Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí

Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí kapilární
izotachoforézy
Úkol:
Pomocí kapilární izotachoforézy stanovte, zda je v reálném vzorku (kukuřičné lupínky Corn
flakes) obsažena kyselina pantotenová.
1. Teoretická část:
1.1. Kyselina pantotenová (Corn flakes)
Kyselina pantotenová – vitamín B5 (chemická struktura viz Obr. 1) se vyznačuje mj.
antistresovými účinky, podporou hojení ran, jizev, popálenin a regeneraci tkání, ochrannými
účinky proti UV paprskům a schopností zabraňovat usazování LDL cholesterolu v cévních
stěnách.
Kyselina pantotenová je obsažena v mnoha potravinách rostlinného a živočišného
původu, a to především v mase, celozrnném pečivu a luštěninách. Často je také spolu s jinými
vitamíny přidávána jako aditivum do různých potravin, kterými jsou především cereálie
(např. kukuřičné lupínky Corn flakes), nápoje a dětská výživa.
Průměrný obsah kyseliny pantotenové v potravinách se vyskytuje řádově v jednotkách
až desítkách mg/kg. Její doporučená denní dávka je v České republice stanovena na hodnotu
6 mg a nejvyšší přípustná denní hodnota je 40 mg.
Obr. 1 Chemická struktura kyseliny pantotenové (vitamínu B5)
1.2. Kapilární izotachoforéza
Kapilární izotachoforéza (CITP) je elektromigrační separační technika umožňující
analýzu nabitých látek (kationtů či aniontů) při vloženém konstantním proudu (gradientu
napětí). Vzorek je dávkován mezi dva základní elektrolyty – vedoucí a koncový – obsahující
ionty mající rozdílné hodnoty pohyblivostí (mobilit). Vedoucí elektrolyt obsahuje ionty se
stejným znaménkem jako separované analyty (koionty) mající nejvyšší mobilitu
v daném elektrolytovém systému. Koncový elektrolyt obsahuje koionty mající nejnižší
mobilitu v daném elektrolytovém systému. Separované látky (analyty) jsou poté rozděleny
mezi vedoucí a koncový elektrolyt na základě jejich rozdílných pohyblivostí.
Každý separovaný analyt vytváří během CITP analýzy vlastní oddělenou zónu.
Výsledkem analýzy je při použití univerzálního vodivostního detektoru schodovitý záznam
tzv. izotachoforegram. Z výšky schodu usuzujeme kvalitu a délka zóny je přímo úměrná
kvantitě (viz Obr. 2).
Obr. 2 Izotachoforegram znázorňující CITP analýzu vzorku obsahující analyt A a B
U elektromigračních metod se můžeme setkat s nízkou opakovatelností migračních
časů, což je způsobeno především elektroosmotickým a hydrodynamickým tokem uvnitř
separační kapiláry. V případě izotachoforetického analyzátoru je možné elektroosmotický tok
potlačit, a to použitím kapilár (kolon) z inertního materiálu (např. z kopolymeru fluorovaného
ethylenu a propylenu – FEP) a/nebo přídavkem vhodného aditiva do pracovního elektrolytu
(např. hydroxyethylcelulóza - HEC). Hydrodynamický tok je v tomto případě potlačen
použitím hydrodynamicky uzavřeného systému (použitím semipermeabilních celofánových
membrán oddělujících elektrolytové nádobky od elektrolytu, kterým je naplněna separační
kapilára).
Při použití dvoukolonového izotachoforetického analyzátoru je využívána tzv.
technika spojených kolon umožňující dvoudimenzionální CITP (2D-CITP). První kolona
(kapilára) v níž dochází k odstranění nežádoucích interferentů a zakoncentrování cílových
analytů je tzv. předseparační kolona. V druhé koloně – analytické – dochází k separaci
zakoncentrovaných analytů.
2. Praktická část
2.1. Přístroje
• Dvoukolonový
izotachoforetický
analyzátor
s vodivostní
detekcí
vybavený
autosamplerem
• Homogenizátor IKA
• Centrifuga
• Ultrazvuková lázeň
• pH metr
•
Analytické váhy
2.2. Pomůcky
Plastové kádinky, plastové nádobky, elektrolytové nádobky, plastové odměrné baňky,
jednorázové navažovací lodičky, špachtle, lžička, pipety, balónek, vatové tampony,
stříkačkové mikrofiltry, injekční stříkačka, viálky, eppendorfky.
2.3. Chemikálie
Standard kyseliny pantotenové, reálný vzorek (kukuřičné lupínky Corn flakes), kyselina
chlorovodíková, TRIS, kyselina octová, hydroxyethylcelulóza (HEC), deionizovaná voda,
kalibrační roztoky pro kalibraci pH metru.
2.4. Pracovní postup
2.4.1. Úprava reálného vzorku
• do plastové nádobky navážíme 2 g reálného vzorku (kukuřičné lupínky Corn flakes)
a přidáme 20 ml deionizované vody
• nádobku umístíme do homogenizační aparatury a vzorek homogenizujeme po dobu
10 minut
• poté přidáme 2 ml kyseliny octové (0,3 M) a opět homogenizujeme po dobu 10 minut
• do eppendorfky odpipetujeme alikvotní podíl (1 ml) zhomogenizovaného vzorku
a umístíme na 15 minut do centrifugy (3000 rpm)
• odebereme supernatant, přefiltrujeme přes stříkačkový mikrofiltr (0,45 µm)
a převedeme do viálky
• viálku umístíme do autosampleru připojeného k izotachoforetickému analyzátoru
2.4.2. Příprava elektrolytů
• podle tabulky složení elektrolytového systému (viz Tab. 1) navážíme nebo odměříme
do odměrné baňky vypočtené množství (V = 250 ml) a doplníme deionizovanou
vodou po rysku
• roztok vložíme na cca 10 minut do ultrazvukové lázně
• pomocí pH metru (předem nakalibrovaného) upravíme pH elektrolytu na potřebnou
hodnotu
• připravené elektrolyty převedeme do elektrolytových nádobek a umístíme do
analyzátoru
2.4.3. Příprava standardního roztoku
• do eppendorfky navážíme 5 mg standardu kyseliny pantotenové rozpustíme v 1 ml
deionizované vody
• připravený roztok zředíme 20x deionizovanou vodou a převedeme do viálky
2.4.4. ITP analýza
• izotachoforetický analyzátor postupně naplníme elektrolytovým systémem (dle
pokynů vedoucího cvičení)
• dále nastavíme metodu (časový průběh separace, hodnoty hnacích proudů, přepnutí
kolon, volba módu)
• pomocí návodu k přístroji a vedoucího laboratorního cvičení provedeme v aniontovém
módu ITP-ITP analýzu:
1. Slepého vzorku (koncový elektrolyt)
2. Připraveného reálného vzorku
3. Reálného vzorku s přídavkem standardního roztoku kyseliny pantotenové
Tab. 1 Složení elektrolytového systému
Vedoucí elektrolyt
Koncový elektrolyt
Předseparační kolona
Analytická kolona
(90x0.8 mm)
(90x0.3 mm)
10 mM HCl + 0,1 % HEC – pomocí histidinu upravit pH
hodnotu na 6,0
5 mM MES + 0,05 % HEC – pomocí TRISu upravit pH
Použitý hnací proud
hodnotu na 6,2
200 µA
25 µA
při detekci 10 µA
3. Vyhodnocení
S použitím naměřených dat (izotachoforegramů) určete, zda je v předloženém reálném
vzorku (lupínky Corn flakes) obsažena kyselina pantotenová. Výsledek zdůvodněte.
4. Otázky k prozkoušení
1. Bylo by možné v případě stanovení kyseliny pantotenové pomocí izotachoforézy použít
také kationtový separační mód? Odpověď zdůvodněte.
2. Navrhněte jiný způsob úpravy vzorku před ITP analýzou.
3. Zjistěte pKa hodnotu kyseliny pantotenové a uveďte v jakém rozmezí pH bude
disociována.
4. Hrozí otrava z předávkování kyselinou pantotenovou, pokud jej organismus přijímá ve
zvýšeném množství?
5. Popište metody, které je možné použít pro kvantifikaci cílových analytů.
6. Je možné pomocí izotachoforetické analýzy provést separaci nenabitých analytů?
7. Popište základní rozdíly mezi kapilární elektroforézou a kapilární izotachoforézou.
8. Jaké jiné elektromigrační metody znáte?
9. Vysvětlete rozdíl mezi univerzálním a selektivním detektorem.
10. Vysvětlete pojem elektroosmóza.
5. Doporučená literatura
1. Boček P. a kol.: Analytická kapilární izotachoforéza, Pokroky chemie. Academia, Praha
1987.
2. Everaerts F. M. a kol.: Isotachophoresis: theory, instrumentation, and applications.
Elsevier, Amsterdam 1976.
3. Šťulík K.: Analytické separační metody. Karolinum, Praha 2004.
4. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and
Sons Ltd, New York 1995.
5. Coultate T. P.: Food: The chemistry of its components. RSC Publishing, Cambridge 2009.
6. Ötleş S.: Handbook of food analysis instruments. CRC Press, Boca Raton 2008.
7. Velíšek J.: Chemie potravin. OSSIS, Tábor 2002.