Nástroje pro genomiku a proteomiku

Transkript

11/14/2013
Úvod do nano- a mikrotechnologií





Nukleové kyseliny
Proteiny
Polysacharidy
Lipidy
….
jádro (eukar.) buněk
K. Záruba
1
11/14/2013

úseky molekuly DNA, které určují pořadí
aminokyselin v syntetizovaných bílkovinách
(translace)
2
11/14/2013
Translace
Transkripce
mRNA
Protein
Gen (DNA)
From Zohar Yakhini Lecture

jakou RNA, jaký protein daný úsek DNA kóduje
Bakteriální plasmidové vektory:


Vektory pro amplifikaci DNA
Vektory pro expresi genů
3
11/14/2013
Klonovací místo

Vytvoření kohesních konců pomocí restrikčních
endonukleas
Selekční marker
(rezistence k antibiotiku)
EcoRI
Počátek replikace
EcoRI
cggtacgtggtggtgaattctgtaagccgattccgcttcggggagaattccatgccatcatgggcgttgc
gccatgcaccaccacttaagacattcggctaaggcgaagcccctcttaaggtacggtagtacccgcaacg
gen
„Normální“ rýže
„Zlatá“
rýže.Tato transgenní rýže obsahuje beta-karoten, který je
zdrojem vitamínu A. Tato rýže pomáhá odstranit nedostatek vitamínu A
u poloviny světové populace – která je závislá na rýži jako hlavní
potravině.V současnosti trpí 70% dětí stáří do pěti let v jihovýchodní
Asii nedostatkem vitamínu A.
4
11/14/2013


dostatečné množství vzorku k analýze:
polymerázová řetězová reakce, PCR

polymerázová řetězová reakce, PCR

Kary Mullis
čtení: Sangerova metoda sekvenování

Oddělení řetězců DNA teplotní denaturací

Nasednutí primerů
5
11/14/2013

Syntéza komplementárního vlákna
72 °C
http://www.scanelis.com/webpages.aspx?rID=679
6
11/14/2013

Lab-On-Chip

DNA polymerasa

Směs dNTP + značené dNTP

ddNTP

primer

sekvenování

Frederik Sanger
7
11/14/2013
Primer pro každou ze čtyř
reakcí je značen odlišnou
fluorescenční barvou – každá
DNA končící dideoxy-bází má
jinou barvu – zde
A, C, G, T.
Primer pro každou ze čtyř
reakcí je značen odlišnou
fluorescenční barvou – každá
DNA končící dideoxy-bází má
jinou barvu – zde
A, C, G, T.
8
11/14/2013
Biotin
Labeled cRNA
GeneChip
komplementarita
hybridizace
A -T
A
A
G
C
T
G
G
T
C
C
-
C-G
Hybridized Array
L
L
+
T
T
C
G
A
C
C
A
G
G
L
L
L
+
L
L
L
L
L
L
L
SAPE
Streptavidinphycoerythrin

skleněný nebo plastový povrch

stovky až tisíce míst (pixelů)

každé místo obsahuje určitý úsek jednovláknové DNA
(ssDNA)

takové místo se označuje próba (the probe)
SIAC 2001 Intro to gene
chips - 38
9
11/14/2013
HYBRIDIZACE

ssDNA nanesena na substrát, obsahuje hledaný gen

DNA ze vzorku označena a nanesena na čip (hybridizace)

analýza jednotlivých pixelů
stejná množství různě
značených fragmentů DNA
SKEN
Laser
DeteKtor
Typical Ink Jet Spot Deposition Results
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html
Volume per spot:
Spot size:
Spot density:
250 nl
1100 µm
70/cm 2
Volume per spot: 0.5 nl
Spot size:
µm
115
Spot density:
Labelled BSA 4800/cm 2
10
11/14/2013

Pohyb laseru




Perfektní prostorové rozlišení
Dobrá citlivost, ale může docházet k vysvěcování fluoroforů
Pomalé
Použití CCD kamery




sample
(labelled)
pseudo-colour
image
Horší prostorové rozlišení
Snadno nastavitelná citlivost (expoziční čas)
Rychlejší a levnější než lasery
Výsledkem je obrázek zachycující fluorescenci jednotlivých
míst čipu
probe
(on chip)

jaké místo odpovídá jakému genu
Duplikace jednotlivých míst


Umístění rozpoznávacích sekvencí na čip


[image from Jeremy Buhler]
reprodukovatelné výsledky
Kontrola


Molekuly DNA na skle

pozitivní vzorek na kontrolním místě

negativní vzorek (bakteriální geny mezi lidskými)
Oligonukleotidy na skle nebo polymerním čipu (Affymetrix)

bodové mutace (hybridizace ano/ne)
11
11/14/2013

Variabilita nekódujících úseků lidského genomu

Dva hlavní typy


Polymorfismus jediného nukleotidu (Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs))

Variabilní počet tandemových opakujících se
sekvencí (Variable Number Tandem Repeats
Polymorphisms (VNTR))

Oba užívány v genetické analýze

Single Nucleotide Polymorphisms
Variable Number Tandem Repeats Polymorphisms

Variable Number Tandem Repeats Polymorphisms
12
11/14/2013

DNA fingerprinting

studium struktury proteinů a jejich funkce

zaměření na biomarkery (příznaky zdraví, nemoci, průběhu
léčby)

včasná diagnostika

proteiny v krvi (krevní sérum)




albuminy (60 %)
imunoglobuliny (18 %)
fibrinogeny (4 %)
regulační proteiny (<1 %)
13

Nástroje pro genomiku a proteomiku

Transkript

Podobné dokumenty

Dezinfekce a antisepse ve veterinární praxi

Prezentace aplikace PowerPoint - Laboratoř experimentální medicíny

Program konference

Pozor! - PROHOPO.cz

Ordinace žen_2015_2 příloha.indd

Vyšetření neznámých typů mutací v omezené oblasti genu (do cca

Halina Šimková: BREVIÁŘ FORENZNÍ GENETIKY

Nanomedicína

kudy do nanosvěta