením otáček míchadla, zvýšením tlaku v bioreaktoru, zvýšením obsahu kyslíku ve
vzduchu. Je však třeba upozornit, že vzájemné závislosti jsou nelineární a jsou
popisovány poměrně složitými modely.
14
Kultivační půdy – média
Kultivační média jsou nezbytná pro kultivaci - růst a metabolismus
mikroorganismů. Dále tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje fyziologii a chování
mikroorganismů a tím ovlivňují výtěžnost, rychlost tvorby produktu a složení produktu.
Živiny obsažené v médiu jsou potřebné pro růst buněk, získávání energie pro syntézu
produktů a zachování buněčné integrity.
Pro technologické účely dělíme média na KOMPLEXNÍ a DEFINOVANÁ.
Komplexní média obsahují zpravidla všechny potřebné živiny v ne zcela přesně
definovaném složení, což je dáno jejich původem. Bývá to organický zdroj živin, např.
Hydrolyzáty proteinů (peptony), extrakty masa, kvasnic, mléka, různé směsi rostlinných
živin apod. Definovaná média mají přesně známé složení, obvykle roztoky minerálních
solí, čisté esenciální živných komponent a jeden nebo více zdrojů uhlíku a energie.
Médium představuje zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu
nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy, dále zdroj
energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě
energie (jako donory nebo akceptory elektronů). Elementární složení všech mikrobiálních
buněk je relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků mikroorganismů na
živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P).
Při návrhu složení média je nutno znát biochemii kultivace, jeho případný vliv na
metabolismus a fyziologii buněčné populace, dále účel kultivace a průběh DSP. Cena
média tvoří přes 50% ceny konečného produktu, je tedy třeba ji zohlednit. Důležitá je
také stálost jeho složení.
Formulace média je vždy kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a
dostupností složek. Elementární chemické složení média se určí ze složení biomasy a
produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů.
Uhlíkatý substrát - část je oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané
energie je na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace). Poměr asimilované a
disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje. Maximální výtěžnost substrátu čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí
se to v YX/S.
Hlavní elementární složky médií jsou obvyklé biogenní prvky. Dalšími složkami
jsou stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu, růstové faktory - esenciální org. sloučeniny,
které si buňka neumí sama syntetizovat, vitamíny – často kofaktory enzymů, Laminokyseliny – především glutamová, puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových
kyselin, VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná, odpěňovadla – povrchové napětí,
oleje, polyglykoly polymery (PPG).
Při přípravě médií je nutno dbát na pH a iontovou rovnováhu. Ke stabilizaci pH se
15
užívají pufry (organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES). Regulace pH se
provádí během kultivací, většinou pomocí NaOH, NH3, H3PO4, H2SO4. Iontová síla i
redox potenciál také ovlivňují růst, produkci a produkty.
Příprava inokula
Průmyslové kultivační procesy začínají stejně jako laboratorní, z čisté kultury
produkčního kmene. Kmeny se uchovávají standardním způsobem, lyofilizované,
hluboko zmrazené, nebo klasicky přeočkováváním na pevných, mnohdy selektivních
půdách. Revitalizace se obvykle provádí v kapalném médiu.
Abychom dosáhli potřebného kultivačního objemu, je zpravidla zapotřebí
několika stupňů. Všem stupňům před produkčním se říká inokulační, objemový poměr
pro převod je 1:10 až 1:20, může však být i mnohem vyšší; pak je třeba počítat s delší lag
fází.
V inokulačních stupních je důraz na růst, nikoli produkci, často se používají
komplexní média. Stupňů by mělo být co nejméně, mohou způsobit změnu chování nebo
charakteru kultury.
Sterilizace u bioreaktorů
Řada produkčních procesů je aseptických. Sterilita znamená nepřítomnost živých
organismů, tedy vyjma těch produkčních. Kultivačnímu procesu tedy předchází
odstranění veškerých živých mikroorganismů ze zařízení a je nutné zabránit vstupu
kontaminace po sterilaci. Provádí se tedy sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího
zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací
zařízení, senzory atd.).
Kontaminace způsobuje například:
•
Produkci toxinů (bezpečnost produktu, inhibice produkčního kmene)
•
Produkci enzymů (degradace produktu)
•
Snížení výtěžnosti (spotřeba substrátu)
•
Produkci metabolitů (polysacharidy)
•
Spotřebu části substrátu (výtěžnost).
Vlastní sterilizace média a bioreaktoru se provádí:
16
• ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa
• horkým vzduchem 150-180ºC
• chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol, formaldehyd....
• UV, X-rays – většinou povrchy, prostory
• ultrafiltrace – plyny, roztoky
• velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu
Hodnocení sterility
Používá se tzv. D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10, která závisí na
odolnosti mikroorganismu.
kde n – počet živých zárodků, t – čas sterilizace, k - konstanta MO pro mokré/suché
teplo.
Sterilizace vzduchu a odplynů
! Nutnost sterilizace velkých objemů:
� Vzdušnění obvykle 1 VVM
� 10 m3 reaktor – za 48 h 29 000 m3 vzduchu
! Koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu
! Ultrafiltrace – splňuje všechny požadavky, používá se ke sterilizaci vzduchu,
hydrofobní membránové filtry v patroně, póry 0.1 µm
Inokulace
Inokulace je aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně. Je
vhodné ji provádět pomocí sterilizovatelného potrubního spojení tanků a čerpat tlakem
sterilního vzduchu. Také se používají sterilní inokulační jehly a septa v aperturách ve
víku bioreaktoru. V tom případě se používají sterilní hadice a čerpání peristaltickými
čerpadly - inokulum tak nepřichází do styku s čerpadlem.
17
Základní typy kultivačních procesů
! Vsádková (batch)
� Uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani odvod metabolitů
! Přítokovaná (fed-batch)
� Přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantní
! Kontinuální (continuous cultivation)
� Otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, konstantní objem reaktoru
�
Vsádková kultivace (batch)
Jedná se o uzavřený systém, všechny živiny i inokulum jsou přivedeny na počátku
kultivace a postupně spotřebovávány, dochází k akumulaci biomasy a metabolitů. Objem
bioreaktoru je konstantní, zanedbává se změna objemu při úpravě pH, odpěňování,
vzdušnění.
Fáze vsádkové kultivace:
•
Lag fáze
•
Exponenciální fáze
•
Stacionární fáze
•
Fáze odumírání
•
Mezi jednotlivými fázemi jsou tranzientní stavy
Snažíme se obvykle o minimalizaci lag fáze, prodloužení a exponenciální fáze.
Při produkci ve stacionární fázi se prodlužuje tato.
V exponenciální fázi probíhá intenzivní a pravidelný růst – lze ho sledovat jako
koncentraci buněk nebo biomasy.
kde x je koncentrace biomasy, µ růstová rychlost, t čas, x0 počáteční koncentrace
biomasy.
Chceme-li proces urychlit (produkt je přímo spojen s růstem), maximalizujeme
růstovou rychlost:
•
Složení média, teplota, pH, DOT, koncentrace substrátů atd.
•
Množství vytvořené biomasy přímo úměrné množství spotřebované živiny
•
výtěžnost (yield):
18
•
Rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby živiny a naopak
•
Hodnota yx/s je za různých podmínek různá.
Typický průběh vsádkového procesu v exponenciální fázi ukazuje Obr. 3.7.
Obrázek 3.7. Vsádkový proces
s - substrát, O - rozpuštěný kyslík, P - produkt, X – biomasa, µ – růstová rychlost.
Řízením vsádkového procesu se pokoušíme:
•
Produkce biomasy – maximální délka exponenciální fáze růstu
•
Produkce primárního metabolitu – prodloužení exponenciální fáze růstu za současné
produkce metabolitu
•
Produkce sekundárního metabolitu – krátká exponenciální fáze, prodloužená
stacionární fáze.
19
Přítokovaná kultivace (fed-batch)
Jedna nebo více živin dávkováno do bioreaktoru během kultivace, produkt
zůstává v bioreaktoru, Vr není konstantní. Řízením rychlosti přítokování limitujícího
substrátu lze ovlivnit rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a
metabolismu. Výhodou je, že řízenou změnou koncentrace živin lze ovlivnit výtěžek
nebo produktivitu. Živiny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem
bioreaktoru roste.
Fed-batch kultivace se používá když nastává nebo je třeba:
•
Substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.)
•
Hustá kultura – vysoká koncentrace buněk
•
Glukosový efekt (over-flow metabolismus)
•
Katabolická represe – snadno metabolizovatelný zdroj (glukosa)
•
Optimalizace tvorby metabolitu – produkce ak, řízené udržování nízké koncentrace s
•
Prodloužení produkční fáze (oddělení produkční a růstové fáze) – sekundární
metabolity
Strategie řízení přítokování
Strategie řízení přítoků při fed-batch kultivacích jsou různé, např. Koncentrace
substrátu se udržuje konstantní nebo se mění podle předem připraveného, či adaptivního
algoritmu. Pomalý konstantní přítok média vede zpravidla k lineárnímu růstu celkové
biomasy, exponenciální přítok média (a v něm limitujícího substrátu) by měl způsobit
exponenciální růst. Možné je i přítokování média podle zvoleného parametru spojeného s
růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace).
Přítokování podle předem daného schématu lze realizovat jako přerušovaný
nástřik nebo kontinuálně dle vypočtené funkce. Pokud má přítokování reagovat na stav
kultivace pak se využívá zpětná vazba je přímá, podle měření koncentrace substrátu v
bioreaktoru, podle toho upraven nástřik nebo nepřímá – měření jiných parametrů, které
jsou spjaté s metabolismem buňky – DOT, pH, CO2 a O2 v odplynech atd.
Kontinuální kultivace
Kontinuální kultivace je otevřený systém, kde dochází k plynulému
(nepřetržitému) dodávání živin (média) a zároveň k plynulému odběru média
pozměněného metabolickou činností mikroorganismů i s částí biomasy. Rychlost přítoku
je rovna rychlosti odtoku, objem bioreaktoru je konstantní. K rozmnožování
20
mikroorganismů dochází za podmínek blížících se optimu.
Základním a nejméně náročným typem kontinuální kultivace je chemostat:
V chemostatu je konstantní rychlost přítoku média f a konstantní zřeďovací
rychlost d, rychlost přítoku substrátu je tedy rovna rychlosti spotřeby substrátu a
mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní µ a konstantní X.
Dalšími typy kontinuálních kultivací jsou např. Turbidistat, kde je konstantní
turbidita (koncentrace biomasy) a mění se D (automatická regulace), nebo auxostat, kde
je konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D (nutristat: S=konst, oxistat:
DOT=konst, CO2stat: CO2=konst).
Optimalizace bioprocesu
Hlavní faktory, které určují kvalitativní i kvantitativní výsledky bioprocesů jsou:
•
Konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene
•
Optimalizace složení média
•
Výběr typu kultivace
•
Podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritérií
•
Optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)
Optimalizace složení média
Prvním krokem je určení kvalitativního a semikvantitativního složení média. Za
tím účelem se provádějí baňkové pokusy a ke snížení počtu experimentů se využívají
optimalizační metody, např. Experimentální design odvozený od response surface
methodology, optimal či central composition design. Velmi důležitá je ekonomika složení
média, zvláště v produkčních stupních.
Dalším krokem je určení kvantitativního složení média, kde se vychází z
experimentů v laboratorním fermentoru a vhodného strukturovaného modelu s bilancí
procesu. Matematický model procesu nebo zařízení zahrnuje vztahy popisující jeho
chování v čase, je tvořen diferenciálními a nelineárními rovnicemi. Základem bývá
bilance:
VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE
21
Model procesu či zařízení je pro reálné použití třeba identifikovat, určit hodnotu
konstant a parametrů. Používají se metody shody experimentu s předpovědí modelu,
např. Aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců. Optimalizačními kritérii
jsou pak extrémy funkcí, kritérium optimalizace nazýváme účelovou funkcí.
Optimalizované proměnné jsou obvykle µ, π, YP/X, YP/S.
Optimalizace kultivačních parametrů
Základními kultivačními parametry jsou:
! Teplota
� Optimální růstová teplota kmene, lze využít pro změny rychlosti růstu a produkce
! pH
� Optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, vliv složení média,
indikátor metabolismu
! Aerace (řízení DOT)
� Podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v různých fázích, řízení
dostupnosti energie, změny metabolismu
Monitoring a automatizace
Prvky zajišťující monitoring a automatizační hardware a software jsou v dnešní
době již konstrukčními součástmi bioreaktorů. Reaktory jsou vybaveny senzory a
zařízeními pro měření základních stavových veličin, jako jsou pH, teplota, do, redox,
dco2, odplyny, x, s, p a pro měření a řízení základních procesních parametrů, jako jsou
otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky. Ještě v nedávné době to bylo realizováno
prostřednictvím analogových měřících a řídících jednotek, dnes je standardem ddc (direct
digital control) realizované plc (procesními počítači. S nimi spolupracují nadřazené
monitorovací, archivační a řídící systémy.
Základní regulace chodu bioreaktoru se dotýká:
! pH – automatizované dávkování H+ a OH! Teplota – dvojitý plášť, pára, tepelná média
! DO (koncentrace rozpuštěného kyslíku –
� Otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, frekvenční měniče
� Průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS
22
(hmotová spektrometrie) měření
� Tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SP (set-point, žádaná
hodnota)
! Přítokování � Tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji vážením reaktoru nebo
zásobníku.
Kultivace rekombinantních mikroorganismů
Prokaryotní expresní systém – E. coli
Dosud nejvíce využívaný prokaryotní expresní systém, zejména pro enzymy a
proteiny je prokaryotní expresní systém – E. coli. Produkce proteinů probíhá v
cytoplasmě a periplasmatický prostor, k dispozici je mnoho expresních vektorů a
promotorů. Nevýhodami jsou nestabilita vektorů, poruchy v iniciaci translace a elongace,
nestabilita mRNA a toxicita produktů pro hostitelskou buňku.
Kultivace rekombinantní E. coli má ale řadu výhod, lze kultivovat do vysoké
hustoty (HCDC) – (fed-batch), lze využít konstitutivní i regulované exprese (regulace
promotoru negativně represí nebo pozitivně – indukcí). Obvyklou kultivační strategií je v
první fázi nárůst biomasy, v další indukce exprese. Rizikem je možná špatná konformace
proteinů (folding), agregace za vzniku inkluzních částic. Obvykle se to řeší snížením
kultivační teploty – redukce rychlosti syntézy proteinů, správné sbalení.
Doba kultivace je závislá na kmeni a médiu, indukuje se často ve vrcholící
exponenciální fázi, vetšinou se tak získá maximum biomasy. Jako strategie se užívá batch i
fed-batch.
Doba exprese je závislá na kmeni a médiu, v produkční fázi dochází ke zpomalení
růstu – vliv nižší teploty a a probíhající exprese. Bývá nutné experimetální stanovení
optimálního lineárního přítokování. Samovolné zvýšení růstové rychlosti často znamená
ztrátu plasmidu. Kultivaci je třeba ukončit před přechodem k degradaci produktu.
Obvyklá doba 12 – 40 hodin.
Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris
Eukaryotní expresní systém je mladší generace, velmi populární, pracuje v
methylotrofní kvasince
pichia pastoris. Disponuje silným promoterem pro
alkoholoxidasu AOX, výhodou je snadná indukce a regulace. Kvasinka má silně
respirativní růst, kultivace se daří v hustých kulturách. Používá se pro expresi velkých
proteinů (>50 kD). Výhodou je rovněž posttranslační modifikace – glykozylace,
odstranění signálních peptidů, tvorba disulfidových můstků.
23
Kultivace rekombinantní P. pastoris je třístupňový proces, proto je zde nutnost
optimalizace vyšší než jinde. První fází je batch na glycerolu, kdy se vyprodukuje
biomasa za současné represe genové exprese. Následuje adaptační fáze – první fed-batch,
kdy je glycerol přítokován rychlostí limitující růst a poslední je produkční fáze – druhý
fed-batch, kdy je methanol (směs methanol+glycerol) přítokován v závislosti na
fenotypu, dochází k indukce exprese.
Použité zdroje
! Kultivační techniky, sylabus ÚKCHB VŠCHT
� http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf
! Bioinženýrství kvasných procesů (Mojmír Rychtera a Jan Páca, VŠCHT Praha 1987)
! Fyziologie bakterií (František Kaprálek, SPN 1986)
! Bioinženýrství (František Kaštánek, Academia 2001)
Doporučená literatura
Goering R.V.., H.M.Dockrel., M.Zuckerman., D.Wakelin., I.M.Roit.,
C.Mims., P.L. Chiodini. (2008) Medical Microbiology (4th Edition).
Elsevier . USA.
Ozturk. S. S., Wei-Shou Hu (eds.).(2008) Cell Culture Technology for
Pharmaceutical and cell based therapies. Taylor, Francis Book, New York,
London.
S. Maulik., S.D. Patel (eds),(1997). Molecular Biotechnology &#8211;
Therapeutic Applcations and Strategies. Wiley-Liss. USA.
Arora, D.K., G.G. Khachatourians.(2004). Applied Mycology and
Biotechnology (vol.4 Fungal genomics). Elsevier. Amsterdam.
A. Pischinger.(2007). The Extracellular Matrix and Ground Regulation.
Basis for a Holistic Biological Medicine. North Atlantic books. Berkeley,
Ca.
Kultivační techniky. Sylabus ÚKCHB VŠCHB.
24
Kaprálek F. (1986) Fyziologie baktérií.SPN Praha.
Kaštánek F. (2001). Bioinženýrství. Academia (Praha).
Rychtera, M., J.Páca.: Bioinženýrství kvasných procesů. Skripta VŠCHT
Praha.
Internetové zdroje
http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf
25