Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.
Transkript
Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.
Identifikace proteinů v proteomice Identifikace proteinů Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Sekvenční analýza se provádí způsoby: 1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2. hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, „de novo“ sekvencování). ) V obou p případech p pak na základě p získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů Pro přímé P ří é sekvencování k á í je j nutný ý blotting bl i nativního i íh proteinu i nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow) na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru. sekvenátoru „Fingerprint“ DIGE Diferenční 2D elektroforéza Proteinové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra) Peptidové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra) Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků – „otisky otisky prstů“ pro každý např. např buněčný proteom nebo pro každý protein Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Edmanovo odbourávání Po odštěpení PTC PTC--derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Běžně je takto možné získat 30 - 40 aminokyselin z N N-konce, konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. y Applied pp Biosystems, y Shimadzu)) jje analyzovaný y ýp protein či firmy peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). blottingu) Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné ffázi. i Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí č 30 30--60 min. min Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Edmanovo odbourávání Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství vzorku 2020-50 pmol, pmol nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není tolik rozšířená. ro šířená Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou cestou je volný N-konec peptidu či proteinu. proteinu Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, acetylace, pyroglutamová kyselina). kyselina Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. cyklu Automatizace Hmotnostní spektrometrie (mass spectometry, MS) MS) Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m (m) a náboje (z (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje j umožňuje j určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností 10 10-4. 4 Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé látk (i látky (ionizace i paprskem k elektronů l kt ů - EI, EI chemická h i ká ionizace i i s nosným ý plynem). S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). y y) Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek látek, peptidů, peptidů proteinů a dalších biobiomakromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy) lipidy).. Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5dihydroxybenzoová. Vzorek (1 mg/mL) se nanese v 0.5 l na nerezovou destičku a nechá se vysušit. vysušit Pak se aplikuje 0.5 0 5 l matrice a opět se nechá vysušit. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový p paprsek p se („ („fire“), („fire“) e ), ) transfer s e eenergie e g e způsobí působ ionizaci. o c.S Směrovaný ě ov ý energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity. SELDI – surface enhanced laser desorption desorption/ionisation /ionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost hl t selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS MS je často propojena s jinými analytickými technikami technikami: ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GCMS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS. K Kromě ě tandemové t d é MS (MS-MS) (MS MS) mohou h být spojeny j ažž tři i více í analyzátorů („multiple“ MS). První vybírá studované látky ze směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale podle fragmentačních obrazů („patterns“). Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením. rozlišením Taková on-line on line analýza pak dává okamžité výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení přístrojů. LC LC-MS MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC GC-MS MS pro těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny, DNA, viry etc. vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava (redukce) (alkylace) štěpení proteasou rozvolnění l ě í S-S S S vazeb b DTT, dithiothreitol IAA, jódoctová kys. 2 5 kD 2,5 3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) m/z UVabs 4. MS/MS spektrum d lší další fragmentace Time (min) m/z 5 Určení části sekvence .. M G A D D H D K L .. 5. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace vzorku proč redukce a alkylace? KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) – detergenty d (SDS (SDS, T Triton i atp.)) 3. MS vybraného štěpu protein II (16 kD) Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován, nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není. není. trypsin denaturace > lepší proteolýza ochrana oxidovaných reziduí Cys agresivní proteasa vysoká ká primární i á í specificita, ifi it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa štěpí: arginyl-X, lysyl-X; ale ne X=prolyl 1. Štěpení proteinu trypsinem Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a přesná m/z intaktního p p proteinu. Pro štěpení se používají endoproteasy endoproteasy, tedy proteolytické enzymy, které k é štěpí š ě í uvnitř i ř proteinové i é molekuly. l k l Důraz ů se klade kl d na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce specifické enzymy, enzymy jako je trypsin z hovězího či vepřového pankreatu (EC 3.4.21.4) nebo Lys C proteasa z Bacillus licheniformis ((EC 3.4.21.50). ) Trypsin yp štěpí p za bazickými ý zbytky y y Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC 3.4.21.19) štěpí za Gl Specificky Glu. S ifi k lze l štěpit š ě i chemicky h i k použitím ži í CNBr. CNB Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting” Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS štěpení p proteázou p ((trypsinem) yp ) protein I (12 kD) DNA (i EST), proteinová databáze 2 fragmenty (4 kD, 8 kD) protein II (16 kD) 3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD) generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových i ý h sekvencí k í masses (m/z) 940.421 - ELSDIAR 1093.477 - QLLLTADDR 1341.556 - PHSHPALTPEQK 1469.633 - PHSHPALTPEQKK 1488.645 - GILAADESTGSIAKR 1646.650 - LQSIGTENTEWENRR 2122 975 - IGENHTPSALAIMENANVLAR 2122.975 2241.903 - YTPSGQAGAAASESLFISNHAY MALDI ToF Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. protein I 4000 8000 m/z 8000 m/z protein a: 3 3, 5, 5 9, 9 12 kD protein b: 2, 7, 9 kD protein c: 4, 8 kD protein d: 3, 9, 12 kD protein e: 2, 6, 8 kD protein II 2000 6000 Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy Bioinformatika pro MS oorganismy ga s y se se sekvenovaným ve ova ý ge genomem o e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (i silico (in ili digest) di ) s experimentálními i ál í i PC programy p g y MASCOT ((firma Matrixscience), ), SEQUEST, Q , ProteinProspector organismy s nesekvenovaným ne genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí MS BLAST BLAST:: MS driven Best Local Alignment Search Tool MultiTag ulti ag (S. Sunyaev Su yaev et al., al., Anal. a.C Chem. e . 2003, 003, in ppress) press ess) ess) Charakterizace koko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce a modulaci funkcí p proteinů. Př. fosforylace y - p přenos signálu g v buňce,, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, hmotnosti citlivosti a rozlišení. rozlišení Typický protokol pro analýzu proteinové modifikace začíná p vzorku,, enzymobe y modifikaci. Pak se analyzuje y j rozdíl štěpením v molekulové hmotnosti určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra spektra.. Pro složitost některých ěk ý h směsí ě í je j výhodnější ýh d ější použít ží MALDI PSD MS/MS nebo b LC MS. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. MALDI MS p pro studium vyšší y struktury y proteinů p Studium prostorové struktury proteinů (zvl. terciární a kvarterní) má význam z důvodu těsného vztahu struktura - funkce. funkce Poznání struktury tedy může poskytnout informace o funkci proteinu. Pro studium struktury proteinů se běžně používá řada spektro spektro-skopických metod (Krystalografie - difrakce paprsků X, NMR spektroskopie a další). Dávají poměrně jasné výsledky, ale jejich nevýhodou může být zejména časová náročnost a nároky na vyšší množství materiálu. materiálu Poskytují rovněž značná množství dat, dat jejichž vyhodnocování je opět náročné. Technikou MS je možné studovat například přístupnost určitých povrchových regionů proteinů s použiím metody zvané protein mass fingerprinting (PMF). Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: Nároky na čistotu: Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování – na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká ((> 1mg/ml) g ) IEC – separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), zakoncentrování? (objem eluentu), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená přiměřená, relativně levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC – metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 – 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) – vysoce soce specifická metoda metoda, vysoká soká kapacita kapacita, sniž snižuje je počt počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu terapeutické účely (> (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 – 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 – 90%) ultračisté lt či té analytické l ti ké standardy t d d (95 – 99%) Počet purifikačních kroků: minimali ace ztrát, minimalizace trát časová časo á a finanční náročnost by b měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou → techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod apod.)) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po (p vysolování y nejde j IEC bez GPC)) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Podmínky kolonové separace Kontrola stupně purifikace typ náplně (bobtnání, stabilita, chemická inertnost), parametry kolony, kolony (s rostoucím průměrem a klesající délkou kolony klesá rozlišení, u LPLC vliv difúze na rozmývání zón) zapojení kolon v sérii recyklace vzorku rychlost průtoku (flow rate, s rostoucí rychlostí roste rozmývání zón x čas, stabilita produktu x NK) pracovní tlak, teplota ekvilibrace náplně min. mrtvé objemy objem nanášeného vzorku (flow adaptor) regenerace kolony kolon skladování, konzervace, sterilizace Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 2 parametry – výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty – homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) – ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pI), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS SDS--PAGE a další elektroforetické metodyy 5. Imunochemické metody prvotní průběžná (tzv (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické – frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované – vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované – vysoká cena cena, výzkum – strukturní studie studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ) Koncentrace produktů a jejich konečná úprava zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) – hygroskopický prášek (sole ∆pH, (sole, ∆pH organická rozpouštědla) – denaturace, denaturace fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, (náročné zdlouhavé) SDS--PAGE SDS Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, molekuly dílčích podjednotek (SDS--PAGE, SEC) (SDS • tvar a Mr – ultracentrifugace • izoelektrický bod pI - IEF • spektrální vlastnosti (UV (UV--VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie • analýza primární struktury, sekvence monomerů • peptidové mapování s MS analýzou • rentgenostrukturní analýza • Prokázání identityy reakcí se specifickou Ab imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu Eluo ované pro oteiny Nenav vázané prroteiny Stan ndardy Půvo odní vzorrek Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba h b stanovit t it molekulovou l k l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) metoda pro sledování čistoty produktu – průběžné, konečné citlivost metody – μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, všech i kontaminujících složek široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu nejlépe gradientové gely gelu, detekce kontaminace NML problematická průkaz ů produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy ý y „„bandů“ Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Porozita gelu a Mr separovaných látek Afinitní chromatografie MPC MPC-protein t i A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování 1 2 Iontoměničová Molekulové síto chromatografie (gelová filtrace) 3 4 Afinitní chromatografie 5 serum E1 E2 Mr Purifikace u ace trypsinu t yps u na a koloně o o ě s pp-a aminobenzamidinem obe a d e Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Identifikace antianti-CA I protilátek izolovaných afinitní chromatografií Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) transfer f proteinů i ů z gelu l na membránu bá = Western blot detekce proteinu protilátkou (k (komplexu l primární i á í a sekundární k dá í protilátky) tilátk ) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence W. blot Sekundární protilátky konjugované s enzymem či flfluorescenční č í značkou čk Primární protilátka membrána s navázanými proteiny Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Porovnání Laemmli versus Schäger/von Jagow - separace trypsinů - Tris–Tricine–SDS-PAGE: gel—16,5% T, 3% C ((MW 1–70 kDa), ), detection with silver staining, g, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested g 3 h by y immobilized trypsin, y ((4)) molecular marker (10–250 kDa) Zleva standardy 29, 29 45, 45 66, 66 97, 97 116 a 200 kDa; hovězí trypsin; vepřový trypsin; cytochrom c (12 kDa); standardy, hovězí trypsin; vepřový trypsin; křenová peroxidasa (40 kDa). Proteiny naneseny po 7 mg. mg Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Tris--Tricine Tris Tricine--SDS SDS--PAGEPAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 APP alfa 1-37 1-38 1-39 1-40 1-42 Abeta standards Čísla udávají množství proteinu v mg/band D il í í k l b Detailní snímek gelu barveného 180 minut a odbarvovaného přes noc éh 180 i db éh ř Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio‐Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu Original CSF Eluting fraction Lane 1, 2 and 10: synthetic y Abeta Standard mix 1-37,, 1-38,, 1-39,, 1-40,, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 g fraction IP 1 (1:4 ( Lane 6: Eluting diluted)) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) HA štěpená Hyaluronidázou v čase Z Bílk Z. Bílková á et al., l Proteomics P i 5, 639 – 647, 2005 200 4 SDS-PAGE 5 6 4 7 5 6 25 kDa Eluce pH 3 6 37 kDa Myelinový bazický protein !! (MS analýza) PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. 7 5 4 25 kDa Eluce pH 2,5 25 2 1 PrP Imunoblot 37 kDa 25 kDa a PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr pH 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 mA/1 gel a potom do konce 200 V a 40 mA/1 gel 7 37 kDa b Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-PrPHRP 3F4 (imunoblot). HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie R Reverzní í HPLC Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy – biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 – 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4°C – 37°C HPLC – analytické uspořádání Preparativní Analytické Částice 5 – 10 µm Č 1,8 – 3,5 µm • Částice Kolona 30,0 – 21,2 mm x 250 mm • Kolona 2,5 – 4,6 mm x 150 – 250 mm (semiprep. 7,8 mm) • Průtoky 10ky µl/min Průtoky 10tky ml/min Obj vzorku k µll • Objem Objem vzorku ml • Kapacita kolony - µg Kapacita kolony – mg • Předkolona Recyklace vzorku • Monolitické kolony Sériové řazení kolon • Kapilární kolony Předkolona • Nano-HPLC Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiályy - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. – částice 5 – 10 µm, menší stupeň hydratace (10 ( – 20%) %) Separace x eluce – pH a iontová síla mob. fáze Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. RP--HPLC RP RP--HPLC RP Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, podmínk kdy kd nedochází nedochá í k denaturaci denat raci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci – endcapping, endcapping omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB – pH 2 – 12 Zirkoniové – výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 – 8 µm (lze až 40 µm) Velikost p pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Detekce UV-VIS (205 nm, nm 215 nm, nm 252 nm, nm 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze – pro silně hydrofobní – C4, C5 pro hydrofilní peptidy – C8, C8 C18 Organický modifikátor – acetonitril, metanol, isopropanol (gradient) Příklady Alternativní stacionární fáze f – monolitické kolony, kapilární kolony – 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min Purifikace biopolymerů Shrnutí……. Shrnutí Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: Nároky na čistotu: Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu terapeutické účely (> (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 – 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 – 90%) ultračisté lt či té analytické l ti ké standardy t d d (95 – 99%) Počet purifikačních kroků: minimali ace ztrát, minimalizace trát časová časo á a finanční náročnost b by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Volba separační metody (výtěžek časová náročnost, (výtěžek, náročnost nabohacení nabohacení)) srážení, vysolování – na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká ((> 1mg/ml) g ) IEC – separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), optimalizace ti li podmínek d í k separace, kkapacita it kkolon l přiměřená, ři ěř á relativně l ti ě levná GPC - separace p látek podle p Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné p fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC – metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 – 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) – vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou → techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr (Mr,, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Praktické příklady Sledování průběhu separace Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie g ((eluce vysokou y iontovou silou)) chromatografie s hydrofóbní interakcí Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 100 1 - 100 % Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů) HIC 50 99 1 1.99 99 1 1.99 99 99 % IEX 25 75 3 3.0 75 % NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, dialýza ultrafiltrace) Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Kontrola stupně purifikace prvotní průběžná (tzv (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické – frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované – vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované – vysoká cena cena, výzkum – strukturní studie studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ) Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 2 parametry – výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty – homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) – ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pI), pozor na proteázy Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS SDS--PAGE a další elektroforetické metodyy 5. Imunochemické metody Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, molekuly dílčích podjednotek (SDS(SDS-PAGE, SEC) • tvar a Mr – ultracentrifugace • izoelektrický bod pI - IEF • spektrální vlastnosti (UV(UV-VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie • analýza primární struktury, sekvence monomerů • peptidové mapování s MS analýzou • rentgenostrukturní analýza • Zakoncentrování produktů a jejich konečná úprava zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) – hygroskopický prášek (sole ∆pH, (sole, ∆pH organická rozpouštědla) – denaturace, denaturace fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, (náročné zdlouhavé) Elektromigrační g metody y Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Princip elektroforézy Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů ((složek směsi)) ve stejnosměrném j ((homogenním) g ) elektrickém poli. Pohyblivost P h bli t separovaných ý h iiontů tů závisí á i í také t ké na: použitém elektrolytu (kapalné fázi) chemické vlastnosti a porozita nosiče Většinu biologicky zajímavých látek lze ve vodném prostředí převést ř é t na elektricky l kt i k nabité bité čá částice částice. ti . Metodika: Metodika: disociace disociace, změna pH pH, adsorpce iontů jiného druhu, chemickou vazbou - tvorbou tzv. ionogenních komplexů. Jevy doprovázející elektroforézu Elektroendoosmóza Produkce Jouleova tepla S rostoucím napětím (Ohm Ohmův ův zákon) roste elektrický proud proud:: I = U/R U/R.. práci,, energie Pokud el. el. proud nekoná mechanickou nebo chemickou práci • na vnitřním povrchu kapiláry v místě styku s vodivým roztokem vzniká elektrická dvojvrstva přeměňuje j na teplo teplo: p : Jouleovo se bez užitku p • p pevná část ((stěna kapiláry) p y) je j nabitá nepohyblivým plošným záporným elektrickým nábojem teplo p Chlazení g gelů u vysokonapěťové y p – voda, termostat, led elektroforézy y Elektroendoosmóza Uplatňuje u kapilární elektroforézy elektroforézy.. Stěny kapilár jsou vyrobeny z kkremičitého ičitéh skla kl a vlivem li di disociace i silanolových il l ý h skupin k i mají jí záporný á ý náboj. náboj. K záporným nábojům se váží pozitivně nabité ionty (“counterions ((“ counterions”), counterions ”), ), vytváří stacionární vrstvu (Sternova) Sternova). V následující vrstvě jsou však tyto ionty již mobilní (Guy(Guy-Chapmanova vrstva) vrstva). • z kapalné části se kladné ionty připojí ke stěně kapiláry (dvojvrtva), ionty se pohybují k anodě • pohyblivá vrstvička se žene kapilárou a strhne t h sebou b celý lý průřez ůř kapaliny k li v kapiláře • roztok putuje kapilárou celý najednou (u elektroforézy putují jen ionty). Typy elektroseparačních metod Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Isoelektrická fokusace p elektroforéza Kapilární Vertikální x Horizontální 1D nebo 2D rozměrná Nativní x Denaturační podmínky Analytická x Preparativní Zónová elektroforéza - Elektroforéza na nosiči provádí se na hydrofilních porézních nosičích, nerozpustných ve vodě, s minimální i i ál í adsorpční d č í schopností, h tí zabraňuje b ň j zpětnému ět é mísení í í rozdělených složek Nosiče P í Papírová á elektroforéza l kt f é – nosičem ič elektrolytu l kt l t jje chromatografický h t fi ký papír í – analýza bílkovin; dělení nízkomolekulárních látek, aminokyselin Elektroforéza na tenké vrstvě – nosičem elektrolytu (H2O + pufr) je vrstva silikagelu nebo škrobu na skleněné podložce. Gelová elektroforéza – agar, agaróza, agaróza, PAAG, porozita gelu gradient porozity gradient pH Provedení: Gelová elektroforéza Aparatury pro trubičkové gely horizontální vertikální plošné, v trubičkách, vertikální , horizontální Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Kombinovaná elektroforéza dělení je využito (kromě.el.náboje) ještě dalších odlišností – např. velikosti a molární hmotnosti iontů iontů. Nosičem elektrolytu je obvykle gel (porozita SDS-PAGE elektroforéza – dělení látek podle Mr gelu) př. SDS(zvýšení účinnosti separace, citlivosti detekce) Použití 1. pro účely analytické i preparativní (méně) 2 k separaci velkých molekul (proteiny nebo NK) 2. 3. k separaci menších molekul (cukry, peptidy nukleotidy) 2D elektroforéza – kombinace izoleektrické fokuzace s gelovou chromatografií Elektrochromatografie – dvourozměrná – jeden směr chromatografie, druhý směr elektroforéza, Elektrodialýza, Elektroultrafiltrace, Elektroultrafiltrace Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1. 2 2. 3. 4. Celkový povrchový náboj separované látky Velikost a tvar molekuly Porosita gelu pH a složení elektrolytu Elektrodesorpce – eluce složek afinitní chromatografie elektrickým polem. Blotting (Western blotting, Immunoblotting) Dva hlavní typy PAAG elektroforézy Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza • Probíhá bez denaturačních činidel. • Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru a podle velikosti pórů v gelu. gelu Proteiny jsou tepelně denaturov denaturová ány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulf sulfá át sodný (SDS) (SDS)-- zachována je tak pouze jejich primární struktura (var 2 – 3 min.) Denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí závisí pouze na jejich molekulové l k l é hmotnosti h t ti SDS gelová elektroforéza • Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a βmerkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby). • Pohyblivost P h bli závisí á i í na molekulové l k l é hmotnosti h i polypeptidových l id ý h řetězců ř ě ů (Mr) Mr) • Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů. • • Akrylamid rylamidový ový gel gel:: pevná a inertní matrix ide deá ální pro separaci protein proteinů ů Menší velikost pórů než u agarosy agarosy Aniontový detergent, detergent, solubilizuje solubilizuje a denatur denaturuje uje protein proteinyy Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru poměru, asi 1 1,4 4g SDS/g proteinu PAA gelová elektroforéza - PAGE Gel z polymerovaného akrylamidu Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). Laemmliho diskontinuální systém Používá se dvou gelů tzv. zaostřovacího („stacking“) gelu nahoře a separačního („running („running“)) gelu dole. Liší se hodnoty pH 6, 8 a 8, 3 elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů. Mobilita separovaných proteinů mezi a) mobilitou iontu ve stacking gelu Cl--, tzv. leading ion = vedoucí Cl Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. b) mobilitou iontu v katodovém pufru (glycin, pK 9.6, tzv. trailing ion = zakončující). Ionty i proteiny migrují do zaostřovacího gelu (5%) koncentrují se do velmi úzké zóny Co obsahuje vzorkový pufr pro SDSSDS-PAGE? Tris pufr utváří vhodné pH Barvení proteinových gelů SDS (dodecyl sulf sulfá át sodný sodný)) detergent poskytující proteinům negativní náboj Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení Bromophenol Blue Blue““ barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu) 2-ME (DTT) stříbrem Coomassie blue Fluorescenční luorescenční barviva RI Specifické barvení pro fosfo--, glykofosfo glyko- Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Molekulová hmotnost proteinů Gel – 10%, Mr marker pozice 5 velikost měřena v daltonech (Da) či kilodalton kilodaltonech ech (kDa) D Dalton lt = jednotka j d tk atomové t é hmotnosti h t ti =p přibližně se rovná hmotnosti atomu H (1,66 x 10 -24 g) = definován d fi á ttaké ké jjako k 1/16 h hmotnosti t ti atomu t O Průměrná amino aminokyselina kyselina = 110 Da Průměrný nu nukkleotidový leotidový pár = 649 Da Nanesení vzorku Separace látek podle jejich Mr Určování molekulové hmotnosti proteinů Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě Porozita gelu a Mr separovaných látek PAGE elektroforézy - modifikace PAGE elektroforéza – preparativní verze 1) Nativní (různé pH, pufry – Tris, MES, MOPS, HEPES) 2) SDS-PAGE – tris/tricine– pro proteiny menší než 14 kDa (urea) 3) SDS-PAGE – tris/borát/EDTA – elektroforéza pro gp, SDS se neváže áž na cukerné k é složky l žk 4) Afinoforéza – polymer modifikovaný látkou vykazující afinitu k jedné ze separovaných složek (např. lektinová, chelatační) 5)) Imunoelektroforéza, I l k f é IImunofixace fi Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Izoelektrická fokuzace Izoelektrická fokuzace Isoelektická fokusace se provádí buď v trubičkách nebo v plochých p ý gelech,, stripech. g stripech p . Hotové IEF g gely y s amfolyty yy nebo immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro auomatizovanou IEF IEF.. Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně straně.. Denaturující podmínky při IEF - 9 M močovina nebo neionogenní g detergenty g y ((Triton X-100 100)). Využití:: stanovení pI, kontrola homogenity, isoenzymy Využití Preparativní IEF Provádí se v chlazených vertikálních skleněných kolonách kolonách,, které jsou naplněny roztokem amfolytů - stabilizováno gradientem sacharosy (viz centrifugace), Ficol Ficol,, Perkol Perkol.. Na konci separace se kolona vypustí do zkumavek ve sběrači frakcí frakcí.. Zařízení Rotofor (Bio (Bio--Rad) membranový b ý systém té zón ó brání bá í smísení separovaných vzorků Separace izoenzymů ( ∆pI pI)) Dvojrozměrná j ((2D)) elektroforéza p proteinů 2D gelová elektroforéza Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu, vypracováno O´Farrellem O Farrellem v 70. letech. , Umožňuje rozlišení až 10 000 proteinů. Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů P t i jsou Proteiny j rozprostřeny tř na ploše l š Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pI v gradientu pH pH. Po separaci v prvním rozměru je provedena elektroforéza v gelu. Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separace izoforem ( ∆pI pI)) Blotting proteinů a nukleových kyselin blotting (angl. blot = skvrna, kaňka, česky přenos) pásy separované látky (např. SDS-PAGE) se přenášejí elektroforézou na membránu (NC, PVDF), kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. vazbou DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979) 1. fáze: fáze: klasická SDS SDS--PAGE (separace podle Mr Mr)) 2. fáze fáze:: blotování působením elektrického p p proudu dojde j kp přeblotování p proteinů z g gelu do membrány 3. fáze fáze:: vyvíjení vizualizace přenesených proteinů, nespecifické nebo specifické barvení Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Rozdělení metod blottingu podle provedení Sestava při blotování Difúzní blotting - prostá difúze v tanku s přenosovým pufrem, dlouhá doba 36-48 hodin, velkou nevýhodou ý difuze do stran - zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - celá jednotka je zatížena, suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatně rychlejší (30 min). Výhodou též ostřejší pásy (potlačení difuze). difuze) Elektroblotting - nejrychlejší a nejúčinnější metoda. Hnací silou je v tomto případě ří dě síla íl elektrického l k i kéh pole. l Podle P dl provedení d í se rozlišuje liš j tzv. „tankový (tank, wet)“ blotting a „polosuchý (semi-dry)“ blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) transfer f proteinů i ů z gelu l na membránu bá = Western blot detekce proteinu protilátkou (k (komplexu l primární i á í a sekundární k dá í protilátky) tilátk ) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence W. blot Primární protilátka membrána s navázanými proteiny Sekundární protilátky konjugované s enzymem, fluor. fl značkou, čk ale l i koloidním zlatem, zlatem, radioaktivně,, radioaktivně luminiscenčně. luminiscenčně. Detekce glykoproteinů Schiffovou reakcí,, alcianovou modří,, vazbou lektinů lektinů.. Elektroblotting SDS--PAGE – široké uplatnění SDS Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. p detekce kontaminace NML problematická průkaz produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace ((denzitometricky) y) omezená Eluo ované pro oteiny Nenav vázané prroteiny porozitu g gelu,, široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou p nejlépe gradientové gely Stan ndardy citlivost metody – μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek x imunoblott (identifikace) Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba h b stanovit t it molekulovou l k l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Půvo odní vzorrek Sledování čistoty proteinů čistota produktu – průběžné, konečné monitorování Prokázání identity y reakcí se specifickou Ab imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu možnost následné MS analýzy „bandů“ Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování 1 2 Iontoměničová Molekulové síto chromatografie (gelová filtrace) 3 4 Afinitní chromatografie 5 Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC MPC-protein t i A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr serum E1 E2 Mr Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Purifikace u ace trypsinu t yps u na a koloně o o ě s pp-a aminobenzamidinem obe a d e Identifikace antianti-CA I protilátek izolovaných afinitní chromatografií Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Tris Tricine SDS PAGE Tris–Tricine–SDS-PAGE: gel—16,5% T, 3% C (MW 1–70 kDa), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecular molec lar marker (10–250 (10 250 kDa) Čísla udávají množství proteinu v mg/band D il í í k l b Detailní snímek gelu barveného 180 minut a odbarvovaného přes noc éh 180 i db éh ř Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio‐Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm TrisTris-Tricine Tricine--SDS SDS--PAGE PAGE--urea pro Abeta peptidy + blotting M1 1 2 3 4 5 6 7 Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu 8 9 10 4 APP alfa SDS-PAGE 5 6 4 7 5 6 7 37 kDa 25 kDa Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. 1-37 1-38 1-39 1-40 1-42 37 kDa Myelinový bazický protein !! (MS analýza) PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. 25 kDa Eluce pH 3 7 Abeta standards Original CSF Eluting fraction 5 4 Eluce pH 2,5 25 2 1 PrP Imunoblot 37 kDa 25 kDa Lane 1, 2 and 10: synthetic y Abeta Standard mix 1-37,, 1-38,, 1-39,, 1-40,, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 g fraction IP 1 ((1:4 diluted)) Lane 6: Eluting Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) HA štěpená Hyaluronidázou v čase 6 a b Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-PrPHRP 3F4 (imunoblot). HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr pH 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 mA/1 gel a potom 200 V a 40 mA/1 gel Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie RP HPLC RP-HPLC Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. HPLC – analytické uspořádání Preparativní Analytické Částice 5 – 10 µm Č 1,8 – 3,5 µm • Částice Kolona 30,0 – 21,2 mm x 250 mm • Kolona 2,5 – 4,6 mm x 150 – 250 mm (semiprep. 7,8 mm) • Průtoky 10ky µl/min Průtoky 10tky ml/min Obj vzorku k µll • Objem Objem vzorku ml • Kapacita kolony - µg Kapacita kolony – mg • Předkolona Recyklace vzorku • Monolitické kolony Sériové řazení kolon • Kapilární kolony Předkolona • Nano-HPLC Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy – biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 – 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4°C – 37°C Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) A Anal. l uspoř. ř – částice čá ti 5 – 10 µm, menší ší stupeň t ň hydratace h d t (10 – 20%) Separace x eluce – pH a iontová síla mob. fáze Kombinace SEC (IEC) + ELFA RP--HPLC RP RP--HPLC RP Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Průtoky do 1 ml/min Teplota Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. g modifikovaný ý různě dlouhými ý alkylovými y ý řetězci – Silikagel endcapping, omezená chemická stabilita! Stacionární fáze – p pro silně hydrofobní y – C4,, C5 pro hydrofilní peptidy – C8, C18 y kolony y PS-DVB – p pH 2 – 12 Polymerní Organický g ý modifikátor – acetonitril,, metanol,, isopropanol p p (gradient) Zirkoniové – výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 – 8 µ µm ((lze až 40 µ µm)) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Alternativní stacionární fáze – monolitické kolony, kapilární kolony – 150 x 0 0,32 32 mm; průměr 3 3,5 5 µm, µm průtok 3 µl/min Výsledek purifikace Identifikace proteinů Březen 2011 Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Identifikace proteinů v proteomice „Fingerprint“ A) Molekulovou hmotnost a identifikace analytu Proteinové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra B)) Identifikace – tzv. sekvenční analýza ý Peptidové mapy 2D elektroforeogramy elektroforeogramy, HPLC spektra spektra, CZE spektra, MS spektra ELFO (Imunoblot) + MS (MALDI TOF, ESI TOF) 1. Edmanovou degradací (přímé sekvencování) 2. Hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, „de novo“ sekvencování) DIGE + Informační databáze Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků – „otisky prstů“ ů“ pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Diferenční 2D elektroforéza Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS. Edmanovo odbourávání množství vzorku min min.. 20 20--50 pmol pmol, opt. 200 pmol konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS) Podmínkou je volný N-konec peptidu či proteinu. proteinu Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, acetylace, pyroglutamová kyselina kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Automatizace Edmanovo odbourávání možné získat 30 - 40 aminokyselin z N-konce, N konce samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba imobilizován. nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí 3030-60 min. min Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin y a tzv. p prázdný ý run. Po odštěpení PTC PTC--derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně)) s detekcí při 270 nm. Hmotnostní spektrometrie (MS) Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m (m) a náboje (z (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální y veličinou jje p podíl hmoty y a náboje j ((m/z), ) při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností 10-4. techniky ionizace (ESI, MALDI) - lze měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). l h id ) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších biobiomakromolekul (oligonukleotidy oligonukleotidy, g y, sacharidy, y lipidy). lipidy) p y). Vzorek na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici t i i (kokrystalizace). (k k t li ) Používá P ží á se např. ř kyselina k li nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová. Destička se vloží do přístroje, j zacílí se laserový ý paprsek („ („fire fire“) “), transfer energie způsobí ionizaci. SELDI – surface enhanced laser desorption desorption//ionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost hl t selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení MS je často propojena s jinými analytickými technikami technikami: GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS (Interphase) Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i více analyzátorů („multiple ( multiple“ MS). MS) 1) Výběr studované látky ze směsi 2) Fragmentace 3) Analýza fragmentů Kombinace s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením - on-line analýza (x offline detekce). detekce) Klíčové je propojení přístrojů. přístrojů LC-MS LC MS v biochemii pro peptidy a proteiny. Spřažení - ESI x MALDI Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu 2 5 kD 2,5 protein II (16 kD) 3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD) vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava (redukce) (alkylace) štěpení proteasou vzorku proč redukce a alkylace? rozvolnění l ě í S-S S S vazeb b 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) m/z UVabs Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. 4. MS/MS spektrum d lší další fragmentace trypsin denaturace > lepší proteolýza ochrana oxidovaných reziduí Cys agresivní proteasa vysoká ká primární i á í specificita, ifi it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa štěpí: arginyl-X, lysyl-X; ale ne X=prolyl Time (min) m/z 5 Určení části sekvence .. M G A D D H D K L .. 5. DTT, dithiothreitol KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) – detergenty d (SDS (SDS, T Triton i atp.)) IAA, jódoctová kys. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting” Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS štěpení p p proteázou ((trypsinem) yp ) protein I (12 kD) DNA (i EST), proteinová databáze 2 fragmenty (4 kD, 8 kD) protein II (16 kD) 3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD) generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových i ý h sekvencí k í MALDI ToF protein I 4000 8000 m/z 8000 m/z protein a: 3 3, 5, 5 9, 9 12 kD protein b: 2, 7, 9 kD protein c: 4, 8 kD protein d: 3, 9, 12 kD protein e: 2, 6, 8 kD protein II 2000 6000 Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy masses (m/z) 940.421 - ELSDIAR 1093.477 - QLLLTADDR 1341.556 - PHSHPALTPEQK 1469.633 - PHSHPALTPEQKK 1488.645 - GILAADESTGSIAKR 1646.650 - LQSIGTENTEWENRR 2122 975 - IGENHTPSALAIMENANVLAR 2122.975 2241.903 - YTPSGQAGAAASESLFISNHAY Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. SEC + Q TOF MASS Bioinformatika pro MS Charakterizace ko ko-- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace organismy o ga s y se se sekvenovaným e o a ý ge genomem o e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (i silico (in ili digest) di t) s experimentálními i tál í i PC programy p g y MASCOT ((firma SEQUEST, ProteinProspector Matrixscience Matrixscience), ), organismy s nesekvenovaným ne genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí Charakterizace koko- a p posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS Význam: důležité Vý důl žité pro regulaci l i buněčné b ěč é distribuce di t ib a modulaci d l i funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, funkční strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS (FT ICR MS) analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti itli ti a rozlišení. liš í Protokol pro analýzu proteinové modifikace 1) štěpením vzorku 2) enzymové modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v Mr určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra spektra.. Děkuji za pozornost Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Zuzana Bilkova@upce cz [email protected] Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Metody izolace a purifikace produktů obrazová příloha Škola molekulárních biotechnologií Profession, Ol Olomouc, březen bř 2011 Bílková Zuzana Zdroje proteinů, polysacharidů a jiných …. mikroorganismy (bakterie, kvasinky, plísně, řasy) živočišné tkáně (myši, (myši krysy, krysy králíci, králíci jateční zvířata orgány, krev, člověk – tělní tekutiny (krev plasmin plasmin,, thrombin, thrombin, specifické protilátky ...;; moč urokinasa ...) rostlinná pletiva tělní tekutinyy savců Cíl izolace Získání biopolymeru (proteiny, polysacharidy glykoproteiny….) polysacharidy, glykoproteiny ) definované čistoty Zachování biologické aktivity Získat p produkt o patřičné p čistotě s vynaložením y přiměřeného (optimálního) úsilí a přiměřeného množství peněz Výchozí materiál - úskalí Komplexnost biologické matrice ( elké množství (velké množst í doprovodných dopro odných bílkovin bílko in a jiných látek) Malá množství cílového produktu Labilita biologické aktivity produktu Strukturní S labilita Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace Zásady pro práci s biologickým materiálem 1. Pokud možno zpracovat co nejdříve 2. V případě potřeby zmrazit (– (– 20;C, – 80 oC) 3. Rozmražování – co nejrychleji jy j x postupně p p zvyšovat y teplotu? Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separační metody y A. Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, ultrafiltrace centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti p proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě povrchového náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie) 4 4. Nízká teplota při izolaci 5. Vhodné pH + iontová síla 6. Vhodná koncentrace bílkoviny 7. Zabránit pěnění p 8. Omezení proteolytické aktivity (směs inhibitorů) 9 9. Přídavek Příd k specifických ifi ký h lát látek k ((např. ř ME ME, EDTA ...)) Separační metody Centrifugace a ultracentrifugace Membránové separace (ultrafiltrace, dialýza) Selektivní precipitace Iontově výměnná chromatografie (IEC) Chromatografie na molekulových sítech (SEC) Hydrofóbní y chromatografie g (HIC) ( ) Afinitní chromatografie (AC, IAC, HPIAC) Preparativní elektromigrační techniky Selektivní precipitace Separace založené na rozdílné rozpustnosti proteinů Rozpustnost proteinu prudce stoupá, p p , jjeje-li v roztoku o pH nižším nebo v pH vyšším než pI proteinu i (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se) se). 1) rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje pH 2) při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj 3) protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v proteinu) t i ) 4) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI pI.. pH roztoku je nižší pI náboj proteinu + Frakcionovaná precipitace - vysolování pH roztoku je vyšší náboj proteinu - Precipitace Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) Bílkoviny aktivní v nativním stavu, srážením ke změnám konformace molekuly (porušení fyz fyz..-chem.vlastností chem chem.vlastností), vlastností)), musí vlastností) biol.. aktivita zajištěna návratem do fyziol biol fyziol.. Podmínek Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť Nezaměňovat s denaturací - Ireverzibilní precipitace –– sole těžkých ý kovů,, koncentrované minerální kyseliny, y y, orga orgag nické kyseliny, teplo Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok rozpustn nost Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Selektivní precipitace vysolování vsolování Molekuly M l k l proteinu t i koagulují k l jí (agregují) díky hydrofóbním interakcím I Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %). Látky používané pro separaci bílkovin – EtOH EtOH,, NaCl, NaCl, ((NH4)2SO4 - rozpustnost se málo mění s teplotou, saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3), levný, čistý Filtrace nahrazena centrifugací Srážení organickými polymery a sloučeninami Srážení organickými rozpouštědly Kompletně mísitelné s vodou Musí mít dobrý precipitační efekt Srážení za nízké teploty (< 0 °C) C)!!! !!! X denaturace proteinu Princip identický jako srážení s org. org. rozpouštědly DEAE d dextran, t PEG PEG, Polyakrylová P l k l á kyselina k li Rivanol (2 (2--ethoxyethoxy-6,9 6,9--diaminoakridinlaktát) Kaprylová kyselina EtOH EtOH,, aceton, MetOH, MetOH, propanol, dioxan 1) etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda) 2)) sníží se stupeň p ionizace a zvýší ý p přitažlivé síly y mezi opačnými p ý náboji, tím se sníží rozpustnost. Přídavky Příd k některých ěkt ý h látek lát k (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza Při této metodě denaturujeme a souč souč.. precipitujeme y cílová bílkovina ((enzym) y ) musí zůstat z balastní bílkoviny, 85 - 90 % v nativním stavu. Denaturační vlivy – T, pH, org org.. rozpouštědla Kapalinová chromatografie v nízkotlakém uspořádání Tepelná denaturace % Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Srážení selektivní denaturací Low pressure liquid chromatography LPLC 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Bílkovina 1 Bílkovina 2 Nízkotlaká (LPLC), střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie Kolonová (CC), na tenké vrstvě (TLC), na papíře (PC), vsádková (batch-wise) teplota Preparativní p účely y ….. Gelová chromatografie Ionexová chromatografie g Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Chromatografické metody – základní charakteristika Distribuce složek mezi dvěma fázemi mobilní a stacionární fáze M Mobilní bil í fá fáze kapalina k li (k (kapalinová li á chromatografie); h t fi ) plyn l (plynová chromatorafie) chromatorafie) Stacionární fáze částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na částicích částicích, kapalina v pórech chrom chrom. nosiče nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní Instrumentace pro LPLC Pumpa – peristaltická nebo gravitace Gradient – směšovač mob. fází Podmínky separace – izokratické izokratické,, gradientové přímo p pumpou p na kolonu Dávkování – p Kolony – skleněné, plastové, kovové (nerezové) Detekce – spektrofotometrická 254, 254 280 nm nm,, …nm …nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný Terminologie Eluční objem Mrtvý objem Retenční poměr Kapacitní poměr Účinnost kolony y (teoretické patro) Rozlišení elučních křivek (selektivita, kapacitní poměr, účinnost) ……… Chromatografická sestava pro preparativní účely KOLONY HighHigh-through put system …… MIKROKOLONY Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. KOLONA pro prep prep.. uspořádání Částice sorbentu Vzorový chromatogram pro LPLC Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. TVARY CHROMATOGRAFICKÝCH PÍKů Iontově výměnná chromatografie Založena na silných elektrostatických silách mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče a ionty látek v okolním roztoku (analyt, i t solí ionty lí apod.) d) Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný p ý náboj,j, afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli pH prostředí, mobilní fáze! Celulosové a dextranové nosiče Ionexová chromatografie eluce prtoeinů vysokou iontovou silou Katexy – záporný náboj vazba kationtů ), sulfopropyl sulfopropyl(SP) p py ((SP)) OSO3 OSO3-silné – sulfo ((S), slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO COO-Anexy – kladný náboj vazba aniontů slab sl abé é – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE) Stacionární fáze organické polymery, materiály na bázi silikagelu Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny pH < pI bílkovina nese kladný náboj separace na katexu pH > pI bílkovina nese záporný náboj separace na anexu pH = pI celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii nebo tzv. negativní izolaci (např. IgG ze séra) Ionexová chromatografie Typická Typic ká ionex ionexová ová chromatografie Nanášení vzorku – nízká iontová síla Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH retenci lze ovlivnit i teplotou p nebo přídavkem p org org. g. modifikátoru Praktické využití purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru, separace látek s podobnou iontovou povahou (silné i slabé elektrolyty) separace neiontových látek Typická Typic ká IEC Loading ends, Low salt wash begins 1M Salt gradient 0 Protein absorbance II Loading starts Peak of unbound protein Salt gradient begins III Salt gradient ends I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins Gelová permeační chromatografie Gelová filtrační chromatografie Molekulová vylučovací chromatografie Chromatografie g na molekulových ý sítech SEC – size exclusion chromatography Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Částice sorbentu Gelová permeační chromatografie Optimální gel pro gelovou filtraci Inertní matrice gelu - chemicky stabilní při různém pH, T Pořadí eluce : největší> největší >střední střední> >nejmenší molekula Jev stérického vyloučení (exkluze) větších molekul, molekul malé molemolekuly pronikají do nitra částic gelu (permeace permeace)) a zpožďují se. Ke skutečné rovnováze mezi koncentrací látek vně a uvnitř částic nedochází. Mechanicky stabilní gel (deformace při tlaku) Velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je rychlejší ale může být nepřesné) rychlejší, nepřesné). Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny. Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny. Určení Mr z kalibrační křivky Odsolování (rychlejší alternativa k dialýze) Záznam průběhu odsolování Jednotlivé frakce proteinů se detekují spektrofotometrem. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Rychlost průtoku proteinu je přímo úměrná velikosti molekuly Rozlišení elučních křivek lze ovlivnit pouze účinností a správnou p volbou molekulového síta Parametry kolony DEXTRANOVÉ GELY Objem vzorku < 2 % objemu kolony!!! Sephadex G-10, G-15 pro odsolování peptidů, AMK) Sephadex G G-25, 25 G-50 G 50 pro odsolování proteinů Sephadex G-75 až G-200 separace proteinů podle Mr do 600 kDa Celkovýý objem j kolonyy VT = VM + Vs – VGM VGM - objem gelové matrice VM - mrtvý objem (aplikace inertní látky na kolonu, Blue dextran 2MDa) objem, 2MDa), objem co zaujímá mobilní fáze (VM = MR pro inert) VS - objem stacionární fáze Kav = (VR + VM) / Vs Kav ~ Kd distribuční koeficient VR – retenční objem (eluční objem) Exclusion limit Exclusion volume Matrice hydroxypropylované – LH -20 pro separaci TG, MK, Stab objem v prostředí ethanolu, Stab. ethanolu chloroformu Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. AGAROSOVÉ GELY Přečištěný agar (zbaven polysacharidů) Zesíťování 2 2,3 2,33-dibrompropanolem, dibrompropanolem epichlorhydrinem CL (cross(cross-linked) – stupeň zesíťování S h Sepharose CL CL--2B POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY • kopolymerací akrylamidu s N,NN,N-methylenbisakrylamidu • Bio Bio--Gel PP-2 Využití SEC (GPC) v praxi Skupinová separace (odsolení, odstranění extrakčního činidla, detergentu, NML od ostatních, pro labilní proteiny (x dialýza) Frakcionace (purifikační metoda) rozdělení látek podle Mr Stanovení molekulové hmotnosti U Určení č í di distribuce t ib biopolymerů bi l ů a syntetických t ti ký h polymerů l ů • Bi BioBeads B d S-X1 – na bázi bá i polystyrenu l t ((vhodné h d é pro lilipofilní fil í polymery a velké organické látky v organických rozpouštědlech Analýza a monitorování vazby ligandu na biopolymer Hydrofóbní chromatografie (HIC) Princip separace HIC Hydrophobic interaction chromatography adsorpční chromatografie g (hydrofóbní (hydrofóbní y povrch)) Separace na nepolární (obrácené) fázi ~ RP RP--LC Nosiče pro HIC jsou méně hydrofóbní než pro RPRPLC – lze tak použít jemné eluční podmínky s cílem zachovat biologickou aktivitu separované látky vhodná pro biopolymery - malá selektivita (separace ( látek na základě jejich rozdílné hydrofobicity + dostatečná kapacita • sorpce molekul „zdánlivě“ hydrofilních proteinů na nosič s hydrofóbními p y klastry y • eluce potlačením hydrofóbních interakcí (snížením iontové síly, přídavkem org org.. rozpouštědla, detergentu) • nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné il é vazby) b ) • interakci podporuje vysoká iontová síla mobilní bil í fáze fá Nosiče pro HIC Hydrofobní chromatografie Matrice methakrylátové (silně hydrofóbní) hydrofóbní) Matrice polysacharidové (spíše hydrofilní pro hydrofilní proteiny s hydrofóbními kapsami) Stacionární fáze – - C8, -fenyl y s vysokou y koncentrací solí Mobilní fáze – vodné roztoky (např. 1,7 M (NH4)2SO4) Eluce – snižováním iontové síly Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Phenyl, Octyl, Phenyl, Octyl, Butyl Sepharose Fast Flow (FF) Butyl + Methakrylátová báze HEMA--co HEMA co--EDMA Sepharon HEMA Použití purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným Hydrophobic interaction chromatography of ββ-glucosidase from the digestive juice of the palm on PhenylPhenyl-Sepharose CLCL-6B. Co to je HILIC chromatography chromatography? ? HIC x HILIC Hydrofilní interakční chromatografie (Hydrophilic interaction chromatography) chromatography) pro velmi polární a hydrofilní látky (x RPRP-LC) – polární báze, kyseliny, AMK, peptidy, sacharidy Nízké pracovní tlaky tlaky, vysoké průtoky Dobrá symetrie píků polárních látek Rychlá eluce hydrofóbních komponent Stacionární fáze – velmi polární – silikagel, vázané polární fáze Mobilní fáze – jako v RPRP-LC, voda, pufr, organická rozpouštědla p Retence – čím vyšší obsah organické složky, tím vetší retence Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Afinitní a imunoafinitní chromatografie Afinitní chromatografie - princip Využití schopnosti biologicky aktivních látek specifick rozpoznat specificky ro po nat jinou jino molekulu molek l látky látk mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické) Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce (nekovalentní vazby) AC,, IAC Affinity Chromatography Immunoaffinity Chromatography Látka navázaná na nosič afinitní ligand Vazba ligandu přes raménko (spacer) Afinitní páry Reverzibilní biospecifická interakce enzym substrát kompetitivní inhibitor koenzym protilátka antigen hapten lektin Glykoproteiny, oligo(poly)sacharidy histony DNA DNA Kompl. p NA buněčný povrchový receptor, léčivo hormon Předpoklady pro vznik biospecifického komplexu Princip afinitní chromatografie Sterické (spacer) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Vazebné (optimální pH, iontová síla) Konformační Princip imunoafinitní chromatografie (IAC, HPIAC) Eluční techniky Eluce = disociace komplexu ligandligand-cílová látka, při ideální eluci by se měli cílové molekuly úplně uvolnit z afinitního ligandu elučním pufrem Způsoby eluce: 1) eluce náhradou ligandu volným ligandem nebo jeho analogem 2)) eluce kompeticí p cílové molekuly y s jjejím j analogem g 3) eluce změnou pH (kroková či lineární gradientová eluce) 4) eluce změnou iontové síly 5) eluce přídavkem chaotropního iontu, detergentu (např. y amonný, ý, močovina)) thiokyanát Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Desorpce ELUCE Nosiče v afinitní chromatografii Základní vlastnosti nosiče vhodného pro afinitníchromatografii: velký specifický povrch, makroporézní struktura mechanická stabilita chemická stabilita snadno derivatizovatelný povrch snadno přístupný ligandu cchemicky e c y inertní e t po povrch c zabraňující ab a uj c nespecifické espec c é so sorpci pc dobré chromatografické vlastnosti (průtoková rychlost) Typy nosičů: jednosložkové x složené vláknitá struktura x partikule Afinitní chromatografie Nosiče v afinitní chromatografii Dělení nosičů pro afinitní chromatografii: Jednosložkové: A) Organické nosiče: nosiče: celulosa ce u osa (Perloza ( e o a MT)) dextran (Sephadex) agarosa (Sepharosa), aj. Obr. 2: CNBr aktivovaná Sepharose B) Anorganické nosiče: nosiče: křemičité nosiče skleněné nosiče, aj. C) Syntetické nosiče: nosiče: polyakrylamid (Enzacryl) metakrylát (Spheron), aj. Složené: polysacharidpolysacharid-polyakrylamid (Sephacryl HR) magnetické částice (Magnogel) Nosiče v afinitní chromatografii Ligandy a jejich imobilizace Volba nosiče: záleží na typu ligandu, průtokové rychlosti, podmínkách separace, p p , aplikaci p vlastnosti ligandu: 1) specifická a reverzibilní vazba na izolovanou látku 2) přítomnost chemicky modifikovatelné skupiny pro vazbu na nosič Nosič Aplikace Celulosa (vláknitá, (vláknitá granulární) vsádkové uspořádání Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Celulosa (partikule) nízkotlaké kolonové uspořádání Dextran vhodný pro vazbu protein. a lektin. ligandů Agarosa nízko nízko-- až střednětlaké kolonové uspořádání Polyakrylamid nízko nízko-- až střednětlaké kolonové uspořádání Magnetické nosiče vsádkové a „on„on-line“ (MSFB) uspořádání Kř ičité nosiče Křemičité ič vysokoúčinné k úči é chromatografické h t fi ké separace Skleněné nosiče vysokoúčinné chromatografické separace Ligandy a jejich imobilizace Postup imobilizace ligandu: vazba ligandu na nosič musí být pevná => aktivace nosiče před vazbou ligandu Činidla užívaná pro aktivaci nosiče: 1) Kyan bromid (CNBr-act. Sepharose 4B) 2) Oxidace jodistanem 3) Karbodiimid (např. CDI, EDAC)+S-NHS 4) Thiol (Thiol (Thiol-act. act Sepharose 4B) 5) Triazin 6) Epoxy (Epoxy (Epoxy-activated activated Sepharose 6B) 7) Hydrazidem akt. nosič používané ligandy: 1) proteiny (např. enzymy, koenzymy, Ab, Ag, protein A) 2) nukleové kyseliny (DNA i RNA) 3) lektiny (např. Concanavalin A) 4) te textilní tilní bar barviva i a (např (např. Cibacron Bl Blue, e Orange A A, Green A) Orientované imobilizace ligandů – protilátek Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Kovalentní vazba ligandu na COO COO--částice Orientovaná imobilizace ligandu - glykoproteinů Kovalentní vazba ligandu neorientovaně i t ě Protein A (G, L) – dvojí využití HPIAC – high g p pressure immunoaffinityy chromatography g p y Izolace IgG g molekul i jjejich j p podtříd Imobilizace IgG molekul Protein A – Staphylococcus aureus Protein G – rod Streptococcus Protein L – ros Peptostreptoroccus Fibrinogen g in human plasma, using an antifibrinogen immobilized antibody tib d column l Magnetické částice Kolonové uspořádání Macroporous bead cellulose 100 – 250 μm (750 x) ø Alginate acid-coated magnetite particles (-COOH) ø 7 -10 10 μm (zv. ( 4 000 x) ) Vsádkové uspořádání Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Poly(GMA) microparticles 2,9 μm (5 000 x) ø Magnetická separace PolyNIPAM nanoparticles (-COOH) 0,29 μm (electron. microscopy, 50 000 x) MSFB Princip magnetické separace Magnetické mikročástice Magnetické jjako integrální g součást průtokového systému MSFB (magnetically stabilized fluidized bad) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Výhody magnetických nosičů Schematický diagram strategie analýzy p proteinů Vysoká rychlost separace (zkrácení doby reakce, separace, prodloužení životnosti reaktorů) Vysoká reprodukovatelnost reakcí díky nulovým ztrátám nosiče Snadná manipulace a práce se systémem Postup separace šetrný vůči fragilním bílkovinám a bioaktivním látkám ((- centrifugace) Vše probíhá v jednom reakčním prostředí - snižuje se pracnost, riziko kontaminace a inaktivace substrátu Chromatografie na imobilizovaných barvivech Dye-binding chromatografphy Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích Barviva částěčně podobná některým kofaktorům Izolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin apod.) Cibacron Blue 3G pro NAD+ a NADP+ dependentní dehydrogenázy Procion Red HE 3B pro NADP+ dependentní enzymy Chelatační afinitní chromatografie IMAC – immobilized metal affinity chromatography Vzájemná interakce mezi biopolymerem v roztoku a ionty kovů vázanými na pevné fázi Chelatační ligand g – např. p IDA ((iminodiacetát iminodiacetát)) Ionty „měkkých“ kovů – Zn Zn,, Cu, Cu, Ni, Co, Fe, Fe, Mn, Mn, Mg Nosiče – biopolymery ((agarosa agarosa,, sepharosa) sepharosa) Stabilita x reverzibilita (ligand--kov versus ligand (ligand ligand--peptid, protein) Koordinační K di č í vazba b mezii akceptorem elektronů (kovem) a donorem elektr. elektr. (AMK – His, Cys, Cys, Trp – vysoká elektronová hustota R) IMAC pro izolaci rekombinantních proteinů 1 kroková purifikace rekombinantních proteinů obsahujících tzv. tzv histidinovou kotvu (His-tag) Shrnutí……. Shrnutí Interakce kovových iontů (Ni22+) s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Vhodné i pro nekorektní formy rek. Proteinů, tzv. inkluzní j se rozpouštějí p j vysokou y koncentrací močovinyy tělíska,, jež nebo guanidinium chloridu, protože se IMAC dá provádět i za denaturačních podmínek!! Renaturace (refolding) proteinů zachycených na koloně postupným snižováním denaturačního činidla Základní zásady purifikačních kroků Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a vyšším výtěžkem, kapacita méně významná ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku díky ztrátám) Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu, polysacharidu!! Praktické příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie g ((eluce vysokou y iontovou silou)) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů) NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, dialýza ultrafiltrace) Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 100 1 - 100 % HIC 50 99 1 1.99 99 1 1.99 99 99 % IEX 25 75 3 3.0 75 % Membránové separační metody Ultrafiltrace centrifugace a Ultrafiltrace, dialýza Separační p metody y založené na rozdílné velikosti molekul DIALÝZA – odstranění nízkomolekulárních látek Dialyzační střívka Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul (Cut off – limitní Mr) Membránová filrace (ultrafiltrace) rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). y tlaku Probíhá za vyššího Dialýza difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem Propustnost membrány pro rozpuštěné látky Velikost povrchu membrány Pohyb částic < 1000 Da Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Elektrodialýza Filtrace Membránová filtrace ULTRAFILTRACE Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Membránová filtrace (ultrafiltrace) speciální membrány s definovanou velikosti pórů - tzv. tzv cut-off limit Afinitní ultrafiltrace – funkcionalizace povrchu membrán ligandem Membrány Na základě chemického složení rozeznáváme membrány organické (polymerní) a anorganické. Starší generace polymerních membrán byla vyrobena na bázi přírodních polymerů (celulosa a její deriváty) syntetické polymery, např. polysulfon, polyamid, polyetherimid, polyethersulfon, polyvinylidenfluorid, polytetrafluorethylen, l t t fl th l kt é jsou které j chemicky h i k a fyzikálně f ikál ě stabilnější (odolnost vůči organickým rozpouštědlům, pH, teplotě) Poslední generací jsou anorganické (keramické) membrány vyrobené z oxidů hliníku hliníku, zirkonu a titánu titánu, silikátových materiálů, karbidů, zeolitů apod., které vynikají extrémní pevností a odolností Typy membrán a) isotropní membrána – homogenní vrstva b) asymetrická membrána - aktivní vrstva (tloušťka < 1 μm μm)) porézní nosná vrstva (~100 μm μm)) c) kompozitní membrána - aktivní vrstva (tloušťka < 1 μm μm)) porézní vrstva, nosná podložka (100 - 200 μm μm)) selektivita, propustnost ionaktivní membrána, afinitní membrána jednosměrná filtrace, příčný tok zanášení membrány („fouling („fouling““ efekt) chemické nebo fyzikální metody regenerace sterilace, životnost membrány Filtrace – membrány NC 0,45 µm 0,20 µm ≤ 20 kDa 0 0,10 10 µm ≤ 7 kDa kD Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Filtrace – membrány NC Centrifuga – výkyvný a úhlový rotor Ultracentrifugace Frakční centrifugace, ultracentrifugace Centrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných komponent. Při kvantifikaci k tifik i rychlosti hl ti pohybu h b molekul l k l v roztoku t k v centrifugačním t if č í poli li používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice: s = m(1 (1 – f f kde m je hmotnost částice, je parciální specifický objem (reciproká h d t hustoty hodnota h t t částice), čá ti ) je j hustota h t t média, édi f frikční f ikč í k koeficient fi i t (závisí na tvaru molekuly) (1 – ) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg (S); S = 10-13 s. Čím je hodnota S nižší, nižší tím pomaleji částice sedimentuje. sedimentuje Na tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální centrifugace vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich sedimentačních koeficientů. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Rychlostní gradientová centrifugace Rovnovážná centrifugace