Přednáška 10

BIOSENZORY
• Senzory snímají zvolenou fyzikální,
chemickou, elektrickou, mechanickou,
optickou nebo jinou veličinu v určité formě,
například:
– změna tvaru (deformace)
– změna elektrického odporu, kapacity, …
– změn intenzity světelného toku
– frekvence vibrací
– změna charakteru akustických vln
Senzory – příklad člověk
• Senzor – uši, nos, hmat, jazyk,
oči
• Převodník – mozek převádí
analogové vjemy na elektrické
signály, které dále zpracovává
• Akční člen – ruce, nohy
provedou analogový výstup
(pohyb) na základě
elektrického signálu dodaného
mozkem
Senzory – příklad, kardiostimulátor
• Senzor – elektroda,
detekuje elektrické pulsy
na srdci
• Převodník – tělo
kardiostimulátoru –
analyzuje tepovou
frekvenci a rozhoduje o
úpravě rytmu
• Akční člen – elektrody –
vydávají elektrické pulsy,
a tak stimulují nebo
upravují srdeční činnost
BIOSENZORY
IUPAC:
A self-contained integrated device which [sic] is capable of providing specific quantitative or
semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in
direct spatial contact with a transducer element
WIKIPEDIA: A biosensor is an analytical device, used for the detection of an analyte, that
combines a biological component with a physicochemical detector.
2 základní části: bio- element a sensor-element
Princip:
Vzorek
Biologický
rozpoznávací
prvek
Převodník
SIGNÁL
VZOREK: cokoliv co je nějakým způsobem spojené s bio (živou přírodou)
BIOLOGICKÝ ROZPOZNÁVACÍ PRVEK: rozeznává analyt/target (molekulu, buňku, …),
který se snažíme detekovat
PŘEVODNÍK (TRANSDUCER): schopen převést informaci o rozpoznání hledané molekuly na
měřitelnou veličinu (resonantní, optické, elektrochemické,…)
Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures, Sensors 2008, 8, 1400-1458
UPLATNĚNÍ:
1. Quality assurance in agriculture, food and pharmaceutical industries (E. Colli, Salmonella)
2. Monitoring environmental pollutants and biological warfare agents (Bacillus anthracis)
3. Medical diagnostics (glukóza)
4. Biological assays (DNA microarrays)
Typy biosenzorů:
1. Katalytické: zařízení, které měří koncentraci chemické složky vzniklé či zaniklé díky
biokatalytické aktivitě (enzymy, microorganismy, organely, tkáně)
2. Afinitní biosenzory: receptor specificky váže molekulu, což způsobuje fyzikálně-chemickou
změnu na převodníku
receptory: protilátky, nukleové kysliny, receptory hormonů
- detekce molekul biologického původu na základě specifických interakcí
ENZYMATICKÝ BIOSENZOR
Analyt = chemický či biologický target
Polopropustná membrána: upřednostňuje průchod analytu
(zabraňuje zanášení)
Rozpoznávací element: specifická interakce
Polopropustná membrána 2: upřednostňuje průchod produktu
specifické interakce
Elektrolyt: iontově vodivé médium
Převodník: detekce události rozpoznání převodem na měřitelnou
veličinu
TYPY ROZPOZNÁVACÍCH (specifických) PRVKů:
1. Enzymy
2. Protilátky
3. Nukleové kyseliny (aptamery)
4.
5.
6.
7.
Buňky
Tkáně
Polysacharidy
MIP
Monoklonální vs. polyklonální
Enzymy
- Biokatalyzátory
- Specifické vůči substrátu (S + E ----> SE ----> P + E)
- Komerčně dostupné biosenzory: glukóza, laktát, alkohol, sukróza, galaktóza, uric acid,
alfa amyláza, cholin, L-lysin = všechny amperometrické O2 / H2O2)
Glucose + O2 + H2O ------> Gluconic acid +H2O2
H2O2 -----> O2 + 2H+ + 2e- (proud na anodě)
Afinitní: nejčastěji protilátky a fragmenty nukleových kyselin
Molecularly imprinted polymers:
PRINCIP: Zámek a klíč
IMOBILIZACE ROZPOZNÁVACÍCH PRVKů:
Fyzikální adsorpce (Van der Waalsovy síly, hydrofobní síly, vodíkové vazby, iontové vazby)
Kovalentní vazba
Uchycení v membráně nebo např. polymerní matrici
Kovalentní vazba: funkční skupiny –NH2 -COOH –SH –COH (crosslinking chemistry)
Invitrogen:
Self-assembled monolayers: např. thioly na kovech, především zlatě
- Molekulární vrstva spontánně vytvořená na nějakém povrchu (adsorpcí) a uspořádaná
do více či méně organizovaných domén
Senzor - vlastnosti
• Dolní detekční limit – nejnižší hodnota veličiny, kterou
je senzor schopen rozlišit od pozadí
• Horní detekční limit – nejvyšší hodnota veličiny,
kterou je senzor schopen detekovat
• Dynamický rozsah – poměr mezních hodnot, které je
senzor schopen změřit
• Reprodukovatelnost – opakovatelnost měření –
statistické vyhodnocení
OPTICKÉ BIOSENZORY
„Optical Transducers“, optické převodníky
•
zdroj
Luminiscenční
- fotoluminiscence (fluorescence,
fosforescence)
- chemiluminiscenční (emise světla
následkem chemické
reakce)
světlo
vzorek
- bioluminiscenční (emise
následkem biochemické
reakce)
•
SPR (surface plasmon resonance)
•
Absorpční (málo využívané – krátká optická
dráha v mikrosystémech)
světlo
čidlo
Luminiscence
• Uvolňování energie ve formě světla.
• Luminiscence vzniká působením
elektrického pole, chemickou reakcí,
přeměnou mechanické energie, při fázové
přeměně aj.
Typy luminiscence
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Bioluminescence, by a living organism
Chemoluminescence, resulting of a chemical reaction
– Electrochemiluminescence, by an electrochemical reaction
Crystalloluminescence, produced during crystallization
Electroluminescence, in response to an electric current passed through it
– Cathodoluminescence, where beam of electrons impacts on a luminescent material
such as a phosphor
Mechanoluminescence, resulting from any mechanical action on a solid
– Triboluminescence, generated when bonds in a material are broken when that material
is scratched, crushed, or rubbed
– Fractoluminescence, generated when bonds in certain crystals are broken by fractures
– produced by the action of pressure on certain solids[1]
Photoluminescence, absorption of photons causing re-radiation of photons
– Phosphorescence, delayed re-radiation
– Fluorescence, where the emitted photons are of lower energy than those absorbed
Radioluminescence, produced in a material by the bombardment of ionizing radiation
Sonoluminescence, from imploding bubbles in a liquid when excited by sound
Thermoluminescence, when absorbed light is re-emitted on heating
Princip fluorescence:
(http://www.uni-leipzig.de/~pwm/web/?section=introduction&page=fluorescence)
GFP
Fluorescence
• Fluorofor absorbuje světlo určité vlnové délky a emituje světlo s delší vlnovou
délkou. Fluorescein – absorbuje modré 480 nm, uvolňuje zelené 520 nm.
• Fluorofory – organické látky, proteiny (GFP), kvantové tečky
• U látek, které přirozeně nefluoreskují je fluorofor kovalentně vázán na detekovanou
látku (značka)
• Problém – pokles intenzity fluorescence při dlouhodobé excitaci vlivem strukturních
změn molekul (neplatí pro kvantové tečky)
Absorpční a emisní
spektrum FITC nejběžnější fluorofor
Absorpční a emisní
spektrum GFP
Emisní spektra kvantových teček
o velkosti 2 nm (modré) – 5 nm
(červené). Excitace světlem 365 nm.
Fluorescenční spektroskopie
Zdroj – výbojka, dioda nebo
laser
Optické filtry
Detektor – spektrofotometr,
fotonásobič
Kvalitativní i kvantitativní
Fluorescence lifetime imaging
• Pulsní zdroj (dioda, laser LIF)
• Intenzita fluorescence po
vypnutí zdroje klesá
exponenciálně (pokud byl puls
velmi krátký)
• Intenzita emise je závislá na
okolním prostředí – pH, obsah
kyslíku, koncentrace iontů
• Využití zejména v biologii
Chemiluminiscence
• Chemická (biochemická) reakce spojená s
uvolněním světelného kvanta
• Příklad – enzym peroxidáza katalyzuje
přeměnu luminolu v alkalickém prostředí
• Peroxidáza bývá využívaná jako enzymová
značka různých proteinů (například protilátek)
2H2O2 + Luminol + OH-  3-aminoftalát + N2 + 3H2O + hn
- Luminol ve forenzní analýze
Chemiluminiscenční detekce
aminokyselin
v mikrofluidním čipu
Dansylace
Elektroforetická separace glycinu a
lysinu značených dansylem a následná
chemiluminiscenční kvantifikace.
Reakce aminoskupin dansylu a
aminokyseliny s oxidačním činidlem
vede k intenzivní chemiluminiscenci.
Dansyl chloride –
značka navázaná na
aminokyseliny
bis[(2-(3,6,9-trioxadecanyloxycarbony)-4-nitrophenyl]oxalate + H2O2 + dansyl-amino acids  hn
Hashimoto et al., Journal of Chromatography A 867, 2000, 271-279
Bioluminiscence
• Zvláštní forma chemiluminiscence, která nastává v
živých organizmech.
• Je spjatá s enzymovými reakcemi
zprostředkovávající přenos energie, zejména ATP a
NADH.
• Enzym luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu za
současného uvolnění fotonů.
• Pozorováno například u světlušek či mořských
živočichů.
ATP + Luciferin + O2  AMP + Oxyluciferin+ PP + CO2 + hn
Detekce ATP a metabolitů konjugovaných s ATP
To analyze ATP, all channels and reservoirs were
first filled with buffer. Buffer solution was then
replaced by BL (bioluminiscence) solution in the
BL reagent reservoir (BRR). Afterward, a
vacuum was applied at the buffer waste
reservoir (BWR) to drive the BL solution into
the channel connecting to the BRR. Then the
buffer solution in the sample reservoir (SR) was
changed to sample.
The sample containing ATP or ATP conjugates
was electroosmoticaly injected at the “cross”,
delivered to the joint of “Y”, where it mixed and
reacted with the BL reagent electroosmotically
driven through one arm of “Y” from BRR, and
then emitted luminescence in the stem of “Y”
(1) Picking up log-phase E. coli cells from cell culture.
(2) On-chip cell lysis and sample extraction. (3)
Injection with gated mode. (4) Separation from cell
background. (5) Mixing and reacting with BL reagent.
(6) Result read-out.
Liu B.F. et al., ANALYTICAL CHEMISTRY 77, 573-578,
2005
Surface Plasmon Resonance
• SPR (“surface plasmon resonance”) = Rezonance
povrchových plazmonů, Povrchová plazmová
rezonance
– optický hranol s nanesenou vrstvou kovu (zlata)
– zdrojový paprsek se v místě kovové vrstvy odráží a
generuje povrchový plazmon, který se šíří podél
rozhraní
– navázání proteinu/DNA vede ke změně povrchového
plazmonu a změně úhlu odraženého světla, které je
detekováno
PRINCIP SPR
- Resonantní oscilace vodivostních elektronů na rozhraní mezi materiálem s
kladnou a zápornou permitivitou (resonance: přirozená frekvence oscilace
elektronů = frekvence světla)
- Stimulované světlem (elektromagnetické vlnění)
- Povrchový plasmonový polariton = elektromagnetické vlnění které se šíří paralelně k rozhraní
kov/dielektrikum (např. voda, vzduch) – senzitivní k tomu, co se děje na povrchu
Základní schéma zařízení
SPR – pro on-line stanovení kinetických konstant
bioafinitních reakcí
SPR - paralelizace
Charakteristiky SPR
–Výhody
•Pracuje v reálném čase
•Do určité míry standardizovaná metoda
•Uživatelsky přátelské (komerční) systémy
•Vhodné pro masivní použití
•Metoda nevyužívající značení
–Nevýhody
•Vysoké investiční náklady (BIACORE 3000)
•Vysoké provozní náklady – hranoly s kovovými vrstvami
•Krátký prostorový dosah
Lokalizovaný povrchový plasmon (LSP)
Uzavření povrchového plasmonu v nanočástici o velikosti odpovídající či menší
než vlnová délka excitačního světla
Efekty: 1. elektrické pole u povrchu částice je značně zesíleno
(rychle klesá se vzdáleností od povrchu)
2. optické zhasnutí částice má maximum na frekvenci resonance plasmonu
(pro kovové nanočástice ve viditelné oblasti = zesílení fluorescence)
Biosensing with plasmonic nanosensors, nature materials | VOL 7 | JUNE 2008 | www.nature.com/naturematerials
ELEKTROCHEMICKÉ BIOSENZORY
Elektrochemické senzory
• Spojené s red-ox reakcí – přenos elektronů
• Při detekci biologických molekul je v systému často
zahrnut enzym katalyzující red-ox reakci – oxidoreduktáza
(glukóza oxidáza, horseradish peroxidáza …)
• Různé typy senzorů
– Ampérometrické (měření proudu za konstantního potenciálu)
– Voltametrické (měření proudu za kontrolované změny potenciálu)
– Potenciometrické (měření potenciálu elektrody při nulovém
elektrickém proudu)
– Vodivostní (měření vodivosti, pro enzymatické reakce – produkce
nabitých složek nebo změna vodivosti na elektrodě v důsledku
navázání biomolekuly)
– kapacitní
– Impedanční
– Field-effect
Princip elektrochemických biosenzorů
s enzymovou značkou
• Na elektrodě bývá umístěn polymerní (hydrofilní)
film obsahující imobilizovanou oxidoreduktázu
• Enzym katalyzuje přeměnu substrátu na produkty.
• Polymerní film musí být elektricky vodivý –
zprostředkovávat transfer elektronů mezi elektrodou
a chemickou reakcí
• Transfer elektronů je závislý na přítomnosti substrátu
Ampérometrický biosenzor – detekce
DNA molekul
Na elektrodu je vložen konstantní elektrický
potenciál
Po navázání DNA s enzymem soybean
peroxidázou v přítomnosti peroxidu vodíku
dochází k redukci peroxidového aniontu a
vzniku oxidované formy peroxidázy
Redukovaná forma peroxidázy je
obnovována pomocí přenašeče elektronů v
hydrogelu – ionty osmia
Ionty osmia jsou redukovány
elektrochemickou reakcí na povrchu
elektrody
Je zaznamenáván elektrický proud
Glukózový biosenzor:
Leland C. Clark (1956): použil Pt elektrodu k detekci kyslíku
- fyzikálně imobilizoval enzym glukózovou oxidázu (dialysis membrane)
blízko Pt elektrody
- Možné detekce: změna pH v důsledku vzniku glukonové kyseliny
- Spotřeba O2: fluorophore detekce
- Peroxid vodíku: elektrochemicky
GOD
Glucose + O2 + H2O ------> Gluconic acid +H2O2
H2O2 -----> O2 + 2H+ + 2e- (proud na anodě)
- Koncentrace glukózy se vyhodnocuje z měření
- koncentrace kyslíku nebo peroxidu
vodíku
- Amperometrická detekce: proud úměrný koncentraci glukózy
Ampérometrická detekce glukózy in-vivo
Možné implantování do těla pro kontinuální detekci hladiny cukru.
Glukóza proniká selektivně propustnou membránou do senzoru.
Glukóza je oxidována enzymem glukózooxidázou.
Oxidovaná forma enzymu je obnovována elektronovým přenašečem, který odevzdává elektrony na
elektrodě.
Je vložen konstantní potenciál, je měřen elektrický proud.
Imunoanalýza na čipu spojená
s elektrochemickou detekcí
Na elektrodě jsou vázány receptory –
protilátky.
Je přiveden vzorek obsahující antigen a
vzniká komplex Ab-Ag.
Je přivedena sekundární protilátka
obsahující enzym HRP.
Je přiveden roztok obsahující peroxid
vodíku a ortho-phenylenediamine - OPD.
Peroxid vodíku vytváří s enzymem
oxidovanou formu enzymu.
Redukovaná forma se obnovuje oxidací
OPD.
Oxidovaná forma OPD se může redukovat
příjmem elektronů z elektrody.
Zaznamenáván je proud.
K. Dill et al. / Biosensors and Bioelectronics 20 (2004)
736–742
Impedanční senzor – bezznačková
elektrochemická metoda
• Impedance
– “zobecněný elektrický odpor“
– Odpor, který elektrický obvod klade průchodu elektrického proudu při
vloženém napětí
– Vkládán je obvykle harmonický AC signál
– Vložen na obvod může být napěťový signál a měří se signál proudový
nebo opačně
• Definice
𝑉 𝑡
𝑍=
𝐼 𝑡
– Impedance je obecně komplexní číslo
– Zahrnuje v sobě informace o elektrickém odporu obvodu (například
elektrická vodivost roztoku) a o kapacitanci kapacitorů v elektrickém
obvodu (například charakter elektrických dvojvrstev u elektrod
ponořených do elektrolytu)
Impedance
• Elektrochemické impedanční senzory tvořených
elektrodami ponořenými do roztoku
elektrolytu/vzorku mohou sledovat:
– změny v jádru elektrolytu
• Při vysokých frekvencích se nestačí nabíjet elektrické
dvojvrstvy u elektrod a obvod se chová jako klasický rezistor
• Nulový fázový posun mezi napětím a proudem
• Lze například stanovovat koncentrace v jádru elektrolytu či
přítomnost makroskopických částic
– změny u povrchu elektrod
• Při frekvencích nižších dochází k nabíjení elektrických
dvojvrstev u povrchu elektrod
• Fázový posun může dosáhnout až 90°
• Změna u povrchu elektrod, například vazba biologické
molekuly, může ovlivnit jak průchod elektrického proudu, tak i
uchovávání elektrického náboje v EDL, což se projeví změnou
impedance
Impedanční senzor –
příklad
• Na zlaté elektrodě jsou imobilizovány
protilátky
• Detekována je přítomnost Proteinu A ve
vzorku (protein A se komplementárně
váže k Fc doméně protilátky)
• Sledovány jsou změny v impedančním
spektru obvodu (závislost absolutní
hodnoty impedance nebo reálné části
impedance na frekvenci)
• Pozorován je nárůst impedance
(„elektrického odporu“) s koncentrací
proteinu A ve vzorku
• Impedanční signál lze rovněž ovlivnit
vazbou sekundárních značených
protilátek, které ovlivňují elektrický
odpor a kapacitanci v blízkosti elektrody