úloha 1. - Ústav biochemie a experimentální onkologie

Transkript

Kolektiv
Lékařská chemie, biochemie a
molekulární biologie
Praktická cvičení II
Univerzita Karlova v Praze
1. lékařská fakulta
Ústav biochemie a experimentální onkologie
Vedoucí ústavu: Prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc.
1
Autorský kolektiv:
Editor: Doc. MUDr. Jaromír Křemen, CSc.
MUDr. Jana Stříbrná, CSc.
RNDr. Eva Bubnová, CSc.
RNDr. Alena Buděšínská, CSc.
Doc. MUDr. Zdeněk Kleibl, PhD.
Doc. MUDr. Michal Zikán, PhD.
MUDr. Petr Bušek, PhD.
Mgr. Lucie Šromová
2
OBSAH
Kyselina močová
Rozpustnost kyseliny močové a jejích solí
Stanovení kyseliny močové v krevním séru a v moči
Biologické oxidace
Důkaz dehydrogenas citrátového cyklu
Důkaz peroxidasy
Důkaz katalasy a pseudoperoxidasová reakce
Sacharidy I
Redukční vlastnosti kyseliny L-askorbové
Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové
Stanoveni koncentrace vitaminu C v ovocné šťávě
Sacharidy II
Reakce se Schiffovým činidlem
Redukční vlastnosti sacharidů
Rozlišení aldohexos a ketohexos
Reakce pentos
Kyselá hydrolýza škrobu
Sacharidy III
Glukosový toleranční test, denní ztráty glukosy močí
Glykovaný hemoglobin
Monitorování glykemie pomocí glukometru Glukotrend
Lipidy I
Alkalická hydrolýza tuků - zmýdelnění tuků
Vlastnosti mýdel
Důkaz přítomnosti dvojných vazeb ve vyšších mastných kyselinách
Lipidy II
Vliv solí ţlučových kyselin na štěpení tuků katalyzované pankreatickou lipasou
Emulgační schopnost ţlučových kyselin
Lipidy III
Stanovení celkového cholesterolu (TC)
Stanovení HDL cholesterolu C HDLc)
Stanovení triacylglycerolů (TAG)
Výpočet HDL indexu a LDL cholesterolu podle Friedewalda
Stanovení TC a TAG ve vlastni kapilární krvi pomocí přístroje
Reflotron, Roche
Hodnocení kardiálního rizika se změnami důleţitých parametrů
Tetrapyrroly
Vlastnosti hemoglobinu
Vlastnosti tetrapyrrolů
Dusíková bilance
Stanovení koncentrace močoviny
Výpočet dusíkové bilance
5
6
7
9
11
14
15
16
19
20
21
22
23
24
26
27
28
29
30
33
35
37
39
40
42
43
46
48
49
53
55
56
58
59
62
63
64
68
71
73
76
3
Clearance
Stanovení koncentrace kreatininu v séru a moči
Markery svalové tkáně
Stanovení katalytické aktivity kreatinkinasy
Stanovení katalytické aktivity AST
Stanovení katalytické aktivity laktátdehydrogenasy
Stanovení AST (GOT) a CK pomoci přístroje
REFLOTRON®, Roche
Základní screening patologických součástí moče
Chemické vyšetření moči
Xenobiochemie
Důkaz ethanolu ve vydechovaném vzduchu
Identifikace cizorodých látek a jejich metabolitů v moči
Stanovení koncentrace dusitanů a dusičnanů ve vodě
Pouţitá literatura
78
81
84
88
90
91
93
94
96
105
107
109
112
114
4
Kyselina močová
Klíčová slova: degradace purinových nukleotidů, kyselina močová, alantoin.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
koncentrovaný roztok amoniaku
kyselina močová
roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŢÍRAVINA!
roztok hydroxidu lithného 0,5 mol/l
roztok chloridu amonného 1 mol/l
zředěná kyselina chlorovodíková 1:1
vzorek krevního séra
vzorek moče
souprava Kyselina močová (Biosystems):
a) pracovní roztok: fosfát 100 mmol/l, detergent 1,5 g/l, dichlorfenolsulfonát 4 mmol/l,
urikasa 0,12 U/ml, ascorbátoxidasa 50 U/ml, peroxidasa 1U/mol,
4-aminoantipyrin 0,5 mmol/l, pH 7,8
b) standard
5
ÚLOHA 1.
Rozpustnost kyseliny močové a jejich solí
Kyselina močová (2,6,8-trihydroxypurin), hlavní produkt degradace purinových bází u
primátů, je vylučována močí. Purinové jádro zůstává tedy během degradačního procesu
intaktní.
Kyselina močová je látka nepatrně rozpustná ve vodě (25 mg/l při 18° C). Vůči bázím
projevuje vlastnosti slabé dvojsytné kyseliny s hodnotami pKA = 5,4 a 10,3 při 25° C.
Rozpustnost kyseliny močové se asi dvacetkrát zvýší v alkalických roztocích, v důsledku
tvorby alkalických solí - urátů (viz Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky
významných organických sloučenin, úloha 3.1.). Nejvíce rozpustný je urát lithný. Na rozdíl
od běţných amonných solí je naopak urát amonný velmi málo rozpustný.
Pracovní postup:
Do tří zkumavek dejte vţdy velmi malé mnoţství kyseliny močové a 1 ml vody,
protřepejte. Většina látky zůstane nerozpuštěna.
Do první zkumavky přidejte 1 ml roztoku hydroxidu sodného.
Do druhé zkumavky přidejte 1 ml koncentrovaného vodného roztoku amoniaku.
Do třetí zkumavky přidejte 1 ml roztoku hydroxidu lithného.
Porovnejte rozpustnost vznikajících solí.
Obsah zkumavky s urátem lithným rozdělte na dvě části.
K prvé části přikapávejte roztok chloridu amonného a pozorujte vylučování málo
rozpustného urátu amonného.
Druhý díl urátu lithného pomalu okyselujte přikapáváním zředěné kyseliny
chlorovodíkové a pozorujte sráţení kyseliny močové.
Poznámky:
6
ÚLOHA 2.
Stanovení kyseliny močové v séru a v moči
Zvýšená koncentrace kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) můţe být důsledkem její
zvýšené tvorby (včetně zvýšeného přísunu potravou), zvýšeného rozpadu buněk (maligní
procesy, leukémie) nebo jejího sníţeného vylučování ledvinami. Hyperurikémie můţe vést
k ukládání málo rozpustných krystalů kyseliny močové do tkání a kloubů (dna). Kyselina
močová a její soli jsou také často součástí močových sedimentů a konkrementů.
Kyselina močová se oxiduje kyslíkem za katalýzy enzymem urikasou na peroxid vodíku
a alantoin. Vzniklý peroxid vodíku se stanovuje oxidační kopulací s dichlorfenolsulfonátem a
4-aminoantipyrinem katalyzovanou enzymem peroxidasou.
Pro stanovení koncentrace kyseliny močové v séru a moči obdrţíte vzorek séra a moče
pacienta označeného číslem a M- muţ nebo Ţ – ţena:
S = sérum
U = moč (připojen údaj o diuréze)
Pracovní postup:
!POZOR! VZOREK MOČE ZŘEĎTE PŘED STANOVENÍM 10x. VÝSLEDEK PAK
VYNÁSOBTE 10x!
Do očíslovaných zkumavek napipetujte reagencie dle tabulky 1.
Vzorky a standard zpracujte v tripletu, slepou zkoušku pouze jednou.
Tabulka 1.
reagencie(ml)
sérum
vzorekS
standard
slepý vzorek
0.05
moč zředěná 10x!
standardní roztok
destilovaná voda
pracovní roztok
vzorekU
0.05
0.05
0.05
1.0
1.0
1.0
1.0
Všechny zkumavky nechte stát 10 min při pokojové teplotě ve tmě (laboratorní stůl).
– Do 60 min změřte absorbance vzorků a standardu proti slepé zkoušce při vlnové délce
500 nm.
– Naměřené hodnoty zapište do tabulky č.2.
7
Tabulka 2.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (µmol/l)
standad
sérum
moč
VYHODNOCENÍ:
Tabulka 3.
vzorek č.
urikémie (µmol/l)
mnoţství vyloučené močí
(mmol/24 hod)
REFERENČNÍ HODNOTY
NAMĚŘENÉ HODNOTY
muţi: 200 420
ţeny: 140 340
4,2
Poznámky:
8
BIOLOGICKÉ OXIDACE
Klíčová slova: oxidace, redukce, redox potenciál, citrátový cyklus, dýchací řetězec,
isocitrátdehydrogenasa
(EC
1.1.1.41),
sukcinátdehydrogenasa
(EC
1.3.99.1),
malátdehydrogenasa (EC 1.1.1.37), katalasa (EC 1.11.1.6), peroxidasa (POD - EC 1.11.1.7),
peroxisomy, superoxidový radikál, superoxiddismutasa (SOD - EC 1.15.1.1),
glutathionperoxidasa (EC 1.11.1.9),
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
čerstvé hovězí srdce
fosfátový pufr 0,1 mol/l, pH 7,4
roztok methylenové modře 0,1 g/l
roztok jantaranu sodného 0,1 mol/l ve fosfátovém pufru
roztok malonanu sodného 1 mol/l ve fosfátovém pufru
extrakt z brambor
roztok o-tolidinu (3,3´-dimethylbenzidinu) v ledové kyselině octové 0,01 mol/l !JED!
peroxid vodíku 1 mol/l
krev zředěná vodou 1:300
roztok methylenové modře 0,1 g/l
parafínový olej
roztok kyanidu draselného 0,02 mol/l !JED!
9
Oxidoredukční (redoxní) reakce jsou spojeny s přesunem elektronů a mohou být pro
organismy zdrojem volné energie. Mezi oxidoreduktasy řadíme enzymy, které svoji reakci
uskutečňují jako přenos elektronů (oxidasy), celých atomů vodíku (hydrogenasy,
dehydrogenasy) a nebo kyslíku (oxygenasy) a tzv. hydroperoxidasy zajišťující degradaci
toxického peroxidu vodíku.
Biologické oxidace I – Citrátový cyklus, dýchací řetězec a oxidativní
fosforylace
Citrátový cyklus je universální metabolický mlýn, ve kterém se spojuje katabolismus
sacharidů, tuků a aminokyselin a jeho cílem je zejména produkce redukovaných koenzymů
pro energetické vyuţití. Je lokalizovaný v matrix a vnitřní membráně mitochondrií. V jednom
běhu citrátového cyklu (zpracování 1 molekuly acetylkoenzymuA) vznikají 3 molekuly
NADH, 1 FADH2, molekula GTP, následně přeměněná na ATP a 2 CO2.
Bylo popsáno velmi málo abnormalit enzymů citrátového cyklu, defekty metabolismu
tohoto charakteru jsou pravděpodobně neslučitelné se ţivotem.
Oxidativní fosforylace je proces tvorby ATP, při vyuţití protonového gradientu
vzniklého během přenosu elektronů z NADH a FADH2 na O2 přes řadu přenašečů (dýchací
řetězec). Elektronový transportní řetězec je lokalizován na vnitřní mitochodriální membráně a
tvoří ho systém membránových komplexů oxidoreduktas (I. NADH – ubichinon
oxidoreduktasa, II. sukcinát-ubichinonreduktasa, III. ubichinon-cytochrom c-oxidoreduktasa
a IV. cytochrom c-oxidasa) a mobilních přenašečů elektronů (ubichinon, Fe-S proteiny a
cytochromy). Společně přenášejí protony a elektrony. Tok protonů pohání uvolňování
nasyntetizovaného ATP z ATP syntasy. Elektrony redukují O2 na O2- reagující s protony
v mitochondriální matrix na konečný produkt této metabolické dráhy – H2O (tzv. metabolická
voda).
Rychlost oxidativní fosforylace je určena potřebou ATP. Podmínkou je dostatečná
nabídka redukovaných koenzymů, O2, ADP a Pi.
Mezi respirační inhibitory patří například barbituráty a insekticid a pesticid rotenon,
které blokují přenos elektronů mezi komplexem I a ubichinonem, dále pak antibiotikum
antimycin A inhibující řetězec v místě přenosu mezi cytochromem c1 a komplexem III. Oxid
uhelnatý, sulfan, azidy a kyanidy blokují přenos elektronů na kyslík na úrovni
cytochromoxidasy. Mezi rozpojovače dýchacího řetězce a oxidativní fosforylace se řadí
například 2,4-dinitrofenol, nebo ve zvýšených dávkách hormon thyroxin. Tyto látky způsobí,
ţe dochází k přenosu protonů přes vnitřní mitochondriální membránu jiným způsobem neţ
přes ATP syntasu. Nedochází tedy k syntéze ATP a chemiosmotický gradient je přeměněn na
teplo. Organismus pociťující nedostatek ATP začne ve zvýšené míře metabolizovat ţiviny.
Hypertyreóza, spojená s nadprodukcí tyroxinu se klinicky projeví hubnutím a zvýšením
tělesné teploty. Podobné příznaky má intoxikace 2,4-dinitrofenolem.
Vrozené metabolické vady oxidativní fosforylace a dýchacího řetězce se projevují
postiţením orgánů s vysokým energetickým obratem, jako jsou svaly (myopatie), mozek
(encefalopatie) a oční nerv (slepota) – Leberova hereditární optická neuropatie. Biochemicky
často nalézáme laktacidózu jako důsledek posunu k anaerobnímu metabolismu.
10
ÚLOHA 1.
Důkaz dehydrogenas citrátového cyklu
Oxidační reakce citrátového cyklu, katalyzované isocitrátdehydrogenasou, 2oxoglutarátdehydrogenasou, sukcinátdehydrogenasou a malátdehydrogenasou, jsou zdrojem
redukovaných koenzymů NADH a FADH2, které přenášejí atomy vodíku do dýchacího
řetězce. Ty jsou dále přenášeny jednotlivými články dýchacího řetězce jako protony a
elektrony aţ na konečný akceptor - molekulový kyslík.
Jako substrát je v tomto modelovém pokusu pouţíván sukcinát, jako akceptor atomů
vodíku slouţí methylenová modř:
Ox / Red
fumarát / sukcinát
methylenová modř / leukoforma
O2 / H2O2
E0'(V)
+0,03
+0,01
+0,68
Dehydrogenace v tomto uspořádání probíhá spontánně, přestoţe standardní redox
potenciál soustavy fumarát/sukcinát je vyšší (+0,03 V) neţ redox potenciál soustavy
methylenová modř/leukoforma (+0,01 V). Aktuální potenciál redox soustavy záleţí podle
Nernstovy-Petersovy rovnice i na koncentracích redukované a oxidované sloţky obou
soustav. V tomto uspořádání je vyšší koncentrace redukované formy (sukcinát) jedné redox
soustavy a současné je vyšší koncentrace oxidované formy (methylenová modř) druhé
soustavy. To ovlivní hodnoty aktuálních redox potenciálů tak, ţe redukce methylenové modře
sukcinátem probíhá samovolně.
V tomto modelovém pokusu je také demonstrována inhibice sukcinátdehydrogenasy
malonátem, který je kompetitivním inhibitorem tohoto enzymu díky své strukturní
podobnosti se sukcinátem.
Pracovní postup:
– Do 4 zkumavek, napipetujte 2 ml enzymového extraktu.
– Do zkumavky č. 3 napipetujte 0,5 ml roztoku malonanu sodného a nechte inkubovat
10 min při laboratorní teplotě (viz tabulka 1.).
– Zkumavku č. 4. vloţte do vroucí vodní lázně, 2 min povařte. a její obsah přelijte do
plastikové zkumavky (4).
– Dále postupujte dle tabulky 1. (jednotlivé reagencie přidávejte do všech zkumavek
v pořadí určovaném řádky v tabulce).
– Po přidání kaţdé reagencie obsah zkumavek protřepejte.
11
Tabulka 1.
zkumavka
enzymový extrakt (ml)
malonan sodný (ml)
inkubace 10 min. při laboratorní teplotě
povařit 2 min. ve vrouc( vodní lázni
pufr (ml)
jantaran sodný (ml)
methylenová modř (ml)
zbarvení
1
1
–
–
–
1,0
–
0,5
2
1
–
–
–
0,5
0,5
0,5
3
1
0,5
ano
–
–
0,5
0,5
4
1
–
–
ano
0,5
0,5
0,5
– Do kaţdé zkumavky přidejte pomalu po její stěně parafínový olej tak, aby utvořil
přibliţně 5 mm vysokou vrstvu pro zachování anaerobních podmínek.
– Inkubujte 30 min při 37° C a průběţně sledujte postupné odbarvování methylenové
modři.
– Po odbarvení příslušnou zkumavku protřepejte a nechte znovu reagovat.
– Výsledné zbarvení zapište do tabulky.
Poznámky:
12
Biologické oxidace II - Reaktivní formy kyslíku
Mezi reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species, ROS) patří především volné
kyslíkové radikály, tedy atomy nebo molekuly s volným nepárovým elektronem, který
sloučenině propůjčuje vysokou reaktivitu. Kromě volných radikálů sem řadíme i další vysoce
reaktivní sloučeniny, například peroxid vodíku. Důleţití zástupci ROS jsou superoxid O2–,
hydroxylový radikál OH. a peroxid vodíku H2O2. Podobnou charakteristiku a význam jako
ROS mají také sloučeniny označované jako RNS, reaktivní formy dusíku (reactive nitrogen
species).
Hlavním místem vzniku ROS v organismu za fyziologických okolností je dýchací
řetězec, ve kterém tyto sloučeniny vznikají jako vedlejší produkt při nedokonalé redukci
kyslíku. Mimo to mohou kyslíkové radikály vznikat tzv. Fentonovou reakcí. Kovový iont
(ţelezo, méně často měď) zde reaguje s peroxidem vodíku za vzniku volného radikálu:
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH‾
ROS jsou velmi reaktivní sloučeniny poškozující biologické makromolekuly. Mohou
být například příčinou zlomů a mutací DNA, sniţují aktivitu enzymů, poškozují iontové
kanály v buněčných membránách a peroxidací membránových lipidů mohou měnit
propustnost membrán a poškozovat je. S působením ROS je také spojován vznik celé řady
onemocnění a patologických stavů, jako je ateroskleróza, reperfuzní poškození ischemické
tkáně a v neposlední řadě také neurodegenerativní procesy (Alzheimerova choroba). ROS a
především RNS mají však i své významné fyziologické funkce (např. v buněčné imunitě a
mezibuněčné signalizaci).
Nadbytek ROS je z organismu odstraňován pomocí několika enzymů, mezi něţ patří
superoxiddismutasa, katalasa a peroxidasa.
Superoxiddismutasa katalyzuje přeměnu volného radikálu superoxidu na peroxid
vodíku, který je dále rozkládán katalasou a peroxidasou.
2O 2 + H2
H2O2 + O2
Katalasa rozkládá peroxid vodíku přímo na kyslík a vodu, jak je znázorněno v této
reakci:
H2O2 → 2 H2O + O2
Peroxidasa potřebuje pro svoji činnost další molekulu, donor elektronů, pomocí kterých
redukuje peroxid na vodu a tento donor tedy vystupuje z reakce ve své oxidované formě.
Typickým příkladem sloučenin, které poskytují peroxidase elektrony pro redukci H2O2, je
glutathion, který je oxidován enzymem glutathionperoxidasou.
13
ÚLOHA 2.
Důkaz peroxidasy
Peroxidasa (POD) katalyzuje redukci peroxidu vodíku na vodu za současné oxidace
vhodného reaktantu, v tomto případě o-tolidinu. Jeho oxidační produkt je zbarven
modrozeleně:
POD
H2O2 + AH2
2 H2O + A
Podobné reakce jsou vyuţívány při spektrofotometrickém stanovení koncentrace
různých metabolitů (např. glukosy, kyseliny močové, cholesterolu) v séru nebo moči, kde
peroxid vodíku vzniká jako vedlejší produkt v příslušné enzymové reakci. Jeho mnoţství,
přímo úměrné koncentraci stanovované látky, se zjišťuje v následné peroxidasové reakci.
Přidaný chromogen (AH2) se v jejím průběhu oxiduje na barevnou sloučeninu vhodnou
k fotometrickému stanovení.
Pracovní postup:
– Do čtyř kalibrovaných zkumavek připravte inkubační směs, postupujte v pořadí
daném řádky v tabulce 3.
– Extrakt ve zkumavce 2 povařte asi 2 min ve vroucí vodní lázni.
– Výsledné zbarvení v jednotlivých zkumavkách zapište do tabulky 3.
Tabulka 2.
zkumavka
extrakt z brambor (ml)
povařit 2 min ve vroucí vodní lázni
o-tolidin v kyselině. octové
peroxid vodíku (ml)
destilovaná voda (ml)
zbarvení
1
1
–
4 kapky
0,2
–
2
1
ano
4 kapky
0,2
–
3
1
–
4 kapky
–
0,5
4
–
4 kapky
0,2
1
Poznámky:
14
ÚLOHA 3.
Důkaz katalasy a pseudoperoxidasová reakce
Katalasa je hemový enzym, přítomný ve většině aerobních buněk. V lidském organismu
je její aktivita nejvyšší v hepatocytech a erythrocytech. Na subcelulární úrovni je
lokalizována převáţně v peroxisomech (obsahují enzymy, produkující peroxid vodíku).
Odstraňování peroxidu vodíku peroxidasou a katalasou má význam např. v prevenci
Fentonovy reakce.
V této úloze je demonstrována katalasová aktivita krve, která se projeví vývojem
kyslíku. Katalasa je inhibována kyanidem, podobně jako cytochromoxidasa.
V krvi lze kromě aktivity katalasy a peroxidasy prokázat také pseudoperoxidasovou
aktivitu. Ta je vázána na přítomnost ţeleznatého iontu v krevním barvivu hemoglobinu. Fe2+
katalyzuje rozklad peroxidu vodíku. Výsledkem je opět redukce peroxidu na vodu a oxidace
o-tolidinu na zelenomodrý oxidační produkt. Protoţe tato reakce není enzymově
katalyzovaná, nedá se, na rozdíl od reakce katalyzované peroxidasou, inaktivovat varem.
Pseudoperoxidasová reakce se pouţívá k důkazu krve v moči.
Pracovní postup:
–
–
–
–
Do tří zkumavek odměřte po 1 ml zředěné krve.
Krev ve zkumavce 2 povařte asi 2 min ve vroucí vodní lázni.
Do všech zkumavek odměřte reagencie v pořadí daném řádky v tabulce 4.
Roztok kyanidu draselného přidejte z dávkovače!
Tabulka 4.
zkumavka
zředěná krev (ml)
kyanid draselný (ml)
peroxid vodíku (ml)
vývoj kyslíku
o-tolidin v k. octové
zbarvení
1
1
–
–
0,2
2
1
ano
–
0,2
3
1
–
0,2
0,2
2 kapky
2 kapky
2 kapky
Poznámky:
15
SACHARIDY I
Klíčová slova: lakton, enol, oxidace, redukce, kyselina L-gulonová, kyselina D-glukuronová.
Reagencie:
roztok kyseliny L-askorbové 2 mmol/l v kyselině chlorovodíkové 20 g/l
roztok síranu ţeleznatého 0,4 mmol/l
roztok chloridu ţelezitého 0,4 mmol/l
roztok hexakyanoţelezitanu draselného 0,01 mol/l
roztok sodné sole 2,6-dichlorfenolindofenolu 1 mmol/l ve fosfátovém pufru,
30 mmol/l, pH 7
6. koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŢÍRAVINA!
7. pomerančová šťáva 10x zředěná vodou
1.
2.
3.
4.
5.
16
Kyselina askorbová
Kyselina askorbová, γ-lakton kyseliny 2-oxo-L-gulonové, neboli vitamin C je ve vodě
rozpustný vitamin odvozený od sacharidů.
Vyskytuje se v čerstvém ovoci a zelenině, zejména bramborách a zelí, ale i v čerstvém
mase.
Savci, kromě vyšších primátů a morčete, ji syntetizují z D-glukuronové kyseliny a proto
pro ně není vitaminem.
Askorbát je silné redukční činidlo, oxiduje se na dehydroaskorbovou kyselinu, resp. její
lakton.
Jako kofaktor se účastní několika důleţitých reakcí, především posttranslační
hydroxylace
prolinu
(prolylhydroxylasa
resp.
prokolagen-prolin-dioxygenasa
[EC 1.14.11.2]) a lysinu (lysylhydroxylasa, resp. prokolagen-lysin-5-dioxygenasa
[EC 1.14.11.4]) v kolagenu. Oba enzymy obsahují jako aktivátor kation Fe2+, který se během
reakce oxiduje na Fe3+ a askorbát jej opět redukuje. Při nedostatku vitaminu C tato
posttranslační modifikace neprobíhá; postupně je poškozována pojivová tkáň (endotel cév –
fragilita cév a tvorba petechií, úpony zubů – uvolňování a vypadávání) a vzniká onemocnění
zvané kurděje (skorbut). Název vitaminu je odvozen od skorbutu a znamená látku „působící
proti kurdějím“. Jako vitamin je znám jiţ od roku 1742, kdy byl pouţit při léčbě kurdějí.
Působí také jako antioxidant. V lidském organismu je důleţitý pro vstřebávání ţeleza
(Fe2+) z potravy. Při jeho nedostatku dochází ke vzniku mikrocytární anemie.
Kyselina askorbová se objevuje v moči při vysokém příjmu potravou. Jako silné
redukční činidlo můţe ovlivnit stanovení některých analytů v moči, zejména těch, které při
reakcích vyuţívají peroxid vodíku. Ten je kyselinou askorbovou přímo redukován. Rovněţ
rychle rozkládá diazoniové sole pouţívané k azokopulačním reakcím. Fehlingovo činidlo
redukuje za studena (intenzita zbarvení závisí na mnoţství kyseliny askorbové).
Kvantitativní stanovení askorbové kyseliny odměrnou analýzou neboli titrací se
pouţívá k zjišťování saturace organismu askorbátem.
Titrace je kvantitativní metoda umoţňující stanovit koncentraci látky v roztoku tak, ţe k
odměřenému mnoţství analyzovaného roztoku se přidává z byrety roztok odměrného činidla
o známé koncentraci. Jako odměrné činidlo se pouţívá taková sloučenina, která se
stanovovanou látkou reaguje kvantitativně ve stechiometrických poměrech. Titrace je
ukončena, kdyţ celkové mnoţství látky přítomné v analyzovaném roztoku úplné zreagovalo
s odměrným činidlem. Tento okamţik se nazývá ekvivalenční bod. K jeho vizuálnímu určení
se pouţívají indikátory, které se přidávají k titrovanému roztoku. Jsou to látky, které
v ekvivalenčním bodě mění svoje zbarvení.
17
Výpočet koncentrace stanovované látky:
Výpočet koncentrace stanovované látky vychází z rovnice příslušné chemické reakce.
V ekvivalenčním bodě je počet molů chemických ekvivalentů titrované látky (1) roven počtu
molů chemických ekvivalentů v odměrném činidle (2):
n1 = n2
c1 V1 = c2 V2
c1 = c2 V2 / V1
n = počet molů chemických ekvivalentů
c = látková koncentrace chemických ekvivalentů
V1 = objem titrovaného roztoku v ml
V2 = objem odměrného roztoku v m1 (spotřeba)
18
ÚLOHA 1.
Redukční vlastnosti kyseliny L-askorbové
Kyselina L-askorbová je sacharidový derivát odvozený od kyseliny L-gulonové.
Endiolové hydroxyl-skupiny na C2 a C3 podmiňují její kyselý charakter (pK A = 4,2) a silné
redukční vlastnosti (E´0= 0,08 V). Se svým oxidačním produktem, kyselinou Ldehydroaskorbovou, tvoří redox systém, který při biochemických reakcích účinkuje jako
neenzymový přenašeč vodíku.
Kyselina L-askorbová redukuje ţelezité ionty na ţeleznaté E´0 Fe3+/Fe2+ = 0,77 V),
které poskytují s roztokem hexakyanoţelezitanu draselného sytě modré zbarvení tzv.
berlínské modři (komplexní sloučenina kationtů Fe3+ a Fe2+ s kyanidovými aniony, (viz
Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků.). Zelené zbarvení není
průkazné.
Pracovní postup:
– Do tří zkumavek připravte reakční směs podle tabulky 1.
Tabulka 1.
zkumavka
3+
roztok Fe (ml)
roztok Fe3+ (ml)
roztok kyseliny askorbové (ml)
roztok K3[Fe(CN)6]
zbarvení
1
1
−
−
1
3 kapky
2
−
1
1
−
3kapky
3
−
1
−
1
3 kapky
– Pozorujte, ve kterých zkumavkách dojde k pozitivní reakci (asi po 30 min).
– Výsledky zapište do tabulky 1.
19
ÚLOHA 2.
Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové
Titrační stanovení kyseliny L- askorbové je zaloţeno na její snadné oxidovatelnosti za
vzniku kyseliny L-dehydroaskorbové. Jako odměrné činidlo se pouţívá roztok sodné sole
2,6-dichlorfenolindofenolu (E´0 = 0,22 V), která je v neutrálním a alkalickém prostředí modrá,
v kyselém prostředí růţová. Redukcí kyselinou L-askorbovou přechází modře zbarvená sůl na
bezbarvou leukoformu. Ekvivalenční bod je určen vznikem růţového zbarvení kyselého
titrovaného roztoku (kyselina askorbová je rozpuštěna v kyselině chlorovodíkové).
Pracovní postup:
– Do Erlenmeyerovy baňky napipetujte 2 ml roztoku kyseliny L-askorbové.
– Titrujte roztokem sodné sole 2,6-dichlorfenolindofenolu do růţového zabarvení,
titraci proveďte třikrát a vypočítejte průměrnou spotřebu
Výpočet:
L-askorbová kyselina (mg/l) =
Mr cčinidlo Včinidlo
Vtitrovaný
Mr – relativní molekulová hmotnost L-askorbové kyseliny = 176,1
Včinidlo – objem 2,5-dichlorfenolindofenolu potřebný pro titraci vzorku v ml
Vtitrovaný – objem kyseliny askorbové, který byl titrován v ml
Tabulka 2.
spotřeba činidla v ml
průměrná spotřeba
mg/l kys. L-askorbové
mmol/l kys. L-askorbově
20
ÚLOHA 3.
Stanovení koncentrace vitamínu C v ovocné šťávě
Pracovní postup:
– Do Erlenmeyerovy baňky odpipetujte 2 ml ovocné šťávy (10x zředěné destilovanou
vodou) a titrujte odměrným činidlem do růţového zbarvení.
– Ze spotřeby odměrného činidla vypočítejte koncentraci vitamínu C ve zředěné
pomerančové šťávě (mg/l). Výsledek vynásobte 10x a zapište do tabulky 5.
– Výsledek porovnejte s údajem výrobce na obalu, zhodnoťte také způsob konzervace
šťávy.
Tabulka 5.
spotřeba odměrného činidla (ml)
koncentrace kyseliny L-askorbové ve zředěné šťávě (mg/l)
koncentrace kyseliny L-askorbové v původní šťávě (mg/l)
údaj výrobce (mg/l)
Poznámky:
21
SACHARIDY II
Klíčová slova: monosacharidy, disacharidy, polysacharidy, adiční reakce aldehydů,
poloacetály, acetály, glykosidy, oxidace, redukce, komplexní sloučeniny, hydrolýza, kyselá
hydrolýza škrobu, sloţení a struktura škrobu.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
roztok glukosy 0;05 mol/l
roztok fruktosy 0,05 mol/l
roztok ribosy 0,05 mol/l
roztok kyseliny glukuronové 0,05 mol/l
roztok maltosy 0,03 mol/l
roztok sacharosy 0,02 mol/l
roztok škrobu 10 g/1
4% roztok formaldehydu
Schiffovo činidlo (roztok barviva fuchsinu odbarvený hydrogensiřičitanem sodným)
Fehlingův roztok I (síran měďnatý 70 g/1)
Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g vinanu sodnodraselného
v 1 1 vody)
Benedictovo činidlo (1 1 činidla obsahuje 17,3 g síranu mědnatého, 100 g. bezvodého
uhličitanu sodného a 173 g citrátu sodného)
Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/1 v roztoku jodidu draselného 40 g/1) 100x zředěný
koncentrovaná kyselina chlorovodíková !ŢÍRAVINA!
Bialovo činidlo: 1,25 g orcinu a 0,1 g FeCl3 a doplnit 707 mol/ HCl do 500 ml.
Tollensovo-Wheelerovo (floroglucinolové) činidlo: 0,5 g floroglucinolu ve 100 ml
koncetrované HCl.
Selivanovo činidlo: ve směsi 50 ml konc. HCl a 50 ml vody rozpustit 0,05 g
resorcinolu
Discheho činidlo: 1 g difenylaminu rozpustit ve 2,5 ml konc. kyseliny sírové a doplnít
do 100 ml kyselinou octovou ledovou)
22
ÚLOHA 1.
Reakce se Schiffovým činidlem
Charakteristickými reakcemi aldehydů a ketonů jsou adice (viz Reakce funkčních
skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 1.1. a 4.). Protoţe však
monosacharidy existují ve vodném roztoku převáţně v cyklické formě, vzniklé
intramolekulární adicí, neposkytují všechny adiční reakce, které jsou běţné pro
oxosloučeniny.
Pracovní postup:
– K 1 ml roztoku glukosy přidejte kapátkem 2 kapky Schiffova činidla.
– Stejnou reakci proveďte i s roztokem formaldehydu.
– Porovnejte výsledek obou reakcí.
Poznámky:
23
ÚLOHA 2.
Redukční vlastnosti sacharidů
2.1. Redukční vlastnosti glukosy (Glc)
Přestoţe glukosa nemá volnou aldehydovou skupinu, reaguje zvláště v alkalickém
prostředí snadno s oxidačními činidly (např. komplexními kationty některých těţkých kovů).
Podmínkou redukčních vlastností glukosy je přítomnost volné hemiacetálové hydroxyskupiny
v její molekule. Při zahřívání v alkalickém prostředí poskytuje glukosa štěpné produkty, které
mají silné redukční účinky.
2.1.1. Fehlingova zkouška
Pracovní postup:
– Ve zkumavce smíchejte Fehlingův roztok I a II v poměru 1 : 1, celkový objem 1 ml,
promíchejte.
– Ke vzniklému modrému roztoku přidejte 1 ml roztoku glukosy, promíchejte a
zahřívejte ve vroucí vodní lázni.
– Po krátkém povaření se vyloučí červená sraţenina oxidu měďného.
– Do tabulky 1. uveďte komplexotvornou sloţku!
2.1.2. Benedictova zkouška
Pracovní postup:
– K 1 ml Benedictova činidla přidejte asi 3 kapky roztoku glukosy, promíchejte.
– Obsah zkumavky zahřívejte ve vroucí vodní lázni asi 2 min, oxid měďný se vyloučí
jako červená sraţenina.
– Do tabulky 1. uveďte komplexotvornou sloţku!
Tabulka 1.
redukované činidlo
Fehling
Benedict
ligand
Zkouška Fehlingova a Benedictova se pouţívá k důkazu glukosy v moči.
Poznámky:
24
2.2. Redukční vlastnosti vybraných sacharidů
Sacharidy, které mají ve své molekule volný hemiacetálový hydroxyl, vykazují
redukční vlastnosti podobně jako glukosa. V alkalickém prostředí tedy redukují komplexní
kation mědnatý na kation měďný, který komplexní ion netvoří a vyloučí se jako nerozpustný
oxid měďný.
Pracovní postup:
– Podle postupu uvedeného v 2.1.1. ověřte redukční vlastnosti fruktosy (Fru), ribosy
(Rib), kyseliny glukuronové (GlcUA), maltosy, sacharosy a škrobu.
Tabulka 2.
sacharid
Fru
Rib
GlcUA
maltosa
sacharosa
škrob
redukce
Poznámky:
25
ÚLOHA 3
Rozlišení aldohexos a ketohexos
3.1. Reakce fruktosy se Selivanovým činidlem
Pracovní postup:
K 1 ml fruktosy přidejte 1 ml Selivanova činidla a krátce zahřejte ve vroucí lázni.
V přítomnosti fruktosy vzniká rychle červené zbarvení.
Tutéţ reakci proveďte s roztokem glukosy a porovnejte výsledek reakce.
Poznámky:
26
ÚLOHA 4
Reakce pentos
3.1. Reakce s orcinolem (Bialovým činidlem):
Pracovní postup:
– Do zkumavky odměřte 1 ml Bialova činidla a přidejte 5 6 kapek vzorku.
– Zahřejte do varu.
– Za 2 3 minuty vznikne zelené zabarvení, které přísluší ribose.
3.2. Reakce s floroglucinolovým činidlem (Tollensova-Wheelerova reakce):
Pracovní postup:
– 1ml roztoku floroglucinolu zahřejte s 0,5 ml vzorku.
– Vznikne červené zabarveni, jeţ přísluší ribose.
3.3. Reakce s difenylaminem (Discheho činidlem):
Pracovní postup:
– K 1 ml vzorku přidejte 2 ml Discheho činidla.
– Protřepejte a zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni.
– Vzniklé modré zabarvení dává deoxyribosa.
27
ÚLOHA 4.
Kyselá hydrolýza škrobu
Molekuly glukosy jsou ve škrobu vázány α-D-(1 4) glykosidovými vazbami, které
nejsou stálé v kyselém prostředí. Proto se kyselou hydrolýzou polysacharidy postupně štěpí
na polysacharidy s kratším řetězcem, oligosacharidy, maltosu a nakonec D-glukosu. Průběh
hydrolýzy se projevuje postupnou změnou zbarvení hydrolyzátu s jodem, protoţe zkracování
šroubovice amylosy mění barvu komplexu škrobu s jodem.
Pracovní postup:
– Připravte 8 zkumavek a do kaţdé odlejte asi 1 ml zředěného Lugolova roztoku.
– Do malé Erlenmeyerovy baňky odměřte válečkem 10 ml škrobového mazu a zahřejte
na ploténce k varu.
– Z dávkovače odměřte do další zkumavky 0,5 ml koncentrované kyseliny
chlorovodíkové a opatrně ji přilijte k vroucí směsi. Baňku přikryjte hliníkovou folií a
udrţujte mírný var.
– Okamţitě odeberte pomocí plastikové pipetky malý vzorek reakční směsi a přidejte do
první zkumavky s Lugolovým roztokem.
– Tento postup opakujte kaţdou minutu a pozorujte změnu zbarvení.
– Jestliţe se jiţ Lugolův roztok hydrolyzátem nebarví, povařte reakční směs ještě 5 min,
aby hydrolýza proběhla úplně.
– Se vzorkem hydrolyzátu proveďte Fehlingovu zkoušku.
– Zbarvení jednotlivých frakcí zapište do tabulky 3.
Tabulka 3.
zkumavka
1
2
3
4
5
6
7
8
zbarvení
Poznámky:
28
SACHARIDY III
Klíčová slova: glykemie, glukosový toleranční test, glykemická křivka, glukosurie,
glukosaoxidasa (GOD - EC 1.1.3.4), peroxidasa (POD - EC 1.11.1.7), glykace proteinů,
HbA1C glykovaný hemoglobin, afinitní chromatografie.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
vzorky séra S1, S2, S3
vzorek moče U
standardní roztok glukosy c = 10 mmol/l
souprava Glukosa GOD-PAP, (BioSystems):
enzymové činidlo:
fosfátový pufr 140 mmol/l, pH 8
glukosaoxidasa (GOD) 166 µkat/l
peroxidasa (PAP) 16 µkat/l
3-methylfenol (chromogen) 10 mmol/l
4-aminoantipyrin (chromogen) 1 mmol/l
29
ÚLOHA 1.
Glukosový toleranční test, denní ztráty glukosy močí
Koncentrace glukosy v krvi se nazývá glykemie, nověji glukosemie. Její hodnota je
výsledkem působení řady regulačních faktorů, mezi nimiţ hrají dominantní roli insulin a
kontrainsulinární hormony
glukagon, katecholaminy, glukokortikoidy a somatotropní
hormon. Hlavním orgánem, který zajišťuje homeostázu glukosy jsou játra. U zdravého
člověka je glykemie nalačno udrţována v poměrně úzkém rozmezí (asi 4 6 mmol/l) a po
jídle nepřevyšuje ve venosní plazmě 11 mmol/l. Netrvá-li toto zvýšení déle neţ 60 min po
příjmu potravy je povaţováno za fyziologické.
Porucha mechanismů podílejících se na udrţování euglykemie se můţe projevit ve
smyslu trvalého zvýšení koncentrace glukosy (hyperglykemie) nebo naopak jejího sníţení
(hypoglykemie). V obou případech jde o stavy ohroţující pacienta jednak chronicky, jednak
akutně. Dlouhodobá hyperglykemie u dekompenzovaného diabetika je spojena s řadou
orgánových komplikací. Těţší hyperglykemie, stejně jako hypoglykemie, mohou vyústit aţ
do bezvědomí a bez včasné odborné pomoci ohroţují pacienta na ţivotě.
Nejčastější poruchou regulace metabolismu sacharidů je diabetes mellitus (DM, asi
7 8 % populace v ČR). Toto onemocnění je způsobeno absolutním nebo relativním
nedostatkem insulinu. Dominujícím laboratorním nálezem u neléčeného diabetika je
chronická hyperglykemie doprovázená v případě výrazné hyperglykémie charakteristickými
známkami DM (polyurie, polydipsie, hubnutí, únava).
Pro diagnózu diabetu svědčí:
a) přítomnost klinické symptomatologie provázené náhodnou glykemií vyšší
neţ 11,1 mmol/l a následně glykemií v ţilní plazmě nalačno vyšší neţ
7,0 mmol/l
b) při nepřítomnosti klinických projevů nález glykemie v ţilní plazmě nalačno
vyšší neţ 7,0 mmol/l po osmihodinovém lačnění.
c) nález glykemie za 2 hodiny při oGTT (orální glukosový toleranční test)
vyšší neţ 11,1 mmol/l
Při nálezu hraničních hodnot glykemie nebo rozporu mezi náhodnou glykemií a
glykemií nalačno je indikován zátěţový test tzv. orální glukosový toleranční test (oGTT).
Test je zaloţen na sledování reakce organismu po perorálním podání definovaného mnoţství
glukosy (75 g ve 200-250 ml vody). Hodnotí se, zda je organismus schopen v daném
časovém úseku udrţovat glykemii ve fyziologickém rozmezí.
V moči se glukosa fyziologicky vyskytuje jen v nepatrném mnoţství, neboť je zpětně
resorbována a běţnými metodami není prokazatelná. Teprve při překročení renálního prahu
pro glukosu (0,16 0,18 g/l, resp. 9 10 mmol/l po dobu 15 min.) se objevuje glykosurie.
Jako fyziologickou lze označit přechodnou alimentární glykosurii po poţití velkého mnoţství
koncentrovaných sacharidů. Ztráta, téţ odpad glukosy (mnoţství glukosy v gramech
vyloučené močí za 24 hod.) se dříve pouţívala k monitorování kompenzace diabetu.
Odběr krve pro stanovení glykemie se nejčastěji provádí nalačno. Je-li indikován oGTT,
stanovují se glykemie nalačno, za 60 a 120 min po zátěţi. Odebírá se kapilární (ev. venosní)
krev, koncentrace glukosy se stanovuje v plné krvi, v plazmě nebo v séru. V plazmě a séru
jsou koncentrace glukosy o 10 – 15 % vyšší neţ hodnoty naměřené v plné krvi a při
hodnocení glykemie je třeba na toto brát zřetel.
Z naměřených hodnot glykemie v jednotlivých odběrech získáme glykemickou křivku.
Z jejího průběhu je moţno usuzovat, zda vyšetřovaný organismus reaguje na glukosovou
30
zátěţ adekvátně či nikoliv. K nejčastěji diagnostikovaným odchylkám patří diabetes mellitus
a porušená glukosová tolerance.
Ke stanovení koncentrace glukosy se vyuţívá spřaţené glukosaoxidasové -peroxidasové
reakce. Enzym glukosaoxidasa (GOD) katalyzuje oxidaci glukosy kyslíkem za vzniku
kyseliny glukonové (přecházející na vnitřní ester glukonolakton) a peroxidu vodíku:
GOD
D-glukosa + O2
glukono-1,5-lakton + H2O2
Nízká koncentrace glukosy v reakční směsi (10 4 mol/l) ve srovnání s hodnotou Km
glukosy pro GOD (3,3.10 2 mol/1) způsobuje, ţe reakce probíhá podle kinetiky 1. řádu.
Rychlost reakce je tedy přímo úměrná koncentraci glukosy. Nevratný průběh této reakce
umoţňuje oxidaci celého mnoţství glukosy.
Vzniklý peroxid vodíku se stanovuje pomocí spřaţené oxidace chromogenu, která je
katalyzována enzymem peroxidasou (viz Biologické oxidace, úloha 3). Koncentrace
vzniklého barviva, určená fotometricky, je úměrná koncentraci glukosy.
Pro sestrojení glykemické křivky obdrţíte tři vzorky od pacienta označeného číslem:
S1 = sérum nalačno
S2 = sérum 1 hod po Glc zátěţi
S3 = sérum 2 hod po Glc zátěţi
Pro výpočet denní ztráty glukosy močí stanovíte koncentraci glukosy ve vzorku moči z
24 hod sběru s údajem o diuréze, označený U.
POZOR! MOČ ZŘEĎTE 10 x. VÝSLEDEK VYNÁSOBTE ŘEDĚNÍM. Kaţdý vzorek
séra, moče a standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek pouze jednou.
Pracovní postup:
– Do očíslovaných zkumavek napipetujte inkubační směs podle tabulky 1.
Tabulka 1.
reagencie (ml)
sérum
VzorekS
vzorekU
standard
0,01
zředěná moč
0,01
standardní roztok glukosy
0,01
destilovaná voda
enzymové činidlo
slepý vzorek
1,5
1,5
1,5
0,01
1,5
– Všechny zkumavky dobře protřepejte a nechte 30 min inkubovat při pokojové
teplotě v temnu (v laboratorním stole).
– Změřte absorbance vzorků i standardního roztoku proti slepému vzorku do 30 min po
ukončení inkubace při vlnové délce 500 nm. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2.
– Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorků a standardu a z koncentrace
standardního roztoku glukosy vypočítejte koncentrace glukosy v séru a v moči.
31
Tabulka 2.
vzorek č.:
absorbance
standard
S1
S2
S3
U
průměr
c (mmol/l)
10
– Ze získaných hodnot nakreslete glykemickou křivku. Určete, o který typ poruchy se
můţe jednat v případě sledovaného pacienta:
– Vypočítejte denní ztráty glukosy močí (g/24 hod) z hodnoty koncentrace glukosy
v moči (g/1) a diurézy (udána u vzorku moče).
Tabulka 3.
c Glc v moči (g/l)
diuréza (l/24 hod)
denní ztráty (g/24 hod)
Poznámky:
32
VYHODNOCENÍ:
Normální tolerance Glc
Porušená glykémie na lačno/hraniční
glykémie na lačno (IFG, impaired
fasting glucose)
Porušená glukózová tolerance (IGT,
impaired glucose tolerance)
Gestational diabetes mellitus
Diabetes mellitus
nalačno
<6
glykemíe (mmol/l)
po 1 hod
≤ 11
5,6-6,9
< 11.1
<7
≥ 5.1 / 5.6
≥7
po 2 hod
<6
7,8
≥ 10
11
≥ 8.5 / 7.7
≥ 11.1
Viz Doporučený postup péče o nemocné s prediabetem 2012, Standards of Medical Care in
Diabetes 2014, ADA, http://www.diab.cz/standardy
Glykovaný hemoglobin
Jedním z vhodných parametrů pro sledování pacientů s diabetes mellitus je glykovaný
hemoglobin, který vzniká glykací bílkovinných řetězců hemoglobinu. Obecně se jedná o
neenzymovou reakci mezi aldehydovou skupinou glukosy (ev. i jiného monosacharidu) a
volné aminoskupiny bílkoviny. Tou můţe být nejen hemoglobin, ale i jakýkoliv jiný protein v
plazmě nebo tkáních. V případě hemoglobinu monosacharid reaguje s N-terminálním
valinem globinového řetězce nebo s ε-aminoskupinou lysinu v jeho řetězcích. Reakce probíhá
ve dvou krocích. Nejdříve vzniká labilní aldimin (Schiffova báze), který se přesmykem
stabilizuje na aminoketon (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných
organických sloučenin, úloha 4.):
Nejreaktivnějším místem pro glykaci hemoglobinu je N-terminální valin β-řetězce (asi
60 % vázané glukosy), tato majoritní komponenta je označována HbA1c. Zbývajících 40 %
glukosy se váţe na dalších 44 glykačních míst. Celkový glykovaný hemoglobin Glyc-Hb je
tedy směsí několika frakcí, které se liší jak místem, v němţ proběhla glykace, tak druhem
navázaného sacharidu.
Podíl HbA1c je úměrný koncentraci glukosy v krvi, u zdravého člověka se pohybuje
v závislosti na pouţité metodice v rozmezí 20-44mmol/mol (IFCC), u pacientů s diabetes
mellitus jsou hodnoty zvýšené v závislosti na hodnotách glykemie. Hodnota HbA1c poskytuje
nepřímou informaci o průměrné hladině glykemie v časovém období 4 6 týdnů (biologický
33
poločas přeţívání erytrocytů) před odběrem krve. Je tedy objektivnějším kriteriem pro
hodnocení kompenzace diabetiků neţ hodnota glykemie.
Glykace hemoglobinu vede samozřejmě ke změně struktury a tedy i vlastností původní
molekuly. Bylo zjištěno, ţe Glyc-Hb má vyšší afinitu ke kyslíku neţ neglykovaný
hemoglobin, protoţe glukosa se váţe na stejné místo jako hlavní allosterický regulátor 2,3BPG. Z toho důvodu se zhoršuje uvolňování kyslíku z Glyc-Hb.
Podobně jako hemoglobin jsou glykovány i ostatní proteiny. Glykace je jednou
z nejdůleţitějších posttranslačních modifikací proteinů nejen v plazmě, ale i ve tkáních. Tato
spontánní reakce souvisí s poškozováním tkání některých orgánů a projevy komplikací u
pacientů s diabetem.
Pro stanovení glykovaného hemoglobinu HbA1c lze vyuţít principu ionexové
chromatografie, při které jsou molekuly separovány podle náboje. Stacionární fází je
makromolekulární matrice (iontoměnič, ionex) obsahující kyselé nebo bazické funkční
skupiny. Pro zachycení HbA1c frakce slouţí iontoměniče s kyselou funkční skupinou (sulfokyselina, karboxylová kyselina) nesoucí záporný náboj – katexy. Ion obsaţený v ionexu je
vyměněn za ion obsaţený v mobilní fázi nebo ve vzorku a na principu soutěţení ionexu o tyto
ionty dochází k separaci. Ionty ze vzorku jsou obvykle ionexem pevně připoutány a uvolní se
elucí roztokem o vyšší iontové síle neţ bylo pouţito u roztoku pro nanesení vzorku.
Vytěsnění navázané frakce je zaloţeno na faktu, ţe síla elektrostatické vazby mezi iontem a
ionexem klesá s velikostí iontu. Malé ionty (např. Na+ nebo Cl–) v dostatečné koncentraci
jsou proto schopny vytěsnit ionty větší.
Fyziologické hodnoty
Prediabetes
Diabetes mellitus
IFCC HbA1C (mmol/mol)
20-44
39-47
> 48-53
NPSG HbA1C (%)
< 6,1
5,7–6,4
> (5,7)-6,5
Viz Standards of Medical Care in Diabetes 2014, ADA, http://www.diab.cz/standardy
34
ÚLOHA 2.
Monitorování glykemie pomocí glukometru GLUCOTREND® ROCHE
Obr. 1. Glukometr GLUKOTREND® a testovací prouţek
GLUKOTREND® je přístroj pro rychlé měření koncentrace glukosy v čerstvé kapilární
krvi pomocí reflexní fotometrie. Reflexní fotometr kvantitativně vyhodnocuje enzymovou
reakci probíhající na testovací zóně testovacího prouţku (obr. 1.). Vlákna testovací zóny
prouţku jsou impregnována činidly, k jejichţ aktivaci stačí pouze voda obsaţená
v naneseném vzorku krve (princip "suché chemie").
Glukometr GLUKOTREND® umoţňuje spolehlivě a velmi jednoduše měřit glykemii
v rozmezí 0,6 – 33,3 mmol/l. Stačí kápnout jednu kapku kapilární krve na testovací prouţek a
ten vloţit do přístroje. GLUKTREND® automaticky stanoví optimální dobu měření a po 30 s
zobrazí na displeji koncentraci glukosy v krvi. Vzhledem k jednoduchosti obsluhy a rychlosti
stanovení je glukometr velice výhodný pro sledování glykemie u lůţka pacienta nebo pro
domácí měření pacienty samými – self monitoring.
35
Pracovní postup:
– Zapněte přístroj, na displejovém okénku se objeví Gluc a třímístné kódové číslo. Nad
tímto číslem se krátce objeví nápis CODE a malý testovací prouţek. Červený bod F se
krátce objeví ve vedení testovacích prouţků E.
– Srovnejte číslo kódu v okénku displeje nakódovaného glukometru s číslem kódu
vytištěném na štítku tuby s testovacími prouţky.
– Vyjměte testovací prouţek z tuby a ihned ji uzavřete. Neuzavření tuby má za následek
znehodnocení hygroskopického činidla v zátce. Testovací prouţky jsou pak
nepouţitelné.
– Uchopte prouţek tak, ţe nápis GLUKOTREND je obrácen nahoru (viz. obr. l.).
Vloţte prouţek do vkládací štěrbiny D ve směru šipky, aţ zapadne s lehkým
cvaknutím.
– Nápis CODE a třímístné číslo zmizí. V okénku displeje problikává testovací zóna na
malém testovacím prouţku a nad ní je zobrazena kapka krve. Červený bod na
testovacím prouţku stále bliká.
– Promasírujte lehce špičku prstu, abyste zvýšili prokrvení a tak usnadnili odběr.
Nezapomeňte na dezinfekci!
– Pouţijte zařízení pro vpich do prstu (Softclix II a lanceta Softclix II).
– Vyjměte testovací prouţek vodorovně mimo vodící lištu E. V displejovém okénku se
krátce objeví malý testovací prouţek a kapka krve. Hlášení GLUC se zastaví.
– Nechte vsáknout kapku krve do ţluté zóny testovacího prouţku. Krev neroztírejte ani
nenanášejte další kapku.
– Prouţek vloţte (nápisem GLUKOTREND nahoru) do vkládací štěrbiny D ve směru
šipky aţ správně zaklapne. Ihned se ozve krátké zapípání a ikonka ukáţe, ţe přístroj
pracuje. Po 30 s se naměřená hodnota ukáţe v okénku displeje.
– Přístroj vypněte, naměřená hodnota je automaticky uloţena.
Poznámky:
36
LIPIDY I
Klíčová slova: jednoduché lipidy, sloţené lipidy, dehydratace, hydrolýza, alkalická
hydrolýza tuků, mýdla, rozpustnost solí, disociace solí, emulgace, tenzidy ionogenní a
neionogenní, oxidace nenasycených sloučenin.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
slunečnicový olej
olivový olej
kyselina olejová
kyselina palmitová
roztok hydroxidu draselného 1 mol/l v ethanolu !ŢÍRAVINA!
ethanol
roztok chloridu vápenatého 0,05 mol/l
zředěný roztok Ajatinu 1:1
zředěný roztok Jaru 1:50
roztok mýdla v ethanolu 10 g/1
roztok fenolftaleinu 2 g/1 ve zředěném ethanolu 1:1
roztok manganistanu draselného 0,01 mol/l
koncentrovaná kyselina sírová !ŢÍRAVINA!
37
Lipidy tvoří heterogenní skupinu přirozeně se vyskytujících látek, jejichţ společnou
vlastností je nerozpustnost ve vodě, ale naopak velmi dobrá rozpustnost v organických
(tukových) rozpouštědlech. Zahrnují triglyceridy (tuky), mono- a diglyceridy, fosfolipidy,
vosky, mastné kyseliny, eikosanoidy, steroidy a v tucích rozpustné vitaminy (ADEK).
V organismu mají význam hlavně jako rezervní zdroj energie. Dále jsou strukturální
sloţkou biologických membrán a důleţité signalizační molekuly.
Lipidy se vyskytují buď jako hydrofobní nebo jako amfifilní malé molekuly. Amfifilní
lipidy umoţňují tvořit ve vodném prostředí vesikuly, liposomy nebo membrány. Biologické
membrány jsou tvořeny dvojvrstvou fosfolipidů, do níţ je zanořen cholesterol a membránové
proteiny (povrchové a transmembránové). Cholesterol spolu s membránovými proteiny se
podílí na „fluiditě membrány“.
Biologické lipidy vznikají úplně nebo částečně ze dvou odlišných typů biochemických
podjednotek čili „stavebních bloků”: ketoacylových nebo isoprenových skupin. Z tohoto
pohledu lze je rozdělit do 8 kategorií:
A. odvozené z kondenzace ketoacylových podjednotek
1.
2.
3.
4.
5.
6.
mastné kyseliny,
glycerollipidy (triacylglyceroly),
glycerofosfolipidy,
sfingolipidy,
sacharolipidy,
polyketidy,
B. odvozené od kondenzace isoprenových podjednotek:
7. steroidy
8. prenolové lipidy.
Pojem lipid se někdy pouţívá jako synonymum pro tuky a naopak termínem tuky bývá
myšlena celá skupina lipidů, coţ není zcela správné, neboť se jedná o podskupinu lipidů triglyceridy (triacylglyceroly), tj, estery glycerolu a mastných kyselin.
38
ÚLOHA 1.
Alkalická hydrolýza tuků - zmýdelnění tuků
Mýdla jsou soli mastných kyselin a vznikají alkalickou hydrolýzou triacylglycerolů.
Proces se nazývá zmýdelnění.
Mýdla také vznikají z tuků v duodenu hydrolytickým působením alkalické střevní šťávy
a napomáhají tak emulgaci dalších molekul esterifikovaných lipidů bezprostředně po vstupu
ţaludečního obsahu.
Pracovní postup:
– Do kádinky odměřte pasterkou 2 ml oleje a přidejte 10 ml alkoholického roztoku
KOH.
– Za stálého míchání zvolna zahřívejte, zmýdelnění proběhne asi za 5 – 10 min.
– Obsah kádinky přelijte do 25 ml horké destilované vody
– Takto získáte roztok alkalického mýdla. Pomocí indikátorového papírku ověřte jeho
pH.
Poznámky:
39
ÚLOHA 2.
Vlastnosti mýdel
2.1. Rozpustnost ve vodě
Draselná mýdla jsou mazlavé látky a sodná pevné, obojí jsou ve vodě rozpustné a mají
emulgační schopnosti. Mýdla vápenatá, hořečnatá a těţkých kovů jsou ve vodě nerozpustná.
Při mytí v tvrdé vodě vznikají nerozpustná vápenatá a hořečnatá mýdla a ta jsou velmi
dobrou ţivnou půdou pro dermatofyta a kvasinky, případně i bakterie, které jsou pak příčinou
zánětlivých onemocnění kůţe. Proto je potřeba při mytí všechny koţní záhyby (tzv.
intertriginózní místa) i meziprstní prostory důkladně opláchnout tekoucí vodou.
Pracovní postup:
– K 1 ml roztoku chloridu vápenatého pomalu přidávejte několik kapek mýdlového
roztoku získaného v úloze 1.
– Pozorovanou chemickou reakci vyjádřete iontovým zápisem:
– Mýdla draselná jsou ve vodě:
– pH jejich vodného roztoku je:
– Mýdla vápenatá jsou ve vodě:
Poznámky:
40
2.2. Emulgační schopnost mýdel
Mýdla, soli mastných kyselin, patří podle své struktury mezi anionaktivní tenzidy (viz
Bílkoviny, úloha 2.). K anionaktivním tenzidům patří i sodné sole alkylsírových či
alkylsulfonových kyselin, např. dodecylsulfát sodný (SDS), který se pouţívá k solubilizaci
buněčných membrán. Patří k nim také soli ţlučových kyselin, které jsou součástí ţluče a
přispívají k emulgaci tuků.
Běţný desinfekční prostředek Ajatin, kvartérní amoniová sůl s alkylem C8 C18 jako
substituentem (viz Bílkoviny, úloha 3.), patří mezi velmi účinné kation-aktivní tenzidy, stejně
jako další desinfekční prostředek Septonex.
Vedle obou výše uvedených skupin ionogenních tenzidů, existuje velká skupina
neionogenních tenzidů, které se díky své zanedbatelné toxicitě pouţívají např. v prostředcích
na mytí nádobí. Polární část jejich molekuly tvoří větší počet atomů kyslíku, které jsou
součástí etherových a esterových vazeb v molekulách těchto typů tenzidů. Příkladem jsou
vyšší estery a ethery polyethylenglykolu s komerčními názvy např. Triton a Tween.
K neionogenním emulgátorům lze počítat i ethanol (viz úloha 2.).
Pracovní postup:
– Ve zkumavce protřepejte kapku oleje s vodou a vzniklou emulzi ponechte stát. Po
chvíli se opět obě sloţky oddělí.
– Přidejte malé mnoţství mýdlového roztoku (z úlohy 1.) a dobře protřepejte. Vznikne
jemná emulze.
– Stejným způsobem vyzkoušejte emulgačni schopnost zředěných roztoků Ajatinu a
Jaru.
Poznámky:
41
ÚLOHA 3.
Důkaz přítomnosti dvojných vazeb ve vyšších mastných kyselinách
Sloučeniny, obsahující jednu nebo více násobných vazeb, jsou velmi citlivé k oxidaci,
čímţ se liší od sloučenin nasycených. Pouţijeme-li jako oxidační činidlo roztok
manganistanu draselného v kyselém prostředí, dojde k hydroxylaci dvojné vazby a k redukci
manganistanu.
Triglyceridy s krátkým řetězcem a vyšším počtem násobných vazeb jsou oleje.
S prodluţující se délkou řetězce mastných kyselin a klesajícím počtem násobných vazeb
stoupá jejich konzistence (mazlavé aţ pevné tuky).
Pracovní postup:
– Do zkumavky odlijte 0,5 ml slunečnicového oleje, 1 m1 roztoku manganistanu
draselného a plastikovou pipetkou přidejte 1! kapku koncentrované kyseliny sírové
(nadbytek koncentrované H2SO4 způsobuje ztmavnutí organické sloučeniny, protoţe
dochází k její mineralizaci).
– Obsah zkumavky dobře, ale opatrně protřepejte. Pozorujte změnu zbarvení.
– Tutéţ reakci proveďte i s olivovým olejem, a také s kyselinou olejovou a několika
krystaly kyseliny palmitové.
– Stupeň nenasycenosti zapište do tabulky 2. Pouţijte znamének +, ++ atd.
Tabulka 2.
sloučenina
slunečnicový olej
olivový olej
kyselina olejová
kyselina palmitová
zbarvení
stupeň nenasycenosti
Poznámky:
42
LIPIDY II
Klíčová slova: lipidy, triacylglyceroly, 2-monoacylglyceroly, mastné kyseliny, esterová
vazba, hydrolytické štěpení tuků, pankreatická lipasa (EC 3.1.1.3), tenzidy, soli ţlučových
kyselin, volné radikály, řetězová reakce, buněčné membrány, peroxidy, reakce aldehydů s
aminoskupinami, antioxidanty, cheláty.
Reagencie:
1. extrakt pankreatické lipasy (obsah 40 draţé Pancreolanu, ZENTIVA, rozpustit ve 400
ml směsi voda - glycerol 1:1, zfiltrovat)
2. slunečnicový olej
3. ethanol
4. roztok hydroxidu sodného 0,01 mol/l
5. roztok fenolftaleinu v ethanolu 2 g/l.
6. roztok rybího tuku (Infadin) v hexanu 40 g/1
7. fosfátový pufr 0,05 mol/l, pH 7
8. fosfátový pufr 0,05 mol/l, pH 9
9. roztok solí ţlučových kyselin 100g/l
10. roztok kyseliny olejové 10 g/l v ethanolu
11. roztok síranu ţeleznatého 0,4 mmol/l
43
Trávení a vstřebávání lipidů
Tuky by měly ve vyváţené stravě dospělého člověka představovat přibliţně 25 - 30 %
energetického příjmu. Jedná se především o triacylglyceroly, tj. estery glycerolu a mastných
kyselin, které slouţí jako hlavní energetická zásoba u většiny ţivočichů. Při jejich trávení
v tenkém střevě dochází nejprve k hydrolýze esterových vazeb za vzniku 2monoacylglycerolů a mastných kyselin (pouze 20 % triacylglycerolů je rozloţeno aţ na
glycerol poté co dojde ke spontánní izomerizaci 2-monoacylglycerolu na 1- či 3monoacylglycerol). Volné mastné kyseliny podléhají zmýdelnění a také fungují jako přídatné
detergenty, resp. emulgátory. Po vstřebání do enterocytu dochází k resyntéze triacylglycerolů,
které jsou následně uvolněny do krevního oběhu ve formě chylomiker.
Význam žlučových kyselin
Triacylglyceroly jsou ve střevě vzhledem ke své hydrofobii přítomny ve formě
tukových kapének, pro jejich efektivní trávení musí nejprve dojít k emulgaci na menší částice.
Tomu napomáhá peristaltika trávicího traktu a zejména přítomnost ţlučových kyselin a
fosfolipidů ţluči. Ţlučové kyseliny jsou syntetizovány v hepatocytech z cholesterolu
(primární ţlučové kyseliny cholová a chenodeoxycholová) a secernovány do ţluči. Působí
jako detergenty, hydrofobní část představuje cyklopentanoperhydrofenantrenové jádro, za
hydrofílii jsou zodpovědné hydroxylové skupiny a karboxylová skupina, na kterou můţe být
amidovou vazbou navázán glycin či taurin (konjugované ţlučové kyseliny). 90 95 %
ţlučových kyselin je v terminálním ileu zpětně resorbováno a prodělává tzv. enterohepatální
oběh. Působením střevních bakterií můţe u části primárních ţlučových kyselin dojít
k dekonjugaci a k odstranění hydroxylové skupiny v poloze 7 za vzniku sekundárních
ţlučových kyselin (kyselina deoxycholová a litocholová).
Pankreatická lipasa
Hlavním enzymem zodpovědným za hydrolýzu triacylglycerolů je pankreatická lipasa,
část lipidů obsahujících mastné kyseliny s krátkým a středně dlouhým řetězcem (do 12 atomů
uhlíku, obsaţené především v kravském mléku) je rozkládána působením lingvální a
ţaludeční lipasy. U novorozenců je sekrece pankreatické lipasy nedostatečná, na štěpení tuků
se podílí lipasa přítomná v mateřském mléce, která je odolná k působení nízkého ţaludečního
pH a vyţaduje niţší mnoţství ţlučových kyselin. Pankreatická lipasa je do duodena
uvolňována společně s proteinovým kofaktorem (kolipázou), který tvoří s lipázou komplex a
zvyšuje její aktivitu. Ke štěpení triacylglycerolů dochází na povrchu emulze tukových
kapének o velikosti 200 500 nm. Vznikající monoacylglyceroly, diacylglyceroly a mastné
kyseliny vytvářejí společně se ţlučovými kyselinami, molekulami cholesterolu, kyselinou
lysofosfatidovou a v tucích rozpustnými vitamíny směsné micely o velikosti 3 10 nm.
Následně dochází pasivní difuzí či pomocí přenašečů ke vstřebání jednotlivých součástí
směsných micel do enterocytů. V hladkém endoplazmatickém retikulu enterocytu dochází
k reesterifikaci monoacylglycerolů a mastných kyselin s dlouhým řetězcem na
triacylglyceroly, které jsou ve formě chylomiker uvolňovány do lymfatického oběhu. Mastné
kyseliny s kratším řetězcem (do C10 event. C12) jsou transportovány cestou portálního oběhu
bez reesterifikace.
Cílem praktika je demonstrovat emulgační schopnosti ţlučových kyselin a jejich
význam pro funkci pankreatické lipasy.
44
Klinické poznámky:
Při onemocněních pankreatu dochází ke zvýšení hladiny pankreatické lipasy v plazmě.
Stanovení pankreatické lipasy společně s pankreatickým izoenzymem α-amylasy se
vyuţívá při diagnostice akutní pankreatitidy.
Orlistat (tetrahydrolipstatin) je irreverzibilní inhibitor ţaludeční a pankreatické lipasy.
Spolu s reţimovými opatřeními můţe být pouţit k léčbě obezity. Sniţuje absorpci
přijatého tuku ve stravě aţ o 30 %, z mechanismu účinku vyplývá neţádoucí účinek,
steatorhea.
Při závaţných chronických onemocněních slinivky břišní (nejčastěji chronická
pankreatitida, ale téţ cystická fibróza - mukoviscidóza) můţe dojít k projevům
nedostatečné zevně sekretorické funkce pankreatu, na níţ se největší měrou podílí
nedostatek pankreatické lipasy. Dochází k poruše trávení a vstřebávání tuků a v tucích
rozpustných vitamínů, onemocnění se projevuje váhovým úbytkem, průjmy a
steatoreou. V diagnostice lze vyuţít např. dechový test, kterým se stanoví schopnost
organismu rozloţit triacylglyceroly značené izotopem uhlíku 13C. Nedostatek
trávicích enzymů lze nahradit podáváním výtaţku vepřového pankreatu ve formě
enterosolventních tablet.
Abetalipoproteinemie (Bassen-Kornzweigův syndrom) je vzácné vrozené onemocnění
způsobené poruchou funkce proteinu přenášejícího triacylglyceroly do lumen
endoplazmatického retikula v enterocytech a hepatocytech (microsomal triglyceride
transfer protein, MTP). Je porušena tvorba chylomiker a VLDL, onemocnění se
projevuje malabsorpcí lipidů a steatorheou, komplikací je postiţení nervového
systému.
45
ÚLOHA 1.
Vliv solí žlučových kyselin na štěpení tuků katalyzované pankreatickou lipasou
Pankreatická lipasa katalyzuje štěpení esterové vazby triacylglycerolů především v
poloze 1 a 3. Produktem tohoto štěpení jsou 2-monoacylglyceroly a volné mastné kyseliny.
Soli ţlučových kyselin, působící jako anionaktivní tenzidy emulgují v tenkém střevě tuky a
tím usnadňují interakci mezi tuky a pankreatickou lipasou. Enzym je v tucích nerozpustný a
proto můţe projevovat svoji katalytickou účinnost pouze na povrchu tukových kapének,
jejichţ celkový povrch se zvyšuje právě emulgací. Lipasa je tímto způsobem aktivována
nepřímo.
Pracovní postup:
– Do tří zkumavek napipetujte po 1 ml extraktu lipasy.
– Obsah zkumavky 1 povařte 3 min ve vroucí vodní lázni. Ochlaďte pod tekoucí vodou
(slepý vzorek).
– Pokračujte v přípravě inkubačních směsí podle tabulky 1. současně ve všech třech
zkumavkách.
Tabulka 1.
zkumavka
extrakt lipasy (ml)
1
1
ano
2
1
0,5
0,5
roztok ţlučových kyselin (ml)
olivový olej (ml)
spotřeba NaOH (ml)
skutečná spotřeba NaOH (ml)
volné mastné kyseliny (mmol)
3
1
0,5
0,25
0,25
0,25
– Obsah zkumavek promíchejte a inkubujte 30 min při 37° C.
– Po skončení inkubace přelijte obsah zkumavek do Erlenmeyerových baněk, zkumavky
vypláchněte 2 x 1 ml ethanolu a ethanol přilijte do odpovídajících baněk.
– Hydrolyzáty, obsahující volné mastné kyseliny, titrujte roztokem hydroxidu sodného
v přítomnosti několika kapek fenolftaleinu aţ do růţového zbarvení.
– Spotřeby hydroxidu sodného zapište do tabulky 1.
– Spotřebu hydroxidu sodného v první baňce (slepý pokus, odpovídá mnoţství volných
mastných kyselin přítomných v olivovém oleji před lipolýzou) odečtěte od spotřeby v
Erlenmeyerových baňkách 2 a 3. Získané skutečné spotřeby zapište do tabulky 1.
– Ze skutečné spotřeby vypočítejte mnoţství volných mastných kyselin (mmol),
vzniklých štěpením olivového oleje.
46
Poznámky:
47
ÚLOHA 2
Emulgační schopnost ţlučových kyselin
Štěpení tuků v tenkém střevě lipasou a vstřebávání monoacylglycerolů a mastných
kyselin závisí na jejich rozptýlení ve vodní fázi. Tomu napomáhají soli ţlučových kyselin,
které jsou součástí ţluče. Sniţují povrchové napětí na rozhraní obou fází jako anionaktivní
tenzidy.
Pracovní postup:
– Do zkumavek napipetujte reagencie dle tabulky:
zkumavka č.
pufr pH 7 (ml)
pufr pH 9 (ml)
destilovaná H2O (ml)
roztok solí ţluč. kyselin (ml)
ethanol (ml)
roztok kyseliny olejové (kapky)
vyhodnocení
1
1,0
−
0,5
−
−
2
2
1,0
−
−
0,5
−
2
3
1,0
−
−
−
0,5
2
4
−
1,0
0,5
−
−
2
– Zkumavky dobře protřepejte a inkubujte 10 min ve vodní lázni při 37° C
– Porovnejte emulgační schopnost solí ţlučových kyselin, ethanolu a vyššího pH podle
projasnění obsahu zkumavek.
– K hodnocení výsledků pouţijte znamének +,
48
LIPIDY III
Klíčová slova: cholesterol, estery cholesterolu, HDL cholesterol, LDL cholesterol,
triacylglyceroly, lipoproteiny, cholesterolesterasa (CHES - EC 3.1.1.13), cholesteroloxidasa
CHOD - EC 1.1.3.6), lipoproteinová lipasa (LPL - EC 3.1.1.34), glycerolkinasa (GYK –
EC 2.7.1.30), glycerolfosfátoxidasa (G30 - EC 1.1.99.5).
Reagencie:
1. vzorek séra
2. souprava Cholesterol (BioSystems):
a) pracovní roztok TC:
PIPES 35 mmol/l, pH 7,0
cholát sodný 0,5 mmol/l
fenol 28 mmol/l
4-aminoantipyrin 0,5 mmol/l
chlorid sodný 20,0 mmol/l
cholesterolesterasa 0,2 U/l
cholesteroloxidasa 0,1 U/l
peroxidasa 0,8 U/l
b) standard TC, koncentrace dle údaje výrobce
3. souprava HDL-Cholesterol, (Biosystems):
a) sráţecí roztok HDLc:
fosfowolframan 0,4 mmol/l
chlorid hořečnatý 20,0 mmol/l
4. souprava Triglyceridy (Biosystems):
a) pracovní roztok TAG:
PIPES 45mmol/l, pH 7
chlorid hořečnatý 5 mmol/l
ATP 0,9mmol/l
4-aminoantipyrin 0,75 mmol/l
4-chlorfenol 6 mmol/l
L-glycerol-3-fosfátoxidasa 4 U/l
glycerolkinasa 1,5 U/l
peroxidasa 0,8 U/l
lipasa 100 U/l
b) standard TAG, koncentrace dle údaje výrobce
49
Lipidy stanovované při biochemickém vyšetření zahrnují celkový cholesterol (TC),
HDL cholesterol (HDLc) a triacylglyceroly (TAG).
Lipidy jako hydrofobní látky jsou v krevním řečišti transportovány ve formě
hydrofilních lipoproteinových částic sloţených z apoproteinů, triacylglycerolů (TAG),
cholesterolu, esterů cholesterolu a fosfolipidů. Volné mastné kyseliny jsou transportovány
vázané na albumin. Podle fyzikálních vlastností a chemického sloţení jsou lipoproteiny
děleny do 4 základních tříd (viz tabulka):
Tabulka 1. Základní rozdělení a charakteristika lipoproteinových částic
dělení dle hustoty
(ultracentrifugace)
elektroforetická
pohyblivost
hustota (g/ml)
velikost
typický apoprotein
% zastoupení proteinu
% zastoupení
cholesterolu
% zastoupení TAG
% zastoupení PL
základní funkce
chylomikra
VLDL
LDL
HDL
zůstanou na
startu
0,98
pre-beta
beta
alfa
1,006
100 1 000 nm
B-48
1
5,5
30 70 nm
B-100
10
19
1,019 1,063
15 25 nm
B-100
20
45
1,063 1,21
7,5 10 nm
A-I
50
15
90
3,5
transport TAG
přijatých
v potravě
k periferním
tkáním
50
20
transport TAG
z jater
k periferním
tkáním
10
25
transport
cholesterolu
k periferním
tkáním
5
30
reverzní
transport
cholesterolu
z tkání do jater
Lipoproteinové částice jsou produkovány v játrech (VLDL, HDL), v tenkém střevě
(chylomikra, HDL), LDL a IDL vznikají katabolismem VLDL v krevním řečišti. Jednotlivé
apoproteiny jsou důleţitou strukturní součástí lipoproteinové částice zodpovědnou za její
hydrofílii (apoB-48, apoB-100, apoA), slouţí jako vazebné molekuly pro buněčné receptory
(apoB-100, apoE) a jako kofaktory enzymů (apoC-II, apoC-III, apoA-I).
Dalším lipoproteinem je lipoprotein (a) [Lp(a)]. Je to částice, která se skládá z molekuly
LDL, jejíţ apolipoprotein apo-B-100 se váţe disulfidovou vazbou se specifickým
glykoproteinem apo(a). Lp(a) můţe mít různé velikosti v závislosti na izoformách. Ukazuje
se, ţe apolipoprotein (a) můţe inhibovat fibrinolýzu, která vzhledem ke značné strukturální
homologii soupeří s plazminogenem. Tento efekt není moţno pozorovat u LDL bez
apolipoproteinu (a). Gen kódující apo(a) se nachází na dlouhém raménku chromosomu 6
poblíţ genu pro plazminogen. Lp(a) je povaţován za aterogenní rizikový faktor, který je
nezávislý na dalších lipidových parametrech a na exogenních faktorech, jako je např. dieta.
Jeho hladina je většinou geneticky determinovana. Zvýšené hladiny Lp(a) nad 0,3 g/l mají
vysokou prediktivní hodnotu pro koronární srdeční onemocnění, zejména v kombinaci se
zvýšenými hladinami LDL cholesterolu. Zatímco stanovení celkového cholesterolu a
triacylglycerolů se pouţívá pro účely skríningu, měření Lp(a) je, kromě LDL cholesterolu,
HDL cholesterolu, apolipoproteinu A I a apolipoproteinu B, cenným nástrojem pro
diferenciální diagnózu koronárních srdečních onemocnění. Normální hodnota je <0,3 g/l.
50
V periferních tkáních jsou z částic bohatých na TAG (chylomikra, VLDL) působením
lipoproteinové lipasy (LPL) uvolňovány volné mastné kyseliny, které jsou v buňkách vyuţity
jako zdroj energie nebo uloţeny ve formě triacylglycerolů. HDL částice mají schopnost
odebírat cholesterol z buněčných membrán a hrají klíčovou úlohu v reverzním transportu
cholesterolu.
Biochemické vyšetření lipidového metabolismu obvykle zahrnuje stanovení hladiny
TAG a celkového cholesterolu a ev. jeho HDL a LDL frakce. Spíše neţ přímým stanovením
je LDL cholesterol dopočítán podle tzv. Friedewaldova vzorce (LDL-cholesterol = celkový
cholesterol – HDL-cholesterol – TAG/2,2). Výpočet je zaloţen na odhadu obsahu
cholesterolu ve VLDL částicích na základě sérové koncentrace TAG, nelze ho však pouţít při
hladině TAG vyšší neţ 4 - 4,5 mmol/l.
Alternativou stanovení cholesterolu v jednotlivých frakcích lipoproteinů je přímé
stanovení jednotlivých apoproteinů reprezentujících aterogenní částice (apo B-100) a HDL
(apo A-I) částice. Poměr apoB-100/apoA-I můţe v některých případech (diabetici, pacienti
s metabolickým syndromem, s hypertriacylglycerolemií) přesněji přispívat k odhadu rizika
kardiovaskulární příhody. Elektroforéza lipoproteinů (Obr. 1.) je v běţné lékařské praxi
vyuţívána jen málo, byla však základem pro dříve pouţívanou klasifikaci
hyperlipoproteinemií dle Fredricksona.
Obr. 1. Srovnání elektroforeogramu séra obarveného na proteiny (A) a lipidy (B)
Klinické poznámky:
Dyslipidemie (dyslipoproteinemie) jsou charakterizovány zvýšenou hladinou a/nebo
nevhodným zastoupením jednotlivých lipoproteinových částic (nejčastěji sníţením
HDL). Hladina lipidů v krvi představuje jeden z významných rizikových faktorů
aterosklerózy a jejích komplikací (ischemická choroba srdeční, cévní mozkové
příhody, ischemická choroba dolních končetin). Kromě znalosti celkové hladiny
cholesterolu v plazmě je však k odhadu kardiovaskulárního rizika důleţitá téţ znalost
zastoupení cholesterolu v jednotlivých typech lipoproteinových částic. Vysoká
hladina HDL cholesterolu představuje protektivní faktor, zatímco LDL cholesterol a
především malé denzní LDL částice jsou vysoce aterogenní.
Dyslipidemie dělíme na
1) izolovanou hypercholesterolemii
2) kombinovanou hyperlipidemii
3) izolovanou hypertriacylglycerolemii
51
Toto dělení nahradilo vzhledem ke své praktičnosti dříve pouţívanou klasifikaci dle
Fredricksona. Hranice, pod kterou jsou koncentrace celkového, LDL cholesterolu a TAG
povaţovány za normální, se neustále sniţuje a závisí mj. na dalších rizikových faktorech
kardiovaskulárních onemocnění. Doporučené hodnoty pro běţnou populaci v ČR uvádí
tabulka 2.
Před rozhodnutím o zahájení léčby dyslipidemie mají být provedeny alespoň 2 odběry
v rozmezí 1 8 týdnů ve stejné laboratoři (pacient má v té době dodrţovat svůj obvyklý
ţivotní styl, způsob stravování a výrazněji neměnit svou tělesnou hmotnost). Při větším neţ
15 20% rozdílu výsledků obou vyšetření je vhodné třetí stanovení. 10leté riziko fatálního
kardiovaskulárního onemocnění lze odhadnout na základě pohlaví, věku, systolického TK,
celkového cholesterolu a kuřáckých návyků z tabulek SCORE. Za osoby s vysokým
kardiovaskulárním rizikem povaţujeme všechny osoby s 10letým rizikem úmrtí na
kardiovaskulární příhodu ve výši ≥5 %.
Tabulka 2. Cílové hodnoty pro běţnou populaci ČR (Česká společnost pro aterosklerózu
2007)
celkový cholesterol
LDL cholesterol
HDL cholesterol
TAG
< 5 mmol/l
< 3 mmol/l
muţi > 1,0 mmol/l ,
ţeny > 1,2 mmol/l
< 1,7 mmol/l
Obr. 2. Tabulky SCORE pro českou republiku
52
ÚLOHA 1.
Stanovení celkového cholesterolu (TC)
Pro stanovení celkového cholesterolu se pouţívá enzymová metoda, která zahrnuje tyto
tři enzymové reakce:
1. Hydrolýzu esterů cholesterolu cholesterolesterasou (CHES):
CHES
cholesterol + mastné kyseliny
estery cholesterolu
2. Oxidaci cholesterolu cholesteroloxidasou (CHOD) za současné tvorby peroxidu
vodíku:
CHOD
cholesterol + O2
4-cholesten-3-on + H2O2
3. Oxidativní kopulaci 4-aminoantipyrinu s fenolem a peroxidem
katalyzovanou peroxidasou (POD) za tvorby barevného produktu:
vodíku
POD
2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol
barevný produkt
Pracovní postup:
– Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.
– Do zkumavek napipetujte roztoky podle tabulky 3. Malé objemy pipetujte ke dnu
zkumavek.
Tabulka 3.
reagencie (ml)
sérum
standard TC
destilovaná voda
pracovní roztok TC
vzorek
0,01
−
−
1,0
standard
−
0,01
−
1,0
slepý vzorek
−
−
0,01
1,0
– Reakční směs nechte inkubovat 10 min při pokojové teplotě.
– Do 10 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorků séra (Avz) i standardu
(Ast) při 500 nm, výsledek zapište do tabulky 4.
– Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorku a standardu a z koncentrace
standardního roztoku TC vypočítejte koncentraci celkového cholesterolu.
53
Tabulka 4.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (mmol/l)
sérum
standard
Poznámky:
54
ÚLOHA 2.
Stanovení HDL cholesterolu (HDL-C)
Lipoproteiny VLDL a LDL jsou selektivně vysráţeny účinkem fosfowolframanu a
hořečnatých iontů Mg2+.
Pracovní postup:
– Do eppendorfské zkumavky napipetujte 0,2 ml séra (stejný vzorek jako v úloze 1.) a
0,5 ml sráţecího roztoku a protřepejte.
– Nechte stát 10 min při laboratorní teplotě a potom centrifugujte 10 min při
4000 ot./min.
– Supernatant opatrně odlijte do zkumavky "eppendorf" a pouţijte k přípravě vzorku
pro stanovení HDLC.
– Vzorek séra (supernatant) a standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou.
zkumavek.
Tabulka 5.
reagencie (ml)
supernatant
vzorek
0,05
standard TC
destilovaná voda
pracovní roztok TC
1,0
standard
slepý vzorek
POZOR! 0,01
0,05
0,05
1,0
1,0
– Do 10 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorků séra (Avz) i standardu (Ast)
při 500 nm, výsledek zapište do tabulky 6.
– Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorku a standardu a z koncentrace
standardního roztoku TC vypočítejte koncentraci HDL cholesterolu.
Tabulka 6.
vzorek č.:
sérum
standard
absorbance
průměr
c (mmol/l)
Poznámky:
55
ÚLOHA 3.
Stanovení triacylglycerolů (TAG)
Enzymové stanovení triacylglycerolů zahrnuje tyto reakce:
1. Hydrolýzu triacylglycerolů katalyzovanou lipoproteinovou lipasou (LPL):
LPL
triacylglyceroly + H2O
glycerol + mastné kyseliny
2. Fosforylaci uvolněného glycerolu katalyzovanou glycerolkinasou (GK):
GK
glycerol + ATP
glycerol-3-fosfát + ADP
3. Oxidaci glycerol-3-fosfátu na dihydroxyacetonfosfát katalyzovanou enzymem
glycerolfosfátoxidasou (GPO):
GPO
glycerol-3-fosfát
dihydroxyacetonfosfát + H2O2
4. Vzniklý peroxid vodíku se vyuţívá k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu
s 4-chlorfenolem na barevný produkt. Reakce je katalyzovaná peroxidasou (POD):
POD
2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + 4-chlorfenol
barevný produkt
Pracovní postup:
– Vzorek séra (pouţívaný y úloze 1. a 2.) i standard TAG zpracujte v tripletu, slepý
vzorek jednou.
zkumavek.
Tabulka 7.
reagencie (ml)
sérum
standard TAG
destilovaná voda
inkubační směs TAG
vzorek
0,01
−
−
1,0
standard
−
0,01
−
1,0
slepý vzorek
−
−
0,01
1,0
– Do 60 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorků (Avz) i standardu (Ast) při
500 nm, výsledek zapište do tabulky 8.
– Z průměru naměřených hodnot absorbance vzorku a standardu a koncentrace
standardního roztoku TAG vypočítejte koncentraci triacylglycerolů.
56
Tabulka 8.
vzorek č.:
absorbance
průměr
c (mmol/l)
sérum
standard
Poznámky:
57
ÚLOHA 4.
Výpočet LDL cholesterolu a HDL indexu podle Friedewalda
Distribuci cholesterolu v krevní plazmě lze vyjádřit vztahem:
celkový cholesterol = c1 + c2 + c3
c1 = HDL cholesterol
c2 = LDL cholesterol
c3 = VLDL cholesterol
Frakce VLDL obsahuje všechny typy triacylglycerolů, jejichţ molární frakce je
konstantní. Koncentraci VLDL cholesterolu je moţno nahradit přibliţně jednou polovinou
koncentrace TAG ve vzorku séra (TAG/2,2). Pro výpočet distribuce cholesterolu mezi
lipoproteiny stačí tedy stanovit celkový cholesterol, HDL cholesterol a triacylglyceroly ve
vzorku séra.
LDLc (mmol/l) = TC
HDLc
VLDL = TC
HDLc - TAG/2,2
TC
HDL index =
HDLc
K výpočtu pouţijte naměřené hodnoty a výsledky zapište do tabulky 9.
VYHODNOCENÍ:
Tabulka 9.
NAMÉŘENÉ
HODNOTY
TC (mmol/l)
HDLc (mmol/l)
LDLc (mmol/l)
TAG (mmol/l)
HDL index
POZOR! Pro výpočet HDL indexu lze pouţít i obrácený vzorec:
HDLc
HDL index =
TC
58
ÚLOHA 5.
Stanovení TC a TAG ve vlastní kapilární krvi pomocí přístroje
REFLOTRON® Roche
Analyzátor Reflotron® (obr. 1.) vyuţívá ke stanovení analytů principu tzv. suché
chemie. Vlastní měření je zaloţeno na technice reflexní fotometrie, při níţ se měří intenzita
odraţeného záření od homogenně zbarvené podloţky.
Obr. 1. Reflotron Plus (Roche). 1 – tiskárna, 2 – displey, 3 – indikační LED diody, 4 –
podavač a komora pro měření reagenčního prouţku, 5 – stojánek na reagencie
Reakce probíhají na pevném nosiči (reagenční zóna prouţku), který obsahuje suchá
činidla, aktivovatelná vodou obsaţenou v naneseném vyšetřovaném vzorku. Reagencie
potřebné pro reakci jsou nanesené aţ pod vrstvou skleněných vláken, na kterých se zachytí
krvinky. Reflotron můţe analyzovat plnou krev, plazmu nebo sérum.
Připojený počítač umoţňuje ze stanovených hodnot spočítat koncentraci LDLC dle
Friedewalda a vyhodnotit kardiální riziko pacientů.
Pracovní postup:
– Zapněte přístroj - na displeji se objeví datum a čas.
– Vyčkejte, aţ se zobrazí zpráva PŘIPRAVEN K MĚŘENÍ
– Vyjměte testovací prouţek z tuby a ihned ji uzavřete. Neuzavření tuby má za následek
znehodnocení hygroskopického činidla uloţeného v zátce, a tím znehodnocení
testovacích prouţků.
59
– Promasírujte lehce špičku prstu, abyste zvýšili prokrvení a tak usnadnili odběr.
Nezapomeňte na dezinfekci! Pouţijte zařízení pro vpich do prstu (lanceta a Autoclix).
Optimální místo vpichu u dospělých je střed bříška prstu (ze strany).
– Kapilární krev nechte volně vzlínat (pouze vlivem kapilárních sil) po barevnou rysku
do heparinizovaných kapilár. Přebytečnou krev otřete na vnějším povrchu kapiláry
čtverečkem buničiny.
– Odtrhněte krycí folii z reagenčního prouţku.
– Pomocí aplikátoru naneste 32 µl krve z kapiláry na příslušný reagenční prouţek.
– Reagenční prouţek umístěte vodorovně do podavače přístroje, na displeji se objeví
zpráva ZAVŘETE DVÍŘKA.
– Po zavření dvířek probíhá čtení magnetického kódu a na displeji se objeví název
zadaného analytu.
– Po ukončení měření přístroj zobrazí stanovenou koncentraci.
– Získané hodnoty zapište do tabulky 8.
– Naměřené hodnoty TC a TAG pouţijte k výpočtu LDLC (klávesa F3) a kardiálního
rizika (klávesa F2).
– Při výpočtech zadávejte příslušné parametry podle poţadavků počítače, kaţdou
odpověď potvrďte klávesou ENTER.
Poznámka: Při výpočtu kardiálního rizika přístroj udá tyto výsledky:
výskyt
pravděpodobnost infarktu v průběhu 4 let v %
faktor kolikrát je rizikový faktor pacienta vyšší ve srovnání s lidmi stejné
věkové skupiny
60
Tabulka 10.
celkový cholesterol (mmol/l)
HDL cholesterol (mmol/l) (nutno zadat, nestanovuje se)
triacylglyceroly (mmol/l)
LDL cholesterol (mmol/l)
HDL index
kardiální riziko – výskyt
– faktor
Poznámky
61
ÚLOHA 6.
Hodnocení kardiálního rizika se změnami důležitých parametrů
Pracovní postup:
– Hodnoty uvedené v tabulce 11. zadejte do počítačového programu Reflotronu pro
výpočet LDLC podle Friedewalda (klávesa F3) jednotlivých pacientů.
– Výsledky doplňte do tabulky 11.
– Pomocí počítačového programu Reflotronu porovnejte kardiální riziko (klávesa F2)
pacientů při optimálních podmínkách (nízký věk, nekuřák atd.) a při nepříznivých
parametrech.
– Zhodnoťte, jak nepříznivé parametry zvyšují kardiální riziko.
Tabulka 11.
pacient
celkový cholesterol (mmol/l)
HDL-cholesterol (mmol/l)
triacylglyceroly (mmol/l)
LDL-cholesterol (mmol/l)
HDL index
kardiální riziko – výskyt
– faktor
A
5,37
1,24
1,25
B
4,71
1,81
0,86
C
5,65
1,81
3,10
D
6,50
2,70
0,66
Poznámky:
62
TETRAPYRROLY
Klíčová slova: komplexní sloučeniny, pyrrol, porfyriny, hem, myoglobin, hemoglobin,
hemoproteiny, metaloproteiny, prostetická skupina, bilirubin, konjugovaný bilirubin,
glukuronosid.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
nesráţlivá krev
krev nasycená oxidem uhelnatým
Ajatin
vzorek nesráţlivé krve pro stanovení hemoglobinu
Drapkinovo činidlo (roztok 50 mg kyanidu draselného a 200 mg ferrikyanidu draselného
v 1 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného 140 mg/l) !JED!
vzorek krevního séra pro stanovení bilirubinu
fyziologický roztok
činidlo diazo I (roztok kyseliny sulfanilové 5 g/l v kyselině chlorovodíkové 0,6 mol/l)
činidlo diazo II (roztok dusitanu sodného 5 g/l)
roztok akcelerátoru (kofein a benzoan sodný)
Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g vinanu sodnodraselného kryst.
v 1 l vody)
63
ÚLOHA 1
Vlastnosti hemoglobinu
Mezi tetrapyrroly, tj. sloučeniny obsahující ve své struktuře čtyři pyrrolová jádra
spojená methylenovými nebo methinovými můstky, náleţí hem
prostetická skupina
hemoglobinu a dalších hemoproteinů (myoglobin, některé oxidoreduktasy).
Pyrrolová jádra spojená methylenovými můstky se nazývají porfyrinogeny, kdeţto
pyrroly spojené methinovými můstky jsou profyriny k nimţ náleţí hem.
Hlavní funkcí hemoglobinu je transport O2 a CO2, mezi plícemi a tkáněmi. Podílí se
rovněţ na udrţování acidobazické rovnováhy vnitřního prostředí (transport H+ a CO2).
Oxid uhelnatý se váţe na hem asi 250x pevněji neţ O2 a tak blokuje transport kyslíku.
Kromě toho je hem schopen přenášet CNˉ a SHˉ k cytochromům dýchacího řetězce, kde
v důsledku pevné vazby na Fe3+ cytochromoxidasy blokují přenos elektronů na O2ˉ.
Při první pomoci u intoxikací kyanidy musí být terapie nasazena během několika minut:
čicháním amylnitritu se hemoglobin oxiduje na methemoglobin, který pevně naváţe CNˉ za
vzniku kyanomethemoglobinu. Dále se podá i.v. roztok Na2SO3, kterým se působením
enzymu kyanidsulfurtransferasy neboli rhodanadasy převedou volné CN– na netoxický
thiokyanát (SCN–) a ten se snadno vyloučí močí. Takto se zabrání vazbě CN– na hemové
proteiny včetně cytochromu P450. Místo amylnitritu lze v prvé fázi podat i.v. kobalamin
(vitamin B12) který rovněţ vyváţe volné CNˉ za vzniku kyanokobalaminu.
Produktem katabolismu hemu je bilirubin a tzv. ţlučová barviva.
1.1. Spektrální křivky derivátů hemoglobinu
Při otravách oxidem uhelnatým (výfukové plyny, nedostatečné spalování, zdrojem
exposice je i kouření) se na hemoglobin (ferrohemoglobin) váţe oxid uhelnatý. Vzniklý
karbonylhemoglobin nemůţe vázat kyslík, tím se sniţuje přísun kyslíku do tkání a vzniká
tkáňová hypoxie.
Účinkem oxidačních činidel dochází k oxidaci Fe2+ na Fe3+, vzniká hemin
(methemoglobin, ferrihemoglobin) a je inhibován přenos kyslíku. K methemoglobinemii
dochází například při otravách dusitany, chlorečnany, anilinem a anilinovými barvivy,
nitrobenzenem i některými léky jako je např. fenacetin, antipyrin.
Pro rychlou identifikaci hemoglobinových derivátů lze vyuţít jejich absorpční spektra.
Absorpční spektrum oxygenovaného hemoglobinu (oxyhemoglobin, HbO2,) má dvě
charakteristická maxima při 576 a 541 nm. Spektrum deoxygenovaného hemoglobinu (Hb)
vykazuje pouze jedno absorpční maximum při 555 nm. Spektrum karbonylhemoglobinu
(HbCO) má dva vrcholy při 572 a 539 nm, hlavní maximum heminu (MetHb) leţí při
633 nm. Sulfhemoglobin (SHb), který vzniká při intoxikaci sulfanem (sirovodíkem), má
výrazné absorbční maximum při 622 nm. Spektrální křivky HbO2 a HbCO lze dále rozlišit
redukcí (např. pomocí S2ˉ) HbO na Hb. Tato změna se odrazí ve změně příslušné spektrální
křivky, v případě HbCO se poloha maxim ve spektru nezmění.
64
Obr. 1. Spektrální křivky
Pracovní postup:
Porovnejte spektrální křivky deoxygenovaného hemoglobinu, oxyhemoglobinu,
methemoglobinu a karbonylhemoglobinu.
1.2. Důkaz karbonylhemoglobinu zkouškou s Ajatinem
Pracovní postup:
Nesráţlivou krev před pouţitím promíchejte.
Do jedné malé zkumavky napipetujte 0,05 ml nesráţlivé krve, do druhé 0,05 ml
krve obsahující karbonylhemoglobin (porovnejte zbarvení).
Do obou zkumavek přidejte 0,25 ml Ajatinu a zkumavky lehce protřepejte (roztok
nesmí příliš pěnit).
Do kaţdé zkumavky přidejte 5 ml destilované vody a promíchejte.
Po 5 min porovnejte zbarvení v obou zkumavkách. Normální krev poskytuje hnědé
zbarvení, které stáním přechází do zelena, v přítomnosti karbonylhemoglobinu je
zbarvení jasně červené a stálé.
1.3. Stanovení koncentrace hemoglobinu v krvi
Tato metoda vyuţívá měření absorbance stabilního kyanohemiglobinu. jehoţ jediný
absorpční pás při 540 nm má molární absorpční koeficient 44 000. Drapkinovo (kyanidové)
činidlo, pouţívané v tomto stanovení, obsahuje hexakyanoţelezitan draselný a kyanid
draselný. Hexakyanoţelezitan draselný oxiduje hemoglobin v nesráţlivé krvi na hemiglobin,
na jehoţ Fe3+ se následně váţí kyanidové anionty.
65
Kyanidové anionty mají výrazně vyšší afinitu k ţelezitému iontu neţ k ţeleznatému;
v organismu blokují ionty CNˉ buněčné dýchání, protoţe vazbou na Fe3+ cytochromoxidasy
dýchacího řetězce v mitochondriích je zablokován přenos elektronů na kyslík.
Pracovní postup:
Vzorek krve zpracujte v tripletu.
Do kaţdé zkumavky odměřte z dávkovače 2.5 ml Drapkinova činidla a automatickou
pipetou přidejte 10 µl krve (krev před pipetováním dobře promíchejte krouţivým
pohybem, pipetujte ode dna nádobky).
Špičku pipety vţdy ještě 3x vypláchněte obsahem zkumavky (špičku pipety
nevyndávejte z kapaliny).
Připravené vzorky dobře promíchejte a nechte stát 10 min při laboratorní teplotě.
Změřte absorbanci vzorků proti kyanidovému činidlu při 540 nm. Výsledky zapište do
tabulky 1.
Z naměřených hodnot spočítejte průměrnou hodnotu absorbance, kterou pouţijete
k výpočtu.
Látkovou koncentraci hemoglobinu vypočítejte pomocí molárního absorpčního
koeficientu (= 44 000) podle vztahu (viz Práce s automatickými pipetami a
spektrofotometrem):
Avz .2,51
cHb (mmol/l) =
44 · 0,01
= Avz 5,7
Výsledek zapište do tabulky 1.
Hmotnostní koncentraci hemoglobinu (Mr = 64 458) vypočítejte ze vztahu:
cHb (g/l) =Avz 368
Tabulka 1.
vzorek 6.:
absorbance
průměr
c (mmol/l)
krev
VYHODNOCENÍ:
Zvýšené hodnoty koncentrace hemoglobinu se vyskytují u onemocnění s abnormální
proliferací erythrocytů, při dehydrataci organismu, delším pobytu ve vyšších nadmořských
výškách. Sníţené hodnoty jsou běţné u anemií nebo po ztrátách krve.
66
Tabulka 2.
vzorek krve č.:
koncentrace Hb (mmol/l)
muţi 2,15 2,65
ţeny 1,85 2,35
koncentrace Hb (g/l)
muţi 140 170
ţeny 120 150
NAMĚŘENÉ HODNOTY
Poznámky:
67
ÚLOHA 2.
Vlastnosti tetrapyrrolů
2.1. Vlastnosti porfyrinů
Poruchy biosyntézy hemu jsou provázeny ukládáním hemových prekurzorů - porfyrinů
v tkáních a jejich vylučováním do moči. Příčinou mohou být dědičné nebo získané defekty
některých enzymů - porfyrie. Z nejčastějších příčin je to zejména toxické působení
polyhalogenovaných uhlovodíků, olova, chronická infekce virem hepatitidy C (HCV)
v kombinaci s abusem alkoholu.
K průkazu porfyrinů v moči i v krvi se vyuţívá fluorescence hematoporfyrinu v UV
světle. Hematoporfyrin vzniká reakcí krve s koncentrovanou kyselinou sírovou, při které se
z hemoglobinu odštěpí globin i ţeleznatý ion a hydratují se vinylové skupiny hemu. Tento
test lze pouţít i při důkazu krevních skvrn.
Pracovní postup:
– Pozorujte červenou fluorescenci hematoporfyrinu v UV světle proti srovnávacím
vzorkům kyseliny sírové bez krve a krve bez kyseliny sírové.
2.2. Stanovení celkového bilirubinu v séru
Hemoglobin je účinkem hemoxygenasy a biliverdinreduktasy degradován v buňkách
retikuloendoteliálního systému na bilirubin. Další přeměna bilirubinu probíhá v játrech.
Protoţe je bilirubin v plazmě téměř nerozpustný, je při transportu do jater vázán na
albumin. V hepatocytech se jeho rozpustnost zvyšuje konjugací s kyselinou glukuronovou.
Vzniklý bilirubindiglukuronát je vyloučen ţlučí do střeva.
Plazmatická koncentrace bilirubinu je výsledkem rovnováhy mezi produkcí bilirubinu z
degradovaného hemoglobinu a schopností jater odstraňovat bilirubin z plazmy. Při
hyperbilirubinemii přestupuje bilirubin z plazmy do periferních tkání a dodává jim
charakteristické naţloutlé zbarvení. Vznik ţloutenky (ikteru) můţe být podmíněn zvýšenou
tvorbou bilirubinu způsobenou nadměrným rozpadem erythrocytů hemolytický ikterus.
Sníţení exkrece bilirubinu v důsledku vrozených nebo získaných poruch jaterní funkce vede
k hepatocelulárnímu ikteru. Blokáda jeho transportu ţlučí do střeva způsobuje obstrukční
ikterus. Pouze konjugovaný bilirubin můţe být vylučován močí.
Pro fotometrické stanovení bilirubinu se vyuţívá jeho kopulace s diazotovanou
kyselinou sulfanilovou na azobarvivo. Reakce nastupuje rychle u konjugovaného bilirubinu
(tzv. přímá van der Berghova reakce
přímý bilirubin) a pomalu u nekonjugovaného
bilirubinu. V tomto případě můţe být reakce urychlena alkoholem nebo purinovým derivátem,
např. kofeinem (nepřímá van der Berghova reakce nepřímý bilirubin).
Pracovní postup:
– Vzorek séra zpracujte v tripletu, kompenzační roztok a slepý vzorek připravte pouze
jednou.
– Do pěti zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3.
68
Tabulka 3
reagencie (ml)
činidlo diazo I
činidlo diazo II
vzorek séra
0,1
1 kapka
kompenzační
roztok
0,1
akcelerátor
fyziologický roztok
0,5
0,5
sérum
0,1
0,1
slepý vzorek
0,1
1 kapka
0,5
0,1
– Zkumavky dobře promíchejte a po 10 min přidejte do kaţdé zkumavky 0,5 ml
Fehlingova roztoku II a opět dobře promíchejte.
– V rozmezí 10 – 60 min změřte absorbanci vzorku a kompenzačního roztoku proti
slepému vzorku při 605 nm.
– Z naměřených hodnot absorbancí vzorku vypočítejte průměr, odečtěte od něj
absorbanci kompenzačního roztoku a pro takto získanou hodnotu odečtěte z kalibrační
křivky odpovídající koncentraci celkového bilirubinu ve vzorku séra.
Tabulka 4.
vzorek č.:
průměr
absorbance
c (µmol/l)
sérum
kompenzační roztok
rozdíl absorbancí
VYHODNOCENÍ:
Zvýšené hodnoty nacházíme u ikterů, nádorů jater a ţlučových cest.
Tabulka 5.
vzorek séra č.:
koncentrace celkového
bilirubinu (µmol/l)
NAMĚŘENÉ HODNOTY
2,0 – 17,0
69
Poznámky:
70
DUSÍKOVÁ BILANCE
Klíčová slova: močovina, kreatinin, kyselina močová, esenciální aminokyseliny,
metabolismus bílkovin, katabolismus, anabolismus
Reagencie:
vzorky séra S1 a S2
2. vzorek moče
3. standardní roztok močoviny, koncentrace dle údajů výrobce
4. souprava Močovina BUN-color (BioSystems):
a) pracovní roztok A:
salicylát sodný 62 mmol/l
nitroprusid sodný 3,4 mmol/l
fosfátový pufr 20 mmol/l, pH 6,9
ureasa 500 U/ml
b) pracovní roztok B:
chlornan sodný 7 mmol/l
hydroxid sodný 150 mmol/l
1.
71
Dusíková bilance je rozdíl mezi mnoţstvím dusíku do organismu přijatého a mnoţstvím
dusíku z organismu vyloučeného. Hlavní zdroj přísunu dusíku představuje dusík obsaţený
v aminokyselinách bílkovin. Rovná-li se mnoţství dusíku do organismu dodaného mnoţství
dusíku z organismu vyloučeného, hovoříme o vyrovnané dusíkové bilanci. Kladná dusíková
bilance nastává v případech, kdy je mnoţství přijatého dusíku vyšší, neţ mnoţství dusíku
z organismu vyloučeného. Naopak, záporná dusíková bilance nastává v situacích, kdy je
mnoţství vylučovaného dusíku vyšší, neţ mnoţství dusíku dodaného.
V klinické praxi se dusíková bilance vyuţívá pro monitorování nutričního stavu
pacienta, zejména tam, kde hrozí vznik stavu malnutrice. Malnutrici z klinického hlediska
dělíme na dva typy, a to na prosté hladovění a stresové hladovění. Prosté hladovění vzniká
při omezení přísunu ţivin. Ke stresovému hladovění dochází při stresové reakci organismu,
která spouští proteokatabolismus i v případech, kdy je vyváţený přísun ţivin zajištěn. Stavy
stresového hladovění vznikají při těţkých úrazech, např. při rozsáhlých popáleninách.
Výpočet dusíkové bilance je zde vhodnou metodou pro monitorování metabolismu bílkovin.
Pro stanovení dusíkové bilance je třeba připomenout, ţe vylučování dusíku se neděje
pouze ve formě močoviny, ale určitý podíl je také vylučován v moči ve formě kreatininu,
NH 4 , kyseliny močové, dále ve stolici a kůţí.
72
ÚLOHA 1.
Stanovení koncentrace močoviny
Močovina je konečný produkt detoxikace amoniaku, který je hlavním produktem
metabolismu bílkovin. Dále vzniká jako produkt bakteriálního metabolismu ve střevě, kde
dochází k jeho vstřebávání do portálního řečiště a zpracování na močovinu v játrech.
Protoţe koncentrace močoviny v krvi závisí na metabolickém obratu bílkovin, funkci
jater, funkci ledvin, kterými je vylučována a hydrataci organismu, údaje o koncentraci
močoviny v krvi představují cennou informaci pro klinické hodnocení řady parametrů.
Pohybuje se v rozmezí 2,0 – 8,0 mmol/l.
Metabolismus bílkovin je úzce propojen s metabolismem sacharidů a mastných kyselin.
Při určitém zjednodušení je moţné konstatovat, ţe u zdravého dospělého jedince je při
vyváţeném a dostatečném přísunu energetických zdrojů v podobě sacharidů a mastných
kyselin metabolismus bílkovin v rovnováze, intenzita proteokatabolických a
proteoanabolických dějů je vyrovnaná. Za určitých situací, jako je růst dětského organismu,
růst plodu v těhotenství nebo reparace poškozených tkání, dochází k převaze dějů
proteoanabolických. Zvýšená syntéza bílkovin poskytuje stavební materiál potřebný pro růst
a reparaci tkání. Naproti tomu v situacích, kdy je přísun energetických zdrojů a bílkovin
omezen nebo dochází k intenzivním stresovým reakcím v důsledku závaţného poškození
organismu, proteokatabolické děje převáţí. V případě proteokatabolismu jsou strukturální
bílkoviny organismu degradovány a jejich štěpné produkty aminokyseliny jsou
spotřebovávány za účelem syntézy glukosy v reakcích glukoneogeneze.
Jelikoţ jsou při syntéze glukosy vyuţívány pouze uhlíkové skelety aminokyselin, jejich
aminoskupiny musí být odštěpeny. To se děje prostřednictvím transaminačních procesů nebo
za vzniku amoniaku. Aby mohly být aminoskupiny a toxický amoniak vyloučeny
z organismu, jsou v ornitinovém cyklu zpracovány tak, ţe vzniká netoxická močovina, která
je následně v moči vyloučena z organismu. Z popsaného principu vyplývá, ţe v situacích,
kdy dochází k posunu metabolismu bílkovin ve smyslu jejich degradace, dochází zároveň i ke
zvýšené produkci močoviny. Stanovení močoviny v moči společně s dalšími údaji poskytuje
cenné informace pro posuzování metabolického stavu organismu. Denně se močí vyloučí
400 – 500 mmol, tj. 25 – 30 g močoviny za 24 hod.
73
Pro stanovení dusíkaté bilance obdrţíte tři vzorky od jednoho pacienta:
S1 = první odběr séra
S2 = sérum odebrané po 24 hod
U = vzorek moče z 24 hod sběru
POZOR! MOČ JE ZŘEDĚNA 50x, VÝSLEDEK VYNÁSOBTE ŘEDĚNÍM.
Stanovení je zaloţeno na hydrolytickém štěpení močoviny, katalyzovaném ureasou, na
amoniak a oxid uhličitý:
ureasa
močovina + H2O
2 NH 4 + CO2
Vzniklý amoniak se stanovuje barevnou reakcí se salicylátem sodným a alkalickým
roztokem chlornanu sodného:
nitroprusid
NH 4 + salicylát + NaClO
indofenol
Pracovní postup:
Vzorky séra, moče a standard zpracujte v dubletu, slepý vzorek pouze jednou.
Napipetujte reagencie do zkumavek podle tabulky 1.
Tabulka 1
sérum (S)
moč (U)
standard
sérum
0.01
−
−
moč (zředěná 50x)
−
0.01
−
standard
−
−
0.01
destil.voda
−
−
−
pracovní roztok A
1
1
1
promíchat a inkubovat 10 min při pokojové teplotě
pracovní roztok B
1
1
1
reagencie (ml)
blank
−
−
−
0.01
1
1
– Promíchejte a inkubujte 10 minut při pokojové teplotě.
– Změřte absorbanci standardu a vzorku proti slepému vzorku při 600 nm. Zbarvení je
stabilní nejméně 2 hodiny.
– Vypočítanou koncentraci moči vynásobte ředěním (50x), výsledky napište do
tabulky 2.
74
Tabulka 2
vzorek
absorbance
průměrná
hodnota
c (mmol/l)
standard
S1
S2
U
75
ÚLOHA 2.
Výpočet dusíkové bilance
Dusíková bilance je určována metabolismem proteinů. Za normálních okolností se
organismus nachází v dusíkové rovnováze, tzn. přívod dusíku v potravě je stejný jako jeho
ztráty v exkretech. Minimální příjem bílkovin pro udrţení vyváţené dusíkové bilance je
30 g/24 hod. Kdyţ příjem dusíku převyšuje jeho výdej, jde o pozitivní dusíkovou bilanci.
Negativní dusíková bilance je charakterizována převahou ztrát.
Má-li být dusíková bilance vyváţená, musí bílkoviny v potravě obsahovat
aminokyseliny postradatelné i nepostradatelné v přiměřeném mnoţství a poměru. Nedostatek
jediné esenciální aminokyseliny změní dusíkovou bilanci na negativní a ani velký přebytek
postradatelných aminokyselin tento stav nezlepší.
Pro výpočet dusíkové bilance uvedených pacientů pouţijte hodnoty získané v úloze 1.
pacient
hmotnost (kg)
příjem bílkovin (g)
diuréza (1/24 hod)*
teplota (°C)
A muţ
70
150
B ţena
60
150
C muţ
60
150
D ţena
70
150
38,2
36,4
37,1
36,7
* bude zadána
Příjem (g N/24 hod):
definovaná výţiva:
– příjem dusíku vypočítejte z uvedeného příjmu bílkovin, výsledek zapište do tabulky 4.
Výdej (g N/24 hod):
ztráty N močí:
– 80 % se vylučuje formou močoviny (vypočítejte z hodnot získaných v úloze 1.)
– 20 % se vylučuje formou kreatininu, NH 4 a kyseliny močové (vypočítejte z hodnoty
N vyloučeného močovinou)
– vypočítejte celkový dusík vyloučený močí výsledky zapište do tabulky 3.
ztráty N kůţí a stolicí:
– jsou přibliţně stabilní, mění se podle tělesné teploty:
– do 37° C 1,0 g
– 37 38° C 1,3 g
– 38 39° C 1,5 g
– 39 40° C 1,8 g
– ztráty vypočítejte podle zadané teploty pacienta
– výsledek zapište do tabulky 3.
76
zadrţený N v tělesné vodě:
– stoupne-li během 24 hod koncentrace močoviny v séru, znamená to, ţe část vytvořené
močoviny nebyla vyloučena. Vzhledem ke své dokonalé rozpustnosti je močovina
distribuována v celkové tělesné vodě. Zvýšení koncentrace močoviny v séru
o 1 mmol/l během 24 hod znamená u 100 kg muţe zadrţení 60 mmol urey (celková
tělesná voda u muţe = 0,6 tělesné hmotnosti, u ţeny = 0,55 tělesné hmotnosti).
– zádrţ vypočítejte z rozdílu koncentrací v séru (viz tabulka 2), výsledek zapište do
tabulky 3.
Tabulka 3.
N vyloučený
močovinou/24h (g)
celkový N
vyloučený močí (g)
ztráty N kůţí
a stolici (g)
N zadrţený
v tělesné vodě (g)
celkový N vyloučený močí (g/24 hod) = cu (mmol/24 hod) · 0,028 · 1,25
celkový N zadrţený v tělesné vodě = cS1
cS2 · 0,028 · t.hm. · faktor t.hm.
přepočet mmol močoviny na g N = 0,028
výpočet ztráty celkového N močí = 1,25
VYHODNOCENÍ:
Příjem větší neţ výdej: anabolismus. efektivní zpracovávání bílkovin potravy (růst,
hojení ran)
Výdej větší neţ příjem: katabolismus, nedostatečná výţiva, odbourávání bílkovin těla.
Tabulka 4.
vzorek č.
příjem N (g)
výdej N (g)
N bilance
77
CLEARANCE
Klíčová slova: kreatin, kreatinin, cystatin C, glomerulární filtrace (GFR), tubulární sekrece,
zpětná resorpce, clearance, exkrece,.
Reagencie:
1. vzorek deproteinovaného séra S
2. vzorek moče U
3. standard K (kreatinin)
4. roztok kyseliny trichloroctové 1,22 mol/l !ŢÍRAVINA!
5. roztok kyseliny pikrové 0,04 mol/l
6. roztok hydroxidu sodného 0,75 mol/l
78
Ledviny jsou jedním ze základných orgánů, podílejících se na udrţování homeostázy
organismu. Vylučují koncové metabolity dusíkatých látek močovinu (viz. Dusíková bilance.)
a kreatinin, dále kyselinu močovou, ionty, H+, atd.
Kreatinin je cyklický imid kyseliny N-metylguanidinoctové. Vzniká ve svalové tkáni
neenzymaticky jako koncový produkt metabolismu kreatinu a kreatinfosfátu. Referenční
rozmezí koncentrace kreatininu v plazmě (kreatininemie) je 70 125 μmol/l pro muţe a
50 105 μmol/l pro ţeny.
Kreatininemie je za fyziologických podmínek ovlivněna mnoţstvím svalové hmoty.
Proto se s niţšími hladinami setkáváme u dětí, osob s malým mnoţstvím svalové hmoty,
pacientů dlouhodobě připoutaných na lůţko (úbytek svalů z inaktivity) či u pacientů
s myodystrofíí. Zvýšenou hladinu kreatininu v séru pozorujeme při selhávání ledvin (renální
insuficienci). Hladina kreatininu v krvi je jen podstatně méně ovlivněna jeho příjmem
v potravě a tělesnou námahou.
Většina kreatininu se do moči dostává glomerulární filtrací (90 %), pouze minoritní
podíl tubulární sekrecí (10 %). Za patologických okolností se na vzestupu kreatininemie
podílí významně i porucha tubulární sekrece. Koncentrace kreatininu v definitivní moči je
přibliţně 100x vyšší neţ jeho koncentrace v plazmě. Celkové mnoţství vyloučené za 24 hod
se za normálních podmínek pohybuje mezi 9 16 mmol (tj.1 1,8 g).
Důleţitou roli v diagnostice poruch ledvinných funkcí má posouzení glomerulární
filtrace, nejčastěji pomocí tzv. clearance endogenního kreatininu. Clearance nějaké látky
představuje teoretický objem krevní plazmy zcela očištěné ledvinami od této látky za
jednotku času (sekundu). V případě látky vylučované pouze glomerulární filtrací odráţí
clearance rychlost glomerulární filtrace (GFR). Optimální indikátorovou látkou pro
monitorování glomerulární filtrace je ta, která se do moči dostává výhradně glomerulární
filtrací a není dále v tubulech ani resorbována ani secernována. Tyto podmínky splňuje inulin,
zásobní sacharid rostlin. Jeho nevýhodou je především obtíţné zajištění stabilní koncentrace
v plazmě (nevyskytuje se přirozeně v lidském organismu, musel by být podáván
intravenózně). Jeho vyuţití je tedy spíše pro vědecké účely.
Pro výpočet clearance je potřeba znát koncentraci indikátorové látky v plazmě a moči,
dále objem moči za definovaný časový interval (nejčastěji 24 hod).
GFR =
U V
P
U – koncentrace látky v moči
P – koncentrace látky v plazmě
V – diuréza za 24 h [ml/s] (objem definitivní
moči v ml / 86400 s)
V praxi lze pouţít odhadu clearance kreatininu dle vzorce Cockroftova a Gaulta.
Zohledňuje fakt, ţe vlastní koncentrace kreatininu závisí na svalové hmotě, pohlaví a věku
pacienta, není nutný sběr moči. Pro ţeny se vypočtená hodnota musí vynásobit koeficientem
0,85.
(140 – věk[roky]) t.hm. [kg]
Clkr =
44,5 · Skr [µmol/l]
Clkr – clearance kreatininu
Skr – sérová koncentrace kreatininu
V klinické praxi
se hodnoty kreatininemie a clearance kreatininu vyuţívá
k monitorování renálních funkcí zejména hloubky chronické renální insuficience. Normální
Clkr se pohybuje v rozmezí 1,3 2,8 ml/s/1,73 m2 tj. hodnoty připadající na ideální povrch
těla, tyto hodnoty se musí korigovat u pacientů s abnormálním povrchem těla (obezita). Při
79
poklesu clearance pod 0,5 ml/s/1,73 m2 mluvíme o renální nedostatečnosti při poklesu pod
0,15 ml/s/1,73 m2 o renálním selhání.
Vhodnější biomarker funkce ledvin je cystatin C. Je to malý neglykosylovaný bazický
protein (13,3 kD), patřící mezi inhibitory superrodiny cysteinových proteas. Cystatin C je
produkován prakticky všemi jadernými buňkami a je přítomen ve všech vyšetřovaných
tělesných tekutinách. Úroveň produkce je konstantní a není ovlivněna zánětlivými procesy,
pohlavím, věkem a svalovou hmotností. V normální ledvině je cystatin C téměř volně
filtrován glomerulární membránou a potom téměř úplně reabsorbován a degradován buňkami
proximálního tubulu. Plazmatická koncentrace cystatinu C je tedy výhradně určena rychlostí
glomerulární filtrace (GFR), coţ činí cystatin C výborným indikátorem GFR. Změny jeho
sérové hladiny odhalí postiţení ledvin dříve (v iniciální fázi), neţ je moţné prokázat
kreatininovou clearancí. Pro vyšetření stačí jen změřit jeho hladinu v séru, oproti kreatininu
odpadá sběr moči za 24 hodin. Koncentrace cystatinu v séru je mírou glomerulární filtrace,
jeho koncentrace v moči je mírou poškození buněk proximálních tubulů.
věk
(roky)
cystatin C
(mg/l)
3 – 50
0,63 – 1,33
> 50
0.74
1.55
Zvýšená hladina v krvi
sníţení glomerulární filtrace
u některých nádorů (melanom, kolorektální karcinom)
Zvýšená hladina v krvi i moči
– urémie (poškození glomerulů i tubulů)
80
ÚLOHA 1.
1.1. Stanovení koncentrace kreatininu v séru a moči
Stanovení je zaloţeno na Jaffého reakci v deproteinovaném séru. Při reakci kreatininu s
kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí vzniká červenooranţově zbarvený produkt, jehoţ
koncentrace se stanovuje fotometricky.
Pro stanovení koncentrace kreatininu v séru a moči obdrţíte vzorek deproteinovaného
séra a moče pacienta označeného číslem:
S = deproteinované sérum
U = moč
POZOR! VZOREK MOČE ZŘEĎTE PŘED STANOVENÍM 50x. VÝSLEDEK JE
TŘEBA VYNÁSOBIT 50x !
Pracovní postup:
Sérum, zředěnou moč i standard zpracujte vţdy v tripletu, slepý vzorek pouze jednou
Do očíslovaných zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 1.
Tabulka 1.
reagencie (ml)
deproteinované sérum
moč zředěná 50x
vzoreks
vzorekv
standard
slepý vzorek
0,25
0,25
standardní roztok K
0,25
destilovaná voda
0,50
0,50
0,50
kyselina trichloroctová
0,25
0,25
0,25
promíchat, nechat stát 5 min při laboratorní teplotě
kyselina pikrová
0,50
0,50
0,50
hydroxid sodný
0,50
0,50
0,50
0,75
0,25
0,50
0,50
– Obsah zkumavek dobře promíchejte.
– Přesně po 20 min změřte absorbanci vzorků i standardu proti slepému vzorku při
505 nm.
– Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2.
– Vypočítejte průměrné hodnoty absorbance a zapište je do tabulky 2.
– Z průměrných hodnot absorbance vzorků a standardu vypočítejte koncentraci
kreatininu v séru cP (µmol/l) a v moči cU (mmol/l).
– Vypočítanou koncentraci v moči vynásobte ředěním (50x).
81
Tabulka 2.
vzorek č.:
standard K
S
U
průměr
absorbance
koncentrace
µmol/l
mmol/l
1.2. Výpočet clearance
Látkové mnoţství kreatininu n, které za sekundu přejde do glomerulárního filtrátu, se
rovná součinu jeho koncentrace ve filtrátu a objemu filtrátu vytvořeného za sekundu. Protoţe
kreatinin je nízkomolekulární látka, je jeho koncentrace ve filtrátu stejná jako v plazmě (cP).
Objem vytvořeného filtrátu musí být stejný jako objem plazmy, která by se filtrací kreatininu
zcela zbavila (VP), tedy
n = cP · VP.
Totéţ látkové mnoţství kreatininu n z glomerulárního filtrátu se pak za kaţdou sekundu
vylučuje definitivní močí. Je tedy současně rovno součinu koncentrace kreatininu
v definitivní moči (cU) a objemu moče vyloučeného za sekundu (VU). Platí tedy n = cU · VU.
Pro výpočet kreatininové clearance GFR vyplývá následující vztah:
VP (ml/s) = GFR =
cU VU
CP
Hodnota GFR se obvykle ještě koriguje na standardní tělesný povrch 1,73 m2. Přitom se
vychází z předpokladu, ţe plocha filtračního média v glomerulech je úměrná tělesnému
povrchu. Tělesný povrch A pacienta se vypočítá ze vztahu:
A = 0,167
ml
0,167 je empirický faktor, m hmotnost pacienta v kg a l jeho výška v m. Pro výpočet
korigované GFRkor platí:
GFRkor (ml/s) =
cU VU 1,73
cP A
Pro výpočet clearance je tedy třeba znát kreatininemii (mmo/l), kreatininurii (mmol/l),
diurézu pro výpočet objemu moče za sekundu (ml/s), tělesnou výšku a hmotnost pacienta.
82
Tabulka 3.
pacient
diuréza* (ml/24 hod)
hmotnost (kg)
výška (cm)
A
muţ
B
ţena
C
muţ
D
ţena
E
muţ
F
ţena
82
170
58
170
95
190
58
165
90
180
70
160
* bude zadána
Pracovní postup:
– Z hodnot naměřených v úloze 1.1. vypočítejte kreatininovou clearance a exkreci
kreatininu močí u zadaného pacienta:
GFRkor = …………... ml/s
exkrece = ………….. mmol/24hod
Poznámky:
83
MARKERY SVALOVÉ TKÁNĚ
Klíčová slova: aktivita enzymů, cytoplazmatické enzymy, mitochondriální enzymy,
laktátdehydrogenasa (LD – EC 1.1.1.27.), alaninaminotransferasa (ALT – EC 2.6.1.2.),
aspartátaminotransferasa (AST – EC 2.6.1.1.), kreatinkinasa (CK – EC 2.7.3.2.), kreatin,
myoglobin, troponin, izoenzymy, elektroforéza.
Reagencie
1. vzorek séra
2. souprava Kreatinkinasa (Biosystems):
pracovní roztokCK: (směs činidla A a činidla B 4:1)
a) činidloCKA: (imidazol 125mmol/l,EDTA 2 mmol/l, octan hořečnatý·25mmol/l,
D-glukosa 25 mmol/l, N-acetylcystein 25 mmol/l, hexokinasa 6,000 U/l, NADP
24 mmol/l, pH 6 7).
b) činidloCK B: (kreatinfosfát 250 mmol/l, ADP 15 mmol/l, AMP 25 mmol/l,
P1,P5-di(adenosin-5)-pentafosfát 102 mmol/l, glukosa-6-fosfát-dehydrogenasa
8,000 U/l
3. souprava Aspartátaminotransferasa (Biosystems):
pracovní roztokAST: (směs činidla A a činidla B 4:1)
a) činidloAST A: (Tris 121 mmol/l , L-aspartát 362 mmol/l, malátdehydrogenasa > 460
U/l, laktát dehydrogenasa > 660 U/l, hydroxid sodný 255 mmol/l, pH 7,8
b) činidloAST B: (NADH 13 mmol/l, 2-oxoglutarát 75 mmol/l hydroxid sodný 148
mmol/l, azid sodný 9,5 g/l )
4. souprava Laktátdehydrogenasa (Biosystems):
pracovní roztokLDH: (směs činidla A a činidla B 4:1)
a) činidloLDH A(N-metyl-D-glukamin 0,406 mol/l, laktát 62,5 mmol/l, pH 9,4)
b) činidloLDH B:(NAD+ 50 mmol/l )
84
Stanovení aktivity některých enzymů v séru je pomocným vodítkem při diagnostice
bolesti na hrudi, jejíţ příčinou můţe být řada onemocnění: infarkt myokardu, plicní embolie,
angína pectoris. Rychlost rozpoznání příčiny vyvolávající bolest je zejména v případě
akutního infarktu myokardu (AIM) rozhodující pro úspěšnou terapii.
V důsledku zvýšené propustnosti membrán buněk srdečního svalu poškozených
ischemií, jsou do krevního oběhu uvolňovány některé cytoplazmatické enzymy: kreatinkinasa,
aspartátaminotransferasa, izoenzym
LD1 laktátdehydrogenasy a BB-izoenzym
glykogenfosforylasy B.
V současné době k uvedeným enzymovým markerům přistupuje i stanovení
myoglobinu, troponinu I a troponinu T (komponenty troponinového regulačního systému,
který se nachází v kontraktilním aparátu příčné pruhovaného svalu). Myoglobin je rychlým
markerem, signalizujícím poškození myokardu, protoţe se při poruše integrity sarkolemy
vyplavuje do krve. Zvýšení koncentrace myoglobinu nastupuje jiţ za 2 hod od prvých
příznaků. Maxima, tj. aţ 30 násobného zvýšení koncentrace myoglobinu proti normě,
dosahuje jiţ po 4 6 hod, coţ je přibliţně o 8 10 hod dříve, neţ je tomu u izoenzymu CKMB kreatinkinasy, který je jedním z nejčasnějších enzymových markerů poškození myokardu.
Podle nejnovějších kritérií WHO je troponin-T nebo I uznáván jako hlavní biochemický
marker AIM, myoglobin je povaţován za nejčasnější marker.
V diagnostice onemocnění svalové tkáně (myokardu nebo kosterního svalstva) se
kromě klinického vyšetření a pomocných metodik (EKG – myokard; EMG, svalová biopsie,
molekulárně genetické vyšetření – kosterní svalstvo), významně uplatňuje laboratorní
vyšetření biochemických markerů svalového poškození. Mezi základní markery svalového
poškození patří: myoglobin, laktátdehydrogenasa (LD), kreatininkinasa (CK) zvláště
izoenzymy CK-MB, aspartátaminotransferasa (AST), troponin T či I.
Laboratorní diagnostika infarktu myokardu
Biochemická diagnostika bolestí na hrudi, která můţe být příznakem akutního infarktu
myokardu (AIM), nestabilní anginy pectoris nebo plicní embolie, je zaloţena na detekci
intracelulárních cytoplazmatických nebo mitochondriálních bílkovin, které se dostávají do
krevního řečiště. K jejich uvolnění z buňky dochází při ischémii, kdy se nejprve zvyšuje
permeabilita plazmatické membrány a při pokračující ischémii dochází ke kompletní
destrukci buňky.
Mezi klasické testy patří stanovení aspartátaminotransferasy (AST). Jedná se
o cytoplazmatický, ale i mitochondriální enzym, jehoţ aktivita začíná stoupat za 4 – 6 h po
vzniku ischémie myokardu a maximum dosahuje za 1 – 2 dny, k normě se navrací do 5 dnů.
Zvýšení hladiny AST není specifické pro postiţení myokardu, dochází k němu i při postiţení
jater, kosterního svalstva nebo při hemolýze. V některých případech (selhávání krevního
oběhu, městnání krve v játrech) můţe dojít i k vzestupu ALT (alaninaminotransferasy), která
je citlivým a poměrně specifickým markerem postiţení hepatocytů.
Kreatininkinasa (CK) kopíruje průběh AST, aktivita stoupá ale o něco dříve. Její
stanovení má význam v diagnostice AIM pouze při stanovení jejího izoenzymu CK-MB.
Izoenzym CK-MB tvoří 3 % celkové CK v kosterním svalstvu, ale představuje 40 % aktivity
CK v myokardu. Relativní nárůst podílu CK-MB na celkové hladině CK podporuje diagnózu
AIM. Celková CK i její izoenzym CK-MB se stanovují na základně své enzymatické aktivity.
Nově se stanovuje antigen CK-MB tzv. CK-MB mass pomocí specifické protilátky. Tento
test je citlivější, protoţe je schopen detekovat i neaktivní, degradované formy CK-MB, je
však ekonomicky nákladnější.
Laktátdehydrogenasa (LD) je nejméně specifickým markem poškození myokardu,
větší specifičnost má stanovení jejích izoenzymů (při AIM je zvýšená aktivita izoenzymu H4,
85
poměr LD1/LD2 se zvýší na hodnotu vyšší neţ 1). Aktivita po AIM stoupá poměrně pozdě,
má však význam pro diagnostiku infarktu, který proběhl před několika dny. Zvýšená aktivita
LD v séru můţe být důsledkem hemolýzy (izoenzym LD1) a poškození jaterního parenchymu
(izoenzym LD5).
K cenným markerům patří myoglobin, jehoţ hladina v séru stoupá za 0,5 – 2 h po
vzniku AIM. Jedná se tedy o marker časný, avšak poměrně nespecifický. Hladina v séru
můţe být zvýšena v důsledku poškození kosterního svalstva či sníţených renálních funkcí.
Za nejspecifičtější a nejcitlivější marker kardiálního postiţení se pokládá stanovení
troponinu T (TnT) nebo I (TnI). Jsou součástí tzv. troponinového komplexu, který
zabezpečuje posun aktinových a myosinových vláken a tím kontrakci svalu. Primární
struktura TnI a TnT myokardu je jiná neţ v kosterním svalstvu, proto k jejich zvýšení v krvi
dochází specificky při poškození kardiomyocytů. Vzestup hladiny Tn nastává po 3 hodinách
od začátku bolesti při AIM, maxima dosahuje kolem 4. dne, zvýšená hladina TnI přetrvává
po proběhlém AIM 7 10 dní, v případě TnT ještě déle.
Obr.1.: Kinetika změn koncentrací srdečních markerů v počátečních hodinách po AIM
Dle doporučení WHO se v běţné klinické praxi nejvíce pouţívá v laboratorní
diagnostice stanovení CK, CK-MB, CK-MBmass, troponin I a myoglobinu.
86
Mezi nové diagnostické testy, které zatím nejsou součástí klinické praxe, patří stanovení
kardiospecifického izoenzymu glykogenfosforylasy BB, H-FABP (heart fatty acids binding
protein) a albuminu s modifikovanou N terminální částí (tzv.: ischemia-modified albumin,
IMA).
Laboratorní diagnostika rhabdomyolýzy
Dalším z poměrně váţných stavů, které jsou spojené s poškozením svalové buňky, je
rhadomyolýza. Při ní dochází k rozpadu buněk příčně pruhovaného svalstva. V séru jsou
detekované vysoké hladiny myoglobinu, celkové CK, AST, LD a aldolasy.
Optický Warburgův test
Pro stanovení aktivity řady enzymů (LD, ALT, AST) se vyuţívá tzv. Warburgův
optický test. Principem tohoto stanovení je schopnost redukovaných forem koenzymů NADH
a NADPH absorbovat záření vlnových délek 330 - 370 nm (v praxi měříme obvykle při
340 nm).
Obr. 2. Srovnání absorpčních spekter NAD a jeho redukované formy NADH
Změny absorbance v této oblasti spektra jsou přímo úměrné změně mnoţství
redukovaných/oxidovaných molekul koenzymu za jednotku času. Pro stanovení aktivity
pomocí tohoto testu není nezbytné, aby některý z koenzymů byl substrátem daného enzymu
(jako je tomu např. v případě LD). První reakcí, která je zároveň limitní reakcí, je reakce
stanovovaného enzymu a poslední je reakce produkující/spotřebovávající NAD(P)H.
Systému spřaţených reakcí se vyuţívá například pro stanovení katalytické aktivity CK, ALT,
AST (viz návody).
87
ÚLOHA 1.
Stanovení katalytické aktivity kreatinkinasy (CK)
Kreatinkinasa (CK) katalyzuje v přítomnosti kreatinfosfátu, fosforylaci ADP za vzniku
ATP a kreatinu. Katalytická aktivita se určuje jako míra vzniku NADPH, který se měří při
340 nm a je výsledkem spřaţených reakcí hexokinasy (HK) a glukosa-6-fosfátdehydrogenasy (G6P-OH)
CK
kreatinfosfát + ADP
kreatin + ATP
HK
ATP + glukosa
ADP + glukosa-6-fosfát
G-6-P-DH
6-fosfoglukonát + NADPH + H+
glukosa-6-fosfát + NADP
Pracovní postup:
Pipetujte do označených zkumavek:
50 µl
1,0 ml
vzorek
pracovní roztok CK
Promíchejte a nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky.
Po 3 minutách změřte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte v minutových
intervalech po dobu 3 minut.
Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou nulovou absorbancí
( A/min).
Výpočet aktivity CK:
Vt 106
A/min
= U/l
l Vs
Molární absorbance ( ) NADPH při 340 nm je 6 300, světelná cesta (l) je 1 cm, celkový
reakční objem (Vt) je 1,05, objem vzorku (Vs) je 0,05 a 1 U/l odpovídá 16,67 nkat/l.
Následující rovnice je pro výpočet katalytické aktivity CK:
A/min
x 3333=U/l
x 55561= nkat/l
88
Obr. 3. Elektroforéza izoenzymů kreatinkinasy
89
ÚLOHA 2.
Stanovení katalytické aktivity AST
Aspartátaminotransferasa (AST neboli GOT) katalyzuje přenos aminoskupiny
z aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a glutamátu. Katalytická aktivita se určuje
jako míra úbytku NADH, k čemuţ dochází vlivem spřaţené reakce s malátdehydrogenasou
(MDH). Úbytek NADH se měří fotometricky při 340 nm.
AST
aspartát + 2-oxoglutarát
oxalacetát + glutamát
MDH
oxalacetát + NADH + H+
malát + NAD+
Pracovní postup:
Pipetujte do označených zkumavek
reakční teplota
pracovní roztokAST
vzorek
37° C
1,0 ml
50 µl
25° C
1,0 ml
100 µl
Promíchejte, nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky.
Po 1 minutě odečtěte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte v minutových
intervalech po dobu 3 min.
Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou minutovou absorbanci
( A/min)
Výpočet aktivity AST:
Vt 106
A/min
= U/1
l Vs
µkat/l = 60 U/l
Molární absorbance ( ); NADH při 340 nm je 6 300, světelná dráha ((l) je 1 cm. celkový
reakční objem (Vt) je 1,05 při 37°C a 1,1 při 30° C. objem vzorku (Vs) je 0.05 při 37° C a 0,1
při 30° C, 1 U/l odpovídá 0,0166 µkat/l. Následující rovnice je pro výpočet katalytické
aktivity CK:
Faktory pro výpočet:
37°C A/min x 3333 = U/l
x 55,55 = µkat/l
30° C A/min x 1746 = U/l
x 29,1 = µkat/l
90
ÚLOHA 3.
Stanovení katalytické aktivity laktátdehydrogenasy (LD)
Laktátdehydrogenása (LD neboli LDH) katalyzuje redukci pyruvátu pomocí NADH za
vzniku laktátu a NAD+. Katalytická aktivita se určuje jako míra úbytku NADH, který se měří
se při 340 nm.
LD
pyruvát + NADH + H
+
laktát + NAD+
Pracovní postup:
Pipetujte do označených zkumavek:
pracovní roztokLD
vzorek
1,0 ml
20 µI
Promíchejte, nasajte do kyvety fotometru a zapněte stopky.
Po 30 vteřinách inkubace odečtěte počáteční absorbanci a pak ji odečítejte
v minutových intervalech po dobu 3 min.
Vypočtěte rozdíl mezi následnými absorbancemi a průměrnou minutovou absorbanci
( A/min).
Výpočet aktivity LD:
Vt 106
A/min
= U/L
· l · Vs
A/min x 6508 = U/L
x 108 = µkat/L
91
VYHODNOCENÍ:
marker
CK
AST
LD
REFERENČNÍ HODNOTY NAMĚŘENÉ HODNOTY
muţi 10 65U/l
ţeny 7 55U/l
< 29 U/l
83
143 U/l
0,167
0,117
1,084 µkat/l
0,917 µkat/l
< 0,48 µkat/l
1,38
2,38 µkat/l
92
ÚLOHA 4.
Stanovení AST (GOT) a CK pomoci přístroje REFLOTRON®, Roche
Stanovení koncentrace katalytické aktivity těchto enzymů je zaloţeno na technice
reflexní fotometrie, při níţ se měří intenzita odraţeného záření od homogenně zbarvené
podloţky. Reakce probíhají na pevném nosiči (reagenční zóna prouţku), který obsahuje
suchá činidla, aktivovatelná vodou obsaţenou v naneseném vyšetřovaném vzorku. Reagencie
potřebné pro reakci jsou nanesené aţ pod vrstvou skleněných vláken, na kterých se zachytí
krvinky. Reflotron® můţe analyzovat plnou krev, plazmu nebo sérum.
5.1. Stanovení ALT AST (GOT) a CK ve vlastní kapilární krvi
Při stanovení postupujte podle návodu uvedeného v praktickém cvičení Stanovení
celkového cholesterolu (TC), HDL cholesterolu (HDL-C) a triacylglycerolů (TAG), úloha 5.
POZOR !
Přístroj Reflotron® udává výsledky v U/l. Získané údaje převeďte do jednotek µkat/l
podle vztahu:
1 U = 0,0166 µkat
5.2. Stanoveni AST (GOT) a CK v séru pouţívaném v úlohách 1-3
Pracovní postup:
– Stejným postupem jako v úloze 5.1. stanovte koncentraci katalytické aktivity
uvedených enzymů v séru pouţívaném v úlohách 1-3.
– Sérum nanášejte na příslušné reagenční prouţky pipetou Reflotron (pevný objem
32 µl).
– Pipeta má tři zaráţky. Při nasáváni vzorku stiskněte píst k první zaráţce a pomalu
uvolňujte píst do základní polohy (vzorek musí být nabrán bez vzduchových bublin).
– Vzorek naneste na reagenční zónu prouţku stisknutím pístu k druhé zaráţce.
– Špičku odstraňte úplným stisknutím pístu pipety.
93
ZÁKLADNÍ
MOČE
SCREENING
PATOLOGICKÝCH
SOUČÁSTI
Klíčová slova: sloţení moče, sediment, hustota, osmolalita, pH, patologické součásti.
Reagencie:
1. Sulkowitchovo činidlo (25 g kyseliny šťavelové, 25 g šťavelanu amonného, 50 ml
koncentrované kyseliny octové v 1,5 l vody)
2. roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l
3. kyselina octová zředěná 1:1
4. krystalický chlorid sodný
5. roztok o-tolidinu (3,3'- dimethylbenzidinu) v ledové kyselině octové 0,01
mol/l !JED!
6. peroxid vodíku 1 mol/l
7. Heitz -Boyerovo činidlo (bezbarvý redukovaný fenolftalein v alkalickém prostředí)
8. Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l)
9. Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g viněnu sodnodraselného v 1 l
vody)
10. Benedictovo činidlo (1 l činidla obsahuje 17,3 g síranu měďnatého, 100 g bezvodého
uhličitanu sodného a 173 g citrátu sodného)
11. krystalický nitroprussid sodný
12. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l !ŢÍRAVINA!
13. koncentrovaná kyselina octová !ŢÍRAVINA!
14. Lestradetovo činidlo (směs síranu amonného, bezvodého uhličitanu sodného a
nitroprussidu sodného v poměru 200:200:1)
15. Lugolův roztok (roztok jodu 20 g/l v roztoku jodidu draselného 40 g/l)
16. l6. roztok chloridu ţelezitého 0,4 mol/l
17. jodová tinktura (roztok jodu v ethanolu 10 g/l)
18. koncentrovaná kyselina dusičná !ŢÍRAVINA!
19. Hammarstenovo činidlo: směs 1 obj. 25 %kys. dusičné a 19 obj. 25 % kys.
chlorovodíkové. 1 obj. směsi kyselin se smíchá se 4 obj. ethanolu
20. Ehrlichovo činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/l v kys. chlorovodíkové 200
g/l)
21. chloroform
22. nasycený roztok octanu sodného
23. koncentrovaná kyselina sírová !ŢÍRAVINA!
24. souprava Quik Read U-ALB, Orion diagnostica
94
Močí je z organismu vylučována naprostá většina cizorodých i endogenních látek,
jejichţ kvalitativní a kvantitativní stanovení je důleţitým ukazatelem celkového stavu
pacienta a jeho metabolismu. Vzhledem k snadné dostupnosti vzorku bez větších nároků na
pacienta a vzhledem k mnoţství informací, které lze z jejich rozboru získat je analýza moči
jedním ze základních vyšetření, umoţňujících stanovit diagnózu, sledovat průběh
onemocnění a jeho léčbu.
Stejně jako u všech laboratorních vyšetření, je pro správnost výsledků kriticky důleţitá
kvalita vzorku. Ta můţe být nepříznivě ovlivněna způsobem odběru, intervalu sběru moče a
dobou mezi odběrem a samotnou analýzou. Pro většinu případů se pouţívá první ranní moč
(koncentrovaná), která musí být zpracována do jedné hodiny od odběru.
Pro speciální vyšetření, kde jsou větší časové nároky, je nutno moč konzervovat, neboť
je vyšší riziko bakteriální, případně plísňové kontaminace. Tato kontaminace můţe mít za
následek např. úbytek glukosy, posun pH do alkalické oblasti vlivem uvolňovaného
amoniaku, nebo rozklad ţlučových kyselin.
Mezi základní vyšetření moči patří stanovení jejích fyzikálních a chemických vlastností
a dále mikroskopické vyšetření močového sedimentu. Z fyzikálního hlediska je hodnocen
objem, barva, zákal, hustota a pH moči. Základní látky, které se v moči stanovují chemickým
vyšetřením, jsou glukosa, ketolátky, proteiny, hemoglobin, ionty a metabolické produkty
degradace hemu. Mikroskopicky se v močovém sedimentu stanovuje mnoţství, typ a
morfologie buněk, válce a eventuálně močové konkrementy. Mezi speciální vyšetření moči
patří detekce produktů vznikajících konkrétní metabolickou poruchou, například kyselina
fenylpyrohroznová, nebo homocystein, případně se provádí speciální toxikologická analýza.
95
ÚLOHA 1.
Chemické vyšetření moče
V současné době se k důkazu příp. semikvantitativnímu stanovení součástí moče často
pouţívají diagnostické prouţky, které podle svého sloţení mohou být monofunkční,
polyfunkční a speciální. Vyšetření moče diagnostickými prouţky je jednoduché, rychlé a lze
ho provádět i u lůţka pacienta.
Chemické principy, na kterých je zaloţena funkce indikačních zón prouţků, vycházejí z
klasické chemické analýzy moče. Na stejných principech jsou zaloţeny í automatické
analyzátory, vyuţívané v klinickobiochemických laboratořích pro kvantitativní stanovení.
1.1 pH
pH čerstvé moče se pohybuje v rozmezí 5 7, hodnota pH je ovlivněna potravou.
Patologické hodnoty jsou především důsledkem poruch acidobazické rovnováhy organismu.
Hodnota pH se zjišťuje indikátorovými papírky nebo pH-metrem.
1.2. Vápenaté ionty
Vápenaté ionty jsou fyziologickou součástí moče. Zvýšený příjem vápníku potravou i
porucha zpětné resorpce Ca2+ se projevuje zvýšenou koncentrací Ca2+ v moči.
Zkouška je zaloţena na reakci vápenatých iontů s oxalátovými ionty (viz Reakce
biochemicky významných funkčních skupin organických sloučenin, úloha 3.2.).
Pracovní postup:
– K l ml moče přidejte 1 ml Sulkowitchova činidla a promíchejte.
– Po 2 min vyhodnoťte vznik zákalu nebo sraţeniny, pouţijte stupnici:
+
malý zákal (normální nález)
++
větší zákal a sraţenina
+++ značný zákal a sraţenina
++++ hustý zákal a sraţenina
– Zapište chemickou reakci iontovou rovnicí:
96
1.3. Bílkoviny
V moči zdravého člověka jsou bílkoviny přítomny jen ve stopovém mnoţství, které
nepřesahuje 0,15 g/24 hod (fyziologická proteinurie). Koncentrace vylučovaných proteinů
močí je závislá na poloze těla i na tělesné námaze. Proto je nutné vyšetřovat první ranní moč,
aby se zachytila noční proteinurie.
Za patologickou proteinurii se povaţuje trvalé vylučování více neţ 100 mg bílkoviny do
moče za 24 hod. Pří velkých ztrátách plazmatických bílkovin močí dochází k poklesu
onkotického tlaku krevní plazmy, a tím i k moţnému úniku tekutiny do intersticia. Při
plazmocytomu, kdy dochází k atypické syntéze imunoglobulinů se objevuje v moči BenceJonesova bílkovina tzv. paraprotein. Jsou to lehké řetězce imunoglobulinů, které snadno
přecházejí do moče. Pro tuto bílkovinu je charakteristický vznik zákalu jiţ při teplotě 50
60° C a jeho rozpuštění při zahřívání na vyšší teplotu.
Důkaz bílkovin v moči je zaloţen na denaturačních reakcích. Zkoušky pro důkaz
přítomnosti bílkovin se provádějí v přefiltrované moči.
Vyšetřování mikroalbuminurie je diagnostická metoda slouţící jako klinicky významný
indikátor zhoršující se funkce ledvin (viz úloha 1.3.3.). Zvláště významné je toto vyšetření
u nemocných s diabetem (I. i II. typu) a nemocných s hypertenzí. Nefropatie patří
k nejčastějším a nejváţnějším komplikacím diabetu. Je rovněţ známo, ţe nemocní
s mikroalbuminurií mají vyšší výskyt kardiovaskulárních příhod a časnou mortalitu. Nález
mikroalbuminurie upozorňuje klinika na nezbytnost léčebného postupu, protoţe časná
léčebná intervence můţe progresi nefropatie zastavit nebo zvrátit. Pokles mikroalbuminurie
je navíc projevem pozitivní reakce na zvolený terapeutický postup.
Mikroalbuminurie je definována jako mírný vzestup exkrece albuminu do moči, který
není prokazatelný indikátorovými prouţky ke stanovení proteinurie. Exkrece albuminu do
moči je mírou glomerulární integrity i tubulární reabsorpce.
1.3.1. Důkaz kyselinou sulfosalicylovou (nejcitlivější a nejpouţívanější zkouška)
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte několik kapek roztoku kyseliny sulfosalicylové.
– Vyhodnoťte vznik opalescence nebo zákalu, případně sraţeniny. Podle intenzity
reakce lze zkoušku hodnotit i semikvantitativně. Pouţijte stupnici:
0 opalescence
do 0,1 g/l
+ průhledný zákal
0,1 0,25 g/1
++ neprůhledný zákal
0,25 2,0 g/1
+++ vločky
0,25 4,0 g/1
++++ tvarohovitá sraţenina
nad 4,0 g/1
1.3.2. Důkaz varem
Pracovní postup:
– Do zkumavky odlijte asi 2 ml moče.
– Pokud je pH vyšší, okyselte moč zředěnou kyselinou octovou na pH 4 4,5. Pokud je
pH nižší, přidejte malé množství krystalického chloridu sodného, který umožní
vysrážení bílkoviny i při tomto nižším pH (viz Bílkoviny I, úloha 5.4.).
– Z tohoto upraveného vzorku odeberte 1 ml.
– Povařte ve vroucí vodní lázni a výsledek porovnejte s vyhodnocením v úloze 1.3.1.
97
1.3.3. Stanovení albuminu v moči - mikroalbuminurie
Stanovení je založeno na měření komplexu antigenu a protilátky pomocí
imunoturbidimetrie (Bílkoviny II, úloha 4.).
1.4. Krev a krevní barvivo
Za patologických okolností se můţe v moči vyskytovat krev (hematurie) nebo
hemoglobin bez přítomnosti erythrocytů (hemoglobinurie). Příčiny hematurie jsou různé,
např. krvácení z močového měchýře a ledvin následkem poranění nebo onemocnění ledvin a
močových cest. K hemoglobinurii dochází také při vysoké koncentraci hemoglobinu
v plazmě, např. při vyčerpané vazebné kapacitě haptoglobinu nebo u těţkých hemolytických
anemií. Vzácněji se můţe v moči vyskytovat myoglobin (myoglobinurie) např. u těţkých
popálenin, těsně po infarktu myokardu nebo při zhmoţdění svalů při sportu. Rozlišení
hematurie a hemoglobinurie umoţní mikroskopické vyšetření močového sedimentu.
Důkaz hemoglobinu se provádí vţdy, je-li v moči přítomna bílkovina. V případě
pozitivního testu na krevní barvivo je nutné provést mikroskopické vyšetření močového
sedimentu.
Zkoušky pouţívané k důkazu krve a krevního barviva jsou zaloţeny na peroxidasové a
pseudoperoxidasové reakci (viz Biologické oxidace , úloha 3.). Zkoušky jsou pozitivní i
v přítomnosti leukocytů v moči. Jejich peroxidasovou aktivitu lze odstranit povařením moče.
1.4.1. Důkaz Heitz - Boyerovým činidlem (velmi citlivá zkouška)
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte 1 ml Heitz-Boyerova činidla a promíchejte.
– Opatrně po stěně zkumavky přidávejte "pasteurkou" roztok peroxidu vodíku (asi
0,5 ml).
– V případě pozitivní reakce vznikne na styčné ploše červenofialový prstenec.
1.4.2. Důkaz o-tolidinem
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte 4 kapky roztoku o-tolidinu a 0,5 ml roztoku peroxidu vodíku.
– V případě pozitivní reakce vznikne modré aţ modrozelené zbarvení.
1.5. Sacharidy
Normální moč obsahuje pouze stopová mnoţství sacharidů. Nejčastěji se vyšetřuje
přítomnost glukosy, méně často fruktosy, galaktosy, laktosy, pentos apod.
Fyziologická koncentrace glukosy v moči můţe být přechodně zvýšená po poţití
velkého mnoţství stravy bohaté na sacharidy, jestliţe její koncentrace v krvi překročí
reabsorpční schopnost ledvinových tubulů (alimentární glykosurie).
Za patologických okolností se glukosa vylučuje ve zvýšeném mnoţství do moče
u diabetické glykosurie, dále v případech, kdy je ledvinový práh pro glukosu sníţen pod
9 mmol/l (renální glykosurie) např. u těhotných ţen a u onemocnění ledvin. U renální
glykosurie není zvýšená koncentrace glukosy v krvi.
Glykosurie se také objevuje u vystupňovaných stresových stavů v důsledku působení
adrenalinu a glukokortikoidů na glykemii.
98
Glukosa v moči se dokazuje bud nespecifickými zkouškami zaloţenými na redukčních
vlastnostech glukosy nebo specifickou glukosoxidasovou reakcí (semikvantitativní stanovení
diagnostickými prouţky a kvantitativní stanovení .
Při důkazu glukosy redukčními zkouškami nesmí moč obsahovat bílkoviny, které se
musí odstranit vysráţením a filtrací (deproteinovaná moč). Falešně pozitivní reakci způsobuje
např. přítomnost kyseliny močové, homogentisové nebo askorbové v moči při nedodrţení
reakčních podmínek.
1.5.1. Důkaz Fehlingovou zkouškou (viz Sacharidy I, úloha 2.1.1.)
Pracovní postup:
– Ve zkumavce smíchejte Fehlingův roztok I a II v poměru 1:1, promíchejte, celkový
objem činidla asi 1 ml.
– Ke vzniklému modrému roztoku přidejte 1 ml deproteinované moče, dobře
promíchejte a zahřívejte ve vroucí vodní lázni.
– V pozitivním případě se po krátkém povaření vyloučí červená sraženina oxidu
měďného.
1.5.2. Důkaz Benedictovou zkouškou (viz Sacharidy I, úloha 2.1.2.)
Pracovní postup:
– K 1 ml Benedictova činidla přidejte asi 3 kapky deproteinované moče a dobře
promíchejte.
– Obsah zkumavky zahřívejte ve vroucí vodní lázni asi 2 min.
– V pozitivním případě se vyloučí oxid měďný jako červená sraženina.
Poznámka:
Oxido-redukční reakce mohou být falešně pozitivní, uţívá-li pacient některé léky – např.
nalidixovou kyselinu (Nalidixin, NegGram) pouţívanou při infekci močových cest,
probenecid při terapii dny a cefalosporinová antibiotika.
Přítomnost kys. askorbové (vitamin C) způsobuje pozitivitu oxidoredukčních testů.
Fehlingova zkouška (zbarvení dle mnoţství kyseliny askorbové) je pozitivní jiţ za studena.
S Benedictovým činidlem vytváří za studena bílou sraţeninu, která do 5 min. přechází přes
ţlutou barvu na oranţovou, nebo při slabém zahřátí, kdeţto v případě Nylanderova činidla
za studena nereaguje a po 2 min. povaření přechází ve slabě černě zabarvený čirý roztok.
1.6. Ketolátky
Ke skupině ketonových látek, dokazovaných v moči, patří kyselina acetoctová, z ní
vznikající kyselina 3-hydroxymáselná a aceton.
Vzestup koncentrace ketolátek v krvi je provázen jejich vylučováním močí (ketonurie).
Průkaz ketolátek v moči má význam hlavně pro včasné rozpoznání metabolické
dekompenzace diabetiků (diabetická ketoacidosa), při hladovění, po těţké námaze a po poţití
většího mnoţství tuků.
Důkaz kyseliny acetoctové a acetonu je zaloţen na vzniku barevného komplexu reakcí s
nitroprussidem sodným v alkalickém prostředí.
99
1.6.1. Důkaz Legalovou zkouškou
Pracovní postup:
– Několik krystalků nitroprussidu sodného rozpusťte v 1 ml destilované vody (zbytek
uchovat pro úlohu 1.9.).
– K 1 ml moče přidejte 2 kapky připraveného roztoku nitroprussidu sodného a 1 ml
roztoku hydroxidu sodného.
– Červeně zbarvený roztok rozdělte do dvou zkumavek.
– Do jedné zkumavky přidejte několik kapek koncentrované kyseliny octové.
– V přítomnosti ketolátek se zbarvení prohloubí do červenofialova.
– V negativním případě se roztok odbarví (původní červené zbarvení roztoku způsobuje
kreatinin vždy přítomný v moči).
1.6.2. Důkaz Lestradetovým činidlem
Pracovní postup:
– Na porcelánovou odpařovací misku poloţte kolečko filtračního papíru a dejte na něj
malé mnoţství Lestradetova činidla.
– "Pasteurkou" kápněte malé mnoţství moče na filtrační papír vedle činidla. Asi po
5 min se na styku vzlínající moče s činidlem objeví fialové zbarvení, které je důkazem
ketolátek.
1.6.3. Důkaz acetonu jodoformovou reakcí
Pracovní postup:
– Ve zkumavce smíchejte asi 0,5 ml moče s 1 ml roztoku hydroxidu sodného, přidejte
přibližně 3 ml Lugolova roztoku.
– V přítomnosti acetonu se roztok zakalí vyloučeným jodoformem.
1.6.4. Důkaz kyseliny acetoctové
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte několik kapek roztoku chloridu železitého a moč zfiltrujte.
– V přítomnosti kyseliny acetoctové má filtrát tmavě červenou barvu.
– V případě pochybnosti povařte nový vzorek moče. Kyselina acetoctová dekarboxyluje,
vznikající aceton vytěká a zkouška je negativní.
1.7. Ţlučová barviva
Do skupiny ţlučových barviv, která se dokazují v moči, patří bilirubin, urobilinogen,
sterkobilinogen, jejich oxidační produkty urobilin a sterkobilin (viz Tetrapyrroly.).
Bilirubin se v játrech konjuguje s kyselinou glukuronovou a se ţlučí odchází do
duodena. Za patologických stavů např. při obstrukci ţlučových cest (obstrukční ikterus) nebo
při těţkém poškození jaterního parenchymu (hepatocelulární ikterus), stoupne koncentrace
bilirubinu nad ledvinový práh (30 34 µmol/l a konjugovaný bilirubin se vylučuje do moče
(bilirubinurie). U hemolytických ţloutenek se v krvi zvyšuje koncentrace nekonjugovaného
bilirubinu, který ale do moče neproniká.
100
Urobilinogen a sterkobilinogen (tzv. Ehrlich pozitivní látky) se v moči vyskytují jen
v malém mnoţství. Při poškození jaterního parenchymu, (infekční ţloutenka, cirhosa) nebo
při nadměrné tvorbě bilirubinu (hemolytická ţloutenka, hemolytická anemie) se jejich
koncentrace v moči zvyšuje.
1.7.1. Důkaz konjugovaného bílirubinu
Podstatou pouţívaných reakci je oxidace bilirubinmono- a diglukuronátů na zelené
bíliverdinglukuronáty. Moč je třeba vyšetřit co nejdříve, aby se předešlo samovolné oxidaci
bilirubinu.
1.7.1.1. Důkaz Rosinovou zkouškou - roztokem jodu
Pracovní postup:
– 1 ml moče převrstvěte 1 ml jodové tinktury.
– V pozitivním případě se na styčné ploše vytvoří zelený prstenec biliverdinu.
1.7.1.2. Důkaz Gmelinovou zkouškou - kyselinou dusičnou
Pracovní postup:
– 1 ml moče převrstvěte 1 ml koncentrované kyseliny dusičné (dávkovač).
– V pozitivním případě se na styčné ploše vytvoří zelený prstenec biliverdinu.
1.7.1.3. Důkaz Hammarstenovou zkouškou (varianta Gmelinovy zkoušky)
Pracovní postup:
–
1 obj. Hammarstenova činidla se smíchá se 4 obj. ethanolu a přidá se kapka moči k
přibližně 2 ml činidla.
– V přítomnosti bilirubinu vznikne zelené zbarvení biliverdinu.
– Přidá-li se postupně více kyseliny, zabarvení směsi se mění přes celou stupnici
Gmelinovy reakce, vzhledem k progresivní oxidaci bilirubinu přes stadium zeleně, biliverdin, modř – bilicyanin a nakonec červený pigment – bilipurin, který se mění na
žluť, která je choletelin.
Hammarstenova zkouška je vhodná pro testování přítomnosti bilirubinu v moči, která
obsahuje malé množství bilirubinu nebo velká množství urobilinu a indoxylu
1.7.2. Důkaz urobilinogenu a sterkobilinogenu
Urobilinogen a sterkobilinogen tvoří za studena v silně kyselém prostředí s
Ehrlichovým činidlem červeně zbarvené kondenzační produkty.
Reakce je nespecifická. Porfobilinogen poskytuje barevné kondenzační produkty, které
nejdou vytřepat do chloroformu. Indol a indolové melanogeny tvoří s Ehrlichovým činidlem
červenofialové zbarvení, které vymizí po protřepání s nasyceným roztokem octanu sodného.
V přítomnosti sulfonamidů vzniká ţluté aţ oranţové zbarvení, (viz Reakce biochemicky
významných funkčních skupin organických sloučenin, úloha 4.).
Urobilinogen a sterkobilinogen reagují s Ehrlichovým činidlem za studena, proto se
vyšetřují v čerstvé, vychladlé moči. V čerstvě vymočené moči vznikne červené zbarvení vţdy
(pozitivitu způsobuje fyziologické mnoţství barviv). Pokud zbarvení v tomto případě
101
nevznikne, jedná se o sníţení koncentrace nebo úplné chybění urobilinogenu (např.
u obstrukčního ikteru).
Hodnocení nálezu ţlučových barviv v moči
hemolytický
ikterus
hepatocelulární
ikterus
obstrukční
ikterus
negativní
negativní
+
+
negativní
+
+
negativní
ţlučová barviva normální nález
konjugovaný
bilirubin
urobilinogen
Pracovní postup:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Ke 3 ml chladné čerstvé moče přidejte 0,5 ml Ehrlichova činidla.
V přítomností urobilinogenu a sterkobilinogenu se do 5 min vytvoří červené zbarvení.
Polovinu roztoku odlijte do druhé zkumavky.
Do jedné zkumavky přidejte l ml chloroformu a protřepejte.
Zbarví-1i se chloroformová vrstva červeně, jsou přítomny urobilinogen a
sterkobilinogen.
Je-li červeně zbarvená vodná vrstva, jedná se o falešnou pozitivitu Ehrlichovy
zkoušky (porfobilinogen).
Do druhé zkumavky přidejte 1 ml nasyceného roztoku octanu sodného.
Pokud zbarvení vymizí, jedná se opět o falešnou pozitivitu Ehrlichovy zkoušky (indol
a jeho deriváty).
V další zkumavce smíchejte 7 ml čerstvě vymočené moče a 5 kapek Ehrlichova
činidla. Pozorujte zda vznikne červené zbarvení.
1.8. Porfyriny
Zvýšené vylučování porfyrinů (tetrapyrrolových prekurzorů hemu) močí - porfyrinurie,
se vyskytuje při vrozených vadách biosyntézy hemu – porfyriích, ale také u jaterní cirhózy, u
pacientů s chronickou infekcí virem hepatitidy C (HCV) s abusem alkoholu a při některých
otravách (olovo, hexachlorbenzen, otravách léky - barbituráty, sulfonamidy, chloramfenikol
atd.).
Moč obsahující porfyriny na světle tmavne a dává pozitivní Ehrlichovu reakci
(porfobilinogen, viz úloha 1.7.2.)
Důkaz porfyrinů vyuţívá jejich červenou fluorescenci v UV světle (viz Tetrapyrroly,
úloha 2.1.).
Určité typy porfyrií (akutní jaterní porfyrie) a otravy (např. aktutní otrava Pb) jsou
provázeny vylučováním netetrapyrrolových prekurzorů – 5-aminolevulátu (∆-aminolevulátu)
a porfobilinogenu. 5-aminolevulát se stanovuje HPLC a porfobilinogen v eluátu po absorpční
chromatografií na anionickém iontoměniči fotometricky Ehrlichovým činidlem..
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte pipetkou 1 kapku koncentrované kyseliny sírové a moč
pozorujte v UV světle.
– V přítomnosti porfyrinů se objeví červená fluorescence.
102
1.9. Indolové melanogeny
Indolové melanogeny vznikají jako meziprodukty při biosyntéze melaninu z tyrosinu.
Jejich vylučování močí ve zvýšeném množství svědčí pro přítomnost nádoru pigmentových
buněk (maligní melanom). Moč obsahující melanogeny na vzduchu tmavne, protože jejich
oxidací vzniká černý pigment tzv. močový melanin.
Indolové melanogeny se prokazují Thormählenovou zkouškou, která se provádí stejně
jako zkouška Legalova pro důkaz ketolátek, ale po přidání kyseliny octové se objeví modré
zbarvení (viz úloha 1.6.1.).
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte 2 kapky připraveného roztoku nitroprussidu sodného z úlohy
1.6.1., 1 ml roztoku hydroxidu sodného a několik kapek koncentrované kyseliny octové.
– V pozitivním případě se objeví modré až modrozelené zbarvení.
1.10. Kyselina fenylpyrohroznová
Při dědičné metabolické poruše funkce enzymu fenylalaninhydroxylasy je blokována
přeměna fenylalaninu na tyrosin. Koncentrace fenylalaninu a jeho metabolitů (fenylpyruvát,
fenyllaktát, fenylacetát) v krvi se zvyšuje a dochází k jejich vylučování močí (fenylketonurie).
Důkaz je založen na reakci kyseliny fenylpyrohroznové s chloridem železitým za vzniku zeleně
zbarveného komplexu.
Pracovní postup:
– K 1 ml moče přidejte 1 kapku roztoku chloridu železitého.
– V pozitivním případě se během několika minut objeví tmavě zelené zbarvení vzniklého
komplexu.
VYHODNOCENÍ:
vzorek č.
pH
vápenaté ionty
bílkoviny
krev
glukosa
aceton
kyselina acetoctová
bilirubin
urobilinogen
porfyriny
melanogeny
kys.fenylpyrohroznová
Poznámky:
103
104
XENOBIOCHEMIE
Klíčová slova: cizorodé látky, smrtelná dávka toxické látky, alkoholdehydrogenasa,
biotransformace cizorodých látek, dusičnany, dusitany, redukce, oxidace. nitrosaminy.
Reagencie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
digitální Alkohol tester, JETT 6
roztok amobarbitalu v ethanolu 2 g/l
roztok fenobarbitalu v ethanolu 2 g/l
roztok pentobarbitalu v ethanolu 2 g/l
kyselý extrakt vzorku moče
mobilní fáze pro chromatografii kyselých látek (25 ml chloroformu, 25 ml acetonu,
2 ml amoniaku)
roztok síranu rtuťnatého v kyselině sirové (k suspensi 5 g ţlutého oxidu rtuťnatého ve
100 ml vody postupně přidávat 20 ml koncentrované kyseliny sírové, po ochlazení
doplnit vodou na 250 ml) !JED!
roztok chlorpromazinu v ethanolu 2 g/l
roztok levopromazinu v ethanolu 2 g/l
roztok prochlorperazinu v ethanolu 2 g/1
roztok thioridazinu v ethanolu 2 g/l
roztok chlorprothixenu v ethanolu 2 g/l
roztok kodeinu v ethanolu 2 g/l
bazický extrakt vzorku moče
mobilní fáze pro chromatografii bazických látek (36 ml ethylacetátu, 2 ml ethanolu,
2 ml amoniaku)
směs ethanol: koncentrovaná kyselina sírová 1:1 !ŢÍRAVINA!
tři vzorky vody
roztok kyseliny sulfanilové 20 mmol/l v roztoku hydrogensíranu draselného 0;2 mol/l
činidlo: roztok N-(1-naftyl)-ethylendiaminhydrochloridu 0.04 g/100 ml
roztok hydroxidu sodného 300 g/l !ŢÍRAVINA!
roztok salicylanu sodného 10 g/:
zředěná kyselina sírová 1:10 !ŢÍRAVINA!
vzorek moče na identifikaci drog
testovací prouţky DrugControl® pro stanovení kanabinoidů a amfetaminu v moči.
105
Xenobiochemie se zabývá metabolismem cizorodých látek. V prostředí, ve kterém
ţijeme, přicházíme do neustálého kontaktu s mnoţstvím látek, které mohou na náš
organismus působit škodlivě a které mohou být příčinou vzniku některých onemocnění, nebo
závaţných intoxikací. Organismus je pro tyto případy vybaven enzymatickým aparátem,
který umoţňuje deaktivaci, ale někdy i aktivaci a vyloučení těchto látek.
Metabolismus cizorodých látek se skládá ze dvou fází, I. biotransformační, jejímţ
cílem je specifické sníţení negativního účinku daného xenobiotika a II. konjugační, kdy je
transformovaná cizorodá látka konjugována s endogenním substrátem a v této formě
vyloučena močí nebo stolicí v závislosti na polaritě molekuly.
V naprosté většině případů jsou za metabolismus xenobiotik v I. fázi zodpovědné
enzymy z rodiny cytochromu P450. Aktivita těchto enzymů je nejvyšší v játrech a je pozitivně
ovlivňována (indukována) koncentrací cizorodých látek. Znalost mechanismů detoxikace
cizorodých látek je velmi důleţitá zejména pro farmakologii, toxikologii, ale i terapii
některých chorob, např. akutních porfyrií.
106
ÚLOHA 1.
Důkaz ethanolu ve vydechovaném vzduchu
Ethanol je řazen mezi cizorodé látky, ale jeho poţívání je natolik rozšířené, ţe se,
de facto, stal v současné společnosti součástí výţivy jako poţivatina se všemi z toho
vyplývajícími důsledky. Hlavní farmaceutický význam ethanolu je dán jeho pouţitím jako
rozpouštědla velkého počtu organických látek, z přímého vyuţití lze zmínit pouţívání 60%
roztoku ethanolu k desinfekčním a antiseptickým účelům.
Poţitý ethanol se snadno resorbuje jiţ v ţaludku, 2 – 10 % se ho vylučuje plícemi a
ledvinami, zbytek je přeměněn v játrech. Největší podíl ethanolu je metabolizován v
cytoplazmě
jaterních
buněk
dvoustupňovou
dehydrogenací,
katalyzovanou
alkoholdehydrogenasou.
K orientačnímu průkazu ethanolu ve vydechovaném vzduchu jsou pouţívány detekční
trubičky obsahující ţlutý dichroman draselný v kyselině sírové. Podle intenzity zeleného
zabarvení vyredukované chromité soli, lze odhadnout koncentraci alkoholu v krvi (viz
Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha l.).
Na stejném principu je zaloţeno stanovení ethanolu Widmarkovou metodou, která však
není specifická (stanoví se i všechny ostatní těkavé látky v krvi, oxidovatelné za daných
podmínek). Pro specifické stanovení ethanolu v krvi se vyuţívá plynová chromatografie nebo
oxidace alkoholu katalyzovaná alkoholdehydrogenasou. Při orientačním průkazu ethanolu se
v současné doby detekční trubičky nahrazují spektrofotometry. Absorpce infračerveného
záření v charakteristické oblasti parami ethanolu specificky udává jeho mnoţství ve
vydechovaném vzduchu. Z tohoto mnoţství se vypočítá koncentrace ethanolu v krvi v g/l
(‰).
Značení piva
Způsob značení piva určuje vyhláška č. 335/1997 Sb.. Uvádí se název druhu a skupiny
(např. pivo leţák), obsah alkoholu v %, zda jde o světlé či tmavé pivo a některé další údaje.
Kromě toho se nepovinně uvádí údaj o extraktu obsahu původní mladiny. Vyhlášce
neodpovídá značení piva ve stupních (např. 10° nebo 12° pivo) a v současnosti je nezákonné.
Místo stupňů je nutno správně uvádět tzv. extrakt původní mladiny (EPM) a to
v hmotnostních procentech (např. 12% pivo
nelze plést s procenty alkoholu, která se
u běţných piv pohybují mezi 4 5 %).
1.1. Detekce ethanolu ve vydechovaném vzduchu
Pracovní postup:
– Bezprostředně po poţití 1 piva proveďte dechovou zkoušku pomocí alkohol testeru.
– Zkoušku opakujte po 30 a 60 min.
– Výsledky zapište do tabulky 1., k vyhodnocení pouţijte znamének + a .
107
Tabulka 1
čas (min)
0
30
60
pivo ..........%
koncentrace EtOH (g/l)
1.2. Výpočty koncentrace alkoholu v krvi
Koncentraci ethanolu v krvi lze vypočítat podle vztahu:
mnoţství poţitého čistého alkoholu (g)
c (g/l) =
0,7 tělesná hmotnost (kg)
Koncentrace ethanolu v krvi klesá zpravidla průměrně o 0.25 g/l za hodinu. V rychlosti
detoxikace hraje roli mnoho faktorů, např. věk, pohlaví, fyzická kondice, stav nalačno,
tolerance atd. Obsah ethanolu v běţných nápojích:
pivo 10%
pivo 11%
pivo 12%
víno
lihoviny
30 g/1
35 g/l
40 g/l
120 g/l
400 g/l
Příklady:
a) Vypočítejte, jaká bude koncentrace ethanolu v krví vyšetřované osoby ihned po poţití
1 piva a dále po 30 a 60 min. Výsledky zapište do tabulky 1.
b) Vypočítejte, za kolik hodin klesne koncentrace alkoholu v krvi na hodnotu 0,1 g/l,
jestliţe muţ o hmotnosti 80 kg vypil v krátké době šest 12% piv a dvě malé odlivky
rumu (malá odlivka = 0,02 1):
(15,5 hod)
c) Vypočítejte, jaký objem lihoviny by teoreticky stačil k dosaţení smrtelné koncentrace
ethanolu v krvi (4 g/1) pro osobu o tělesné hmotnosti 70 kg:
(490 ml)
Poznámky:
108
ÚLOHA 2.
Identifikace cizorodých látek (xenobiotik) a jejich metabolitů v moči
Cizorodé látky, které se dostávají do lidského organismu (potravinářská barviva a
stabilizační látky, léčiva) jsou vylučovány ledvinami buď v původní formě, nebo
transformované na metabolity. Hlavním orgánem, v němţ se uskutečňuje metabolismus
cizorodých látek, jsou játra.
Xenobiotika se dokazují ve vzorcích nativní moči nebo podle povahy analyzovaných
látek v jejím kyselém či bazickém extraktu (extrakci často předchází hydrolýza případných
konjugátů).
Pro důkaz jednotlivých látek se vyuţívá např. tenkovrstevná chromatografie (TLC),
která je rychlá a ekonomicky výhodná (viz Aminokyseliny, úloha 1.1. V současné době
k těmto klasickým metodám přistupuje i vyuţití automatických přístrojů.
2.1. Identifikace kyselých látek (amobarbital, fenobarbital, pentobarbital)
Barbituráty se řadí podle svého účinku mezi hypnotika a sedativa. Ve směsi s dalšími
léčivy se pouţívají jako analgetika a antiepileptika.
Pracovní postup:
– Na silufolové desce lehce vyznačte obyčejnou tuţkou start {asi 2 cm od spodního
okraje desky) a čtyři body, na které opatrně naneste mikropipetkami standardní
roztoky barbiturátů a ethanolový roztok kyselého extraktu moče (nepoškodit tenkou
vrstvu!).
– Desku vloţte do chromatografické vany s připravenou mobilní fází pro chromatografii
kyselých látek. Start musí být nad hladinou kapaliny.
– Vanu dobře přikryjte skleněným víkem.
– Kdyţ čelo rozpouštědla dosáhne do vzdálenosti 1 2 cm od horního okraje desky,
chromatogram vyndejte z vany.
– Čelo rozpouštědla označte tuţkou a chromatogram nechte na vzduchu uschnout.
– Suchý chromatogram opatrně detekujte postřikem roztokem síranu rtuťnatého
(v digestoři). Barbituráty vytvoří bílé skvrny, vystupující nad povrch tenké vrstvy.
– Pomocí vypočítaných hodnot Rf standardů i vzorku identifikujte jednotlivé barbituráty.
2.2. Identifikace bazických látek (chlorpromazin, levopromazin, prochlorperazin,
thioridazin, chlorprothixen, kodein)
Prvních pět látek jsou léčiva patřící do skupiny neuroleptik (psychofarmaka). Kodein je
methylderivátem alkaloidu morfinu. Uţívá se jako antitusikum a jako součást velmi účinných
analgetik. Není většinou návykový, ale je zneuţíván k přípravě heroinu. Ten jiţ nemá
jakékoliv terapeutické pouţití, zato je však silně návykový.
109
Pracovní postup:
– Analogickým postupem jako v úloze 2., proveďte chromatografii standardů a vzorku
bazického extraktu moče stejného čísla jako v úloze 2.1.
– K vyvíjení chromatogramu pouţijte mobilní fázi pro bazické látky.
– Usušený chromatogram rovnoměrně postříkejte směsí ethanolu a kyseliny sírové.
Ihned po detekci se objeví barevné skvrny.
– Podle hodnot Rf a zbarvení jednotlivých skvrn identifikujte léčiva ve vzorku.
2.3 Stanovení kanabinoidů a amfetaminu v moči pomocí testovacích prouţků
DrugControl©
2.3.1. Kanabinoidy
Zdrojem těchto látek, které patři mezi halucinogeny, jsou listy a výhonky (marihuana,
hašiš
pryskyřice) některých odrůd konopí setého (Cannabis sativa). Účinnou látkou je
především 9-3,4-trans-tetrahydrokanabinol ( 9-THC ).
9
-3,4-trans-tetrahydrokanabinol
Při kouření se rychle absorbuje z plic do krve, ze ţaludku při orálním uţívání se
absorbuje do krve pomaleji. Ovlivňuje CNS (včetně narušeni motorické koordinace) a
kardiovaskulární systém (zvýšení krevního tlaku a srdečního tepu). Droga se eliminuje
přibliţně z 80 % během prvních pěti dnů, největší podíl stolicí, zbytek močí. Metabolity
mohou být v moči detekovány i desátý den po příleţitostném uţití, při chronickém uţíváni aţ
do 36 dní.
2.3.2. Amfetamin
Patři do skupiny látek, nazývaných sympatomimetika, která stimulují adrenergní reakce.
Přirozeným sympatomimetikem je adrenalin a jeho demethylovaný prekursor noradrenalin.
Efedrin, alkaloid obsaţený v rostlinách řádu Efedra, který také patří k těmto látkám, má navíc
výrazně dráţdivé účinky na CNS, právě tak jako z něj synteticky vyráběný amfetamin a 2-Nmethylamfetamin (Pervitin), který je návykový.
110
Efedrin
Amfetamin
Vylučování moči začíná během 20 min po aplikaci, v průběhu 24 hod se vyloučí 30 %
amfetaminu v původní podobě. Při občasném uţití jednotlivých dávek (asi 10 mg) je jeho
koncentrace v moči během prvních 24 hod 0,5 - 4.0 mg/l, při chronickém uţívání se
koncentrace v moči pohybuje mezi 25 – 300 mg/l.
Pracovní postup:
– Vytemperovanou obálku s testovacím prouţkem otevřete aţ těsně před pouţitím.
– Prouţek ponořte označeným koncem do moči. Hladina nesmí přesahovat označenou
linku.
– Prouţek nechejte nasáknout po dobu asi 30 vteřin.
– Poloţte prouţek na vodorovnou podloţku a výsledek odečtěte po 5 10 minutách.
Tabulka 2.
vzorek moče č.:
kyselé látky
bazické látky
kanabinoidy
amfetamin
111
ÚLOHA 3.
Stanovení koncentrace dusitanů ve vodě
V ţivotním prostředí dochází k hromadění dusičnanů při intenzivní zemědělské
produkci (umělá dusíková hnojiva). Dusičnany jsou většinou redukovány na dusitany
mikroorganismy přítomnými ve vodě, půdě i ústní dutině. Dusičnany, které nejsou
v organismu přeměněny bakteriální flórou na dusitany, se vstřebávají, nepronikají však do
buněk a jsou vylučovány močí.
Dusitany se pouţívají ve velké míře i při výrobě uzenin. Jsou pro lidský organismus
toxické. Jednou z příčin jejich toxicity je oxidace Fe2+ hemoglobinu na Fe3+ za vzniku
nefunkčního hemiglobinu (viz Tetrapyrroly): Při chronickém přívodu dusitanů spočívá riziko
v tvorbě nitrosaminů, které mají především účinky hepatotoxické a jiţ ve velmi malých
dávkách jsou mutagenní a karcinogenní.
Nejvyšší přípustná koncentrace podle státní normy je pro dusičnany 50 mg/l (pro
kojence do 6 měsíců pouze 15 mg/l) a pro dusitany pouze 0,1 mg/l.
3.1. Stanovení dusitanů
Podstatou stanoveni dusitanů ve vodě je diazotace kyseliny sulfanilové přítomnými
dusitany a následující kopulace vzniklé diazoniové soli s N-(1naftyl)-ethylendiaminem za
vzniku červeného azobarviva. Intenzita zbarvení, stanovovaná fotometricky při 550 nm, je
přímo úměrná koncentraci dusitanů.
Analogický test se vyuţívá pro nepřímý průkaz bakteriurie. Čím více bakterií je v moči,
tím více dusitanů vznikne redukcí dusičnanů přítomných v moči. Pro správnost vyšetření je
třeba zajistit dostatečný přívod dusičnanů potravou a dostatečně dlouhé setrvání moče v
močovém měchýři (4 6 hod).
Pracovní postup:
– Koncentraci dusitanů stanovte v běţné pitné vodě z vodovodní sítě, v balené pitné
vodě a ve vodě studniční.
– Do čtyř zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3, jako slepý vzorek pouţijte
destilovanou vodu.
– Potom napipetujte do kaţdé zkumavky 2 ml destilované vody (konečný objem 5 ml) a
změřte absorbance vzorků pří 550 nm proti slepému vzorku.
– Naměřené hodnoty absorbancí zapište do tabulky 5.
– Z kalibračního grafu odečtěte odpovídající hmotnostní koncentraci dusitanů
v jednotlivých vzorcích vody.
112
Tabulka 3.
reagencie (ml)
vzorek vody
kyselina sulfanilová
činidlo
pitná voda
balená voda studniční voda slepý vzorek
2,5
2,5
2,5
2,5
0,25
0,2 5
0.25
0.25
promíchat, nechat stát 10 min
0,25
0,25
0,25
0,25
promíchat, nechat stát 20 min
Poznámky:
113
POUŢITÁ LITERATURA
Biochemistry Course. Laboratory Notes. St.Thomas's Hospital Medical School, London.
Edition 12, 1977.
Bubnová, E. a kol.: Praktická cvičení z lékařské chemie a biochemie. Karolinum, Praha 2002.
Couch, F. J, Weber, B. L: Breast cancer; in Vogelstein B, Kinzler KW (eds). The genetic
basis of human cancer. New York, McGraw-Hill 1995, pp 537-563.
Dane, E., Wille, F.: Kleines chemisches Praktikum. Verlag Chemie, GmbH, Weinheim 1961.
Doleţalová, V a kol.: Principy biochemických vyšetřovacích metod, I. a II. část, Institut pro
další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 1995.
Doubrava, J., Koštíř, J., Pospíšil, J.: Základy biochemie, SPN Praha 1984.
Dzúrik, R. a kol.: Štandardná klinickobiochemická diagnostika. Osveta, Martin 1996.
Gräser, H.: Biochemisches praktikum. VEB Deutcher Verlag der Wissenschaften Berlin 1971.
Henning, H.-G., Jugelt, W., Sauer, G.:Praktische Chemie. Ein Studentenbuch für
Biowissenschaftler. VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1991.
Hiršová, D.: Chemické názvosloví. Karolinum 1999
Kalous, V., Pavlíček, Z.: Biofyzikální chemie, SNTL Praha 1980.
Kaplan, L. A., Pesce, A. J., Kazmierczak, S. C.: Clinical Chemistry, 4th edition, 2003
Kraml, J. a kol.: Návody k praktickým cvičením z lékařské chemie a biochemie. Karolinum,
Praha 2000.
Křemen, J., Pohlreich, P., Stříbrná, J.: Techniky molekulární biologie a jejich vyuţití v
medicíně. Karolinum, Praha 1998.
Kušnír, J.: Návody k praktickým úlohám z biochemie. Univerzita P J. Šafárika, Košice 1994.
Masopust, J., Průša, R.: Patobiochemie metabolických drah. UK, 2. LF Praha 1999
Melichar, B.: Chemická léčiva. Avicenum Praha 1972.
Musil, J.: Molekulové základy klinické biochemie, Grada Avicenum Praha 1994.
Musil, J. a kol.: Lékařská chemie a biochemie. Praktikum. Avicenum, Praha 1991.
Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.: Assay for Lipid Peroxides in Animal Tissues by
Thiobarbituric Acid Reaction. Anal. Biochem. 95, 351-358, 1979.
Peprla, J., Kuklínek, P.: Přehled laboratorních vyšetření. Lachema Brno 1995.
Prokeš, J.: Úvod do toxikologie. Karolinum, Praha 1991.
Racek, J. a kol.: Klinická biochemie. Karolinum Praha 1999.
Rácz, O. a kol.: Glykohemoglobín, glykácia bielkovin a diabetes mellitus. Osveta, Martin
1989.
Soška, V.: Volné kyslíkové radikály a jejich scavangery. Klin. Biochem. Metab. 1 (22), 57-61,
1993.
Štípek, S. a kol.: The Effect of Quinolinate on Rat Brain Lipid Peroxidation is Dependent on
Iron. Neurochem. Int. 30, 233-237, 1997.
Štípek, S. a kol.: Xanthine oxidoreductase. Sborník lékařský, 95, 289-295, 1994.
114
Táborská, E. a kol.: Návody ke cvičením z biochemie. Masarykova universita, Brno 1993.
Vodráţka, Z.: Fyzikální chemie pro biologické vědy. SNTL Praha 1982.
VopršalovÁ, M., Ţáčková, P.: Základy toxikologie pro farmaceuty. Karolinum, Praha 1996.
Zikán, M., Jančárková, N., Pohlreich, P., Matouš, B., Kleibl, Z., Stříbrná, J., Ţivný, J.:
Hereditární dispozice ke vzniku karcinomu prsu a ovaria. Čas. Lék. Česk.
2004;143(1):26-30.
Zima, T.: Přehled laboratorních vyšetření, VFN 2002.
115

úloha 1. - Ústav biochemie a experimentální onkologie

Transkript

Podobné dokumenty

ORGANICKÉ SLOUČENINY DUSÍKU

VYŠETŘENÍ FUNKCE JATER v PEDIATRII (1. část) 1. Úvod

práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem

ST0170 Ferritin - Dot Diagnostics s.r.o.

Skripta návodů do cvičení z laboratorní techniky

Analýza moči Soubor

úloha 1. - Ústav biochemie a experimentální onkologie

Uživatelská příručka

2 - CEVA

Uživatelská příručka

Organické látky - transformace a degradace

Výživa a pohybová aktivita v prevenci a léčbě civilizačních

Přehled laboratorních vyšetření, referenčních mezí a doporučení

Bližší informace o laboratorním vyšetření

Fulltext

Česky POPIS PRODUKTU Tytin® - ušlechtilá slitina s vysokým

(Cen\355k Eickemeyer 2012.xls)

Dietní specifika u osob s obezitou, diabetem a dalšími onemocněními

Příloha č.: 1 ze dne: 7.4.2009 je nedílnou součástí osvědčení o