přednáška

kvantitativní detekce CMV a její
dopad na management pacienta
po alogenní HSCT
L. Król1,2, P. Hubáček1,3, T. Kalina1,2
1Klinika
dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a FN Motol
UK 2. LF
3Ústav lékařské mikrobiologie, UK 2. LF a FN Motol
2CLIP-Cytometrie,
agenda
•  úvod
•  kvantitativní detekce CMV a rezistence k
virostatikům
•  rekonstituce CMV specifické imunity
úvod
úvod
•  cytomegalovirus (CMV)
▫  patří do rodiny β-herpesvirů
▫  séroprevalence je 60-90% zdravých dospělých
▫  séroprevalence narůstá s věkem
▫  po primoinfekci přežívá v infikovaném jedinci po
zbytek života
–  zejména v makrofázích
–  RES
CMV infekce
•  zdravý imunokompetentní jedinec
▫ 
▫ 
▫ 
▫ 
nejčastěji inaparentní primoinfekce
během života dochází k občasným reaktivacím
reaktivace probíhají pod obrazem chřipkových symptomů
kontrola infekce zajištěna CMV-specifickými T-lymfocyty
•  imunokompromitovaný jedinec
▫  časté reaktivace způsobené poruchou adaptivní imunity
▫  život ohrožující infekce ve stádiu tzv. CMV nemoci
▫  vysoká morbidita a mortalita (až 90%)
CMV nemoc
CMV po HSCT
•  CMV zůstává jednou z nejvýznamnějších komplikací po HSCT
•  imunosuprese vede k vysokému riziku opakovaných reaktivací a
rozvoje CMV nemoci s vysokou mortalitou
•  signifikantní rizikové faktory jsou GvHD grade II-IV a pretransplantační sérologická kombinace D+/R•  klinický obraz
▫  symptomatická CMV infekce
–  horečka s/bez myelosuprese bez orgánové nemoci
▫  CMV nemoc
–  symptomy pneumonitidy, kolitidy, encefalitidy, retinitidy…
GVHD
imunosuprese
infekce
(IFI, viry)
CMV po HSCT
•  terapie je založena na podávání virostatik (GCV, VGCV, FCV, CDV
atd.) a/nebo snížení imunosuprese
▫  pre-emptivní režim
–  založen na pravidelném monitoringu pomocí PCR
–  1x týdně po dobu pobytu na transplantační jednotce
–  dále min. 1x měsíčně během ambulantního sledování
–  riziko rozvoje pozdní CMV nemoci – důvodem je snižující se počet vyšetření s
prodlužujícím se časem po transplantaci
–  při překročení limitu zahájení terapie virostatiky
–  v našem případě 1000 kopií na 100 tisíc genomových ekvivalentů
–  může vést k přeléčení pacientů s rizikem nežádoucích účinků virostatik
–  terapie může selhat díky rozvoje rezistence nebo špatného stavu imunity
•  definitivní kontrolu CMV infekce umožní rekonstituce CMV-specifické
imunity
▫  zejména CD4+ a CD8+ T-lymfocyty
▫  trvá měsíce až roky po HSCT
▫  rekonstituci je možné také monitorovat a lépe cílit virostatickou terapii
kvantitativní detekce CMV a rezistence
k virostatikům
pacienti
děti
dospělí
133 chlapců a 81 dívek
medián cěku při HSCT 9.3 let (0.2-20.5)
248 allogenních HSCT; zemřelo 38
261 mužů a 170 žen
medián věku při HSCT 45.3 let (18.7-60.2)
451 allogenních HSCT; zemřelo 172
ALL
MDS
AML
AML
MDS
CML
CML
AHL
ALL
NHL
CLL
IMF
IMF
HD
NHL
SAA
HD
Immunodef.
SAA
FA
Sarcoma
MPS/ML
CMV serostatus:
D-/R+ - 13%
D+/R+ - 29%
FD
D+/R- - 39%
D+/R+ - 50%
D-/R- - 18%
MUD
MSD
CMV serostatus:
D-/R+ - 32%
Other
BM
MMUD
CB
PBSC
ATG
Haplo
No ATG
CB
+BM
Cam
FD
D+/R- - 10%
D-/R- - 8%
MSD
MUD
BM
MMUD
PBSC
ATG
No ATG
Cam
prospektivně testováno 17,463 vzorků krve (7,546 od dětských pacientů, 9,917 od
dospělých pacientů) a 975 vzorků jiných biologických materiálů (BM, plazma, CSF, vzorky
tkání…) od 76 dětí a 147 dospělých
kvantifikace CMV
DNA se izoluje z krve, plasmy, kostní
dřeně a CSF pomocí Qiagen DNA
Blood kits
Qiagen DNA Mini Kits používáme pro
izolaci DNA z tkání
DNA ze stolice se izoluje pomocí
MoBio kits
testování CMV a kvantity
albuminového genu pomocí Biorad
IQcycler a ABI 7300
virové nálože normalizovány na
100,000 genomových
ekvivalentů (GE) a výsledky
vyjádřeny jako normalizované
virové kopie (NVCs)
vzorek
incidence v čase
kumulativní incidence u různých normalizovaných CMV náloží
70%
děti
60%
pozitivita
50%
101
102
40%
30%
103
threshold pro zahájení
terapie 1,000 NVCs
104
•  překročeno u 28% dětí
a 34% dospělých v 1
roce po HSCT
20%
10%
105
0%
0
70%
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
dospělí
60%
330
360
pozitivita
101
102
50%
40%
103
30%
20%
104
10%
105
0%
0
30
60
90
120
150
180
210
dny po HSCT
240
270
300
330
360
•  nesignifikantní rozdíl
mezi dětmi a dospělými
(p=0.08)
proporce pozitivních pacientů dle týdne a
počtu kopií
60%
jakákoliv
pozitivita
50%
40%
děti
dospělí
30%
20%
10%
0%
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
40
44
48
52
Weeks after HSCT
60%
pozitivita > 1,000
NVCs
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0
4
8
12
16
20
24
28
32
Weeks after HSCT
36
CMV nejčastěji detekováno
kolem 8. týdne po HSCT
maximální kvantita v krvi
7
Log NVCs u pozitivních pacientů
6
5
4
3
2
1
pacienti, kteří zemřeli na CMV
pneumonitidu
pacienti, kteří zemřeli na
kombinaci CMV nemoci a jiné
infekce nebo refrakterní GvHD
pacienti s jasnými klinickými a
laboratorními známkami CMV
nemoci, kteří byli úspěšně léčeni
pacienti bez známek
CMV nemoci
CMV nemoc byla
diagnostikována u 29
pacientů
l 
0
l 
l 
ND
l 
pneumonitis - 17
GIT – 9
encefalitis/retinitis - 1
retinitis - 2
nekomplikovaná reaktivace/infekce
Log of normalised viral copies
7
1,E+07
dívka, 3.3 let
dárce: MSD
štěp: BM
Conditioning:
6
1,E+06
5
1,E+05
4
1,E+04
ALG (75 mg/kg)
Cyklofosfamid (200 mg/kg)
GvHD profylaxe: CsA, MTX
GvHD: ne
Outcome: žije bez klinických obtíží
3
1,E+03
1,E+02
2
1,E+01
1
1,E+00
0
Cyclosporine A
1,E-01
ND
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
HSCT pro SAA
CMV ser.: D+/R+
360
Days after HSCT
1,E+07
7
Log of normalised viral copies
GCV
CDV
1,E+06
6
BKV+HC
1,E+05
5
1,E+04
4
1,E+03
3
1,E+02
2
1,E+01
1
1,E+00
0
1,E-01
ND
steroids
steroids
steroids
Cyclosporine A
0
30
60
90
120
150
180
210
Days after HSCT
240
270
300
330
360
chlapec, 13 let
HSCT pro MDS-RAEB
dárce: MMUD (9/10)
CMV ser.: D+/R+
štěp: PBSC
Conditioning:
Busulphan (16 mg/kg)
Cyklofosfamid (120 mg/kg)
Melphalan (140 mg/m2)
ATG (40 mg/kg)
GvHD profylaxe: CsA+MTX
GvHD:
grade II (D+28), cGvHD
BKV+ HC (D+40; 1x CDV-zlepšení)
Outcome: žije, hypofunkce štížné žlázy
komplikovaná infekce
GCV
FOS
VGCV
1,E+07
7
Log of normalised viral copies
detejce anti CMV IgM
6
1,E+06
5
1,E+05
4
1,E+04
3
1,E+03
1,E+02
2
1
1,E+01
1,E+00
0
steroids
Cyclosporine A
1,E-01
ND
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
Days after HSCT
GCV
FOS
VGCV
Log of normalised viral copies
1,E+07
7
1,E+06
6
1,E+05
5
1,E+04
4
1,E+03
3
1,E+02
2
1,E+01
1
1,E+00
0
steroids
Cyclosporine A
1,E-01
ND
0
30
60
90
steroids
tacrolimus
120
150
180
210
Days after HSCT
240
270
300
330
dívka, 2.9 let
HSCT pro MDS-RC
dárce: MMUD (4/6) CMV ser.: D-/R+
štěp: CB
Conditioning: Busulphan (18 mg/kg)
Cyklofosfamid (120 mg/kg)
Melphalan (140 mg/m2)
ATG (40 mg/kg)
GvHD profylaxe: CsA, MTX, steroidy
GvHD: ne
Outcome: žije, STH deficience
360
dívka, 14.3 let HSCT pro AML/EWS
dárce: MUD
CMV ser.: D+/R+
štěp: PBSC
Conditioning: Busulphan (16 mg/kg)
Cykofosfamid (120 mg/kg)
Melphalan (140 mg/m2)
ATG (40 mg/kg)
GvHD profylaxe: CsA+MTX
GvHD: grade II (D+28, +41), cGvHD
Outcome: zemřela D+317 na
mukormykózu v kombinaci s
CMV nemocí
CMV rezistence
NH2
I
II
III IV
329-363
VI
373-400
VII
427-468
659
665
590-592
593-599
603
606607
520
klinické podezření na rezistenci k
podávanému virostatiku v případě
že nedošlo k poklesu, nebo se
objevil vzestup, CMV kopií v
periferní krvi po 2 týdnech terapie
460
UL97 phosphotransferase - resistance ke GCV
IX
476-492
XI
565-595
COOH
652-681
405
Del 981-982
987
1052
957
897
834
812-813
821-829
841
781
802
805
809
751
756
722
588
501
503
513
515-516
521-522
545
552
393
408
410
412-413
UL54 DNA polymerase – rezistence ke GCV, CDV, FOS
304
potvrzení sekvenční analýzou
regionů UL97 a UL54, které
kódují rezistenci*
708
GCV
CDV
potrvzena u 242 vzorků od 22
dětí a 50 dospělých
Exo I
295-312
NH2
Exo II
404-418
IV
379-421
269
838
773
787
757
700
715
585
495
500
FOS
Exo III
533-545
δC
492-588
II
696-742
VI
III
I
VII
V
771-7 805-84 905-919 962-9 978-988
5
90
70
COOH
1070
*Boutolleau et al. Antiviral Research 2009
pozdní primoinfekce
*
detekce UL97 mutace
1,E+07
Log of normalised viral copies
7
GCV
FOS
VGCV
CDV
1,E+06
6
1,E+055
1,E+04
4
1,E+03
3
1,E+02
2
1,E+011
1,E+00
0 steroids
Cyclosporine A
1,E-01
N
D0
tacrolimus
sirolimus
MMF
sirolimus
MMF
rituximab
MTX
steroids
steroids
steroids
Cyclosporine A
1
2
3
4
5
6
7
8
Years after HSCT
chlapec, 18.6 let, HSCT pro AML M2
dárce: MMUD (8/10) CMV ser.: D-/Rštěp: PBSC
conditioning: TBI (14.4 Gy), Cyklofosfamid (120 mg/kg), ATG (30 mg/kg)
GvHD profylaxis: CsA+MTX
GvHD: grade II (D+20), chronická extensivní GvHD,
další komplikace: TTP/HUS, stenóza esofagu, Coombs++, aseptická nekróza kyčelního kloubu bilat.
outcome: žije, TEP kyčelních kloubů, opakované dilatace esofagu bužiemi
poměr mezi WT a L595S CMV mutantou
1,E+07
7
*
detekce UL97 mutace
1,E+06
6
1,E+05
Log NVCs
5
1,E+04
4
1,E+03
3
1,E+02
2
1,E+01
1
1,E+00
0
1,E-01
N 1900
D
2000
2100
2200
Days after HSCT
Total CMV
WT
Mutant CMV
2300
2400
CMV encefalitida/retinitida
detekce UL97 mutace
1,E+07
7
*
*
1,E+06
6
1,E+05
5
Log NVCs
GCV
GCV
FOS
detekce UL54 mutace
VGCV
CDV
Anti CMV Ig
retinitis
4
1,E+04
3
1,E+02
2
1,E+03
1
1,E+01
0
steroids
Cyclosporine A
1,E-01
N
D 0 30 60 90
1,E+00
steroids
120
150 180
Encephalitis/
Retinitis
210
240
270
300
330
360
390
420 450
480
510
540
570
Days after HSCT
dívka, 18.6 let, HSCT pro AML M2
dárce: MMUD (8/10) CMV ser.: D-/Rštěp: PBSC
conditioning: Busulphan (16 mg/kg), Cyklofosfamid (120 mg/kg), Melphalan (140 mg/m2) ATG (40 mg/kg
GvHD profylaxe: CsA+MTX
GvHD: grade II (D+61) – skin GIT ostatní komplikace: D+16 BKV+ HC, D+377 Herpes zoster
outcome: žije, částečná slepota
600
poměr mezi WT a L595S CMV mutantou
*
1,E+07
7
*
detekce UL97 mutace
detekce UL54 mutace
2,6x106 CMV kopií/ml CSF
1,E+06
6
retinitis
1,E+05
5
Log NVCs
1,E+04
4
1,E+03
3
1,E+02
2
1,E+01
1
Encephalitis/
Retinitis
1,E+00
0
1,E-01
N
D
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
Days after HSCT
Total CMV
WT
Mutant CMV
*Hubacek et al. Pediatr Tranplantation 2009
závěry I.
•  kvantitativní detekce CMV v pravidelných intervalech po Tx pomáhá
klinikům k včasnému zahájení terapie a předchází rozvoji CMV
nemoci
•  nejčastěji je reaktivace detekována 2 měsíce po transplantaci
•  nedojde-li k odpovědi do 2 týdnů od zahájení terapie, narůstá
klinické podezření na CMV rezistenci k podávanému virostatiku
•  rezistence na virostatika se objevuje po 2-3 měsících selektivní
terapie
•  v případě rozvoje CMV nemoci je potřeba výsledky z plné krve
interpretovat velmi obezřetně, protože virové nálože v tkáních
mohou být mnohem vyšší
rekonstituce CMV specifické imunity
CMV po HSCT
•  terapie je založena na podávání virostatik (GCV, VGCV, FCV, CDV
atd.) a/nebo snížení imunosuprese
▫  pre-emptivní režim
– 
– 
– 
– 
založen na pravidelném monitoringu pomocí PCR
při překročení limitu zahájení terapie virostatiky
může vést k přeléčení pacientů s rizikem nežádoucích účinků virostatik
terapie může selhat díky rozvoje rezistence nebo špatného stavu imunity
•  definitivní kontrolu CMV infekce umožní rekonstituce CMVspecifické imunity
▫  zejména CD4+ a CD8+ T-lymfocyty
▫  trvá měsíce až roky po HSCT
▫  rekonstituci je možné také monitorovat a lépe cílit virostatickou terapii
výzkumné otázky
•  1. Jak najít pacienty, kteří jsou schopni kontrolovat
CMV infekci po HSCT?
▫  takový pacient již není v riziku CMV infekce a nepotřebuje další léčbu
virostatiky
▫  prognóza takového pacienta je mnohem lepší, protože je ušetřen vedlejších
účinků virostatik
–  neutropenie (ganciclovir) – zvyšuje rizika dalších komplikací (sepse, invazivní mykotické
infekce)
–  nefrotoxicita (foscavir, cidofovir)
▫  cost-benefit pro zdravotnické zařízení – virostatika jsou velmi drahá
•  2. Co můžeme udělat pro vysoce rizikové pacienty?
▫  pacienti s rezistencí na virostatika
▫  pacienti se špatnou funkcí imunitního systému
1. Jak najít pacienty, kteří jsou schopni…?
trvalou kontrolu CMV zajistí pouze rekonstituce CMVspecifické imunity, a to zejména CD4+ a CD8+ T-lymfocyty…!!!
•  metoda intracelulárního značení cytokinů (ICS)
▫  technika mnohobarevné průtokové cytometrie
▫  umožňuje nám sledovat 12 různých parametrů na single cell
úrovni
▫  současná detekce různých efektorových funkcí CD4+ a CD8+ Tlymfocytů
interferon γ (IFNγ)
interleukin 2 (IL2)
CD154 (CD40 ligand)
CD107a (LAMP1)
hlavní prozánětlivý cytokin
růstový faktor pro lymfocyty
aktivační molekula
degranulační marker
intracelulární značení cytokinů
over night rest
FICOLL
stimulace
dump channel
(CD14, CD20 PB, ViViD)
CD8 H-V500
lyzace a
povrchové
značení
permeabilizace
intracelulární
značení
akvizice a
analýza dat
CD154 PE, CD4 ECD, CD3 PerCP-Cy5.5
IFNg PC7, IL-2 APC
CD4+
IFN-γ
efektorové funkce T-lymfocytů
CD8+
CD107a
CD40L
IFN-γ
IL2
IL2
CD107a
CD40L
pacienti
•  vyšetřili jsme pomocí ICS 118 jedinců
▫  dospělí dobrovolní dárci
▫  dětští dobrovolní dárci
▫  dětští pacienti po HSCT
19
38
61
•  virová nálož všech pacientů byla monitorována od
1x týdně od dne +7 po HSCT pomocí RQ-PCR
•  pacienti byli testováni ve fixních časových bodech
po SCT
▫  den +28, +56, +90, +180 a +365 po HSCT
▫  v případě reaktivace CMV byli pacienti testováni 1x
týdně do PCR negativity
charakteristika pacientů
20
23
24
ALL
boys
38
girls
8
9
AML
MDS
other
10
14
naïve
16
21
without
reactivation
controlling CMV
non-controlling
CMV
vztahy mezi profily odpovědí
Krol et al.: BMT 2011 Aug;46(8):1089-98
CD8+ T-lymfocyty
*= p<0.003 (Bonferoniho korekce)
master efektory
IFNγ+/IL2+
marker protekce
Krol et al.: BMT 2011 Aug;46(8):1089-98
proč master effektory?
*
*
*
n.s.
n.s.
*
Krol et al.: BMT 2011 Aug;46(8):1089-98
2. Co můžeme udělat pro high risk pacienty?
▫  pacienti s rezistencí na virostatika
▫  pacienti se špatnou rekonstitucí CMVspecifické imunity
•  adoptivní transfer CMVspecifických CD8+ T-lymfocytů
▫  dříve se k terapii virových infekcí
používala infúze dárcovských
lymfocytů (DLI)
–  neselektované lymfocyty
–  vysoké riziko indukce těžké GvHD s
možností smrti pacienta
▫  nyní jsou dostupné metody in vitro
buněčných manipulací
–  umožňují selekci vysoce specifických
protivirových T-lymfocytů
–  založeny na magnetické selekci nebo
krátkodobé kultivaci
–  T-lymfocyty dostupné do 24 hod – 1
týdne od indikace terapie
•  CMV-specifické T-lymfocyty
▫  připravujeme single centre nerandomizovanou klinickou studii fáze I
▫  dárcem CMV-specifických lymfocytů bude jeden z rodičů (3rd party donor)
▫  lymfocyty budou získány magnetickou separací na CliniMACS pomocí
Streptamerů
•  AdV-specifické T-lymfocyty
▫  ve spolupráci se sv. Annou ve Vídni připravujeme multicentrickou studii fáze I/II
▫  založeno na selekci AdV-sepcifických T-lymfocytů pomocí Streptamerů a jejich
následné 3 dny trvající in vitro expanzi
▫  již léčen 1. pacient z našeho pracoviště na compassionate use úrovni
závěry II
•  mnohobarevná průtoková cytometrie je vhodným
nástrojem pro imunitní monitoring a umožňuje studovat
komplexitu CMV-specifických T-buněčných odpovědí
•  master efektory (CD8+IFNγ+/IL2+) korelují s kontrolou
CMV
•  master efektory mohou sloužit jako marker dobré
rekonstituce imunitního systému po HSCT
•  CD4+ T-lymfocyty nekorelují s kontrolou CMV, ale jsou
nezbytné pro správnou funkci imunitního systému
•  high risk pacienty bude výhledově možné léčit podáním
CMV-specifických CD8+ T-lymfocytů získaných od
jednoho z rodičů pomocí CMV Streptamerů