Časopis - Beckman Coulter

informační magazín číslo 6 - 2007
BIOMARKERY V TĚLNÍCH TEKUTINÁCH
– JEHLA V KUPCE SENA?
DIAGNOSTICKÝ A PROGNOSTICKÝ
VÝZNAM THYMIDINKINÁZY (TK)
INDIKÁTOROVÉ PROTEINY V MOČI (1)
Současné postavení
imunologie v medicíně
a možnosti dalšího vývoje
Toto číslo našeho časopisu jsme se rozhodli věnovat zejména imunologii, a proto jsme oslovili profesorku MUDr. Jiřinu Bartůňkovou,
DrSc., přednostku Ústavu imunologie 2. lékařské fakulty University
Karlovy a Fakultní nemocnice v Praze Motole, aby nás seznámila se
svými názory na současné postavení imunologie v medicíně a na
možnosti dalšího vývoje tohoto oboru.
Paní profesorko, jak podle vašeho názoru napomáhá
v současné době imunologie ostatním klinickým oborům a pro
který obor očekáváte největší přínos?
Postavení imunologie mezi tradičními lékařskými obory je stále problematické.
Někteří jej považují stále „jen“ za laboratorní obor a skutečně i v některých
evropských zemích tomu tak je. Tyto země včetně USA však vyvíjejí obrovskou
snahu, aby imunologie byla oborem opravdu klinickým, což odráží pokrok
v poznání patogeneze řady chorob. My – myslím tím v České republice – máme
určitý náskok v tom, že díky našim učitelům se podařilo již koncem sedmdesátých let minulého století prosadit klinickou imunologii a alergologii jako skutečně klinický obor. Koncepce tohoto oboru, vycházející z mezinárodního
doporučení IUIS (Mezinárodní unie imunologických společností), a EFIS (Evropská federace imunologických společností) říká, že alergologie a klinická imunologie je interdisciplinárním oborem a je klinickou i laboratorní disciplinou.
Zabývá se studiem, diagnostikou, léčbou a prevencí onemocnění vyvolanými
poruchami imunitních mechanismů nebo patologickými stavy, na jejichž vzniku, průběhu a prognóze se imunologické mechanismy významně podílejí. Jsou
to stavy, kdy imunomodulace tvoří důležitou část terapie a prevence. Nedílnou
součástí oboru je specializovaná laboratorní diagnostika. Laboratorní imunologické vyšetření dává odpověď na některé otázky diagnostické, prognostické
a napomáhá při monitorování aktivity onemocnění, respektive účinnosti nasazené terapie. Tím, že imunitní systém je funkční celek, který zasahuje do každé
části lidského těla, mohou být projevy imunopatologických stavů opravdu
v kterékoliv klasické „orgánové“ lékařské specializaci. Nedá se tedy jednoznačně
říci, pro který obor je imunologie největším přínosem. Zobecnit se do určité
míry dá, že přínos imunologického laboratorního vyšetření spočívá ve všech
oborech medicíny, především ve včasnosti diagnostiky. Laboratorní patologie
totiž může dlouhou dobu předcházet klasickým klinickým projevům onemocnění. Cílené a správně interpretované laboratorní vyšetření napomůže časné
diagnostice imunopatologických stavů, což umožní klinickým imunologům,
alergologům i dalším specialistům, kteří imunologickou laboratorní diagnostiku využívají, přijmout adekvátní léčebná nebo režimová opatření dříve, než
dojde u pacienta k nevratnému poškození orgánů.
Jak se odráží pokrok v technologiích v laboratorní
diagnostice?
Laboratorní diagnostika prošla za posledních třicet let významným technologickým pokrokem. Přístrojové vybavení, automatizace a komerční kvalitní reagencie zkvalitnily diagnostiku. Výpočetní technika pak umožnila jednodušší
analýzu výsledků a přinesla laboratorní informační systémy. Je však třeba přiznat, že špičkové technologie jsou více přínosné pro výzkumnou práci, než pro
zcela rutinní diagnostiku. Automatizace je sice přínosná, ale zejména v imuno-
2
informační magazín číslo 6 - 2007
logickém laboratorním vyšetření je stále celá řada
metod, které jsou „manuální“ a vyžadují zkušenost
laboratorního personálu. Někdy i příliš velká citlivost metodik je na závadu – uvedu například vyšetřování autoprotilátek. Pokud použijeme některou
velmi senzitivní metodu, může se stát, že detekujeme „přirozené“ autoprotilátky, které jsou fyziologickou součástí séra, a můžeme při nesprávné
interpretaci pacientovi přiřknout diagnózu autoimunitního onemocnění.
Některá onemocnění bychom nebyli schopni bez
moderních technologií vůbec diagnostikovat. Opět
mohu uvést příklad z klinické imunologie – vzácná
imunodeficience, deficit membránových adhezivních molekul LAD (absence molekuly CD18) by
nešla bez průtokové cytometrie diagnostikovat,
stejně tak jako některé další vrozené imunodeficience. Podobně bez technologie průtokové cytometrie se neobejde typizace leukémií a diagnostika
POKRAČOVÁNÍ NA STRANĚ 4
Obsah
Naše praktické zkušenosti s detekcí
autoprotilátek imunofluorescencí
5
Ještě jednou ANCA ...
tentokrát z metodického hlediska
6
Tématu stanovení autoprotiátek proti cytoplasmě neutrofilních leukocytů
(ANCA) jsme se v našem časopise věnovali na jaře 2006. Od té doby máme
k dispozici několik dalších, doufáme, že užitečných, informací.
ASP 1200TM nově v České a Slovenské republice
7
Prostřednictvím naší společnosti uvádí britská společnost The Binding Site na
náš a slovenský trh automat na zpracování substrátových skel pro stanovení
autoprotilátek nepřímou fluorescenční mikroskopií.
Nové monoklonální protilátky
pro průtokovou cytometrii
8
Konjugované protilátky řady IOTest® jsou univerzální reagencie pro
průtokovou cytometrii určené pro všechny typy průtokových cytometrů.
Časopis vydává a distribuuje
IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10
Časopis připravují
Mgr. Jiří Moos, CSc.
Mgr. Pavel Kružík
Mgr. Patrik Šaf
RNDr. Helena Kurzweilová
RNDr. Běla Říčařová, CSc.
Ing. Petr Suchan
Mgr. Markéta Krupařová
Ing. Roman Šandrik, PhD.
Ing. Kateřina Ťuková
Ing. Lukáš Palivec, PhD.
Do časopisu přispěli
Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc.,
2. LF UK a FN Motol
RNDr. Běla Říčařová, CSc.
Mgr. Pavel Kružík
RNDr. Marcela Jarešová, IKEM
Mgr. Jiří Moos, CSc.
Ing. Roman Vlček
RNDr. Mária Knapková,
NsP F.D. Roosevelta Banská Bystrica
MUDr. Dana Kantarská,
NsP F.D. Roosevelta Banská Bystrica
Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc., FN Plzeň
MUDr. Jana Granátová,
Fakultní Thomayerova nemocnice
Mgr. František Vičar
Mgr. Markéta Krupařová
Grafická podoba
Nina Nováková
Tiskárna
REPRO servis s. r. o.
Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5
Náklad čísla
1400 výtisků
Biomarkery v tělních tekutinách
– jehla v kupce sena?
9
Termín biomarker se v posledních letech stal, zvláště pak ve spojení
s termínem klinická proteomika, jedním z nejfrekventovanějších pojmů
v oblasti biomedicínckého výzkumu.
Izolace a purifikace nukleových
kyselin metodou Agencourt SPRI
11
Agencourt Bioscience Corporation je jedním z největších automatizovaných
sekvenačních center v USA, které patří do koncernu Beckman Coulter. Toto
centrum se mimo jiné podílelo na projektu sekvenace lidského genomu (HUGO).
Naše nálezy AFP v plodovej vode
a korelácia s fenotypom
12
Štandardizácia prenatálneho biochemického
skríningu vrodených chýb v Slovenskej republike
14
Změny hladin thymidinkinázy (TK) v průběhu
adjuvantní a paliativní chemoterapie
15
Indikátorové proteiny v moči (1)
18
Stanovení celkové proteinurie je rutinním požadavkem, ne vždy však poskytuje
klinickému lékaři dostatečnou informaci. Patologická exkrece plazmatických bílkovin do moče je často projevem renálních i některých extrarenálních onemocnění.
Slavnostní otevření laboratoře v Nemocnici Kyjov
23
Dne 21.března 2007 byla v areálu Nemocnice v Kyjově slavnostně otevřena
laboratoř na oddělení klinické biochemie.
Kde se můžeme setkat (červen – září 2007)
Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech, a.s. formou stánku
informační magazín číslo 6 - 2007
3
24
americké Federace klinicko-imunologických společností (FOCIS). V loňském roce jsme byli také
akreditováni k postgraduální profesní výuce dle
zákona 95/2004 v oboru alergologie a klinické imunologie. Tradicí se stalo každoroční pořádání jarní
konference na téma primárních imunodeficiencí
(ESID Prague spring meeting), které se stalo platformou pro setkávání vědeckých, laboratorních
a klinických pracovníků z východních i západních
zemí. Zapojeni jsme také do několika mezinárodních projektů včetně 6. rámcového programu EU.
minimální reziduální nemoci. Na druhou stranu některé nemoci dokážeme diagnostikovat stále pomocí zcela „primitivních“ metodik – například chronickou
granulomatózní chorobu (deficit NADPH oxidázy) – diagnostikujeme jednoduchým (a levným) barevným NBT testem pod mikroskopem stejně jako před
padesáti lety. Ke konfirmaci pak samozřejmě použijeme moderní metody (např.
chemiluminiscenci) a také přesná molekulární diagnostika této choroby je beze
sporu závislá na moderních technologiích.
Jaké nároky klade zavádění nových technologií na kvalifikaci
laboratorních a klinických pracovníků. Jaké největší problémy
jsou s tím spojeny?
Moderní přístroje jsou zajisté pokrokem a usnadněním laboratorní práce, ale
tím více kladou nároky na vzdělání lékařů, ev. přírodovědců, aby dokázali laboratorní výsledky správně interpretovat. A samozřejmě také klinici musí vědět,
co indikovat. Spolupráce laboratorních a klinických pracovníků je základem
racionální diagnostiky. Technologie, ať již je jakkoliv moderní, nesmí přerůst do
samoúčelného vyšetřování. Dnes se bohužel často setkáváme s „převyšetřováním“ pacientů, kteří potom chodí se stohem laboratorních nálezů od lékaře
k lékaři a nikdo si s interpretací neví rady. A nezanedbatelný fakt je, že se tato
vyšetření účtují zdravotním pojišťovnám, čímž laboratorní komplement, zejména v soukromé sféře, odčerpává ze systému zdravotního pojištění nemalé
finance, které pak chybí jinde. Není to samozřejmě chyba laboratoří, ale současného systému, který nemá účinné kontrolní a regulační mechanismy.
Jak se na vašem pracovišti kloubí laboratorní a klinická práce?
Jakých úspěchů jste v posledních letech dosáhli?
Naše pracoviště má laboratoře rutinní a výzkumné a ambulantní složky pro děti
i dospělé. Jako součást Fakultní nemocnice v Motole a 2. lékařské fakulty úzce
spolupracuje s dalšími ústavy i klinikami. Poskytujeme tedy komplexní laboratorní i konzultační činnost pro hospitalizované i ambulantní pacienty. Snažíme
se naplňovat koncepci oboru klinické imunologie a alergologie v celé šíři a propojovat léčebně-preventivní složku s výzkumem a výukou. Právě komplexnost
naší činnosti vedla nedávno k uznání našeho pracoviště jako Centra Excelence
4
informační magazín číslo 6 - 2007
Jaké výstupy očekáváte v ne příliš
vzdálené budoucnosti?
V naší výzkumné práci jsme se v posledních deseti
letech zaměřili zejména na protinádorovou imunologii, konkrétně na imunoterapii nádorů pomocí
dendritických buněk. V rámci preklinických studií
jsme se naučili pěstovat z monocytů periferní krve
dendritické buňky, optimalizovali jsme přípravu
nádorových antigenů a propracovali jsme metodologii postupu u ovariálního karcinomu. Zároveň
jsme studovali biologii dendritických buněk za
různých podmínek a řadu výsledků jsme publikovali v impaktovaných zahraničních časopisech. Ve
výzkumu mají nezastupitelnou úlohu zejména naši
postgraduální studenti, dvě studentky letos obhájily na toto téma svoje PhD. Aplikace nádorových
vakcín pacientům podléhá zákonu o léčivech, proto bylo zapotřebí vybudovat superčisté prostory,
které vyhovují zásadám správné výrobní praxe
(GMP). To se nám na sklonku minulého roku díky
podpoře vedení fakultní nemocnice a za finančního přispění sponzorů podařilo. V současné době
provádíme zkušební přípravu nádorových vakcín
v těchto prostorách a připravujeme složité písemné podklady ke schválení klinického protokolu pro
Státní ústav pro kontrolu léčiv. I když je stále mnoho otázek kolem vakcinace dendritickými buňkami
nevyřešeno, výsledky zahraničních studií ukazují,
že je tato metoda v rámci imunoterapeutických
postupů jednou z nejúčinnějších. Možnost poskytnout tuto léčebnou metodu jako součást komplexní protinádorové terapie onkologickým pacientům
ve FN Motol bych považovala za završení našeho
mnoholetého výzkumného úsilí.
Děkujeme Vám za rozhovor a za inspirující odpovědi.
BĚLA ŘÍČAŘOVÁ
[email protected]
PAVEL KRUŽÍK
[email protected]
Naše praktické zkušenosti
s detekcí autoprotilátek
imunofluorescencí
RNDr. Marcela Jarešová, vedoucí
laboratoře imunologické
diagnostiky IKEM Praha
ednou ze základních metod stanovení autoprotilátek je stále metoda nepřímé imunofluorescence, obecně považovaná za „zlatý standard“. K tomuto účelu se nyní používají výhradně
komerční substráty, které dodává na trh množství
firem. Dříve používané „home-made“ řezy výhradně připravované z myších a krysích tkání byly nahrazeny komerčně vyráběnými řezy. V nabídce jsou také
tkáně opičí, které jsou lidským tkáním bližší, a proto
jsou ve většině případů vhodnější.
V naší laboratoři používáme převážně substráty firmy The Binding Site, která je naším hlavním dodavatelem. Vzhledem k tomu, že v našem institutu je velkým oddělením nefrologie, velmi často vyšetřujeme
kromě ostatních autoprotilátek také autoprotilátky
ANCA, a-dsDNA, a-GBM.
Ačkoliv při imunofluorescenčním vyšetřování sér
přesně dodržujeme postup práce podle návodu výrobce, občas se během naší práce setkáváme s určitými
problémy. Při přípravě preparátů musí laboratorní
pracovník dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci jamek pozitivní kontrolou nebo jednotlivými séry
navzájem. Máme zkušenost, že v případě, kdy jsou
jednotlivé jamky sklíčka umístěné blízko sebe (například u 12-jamkových skel), ke kontaminaci může dojít
i při největší pečlivosti velice snadno. Proto je výhodnější používat skla, kde nejsou jamky druhé řady přímo pod první řadou, ale jsou trochu posunuté do
strany.
V minulosti jsme měli období, kdy jsme pozorovali
slabě pozitivní obraz C-ANCA na všech polích, včetně
negativní kontroly. (Jako pozitivní kontrolu zásadně
používáme P-ANCA kontrolu.) Tento problém pak fir-
Obr. 4: Protilátky u paraneoplastického
syndromu (namířené proti
nekolagenním doménám α-1 řetězce
kolagenu IV)
ma The Binding Site vyřešila změnou konjugátu. Při
dobarvování preparátu Evansovou modří se nám
osvědčilo přidávat do promývací lázně větší množství Obr. 1 :ANCA – negativní kontrola
modři (5 – 6 kapek), obraz negativní kontroly je pak (5 - 6 kapek Evansovy modři
čistě červený, bez náznaků jakékoliv pozitivity v promývací lázni)
(porovnejte obr. 1 a 2). To je důležité pro správné
odečtení pozitivních sér pacientů se začínající nebo
naopak zaléčenou Wegenerovou granulomatosou
(obr. 3). Jistě je výhodou používat soupravu jako
celek objednaný od výrobce, protože pak máme
zaručeno, že používáme ty správné reagencie.
S téměř nevysvětlitelnou záhadou jsme se setkali,
když preparáty připravované jednou, jinak velmi
precizní laborantkou, začaly mít závoj béžové barvy,
který nebylo možné proostřit. Teprve po dlouhém
pátrání jsme zjistili, že tato pracovnice začala popi- Obr 2: Negativní kontrola (2 kapky
sovat preparáty červeným fixem na sklo místo Evansovy modři v promývací lázni)
původní černé a barva fixu (byť určeného na popis
skla) se v promývací lázni rozpouštěla. Proto je
výhodnější popisovat sklíčka obyčejnou tužkou. Při
jakékoliv nejasnosti při odečítání (např. příliš slabá
intenzita fluorescence, kdy nelze rozlišit, zda se jedná o granulární fluorescenci či ne), musíme imunofluorescenční vyšetření doplnit ELISA testem.
Velmi dobré zkušenosti máme se soupravou na
stanovení a-GBM autoprotilátek. Použitím urey dojde na nekolagenních doménách α-3 řetězce kolagenu IV k odkrytí epitopů a tím tedy ke snadnějšímu
Obr. 3: C-ANCA v séru pacienta
navázání eventuelně přítomných autoprotilátek. s Wegenerovou granulomatosou
Signál je navíc zesílený vazbou biotin-streptavidin,
takže u pacienta se zaléčeným Goodpasteurovým syndromem byla linie membrány
viditelná ještě v okamžiku, kdy ELISA vyšetření již bylo negativní. Protilátky mohou
být však namířené proti nekolagenní doméně jiného řetězce než je α-3 řetězec
kolagenu IV, například α-1 řetězce (paraneoplastický syndrom) (obr. 4) a v imunofluorescenci vidíme naprosto stejný obraz jako u Goodpasteurova antigenu (obr. 5).
Proto je nezbytné každý pozitivní nález na fluorescenci konfirmovat ELISA testem.
Výše uvedené příklady jsou jen zlomkem nástrah, které
mohou laboratoř při stanovování autoprotilátek potkat.
Důsledné dodržování doporučených postupů výrobcem jsou
skutečně samozřejmostí a jakékoli odchylky v metodice
mohou způsobit nevysvětlitelné záhady, jejichž řešení pak
stojí příliš cenného času.
V neposlední řadě je důležitá i spolupráce s klinickými
odděleními, řádné vyplňování skutečných diagnóz může
velmi přispět ke komplexnímu pohledu na věc a může fungovat i jako zpětná kontrola laboratoře.
RNDR. MARCELA JAREŠOVÁ, LABORATOŘ
Obr. 5: Autoprotilátky a-GBM
(namířené proti nekolagenním
doménám α-3 řetězce kolagenu IV)
IMUNOLOGICKÉ DIAGNOSTIKY, IKEM,
VÍDEŇSKÁ 800, 140 00 PRAHA 4,
E-MAIL: [email protected]
informační magazín číslo 6 - 2007
5
Ještě jednou ANCA ...
tentokrát z metodického hlediska
Tématu stanovení autoprotiátek proti cytoplasmě neutrofilních leukocytů
(ANCA) jsme se v našem časopise věnovali na jaře 2006. Od té doby máme
k dispozici několik dalších, doufáme, že užitečných, informací.
ůležitým mezníkem pro standardizaci tohoto stanovení bylo
vypracování závazného mezinárodního doporučení sestav jednotlivých typů testů a testů na ně navazujících a zásad pro
jejich vyhodnocování, které bylo publikováno skupinou vedenou
Judy Savige v roce 1999 (1). O čtyři roky později byl vydán dodatek k původnímu dokumentu (2) týkající se zásad kontroly jakosti,
ověřování specificity imunofluorescentních vzorů a vydávání výsledků.
Vedle již zavedeného využití stanovení ANCA v diagnostice vaskulitid předkládá
tato publikace možnosti využití ANCA v diagnostice dalších autoimunitních
chorob, především zánětlivých střevních onemocnění, autoimunitní hepatitidy
1. typu a dalších. Dodržování doporučených algoritmů při vyšetřování ANCA je
skutečně základním předpokladem pro vydávání správných výsledků.
Druhým předpokladem pro správné vyhodnocení ANCA jsou konkrétní podmínky laboratorního stanovení. Nepochybujeme o tom, že zajištění vhodných
laboratorních podmínek pro spolehlivý záchyt přítomnosti ANCA a správné
určení specificity věnují pracovníci laboratoří klinické imunologie u nás velkou
pozornost. Při použití metody nepřímé imunofluorescenční mikroskopie (IIFA)
má zásadní význam jak dodržování správného postupu a podmínek stanovení,
tak volba vhodných reagencií specificky nastavených pro toto použití.
Pracovníci výzkumných a vývojových laboratoří společnosti The Binding Site
věnují výrobkům určeným pro stanovení ANCA metodou nepřímé imunofluorescenční mikroskopie (IIFA) systematickou pozornost. Před více než 10 lety
proběhla revize postupů přípravy substrátových skel s neutrofily (izolace, fixace
etanolem nebo formalinem) vylučující aktivaci těchto buněk, v minulém roce
došlo i k úpravě konjugátu.
Vhodný konjugát je složkou, která má pro výslednou kvalitu preparátů velký
význam. Při výrobě konjugátu hraje důležitou roli volba vhodného fluorochromu, optimální molární poměr mezi molekulou imunoglobulinu a fluorochromu
i obsah konjugátu v pracovním roztoku; to vše podstatnou měrou přispívá
k optimálnímu „výkonu“ stanovení. V polovině roku 2006 uvedla TBS novou
verzi konjugátu anti IgG s fluoresceinem pro ANCA (FA003.A).
Pro stanovení ANCA je důležitá volba vhodného montovacího média pro
imunofluorescenční preparáty. V montovacích médiích pro imunofluorescenční mikroskopii se často s výhodou uplatňuje přídavek polyvinylalkoholu (PVA).
Obecně PVA zvyšuje jasnost fluorescence a zlepšuje zřetelnost imunofluorescentních vzorů u buněčných i tkáňových substrátů. Neutrofilní leukocyty jsou
Nepochybujeme o tom, že zajištění
vhodných laboratorních podmínek
pro spolehlivý záchyt přítomnosti
ANCA a správné určení specificity
věnují pracovníci laboratoří klinické
imunologie u nás velkou pozornost.
6
informační magazín číslo 6 - 2007
však výjimkou. Pro stanovení ANCA je tento typ
montovacího média zcela nevhodný, protože PVA
poškozuje buněčnou strukturu neutrofilů, takže
může následně dojít k vytvoření nesprávného imunofluorescentního vzoru a tím k odečtu nesprávného výsledku. Používání montovacího média speciálně určeného pro neutrofilní leukocyty je tedy
víc než doporučováno (CON46.2 a CON46.3)
Správná laboratorní práce samozřejmě předpokládá používání kontrolních vzorků.
Kvalita komerčně dodávaných kontrol musí
vyhovovat řadě přísných kriterií; na prvním místě je
to pro pozitivní kontroly určené pro IIFA monospecificita – testovaná na odpovídajícím substrátu
a dále potvrzená dalšími nezávislými metodami
(dál je to vhodné ředění a záruka použitelnosti do
data exspirace). Používání tzv. vnitřních kontrolních vzorků (tedy získaných při testování pacientských vzorků v laboratoři) je rovněž doporučováno,
ale jen pokud jsou současně použity profesionálně
připravené komerční kontroly. Vnitřní kontrolní
vzorky mohou jen těžko splňovat všechna kritéria
a spoléhat se z úsporných důvodů jen na ně může
představovat značné riziko.
Kompletní soupravy pro stanovení ANCA obsahují všechny reagencie specificky nastavené; při
objednávání jednotlivých složek samostatně doporučujeme věnovat pozornost nejen specificitě, ale
i tomu, k jakému použití je výrobek určen.
Zmínka o vhodných podmínkách stanovení rovněž stojí za pozornost, a to především dodržení
správné hodnoty pH tlumivého roztoku PBS, která
je 7,2. Neodpustím si historickou poznámku. Během
téměř 15 let, kdy společnost TBS zastupujeme, jsme
se několikrát setkali s problémy nedostatečné citlivosti stanovení ANCA a vždy trvalo delší dobu, než
jsme se dopátrali příčiny. Křížovým testováním jednotlivých složek ve standardních podmínkách jsme
v těchto případech nikdy nenašli žádnou závadu.
V závěru došlo na kontrolu pH PBS: byla kolem 6,5
nebo dokonce nižší. Vzhledem k tomu, že tyto laboratoře používaly totéž PBS také na další tkáňové
a buněčné substráty, a to bez problémů, otázka
kontroly PBS zůstávala v pozadí. Je dobré mít na
paměti, že ze všech běžně používaných substrátů
pro IIFA jsou neutrofilní leukocyty nejzranitelnější,
tedy že stanovení ANCA provedené i v mírně
nestandardních podmínkách může být ohroženo
nesprávnými výsledky a že se tato odchylka na
odolnějších substrátech nemusí projevit. Ať už
používáte pracovní PBS připravený z 20x koncentrovaného roztoku z TBS (při problémech s pracovním roztokem PBS bývá na vině mimořádně nízká
hodnota pH destilované vody použité k ředění),
nebo jste odběratelem PBS z lékárny, kontrola pH je
vždy, kdy výsledky kontrol neodpovídají definovanému obrazu, na místě.
Literatura
1. Savige J, Gillis D, Benson E, et al. International
Consensus Statement on Testing and Reporting of
Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA), Am
J Clin Pathol 1999;111: 507-513.
2. Savige J, Dimech W, Fritzler M, et al. Addendum
to the International Consensus Statement on
Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies. Quality Control Guidelines, Comments, and Recommendations for Testing in Other
Autoimmune Diseases, Am J Clin Pathol 2003; 120:
312-318.
ASP 1200TM nově
v České a Slovenské
republice
Prostřednictvím naší společnosti uvádí britská
společnost The Binding Site na český a slovenský trh automat na zpracování substrátových
skel pro stanovení autoprotilátek nepřímou
fluorescenční mikroskopií.
Automat ASP 1200TM* je určen pro velké, střední i malé laboratoře. Jde o prostorově úsporný, plně automatizovaný, velmi spolehlivý přístroj, který během své
činnosti nevyžaduje přítomnost obsluhy. Jedná se o otevřený systém, kde lze
použít různé typy substrátových skel.
Rozměry: výška: 50 cm, šířka: 50 cm, hloubka: 55 cm, hmotnost: 19,5 kg
Přístroj umožňuje provedení až čtyř různých typů testů současně, testy se
mohou lišit dobou inkubace, požadavky na promývání, typem kontrol i typem
konjugátu, tím je zabezpečeno docílení optimálních imunofluorescentních vzorů.
Maximální kapacita je 96 vzorků.
Automat umožňuje jak záchyt přítomnosti autoprotilátek (screening), kdy jednotlivá séra naředí vhodně pro daný typ stanovení, tak stanovení titru pacientského séra, kdy jsou vzorky ředěny geometrickou řadou do zvoleného stupně.
Oba typy stanovení mohou probíhat současně.
Pro programování a řízení činnosti je ASP1200 vybaven samostatným softwarem. Nastavení softwaru pro pracovní protokoly umožňuje uživateli zvolit si
z předem naprogramovaných sestav testů. Sestavy testů výrobce připravuje individuálně podle požadavků konkrétního uživatele, tyto sestavy lze i kdykoliv později upravit nebo rozšířit. Výrobce rovněž zaručuje poskytnout stávajícím
uživatelům každou aktualizovanou verzi
softwaru.
Společnost The Binding Site upravila
v předstihu diagnostické IFA soupravy pro
použití na ASP 1200 tak, aby objemy
všech reagencií umožňovaly bezproblémové zpracování.
*ASP1200TM je ochranná známka společnosti The Binding Site Ltd., Birmingham, Velká Británie.
BĚLA ŘÍČAŘOVÁ
BĚLA ŘÍČAŘOVÁ
[email protected]
[email protected]
Obr. 8: Systémové roztoky
informační magazín číslo 6 - 2007
7
Nové monoklonální protilátky
pro průtokovou cytometrii
Konjugované protilátky řady IOTest® jsou univerzální reagencie pro průtokovou cytometrii určené pro všechny typy průtokových cytometrů. Tyto reagencie jsou určeny pro značení
povrchových a intracelulárních antigenů.
IOTest® Anti-HLA-DR-PC7
Objednací číslo: A40579
Klon: Immu-357
Izotyp: IgG1
Fluorochrom: PC7 (Phycoerythrin-Cyanine 7)
Počet testů: 50 testů; 10 μL na test
IOTest® CD138-PE
Objednací číslo: A40316
Klon: B-A38
Živočišný druh: myš
Izotyp: IgG1
Množství: 100 testů, 20 μL na test
Antigen HLA-DR je exprimován na aktivovaných lymfocytech T, lymfocytech B
a monocytech periferní krve, buňkách různých typů leukemií a lymfomů, subpopulacích dendritických buněk periferní krve a lymfoidních tkání.
Během vývoje reagencie HLA-DR-PC7 byly také testovány vícebarevné kombinace s dalšími monoklonálními protilátkami včetně tetraCHROME CD45-FITC/
CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 (objednací číslo 6607013) a lyzačním systémem
IMMUNOPREP v postupu bez promývání. HLA-DR-PC7 je také kompatibilní
s postupem VersaLyseTM (Lyse & Fix protocol).
Vhodnou izotypovou kontrolou je IOTest® IgG1, PC7, objednací číslo 6607099.
Vysoká exprese antigenu CD138 (Syndecan-1) je
typická pro buňky mnohočetného myelomu (Dhodapkar et al., 1998, “Syndecan-1 is a multifunctional regulator of myeloma pathobiology: control of
tumor cell survival, growth, and bone cell differentiation“, Blood, 91:2679-2688). Dále je tento antigen exprimován na dlaždicových buňkách epitelu,
zrajících lymfocytech B v kostní dřeni a plazmatických buňkách v lymfoidních orgánech.
Exprese antigenu CD138 není pozorována na
normálních lymfocytech B periferní krve.
V doporučeném postupu pro přípravu vzorků se
používá reagenční systém pro lýzu erytrocytů VersaLyseTM (Lyse & Fix protocol) s promytím suspenze
buněk
Vhodnou izotypovou kontrolou je IOTest® IgG1,
PE, objednací číslo A07796.
Další monoklonální protilátky s fluorochromem PC7:
CD2, IOTest®, PC7
IM3625
CD20, IOTest®, PC7
IM3629U
CD3, IOTest®, PC7
6607100
CD34, IOTest®, PC7
A07509
CD4, IOTest®, PC7
6607101
CD41, IOTest®, PC7
6607115
CD5, IOTest®, PC7
IM3627
CD45, IOTest®, PC7
IM3548U
CD8, IOTest®, PC7
6607102
CD56, IOTest®, PC7
A07508
CD14, IOTest®, PC7
A22331
CD61, IOTest®, PC7
IM3716
CD16, IOTest®, PC7
6607118
CD117, IOTest®, PC7
IM3698
CD19, IOTest®, PC7
IM3628U
Tubulin, IOTest®, PC7
6607114
Kombinace monoklonálních protilátek s fluorochromem PC7
6607119
CD64-PE/CD16-PC7, IOTest®
6607103
CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PC7, IOTest®
6607114
CD62L-FITC/CD45RA-PE/CD4-PC7, IOTest®
6607115
CD62L-FITC/CD45RA-PE/CD8-PC7, IOTest®
6607106
CD62L-FITC/CD45RO-PE/CD8-PC7, IOTest®
8
informační magazín číslo 6 - 2007
PAVEL KRUŽÍK
[email protected]
Vysoká exprese antigenu CD138 je typická
pro buňky mnohočetného myelomu.
Biomarkery v tělních
tekutinách – jehla
v kupce sena?
Termín biomarker se v posledních letech stal,
zvláště pak ve spojení s termínem klinická proteomika, jedním z nejfrekventovanějších pojmů
v oblasti biomedicínského výzkumu. Co je vlastně tak důležitého a zajímavého na hledání
nových proteinových biomarkerů?
e to na jedné straně potřeba stále přesnějších
a specifičtějších diagnostických metod
a postupů, na druhé straně neúprosný tlak
ekonomický. Ideální biomarker je protein
vyskytující se v krvi pouze u pacientů s jedním
konkrétním syndromem/nemocí, nevyskytuje se
v měřitelných koncentracích u zdravé populace
a jeho asociace s nemocí je 100 %. Navíc se vyskytuje
v dostatečné koncentraci (nejlépe g/L) v krevní plasmě/séru, je stabilní, má minimální biologickou variabilitu v populaci …
Takový biomarker je samozřejmě dost nepravděpodobný, nicméně můžeme se pokusit se k tomuto ideálu aspoň přiblížit. Proteomické přístupy směřují
k novému diagnostickému markeru ve třech krocích:
■ Mezi všemi dostupnými proteiny najít a identifikovat ty, jejichž exprese má vztah k nemoci/syndromu.
Neformulovat hypotézu!
■ Mezi kandidátními proteiny vyhledat ten, který
může nejlépe sloužit jako diagnostický marker.
■ Připravit soupravu a klinicky ověřit diagnostický
postup.
Hledání nových proteinových biomarkerů v lidských
tělních tekutinách můžeme přirovnat k pověstnému
hledání jehly v kupce sena nebo také k hledání několika zlatých zrnek v tunách hlušiny. Důvod je zřejmý:
lidský genom obsahuje 30 000 genů, v typické buňce
je pak exprimováno asi 10 000 genů. Dalším zdrojem
diverzity proteinů je alternativní sestřih mRNA, a na
úrovni proteinu pak zejména opracování polypeptidů
pomocí proteáz (typicky např. aktivace proenzymů na
aktivní enzym) a postranslační modifikace (typicky
fosforylace či glykosylace). Nejpoužívanější metodou
mapování komplexních proteinových směsí – buněčných lyzátů - je dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (2D PAGE). Při použití této metody se každá forma téhož proteinu, každá
postranslační modifikace, projeví jako nový spot =
nový protein. Takovéto chápání proteomu je jistě
správné, nicméně musíme očekávat 5x104 – 106 (odhady se liší) různých proteinů
v každé individuální buňce. Tím ovšem možnosti variability proteomu nekončí.
Metoda 2D PAGE pracuje s denaturovanými proteiny a nezachytí tak nekovalentní
interakce proteinů, jako jsou komplexy s dalšími proteiny či vazba nízkomolekulárních kofaktorů a léčiv. Diagnostické metody jsou však obvykle založeny na kvantifikaci nativního proteinu v tělních tekutinách pomocí specifických protilátek a tam
se nekovalentní interakce projeví často velmi zásadně.
Mezi typické tělní tekutiny pro diagnostické účely zahrnujeme krevní sérum/plasmu a moč. Méně časté, o to však zajímavější matrix, jsou tekutiny jako sliny, mozkomíšní mok, amniotická tekutina, bronchoalveolární laváž či folikulární tekutina.
Zůstaneme-li u nejběžněji používané tělní tekutiny - krevní plasmy/séra, více než
50% proteinové hmoty tvoří sérový albumin. Po odstranění 10 nejběžnějších
(= abundantních) sérových proteinů (sérový albumin-ALB, Imunoglobulin G-IGG,
transferin-TRF, Imunoglobulin A-IGA, Alfa-2-makroglobulin-AMG, Imunoglobulin
M-IGM, Alfa-1-antitrypsin-AAT, Apolipoprotein A (I, II)-APA, haptoglobin-HPT,
Alfa-2-kyselý glykoprotein/orosomukoid-AAG) zbude přibližně 10 % hmotnosti
proteinů, a to je oblast potenciálních biomarkerů. Ve skutečnosti na biomarkery
připadá mnohem menší podíl. Snadno se o tom přesvědčíme z literárních údajů
i experimentem. Když místo séra použijeme plasmu, která je pro většinu proteomických experimentů vhodnější, a když kromě zmíněných proteinů odstraníme i fibrinogen, zásobárna potenciálních biomarkerů se zmenší na 5-7 % celkové hmoty
proteinu.
Protože krevní plasma je základ i pro mnohé jiné tělní tekutiny, podívali jsme se,
jak významnou součást tvoří sérové proteiny např. v tekutině ovariálních folikulů.
Většina abundantních proteinů lidské
plasmy/séra je přítomna ve vysoké koncentraci i ve folikulární tekutině. Například
sérový albumin představuje dvě třetiny celkové hmoty proteinů a 8 abundantních
sérových proteinů představuje 94-95 %
hmoty veškerých proteinů folikulární tekutiny – viz. obr. Folikulární tekutina.
Na 2D elektroforéze vypadá díky abundantním proteinům lidská plasma/sérum
jako poměrně jednoduchá proteinová
směs. Ve skutečnosti je pravdou pravý opak.
Krev je jednak prostředím pro mezibuněčnou komunikaci a obsahuje jednak proteiny jako cytokiny či růstové faktory, jednak
proteiny uvolněné při rozpadu buněk
v tkáních či při přestavbě extracelulární
matrix. Tyto proteiny jsou ovšem maskovány přítomností abundantních proteinů.
informační magazín číslo 6 - 2007
9
Sérum
Folikulární tekutina
Sérové koncentrace
pg/ml
IgY kolonky jsou nabízeny pro odstraňování lidských
proteinů (12 proteinů) nebo proteinů laboratorního
potkana nebo myši (7 proteinů) ve třech formátech.
■ Spin kolonky s kapacitou 20 μL lidské plasmy
a výtěžkem 160 μg celkového proteinu/cyklus.
■ 2 mL chromatografické kolonky s kapacitou 50 μL
lidské plasmy a výtěžkem 400 μg celkového proteinu/cyklus.
■ 10 mL chromatografické kolonky s kapacitou
250 μL lidské plasmy a výtěžkem 2 mg celkového
proteinu/cyklus.
Každá souprava je určena pro 100 cyklů.
Metodika:
Problém abundantních proteinů vynikne ještě lépe, srovnáme-li koncentrace
Vzorky tělních tekutin byly získány v rámci společnéhlavních sérových proteinů s koncentrací některého existujícího biomarkeru. Jako
ho projektu z Centra asistované reprodukce Všeobeczástupce biomarkerů jsme si vybrali Inhibin A v séru pacientek stimulovaných k in
né fakultní nemocnice v Praze, řešitel: MUDr. Karel
vitro fertilizaci. Koncentrace Inhibinu A jsou srovnávány s koncentrací sérového
Řežábek,CSc.
albuminu a s koncentrací sérových proteinů podobné velikosti, konkrétně s proteiSpecifické proteiny v séru a folikulární tekutině byly
ny o velikosti 40-77 kDa.
měřeny na analyzátoru Immage (Beckman Coulter)
Ze srovnání je patrné, že koncentrace Inhibinu A jsou od koncentrací nejbližšího
a celkový protein na analyzátoru Unicel DxC 800
sérového proteinu vzdáleny více než o 6 řádů.
(Beckman Coulter). Inhibin A byl měřen soupravou
Protože 2D PAGE i negelové techniky sloužící k separaci proteinových směsí
ELISA (DSL).
(např. ProteomeLab PF2D) mají omezenou kapacitu vzhledem k množství analyzoJIŘÍ MOOS
vaných proteinů, je zřejmé, že se musíme nejprve zbavit abundantních proteinů,
[email protected]
a pak teprve hledat mezi potenciálními biomarkery.
VANDA FILOVÁ
Odstranění abundantních proteinů musí být kvantitativní a hlavně [email protected]
kovatelné.
Beckman Coulter nabízí k odstranění (depleci) abunZájemce o klinickou proteomiku co nejsrdečněji zveme na:
dantních proteinů systém, který se nazývá IgY. Jak již
název napovídá, systém je založen na depleci proteinů
Joint meeting of 3rd Czech Proteomic conference
pomocí imobilizovaných slepičích protilátek. Použití sle& 1st Central and Eastern European Proteomic
pičích protilátek přináší dvě nezanedbatelné výhody ve
srovnání se systémy používající savčí protilátky:
Conference
■ lidské a slepičí sérové proteiny jsou si fylogeneticky
vzdálenější než lidské a jakékoliv savčí proteiny. Z toho
Konference se koná 29.-31. října v Praze v hotelu Top hotel a je organizována
vyplývá, že slepičí imunitní systém je lidskými proteiny
Proteomickou sekcí ČSBMB. Na jejích stránkách se také můžete zaregistrovat
stimulován mnohem účinněji a výsledné antisérum je
http://www.czproteo.cz/
pak schopno odstranit abundantní proteiny z plasmy/
séra opravdu kvantitativně.
Beckman Coulter je hlavním sponzorem konference
■ Fc fragment slepičího imunoglobulinu neváže složky [email protected]
ského komplementu, Fc receptory ani revmatoidní faktor.
10
informační magazín číslo 6 - 2007
Izolace a purifikace nukleových
kyselin metodou Agencourt®
SPRI® pomocí automatizované
stanice Biomek®
Agencourt® Bioscience Corporation je jedním z největších
automatizovaných sekvenačních center ve Spojených státech, které
patří do koncernu Beckman Coulter. Toto centrum se mimo jiné podílelo
na projektu sekvenace lidského genomu (HUGO).
eagencie Agencourt® využívající technologii SPRI® (Solid Phase Reversible
Immobilization) jsou určeny pro izolaci
a purifikaci nukleových kyselin v různých
typech matric. Princip metody spočívá
v navázání paramagnetických partikulí na
nukleovou kyselinu v roztoku a jejich
následné fixaci pomocí magnetického separátoru.
Ostatní složky roztoku mohou pak být odsátím
odstraněny ze směsi. Tento postup je společný pro
všechny druhy reagencií Agencourt®, ať už určených pro izolaci geonomové či plazmidové DNA,
izolaci RNA z tkání či buněk, nebo purifikaci sekvenační PCR reakce či PCR clean-up. Veškeré
postupy jsou realizované bez použití filtrace nebo
centrifugace a jsou tak přímo předurčeny pro případnou automatizaci těchto metod na automatizovaných stanicích Biomek®.
Nejčastější aplikací zejména v klinických molekulárně biologických laboratořích
je izolace geonomové DNA z plné krve.
Pro tuto aplikaci je určena reagencie Agencourt® GenfindTM, která je k dispozici ve formátech pro 96-jamkové destičky nebo mikrozkumavky 2 ml, přičemž lze
vycházet z 200 μl resp. 400 μl plné krve, a to jak čerstvé, tak i zamražené, s vysokým výtěžkem DNA pohybujícím se v rozmezí 10-15 μg na 200 μl krve.
Stejně jako ostatní reagencie Agencourt® je možné i Agencourt® GenfindTM
použít jak pro manuální izolaci pomocí klasické pipety, tak s výhodou především
na automatizované stanici- pipetoru Biomek® NXP nebo Biomek® FXP. Software
automatického pipetoru Biomek® je pro tyto účely doplněn o softwarové okno
obsahující kompletní nastavení metody pro
izolaci pomocí reagencie Agencourt® GenfindTM, takže uživatel nemusí nastavovat
celou metodu pipetace, ale pouze zadá
vstupní požadavky pro pipetované objemy.
Biomek® NXP a Biomek® FXP mohou
pracovat s moduly pro pipetaci pro formát
96-jamek, 384-jamek nebo tzv. Span-8
(pipetovací hlava obsahující na sobě
naprosto nezávislých 8 pipet jak z pohledu pipetovaného objemu, tak pozice), případně jejich kombinacemi. Všechny platformy Biomek® jsou ovládany stejným
softwarem s intuitivním ikonovým zadáváním pipetačních kroků.
Pro purifikaci sekvenační PCR reakce před
vlastní sekvenací na genetickém analyzátoru je určen kit Agencourt® CleanSEQ®,
umožňující jednoduchou tříkrokovou purifikaci sekvenační reakce. Reagencie Agencourt® CleanSEQ® je optimalizována jak pro
systémy Beckman Coulter, tak pro sekvenátory Applied Biosystems (ABI). Výborných
signálů sekvenace je při použití Agencourt®
CleanSEQ® dosaženo i při významném
ředění Big Dye reagencií (ABI).
Purifikaci lze automatizovat pomocí platforem Biomek® 3000, Biomek® NXP
a Biomek® FXP.
Pro tuto aplikaci je rovněž dostupný softwarový modul, umožňující jednoduché
zadání metody uživatelem.
Více informací lze získat na www.Agencourt.com a www.beckmancoulter.com/
products/specifications/automatedsolutions/default.asp
ROMAN VLČEK
[email protected]
informační magazín číslo 6 - 2007
11
Naše nálezy AFP v plodovej
vode a korelácia s fenotypom
Úvod
■
Laboratórium prenatálneho skríningu pri Detskej fakultnej nemocnici v Banskej
Bystrici a Oddelenie lekárskej genetiky pri Fakultnej nemocnici s poliklinikou F.
D. Roosevelta v Banskej Bystrici spolupracujú pri vyhodnocovaní výsledkov
prenatálneho skríningu vrodených vývojových chýb. Laboratórium vyšetruje
séra aj plodové vody gravidných žien a výsledky vyhodnocuje ako tzv. Triple
test, aj ako samotné sérové AFP (MS AFP) a tiež AFP v plodovej vode (AF AFP).
Pozitívne výsledky z plodových vôd sú nahlasované Ambulancii rizikovej gravidity a Oddeleniu lekárskej genetiky pri FNSP F. D. Roosevelta. Rozhodli sme sa
spracovať obdobie 9. mesiacov roka 2006 z pohľadu laboratórnych nálezov AFP
v plodovej vode a genetických nálezov plodu.
■
Metóda
Alfafetoproteín je hlavný globulín fetálneho séra. Vstupuje do plodovej vody
močom plodu a presakuje cez placentu do materskej cirkulácie. Je produkovaný
z väčšej časti pečeňou plodu. Hladiny AFP u plodu a matky sú rozdielne
v rôznych obdobiach vývoja plodu. Hladina AFP v plodovej vode dosahuje
vrchol okolo 14. – 15. gestačného týždňa, potom klesá. Naopak, hladina AFP
v materskom sére kontinuálne stúpa počas gravidity.
Prenatálna diagnostika rázštepových vád je založená hlavne na ultrasonografickom gynekologickom vyšetrení pacientky, ale aj vyšetrení alfafetoproteínu v sére a plodovej vode. AFP preniká v dôsledku porušenia integrity povrchu
plodu a komunikácie likvorového priestoru plodu s plodovou vodou vo zvýšenom množstve do plodovej vody a krvi matky. Hladina AFP je zvýšená pri rázštepových defektoch neurálnej trubice (anencefália, myelokéla, meningomyelokéla), defektoch brušnej steny (gastroschíza), fetálnom alebo placentárnom
krvácaní a pri viacplodovej gravidite.
Plodová voda tvorí najobjemnejšiu súčasť extracelulárneho fetálneho priestoru. Má dôležitý význam pre vývoj jednotlivých orgánov, aj pre celkový rast
plodu. Tvorba, obmena a resorbcia plodovej vody je spoločným podielom matky a plodu. Na tvorbe plodovej vody sa podieľa:
■ priama filtrácia z materskej plazmy
■ prenikanie z fetálnej plazmy kožou plodu
■ prehĺtanie plodovej vody, vylučovanie obličkami plodu (plod do plodovej
vody močí)
Obrázok č.1.
dýchacie ústrojenstvo – spätná resorbcia pľúcami
pupočník
Množstvo plodovej vody je stanovované ultrazvukom (napr. „technikou štyroch kvadrantov“) ako
tzv. AFI – index plodovej vody. Hodnotí normálny,
zvýšený a znížený objem plodovej vody. Normálne
množstvo plodovej vody v 35. – 38. gestačnom
týždni je 1000 ml, v 40. gestačnom týždni cca
800 ml. Zmeny objemu plodovej vody sú v zmysle
zníženého objemu – oligohydramnion, až neprítomnosť plodovej vody – anhydramnion a zvýšeného objemu – polyhydramnion. Hladina AFP
v plodovej vode môže byť zvýšená pri oligohydramnione, ako falošná pozitivita.
Spracovanie plodovej vody
Odber plodovej vody vykonávame na špecializovanom pracovisku ultrasonongrafie príslušného
gynekologického oddelenia. Materiál je doručený
do Cytogenetického laboratória Oddelenia lekárskej genetiky, kde sa stanovuje karyotyp plodu. Plodová voda sa centrifuguje, sediment sa naloží na
kultiváciu amniocytov s výslednou karyotypizáciou. Plodová voda, určená na genetickú kultiváciu
karyotypu, nesmie byť po odbere zmrazená.
Supernatant plodovej vody je odoslaný do
laboratória na vyšetrenie AFP. Pokiaľ sa nevyšetrí
do 12 hodín od odberu, musí byť zmrazený pri
-20 °C.
Analýza AF AFP
AFP v plodovej vode vyšetrujeme pomocou kitu
IRMA AFP MONOCLONAL firmy Immunotech Beckman Coulter. Ide o imunorádiometrické in vitro
Graficke znázornenie pozitivného skríningu
12
informační magazín číslo 6 - 2007
stanovenie s dvomi monoklonálnymi protilátkami
v dvojkrokovom stanovení. Viazaná aktivita I125 je
meraná gamameračom. Koncentrácia AFP v IU/ml
sa odčíta z kalibračnej krivky a je priamo úmerná
odmeranej rádioaktivite. Plodová voda je nariedená
fosfátovým pufrom 1 : 100.
Výsledky AF AFP vyhodnocujeme softwarom,
ktorý hodnotí referenčný rozsah hladiny AFP v plodovej vode v jednotlivých gestačných týždňoch
gravidity. Hodnotíme 17. – 22. gestačný týždeň.
Pozitívne výsledky sú hodnotené ako znížené alebo
zvýšené.
Gestačný
Rozsah hladiny
týždeň
AF AFP v IU/ml
17
7000 – 18000
18
6000 – 14000
19
6000 – 13000
20
5000 – 12000
21
4000 – 11000
22
2000 - 10000
Výsledky
V období od januára do konca septembra 2006 sme
vyšetrili hladinu AFP v 259 plodových vodách. Boli
odobraté v 17. – 22. gestačnom týždni gravidity. Vyšiel
nám pozitívny výsledok u 55 pacientiek (21 %).
Korelácia pozitívneho skríningu
s genetickým nálezom
Pozitívny skríningový výsledok bol vyhodnotený
u 55 pacientiek.
Potvrdené patológie plodu genetikom boli u 10
pacientiek.
Pozitívne prediktívna hodnota, ako podiel skutočne
pozitívnych ku súčtu skutočne pozitívnych a falošne pozitívnych predstavuje 15,38 %.
PPV = 10/55+10
PPV = 15,38 %
Pozitívne prediktívna hodnota u zníženej hladiny
AF AFP predstavuje 16,21 %.
Pozitívne prediktívna hodnota u zvýšenej hladiny
AF AFP predstavuje 22,2 %.
Distribúcia patologických hodnôt AF AFP v grafickom
znázornení.
Chromozomálne aberácie
tvoria v našom súbore polovicu
záchytov, tieto sú vždy potvrdené
cytogeneticky.
Hodnoty AF AFP u chromozómových aberácií sa pohybovali v rozsahu 0,2 - 0,4
MOM, hodnoty rázštepových aberácií a iných vád sa pohybovali v rozsahu
1,87 – 4,2 MOM.
Indikácie, ktoré viedli ku odberom plodovej vody boli
nasledovné
Pozitívny Triple test
Vek
USG pozit
MS AFP
Genetická indikácia
Toxoplazmóza
Farmakologická indikácia
IVF
19
19
10
2
2
1
1
1
Patologické nálezy z karyotypizácie plodových vôd, vyšetrené v Cytogenetickom
laboratóriu Oddelenia lekárskej genetiky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke:
Prenatálne zistené chyby celkom
10
Chromozomálne vady celkom
5
Trisomia 21
2
Trisomia 18
1
Turnerov s.
1
XYY
1
Rázštepové VVCH celkom
4
Gastroschisis
2
NTD
2
Iné: holoprosencefália s fac. dysmorfiou
1
Z potvrdených nálezov je skríningom zachytená diagnóza lipomeningomyelokéla, anomália krytá kožou, ktorá nebola viditeľná pri sonografickom vyšetrení. Nález bol najprv zachytený Triple testom, riziko NTD 1 : 160 a následne aj
v plodovej vode v 19. týždni gravidity, MoM 1,87. Zaujímavý je záchyt VVV
centrálneho nervového systému – holoprosencefália s faciálnou dysmormfiou.
Indikáciou ku odberu plodovej vody bol pozitívny nález ultrasonografie, AF AFP
malo hodnotu 2,60 MoM, diagnóza bola potvrdená patologicko-anatomickým
vyšetrením. Chromozomálne aberácie tvoria v našom súbore polovicu záchytov, tieto sú vždy potvrdené cytogeneticky.
Záver
Pozitívne prediktívna hodnota AF AFP v našom súbore bola 15,38 %.
Riziko patológie plodu u rázštepových vád bolo 22,2 %, u chromozómových
aberácií 16,21 %.
Patologické nálezy AFP v plodovej vode a ich korelácia s fenotypom priniesli
zaujímavé výsledky. Odhalili sme významný počet vrodených vývojových chýb
plodu z relatívne malého súboru vzoriek. Náš nález potvrdzuje význam spätnej
väzby laboratórneho výsledku a klinickej diagnózy. Naďalej budeme porovnávať
a vyhodnocovať skríningové nálezy AF AFP s genetickým záverom.
RNDR. MÁRIA KNAPKOVÁ, E-MAIL: [email protected]
PRIM. MUDR. DANA KANTARSKÁ, E-MAIL: [email protected]
NSP F.D. ROOSEVELTA BANSKÁ BYSTRICA, NÁM. GEN. SVOBODY 1,
975 17 BANSKÁ BYSTRICA
informační magazín číslo 6 - 2007
13
Štandardizácia prenatálneho
biochemického skríningu vrodených
chýb v Slovenskej republike.
(Odborné usmernenie MZSR 2006)
zistili aj zvyšovanie záchytu chromozómových abeDiagnostika vývojových chýb plodu (VVCH) v gravidite sa vykorácií. V súčasnosti je záchyt chromozómových abenáva buď priamo (sonografický skríning, laboratórne genetické
rácií na úrovni okolo 3 % z počtu PGD.
vyšetrenie), alebo nepriamo (sonografické a/alebo biochemické
Významný impulz pre štandardizáciu výkonu PGD
markery pre VVCH). Cieľom biochemického skríningu je vypočítať
v II. trimestri gravidity prináša novoprijaté Odborné
individuálne riziko pre VVCH, najčastejšie Downovho syndrómu
usmernenie MZSR o prenatálnom multimarkerovom
(DS) a rázštepu nervovej trubice (NTD). O vypočítanom individuálskríningu vrodených vývojových chýb (VVCH), (Vestnom riziku VVCH a paušálnom populačnom riziku VVCH informujeme
ník MZSR 2006, 122, čiastka 56-60, 15. novembra
tehotnú ženu.
2006). Odborné usmernenie 2006 vyjadruje zásadnú
Zvýšené riziko VVCH nad určitú hranicu je indikáciou na ponuku špecializovapožiadavku na štandardizáciu výkonu skríningu všeného vyšetrenia, napríklad prenatálneho vyšetrenia chromozómov plodu, DNA
obecne a menovite biochemického skríningu VVCH.
analýzu alebo sonografiu s vysokou rozlišovacou schopnosťou. Ak má tehotná
Zdôrazňuje sa uplatnenie systému kontroly správnej
žena o špecializované vyšetrenie záujem, tak po podrobnej konzultácii tieto
klinickej a laboratórnej praxe. Tento zámer je presne
vyšetrenia vykonáme.
definovaný pre podmienky vykonávania základného
Pre výpočet rizika DS pomocou biochemického skríningu sa používa vyšetrenie
„povinného“ skríningu v II. trimestri.
tzv. biochemických markerov. Je ich viacero a triedia sa na markery I. a II. trimesOdborné usmernenie reaguje aj na najnovší vývoj
tra. V období I. trimestra sa najčastejšie používa vyšetrenie tehotenského plazmav skríningových stratégiách, ktoré sa posúvajú do I.
tického proteínu A (PAPP-A) a voľnej beta podjednotky hCG (free beta hCG).
trimestra. Skríning VVCH v I. trimestri je veľmi
V druhom trimestri sú to alfa-l-fetoproteín (AFP), choriongonadotropín (najčaspožadovaný, významne efektívny, vyžaduje kontrotejšie total hCG), nekonjugovaný estriol (uE3) a inhibin A.
lovanú kvalitu vo výkone merania sonografických
Výkon prenatálneho skríningu VVCH bol do roku 2006 odvodený od Odbornémarkerov, preto je aj omnoho náročnejší. Úloha
ho usmernenia MZSR o preventívnych prehliadkach v odbore gynekológia
kvality tímu a jeho spolupráca sú tu extrémne
a pôrodnictvo z roku 1996 (Odborné usmernenie MZ SR zo 16.2.1996 : Prevendôležité. Vyžadované špecializované sonografické
tívne prehliadky v odbore gynekológia a pôrodníctvo: Skríningové vyšetrenie
vyšetrenia a náročné biochemické parametre neutehotných: v 16.–20. týždni gravidity: odber krvi na AFP (VVCH)).
možňujú plošnú organizáciu skríningu v I. trimestri
V tom období bola povinnosť skríningovo vyšetriť len AFP ako jeden skríningona úrovni praktického gynekológa. Skríning v I. trivý parameter. Postupne sme vďaka aktivitám laboratórnych pracovísk došli ku
mestri sa spravidla poskytuje v špecializovaných
rozvoju skríningu a používaniu viacerých skríningových parametrov (hCG, estricentrách. Z toho dôvodu Odborné usmernenie 2006
ol), ako aj špecializovaného softvéru na výpočet individualizovaného rizika Dowzatiaľ len charakterizuje vyšetrované markery
novho syndrómu. Najčastejšie sa v SR používa softvér ALPHA (Logical Medical
a správny postup. Zdôrazňuje sa nutnosť certifikátu
Systems Ltd, London, UK). Tato snaha pracovísk však nestačila, pretože zhruba na
pre sonografické vyšetrenie nuchálnej translucencie
polovici územia SR sa ešte v roku 2006 vykonával biochemický skríning len
(NT) a výpočet rizika pomocou špecializovaného
vyšetrením AFP.
softvéru.
V posledných rokoch sme taktiež konštatovali, že biochemický skríning VVCH je
Skríning VVCH v II. trimestri zostáva základom. Za
v SR vykonávaný v obmedzenom rozsahu a existujú mimoriadne veľké regionálne
minimálny rozsah výkonu sa považuje vyšetrenie
rozdiely v dostupnosti. Ukázalo sa, že Odborné usmernenie MZSR z roku 1996 je
AFP a hCG a výpočet rizika sa musí vykonávať pomouž prekonané. Chýbala nám požiadavka na kontrolu kvality výkonu biochemického skríningu, ktorá by definovala detailný miniTýždeň gravidity
11 12 13 15-18
málny záväzný vykonávací algoritmus.
Našu požiadavku na samostatné Odborné
Skríningová stratégia
% záchytu
usmernenie MZSR o biochemickom skríningu
Kombinovaný (NT+PAPP-A+freebeta hCG)
87
VVCH potvrdzovali aj používané indikácie na preKombinovaný (NT+PAPP-A+freebeta hCG)
85
natálne cytogenetické vyšetrenia (PGD). V roku
1991 sme v SR vykonali 1298 PGD a v roku 2006 to
Kombinovaný (NT+PAPP-A+freebeta hCG)
82
bolo 3000 takýchto vyšetrení. V rokoch 1991-1999
Quadruple (AFP+hCG+E3+inhibin A)
81
bol dominantnou indikáciou PGD vek matky nad
Sekvenčný (kombinovaný + quadruple)
87
85
82
95
35 rokov (44 %) a „pozitívny biochemický skríning“
bol indikáciou len u 30 % výkonov PGD. V roku
Integrovaný biochemický (všetky biochemické)
88
2006 bol vek matky indikáciou u 40 % výkonov
Integrovaný kombinovaný (sono + biochémia)
96
PGD ale „pozitívny biochemický skríning“ už u 46 %
(NT= nuchálna translucencia)
výkonov PGD. V období rokov 2002 až 2006 sme
14
informační magazín číslo 6 - 2007
Skríning VVCH
v I. trimestri je veľmi
požadovaný, významne
efektívny, vyžaduje
kontrolovanú
kvalitu vo výkone
merania sonografi
ckých markerov...
cou certifikovaného softvéru. Odber krvi a zadanie
potrebných údajov pre výpočet rizika VVCH organizuje praktický gynekológ. Vyšetrujúce laboratóriá
majú byť zapojené do externého hodnotenia kvality
a musia spĺňať požiadavky správnej laboratórnej
praxe. Hodnotiace pracovisko má vykonávať najmenej 1000 hodnotení skríningov ročne, aby sa zabezpečilo spoľahlivé určenie mediánov stanovovaných
analytov pre daný gestačný vek. V oblastiach so
sťaženou transportnou dostupnosťou a počtom
vyšetrení 500 -1000 ročne má byť pracovisko napojené na najbližšie štandardizované hodnotiace pracovisko.
Usmernenie definuje aj úlohu genetika v tom, že
indikáciu na prenatálne genetické vyšetrenie stanovuje lekár-genetik v spolupráci s gynekológom.
Genetik má totiž za úlohu zabezpečiť genetické
testovanie plodu štandardným spôsobom. Má teda
vykonať genetickú konzultáciu pred PGD a odbornú interpretáciu výsledkov genetického vyšetrenia
plodu .
Aktuálny stav výkonu skríningu v SR sa zohľadňuje pri jednaniach so zdravotnými poisťovňami
o financovaní niektorej skríningovej stratégie. Podľa
súbornej práce Malone F.D. et al (2005) sa zisťuje
záchytnosť DS, pri výbere na úrovni 5 % falošnej
pozitivity, podľa rôznych skríningových stratégií
v tabulke.
Štandardizovaný výkon skríningu podľa Odborného usmernenia 2006 umožní v SR prenatálne odhaliť teoreticky okolo 60 % prípadov DS. Pri zohľadnení
záujmu zo strany populácie a ostatných faktorov je
reálne očakávať prenatálnu záchytnosť DS medzi 40
– 50 %. Ďalšie zvýšenie záchytnosti DS a iných chromozómových aberácií alebo VVCH je možné len rozšírením využívania prenatálneho skríningu v I. trimestri.
Literatúra:
Malone F.D. et al.: First-Trimester or Second-Trimester Screening, or Both, for Down´s Syndrome, N Engl
J Med 353, 19,Nov 10,2005 s. 2001-2011.
PRIM. MUDR. FRANTIŠEK CISÁRIK, CSC.,
ODDELENIE LEKÁRSKEJ GENETIKY,
NSP ŽILINA, V. SPANYOLA 43,012 07 ŽILINA,
E-MAIL: [email protected]
Změny hladin
thymidinkinázy
(TK) v průběhu
adjuvantní
a paliativní
chemoterapie
u kolorektálního
karcinomu
Úvod
Thymidinkináza (TK) je důležitý enzym v metabolismu nukleových kyselin, a je
proto považována za významný marker buněčné proliferace (1,2). Rozhodli
jsme se proto sledovat dynamiku thymidinkinázy v průběhu adjuvantní a paliativní chemoterapie u pacientů s kolorektálním karcinomem.
Materiál a metodika
Thymidinkináza byla sledována u 30 nemocných s diagnózou karcinomu
tlustého střeva a rekta a léčených chemoterapií na Oddělení onkologie
a radioterapie Fakultní nemocnice Plzeň. Thymidinkináza byla stanovována
radioreceptorovou analýzou (RRA, Immunotech Praha). Podmínkou zařazení
do studie bylo, že thymidinkináza byla sledována vždy před zahájením cyklu
chemoterapie a po jejím skončení, a to u 3 cyklů adjuvantní či paliativní chemoterapie. Jednalo se vždy o režim s 5-fluorouracilem (De Gramonte, Mayo
režim). Hodnoty TK byly korelovány s klinickým průběhem onemocnění
a s typem terapie.
Výsledky
Základní charakteristika souboru nemocných je uvedena v tabulce č. 1. V následujících grafech jsou uvedeny jednotlivé hodnoty u všech 30 nemocných před
a po jednotlivých cyklech. Z grafu č. 1 až 3 vyplývá, že ve většině případů byly
hodnoty na začátku 1. cyklu nízké a výrazně stoupaly až po skončení 1. cyklu
chemoterapie. Do následujícího cyklu hodnoty opět klesly. Obdobnou dynamiku jsme zaznamenali po druhém i třetím cyklu chemoterapie. Na základě těchto dynamických změn byly hodnoty thymidinkinázy korelovány s typem chemoterapie (adjuvantní, paliativní) a klinickým průběhem onemocnění. Příklady
typických změn hodnot thymidinkinázy před a po adjuvantní chemoterapii
jsou uvedeny na grafu č. 4. Charakteristické změny pozorované při paliativní
chemoterapii jsou na grafech č. 5 a 6. U adjuvantní chemoterapie byly hodnoty thymidinkinázy při zahájení každého cyklu terapie nízké a po skončení terapie vždy vysoké (viz graf č. 4). U paliativní chemoterapie byla dynamika hodnot
TK různá. Obecně lze konstatovat, že pokud se dynamika TK u paliativní chemoterapie podobala typické dynamice adjuvantní terapie, zaznamenali jsme
u pacientů příznivou odpověď na léčbu. Pokud zůstávaly hodnoty trvale vysoké
či dokonce vzrůstaly, nebyla zaznamenána terapeutická odpověď (viz grafy č. 5
a 6).
Současně s thymidinkinázou jsme u nemocných sledovali i další nádorové
markery (CEA, CA 19-9, TPA, TPS). Tato sledování nejsou součástí tohoto sdě-
informační magazín číslo 6 - 2007
15
Graf č. 1: Vzestup thymidinkinázy v průběhu prvního
cyklu chemoterapie
Graf č. 2: Vzestup thymidinkinázy v průběhu druhého
cyklu chemoterapie
Thymidinkináza se jeví
jako vhodný parametr
pro kontrolu efektu
adjuvantní a paliativní
chemoterapie
kolorektálního
karcinomu.
lení, ale v souhlase s literaturou jsme prokázali, že
při adjuvantní i paliativní chemoterapii vykazují
tyto markery na rozdíl od TK poměrně malou variabilitu.
Diskuse
Graf č. 3: Vzestup thymidinkinázy v průběhu třetího
cyklu chemoterapie
Graf č. 4: Vzestup thymidinkinázy v průběhu adjuvantní
chemoterapie (6 cyklů)
Na základě našich výsledků a údajů z literatury je
zřejmé, že thymidinkináza je použitelná pro sledování průběhu a efektu chemoterapeutické léčby
(3,4). Zdá se, že je jediným markerem, který lze
použít u adjuvantní terapie, vzhledem k tomu, že
u těchto nemocných jsou ostatní nádorové markery, včetně cytokeratinů, v mezích normy a vykazují
minimální variabilitu. U paliativní léčby sice ke
změnám ostatních nádorových markerů dochází,
ale dynamika změn je podstatně pomalejší a méně
signifikantní, než jsou pozorované změny thymidinkinázy. Z těchto důvodů většina autorů sledování nádorových markerů pro monitoraci terapie
nedoporučuje (5, 6). Pokud jsou údaje o vztahu
nádorových markerů k efektu terapie, jde o hodnocení hladin markerů získaných nejméně tři měsíce
po skončení terapie (7). Taková sledování umožňují
hodnocení konečného efektu chemoterapie, ale
nehodí se pro individualizaci a optimalizaci terapie
(8). Thymidinkinázu lze k tomuto účelu použít především proto, že má krátký biologický poločas
a účastní se při syntéze DNA (9,12). U nádorů kolon
a rekta souvisí přítomnost thymidinkinázy a thymidylát syntetázy přímo s etiopatogenezí nádoru a je
diskutována i otázka využití thymidinkinázy v léčbě
(10,11). Naším dlouhodobým cílem je vypracovat
systém optimalizace a individualizace terapie
pomocí sledování změn biologické aktivity nádorového procesu.
Závěr
Ze sledovaných nádorových markerů se v průběhu chemoterapie typicky měnila pouze thymidinkináza, která u adjuvantní chemoterapie byla
většinou nízká při zahájení cyklu a po skončení
cyklu obvykle docházelo k výraznému zvýšení
hodnot. Naproti tomu u paliativní chemoterapie
byla dynamika thymidinkinázy různá a závisela
především na efektu terapie. Ostatní nádorové
markery se chovaly nestandardně a se změnami
16
informační magazín číslo 6 - 2007
TK korelovaly minimálně. Thymidinkináza se jeví
jako vhodný parametr pro kontrolu efektu adjuvantní a paliativní chemoterapie kolorektálního
karcinomu.
Literatura
1. Kralovanszky J, Koves I, Orosz Z, Katona C, Toth K,
Rahoty P, Czegledi F, Kovacs T, Budai B, Hullan L,
Jeney A. Prognostic significance of the thymidylate
biosynthetic enzymes in human colorectal tumors.
Oncology 62(2):167-74, 2002.
2. Wu J, Mao Y, He L, Wang N, Wu C, He Q, Skog S.
A new cell proliferating marker: cytosolic thymidine kinase as compared to proliferating cell nuclear
antigen in patients with colorectal carcinoma.
Anticancer Res 20(6C):4815-20, 2000.
3. O‘Neill KL, Buckwalter MR, Murray BK. Thymidine
kinase: diagnostic and prognostic potential. 7:
Expert Rev Mol Diagn: 1(4):428-33, 2001.
4. Bidart JM, Thuillier F, Augereau CH et al. Kinetics
of Serum Tumor Marker Concentrations and Usefulness in Clinical Monitoring. Clinical Chemistry
45 (10): 1695-1707, 1999.
5. Bast, RC., Bates,S., Bredt,AB., et al.: Clinical practice guidelines for the use of tunor markers in
breast and colorectal cancer. J Clin Oncol 14, 1996,
s.2843-2877.
6. De Vita, VT., Vincent, T., Hellman, S., Rosenberg,
A.: Cancer of the Colon. In: Cancer: Principles
Practise of Oncology. Lippincott - Raven Publishers
1997, s. 1144-1182.
7. European Group on Tumor Markers: Consensus
Recommendations. Anticancer Research 19: 27852820, 1999.
8. Lothar,T.: Tumormarker. In: Labor und Diagnose.
Frankfurt am Main: TH Books: 976-979, 1998.
9. Akbay A, Demirtas S, Yavuz Y. Increased serum
thymidine kinase following chemotherapy. Ann
Clin Biochem 36 (6):771-773, 1999.
10. Thomas WM, Robertson JF, McKenna PG, O‘Neill
KL, Robinson MH, Hardcastle JD. Serum thymidine
kinase in colorectal neoplasia. Eur J Surg Oncol.
21(6):632-4, 1995.
11. Fujii R, Seshimo A, Kameoka S. Relationships
between the expression of thymidylate synthase,
dihydropyrimidine dehydrogenase, and orotate
phosphoribosyltransferase and cell proliferative
activity and 5-fluorouracil sensitivity in colorectal
carcinoma. Int J Clin Oncol. 8(2):72-8, 2003.
12. Tanigawa N, Katoh Y, Fujii H, Shimomatsuya T,
Aotake T, Yamakawa M. Prediction of prognosis of
patients with gastrointestinal cancer based on thymidine uptake. Gan To Kagaku Ryoho. 21(3):38894, 1994.
PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.,
ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY,
FN PLZEŇ, DR.E.BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇ,
E-MAIL: [email protected]
Ze sledovaných nádorových
markerů se v průběhu
chemoterapie typicky měnila
pouze thymidinkináza, ...
Graf č. 5: Vzestup thymidinkinázy v průběhu paliativní
chemoterapie (6 cyklů) - příznivá prognóza
Graf č. 6: Vzestup thymidinkinázy v průběhu paliativní
chemoterapie (6 cyklů) - nepříznivá prognóza
Tabulka č.1: Základní charakteristika skupiny pacientů
Adjuvantní
chemoterapie
Paliativní
chemoterapie
Počet pacientů
15
15
Průměr věk (roky)
60,7
62,9
Medián (roky)
61,0
64,0
37,0 – 76,0
53,0 - 71,0
Minimum-maximum
(roky)
informační magazín číslo 6 - 2007
17
Indikátorové
proteiny v moči (1)
Stanovení celkové proteinurie je rutinním
požadavkem, ne vždy však poskytuje klinickému
lékaři dostatečnou informaci. Patologická exkrece
plazmatických bílkovin do moče je často projevem
renálních i některých extrarenálních onemocnění.
okud koncentrace bílkovin v moči překročí 100-150 mg/l, projeví
se obvykle klinicky manifestní proteinurií, prokazatelnou testačními proužky nebo zkouškou s kyselinou sulfosalicylovou. Stanovení
celkové proteinurie může vyhovovat jako orientační hodnota pro
odhad ztráty bílkoviny močí nebo jako součást vyšetření u nemocných s předpokládaným onemocněním ledvin. Pro sledování nemocných s již známým
renálním onemocněním hodnota celkové proteinurie neposkytuje dostatek
informací. Celková hodnota může být (a často je) tvořena více proteiny a jejich
vzájemný poměr se může měnit. Je známé, že i pokud celková proteinurie
nepřesahuje dohodnutou hodnotu 150 mg/d, může být svým složením patologická (mikroalbuminurie, řada tubulárních proteinurií, některé malé paraproteinurie). Pro časnou diagnostiku mohou být však významné již první změny
v exkreci plazmatických bílkovin, při nichž ještě klinicky manifestní proteinurie
není prokazatelná.
Představu o kvalitativním složení proteinurie poskytuje elektroseparační
analýza močových bílkovin. V praxi se jedná o různé modifikace elektroforézy
v polyakrylamidovém gelu, nověji i na podkladě reakce se specifickými protilátkami proti jednotlivým tzv. indikátorovým bílkovinám nebo elektroforéza nezahuštěné moče v agarózovém gelu při vyšším napětí. Elektroseparační techniky
poskytují informaci o spektru většiny vylučovaných bílkovin a jejich vzájemných vztazích, avšak rutinně neumožňují kvantifikaci jednotlivých složek ani
vyjádření závislosti exkrece jednotlivých složek na velikosti diurézy.
Perspektivním cílem vyšetřování protinurií je automatizovaná analýza
vhodných indikátorových bílkovin v moči a vzájemné posouzení jejich
exkrecí pomocí indexů a grafů, případně expertních systémů.
V základní verzi je využíváno stanovení albuminu jako glomerulárního markeru, alfa-1-mikroglobulinu jako tubulárního markeru, celkové proteinurie
pro kontrolu úplnosti proteinurie a detekci event. prerenální proteinurie. Diagnostická výtěžnost vzroste v kombinaci se screeningovým vyšetřením močovými reagenčními proužky (bílkovina, krev a leukocytární esteráza). Rozšířená
verze je doplněna o stanovení NAG pro diferenciaci akutní a chronické tubulární léze, IgG pro rozlišení glomerulárního a tubulointersticiálního poškození
a alfa-2-makroglobulinu pro diferenciaci hematurie; všechny hodnoty exkrece jsou vztažené na močový kreatinin a jako optimální vzorek je považována
druhá ranní porce.
Popsaný systém umožňuje:
■ časnou detekci již v prvních fázích. Při screeningovém posuzování renální
funkce pomocí konvenčního vyšetření na základě celkové proteinurie a na
základě exkrece specifických proteinů močí (celková proteinurie, albumin
a alfa-1-mikroglobulin) je druhým ze způsobů zachyceno o cca 50 % renálních dysfunkcí (glomerulárních i tubulárních)
■ vyšší záchyt tubulárních a prerenálních proteinurií
■ vyloučení renálního postižení spolehlivěji než pouze na podkladě stanovení celkové proteinurie
■ neinvazivní diferenciaci glomerulopatií a tubulointersticiálního
postižení
18
informační magazín číslo 6 - 2007
■
neinvazivní diferenciaci renální a postrenální
hematurie (s omezením vlivu subjektivního hodnocení při posuzování dysmorfních erytrocytů
mikroskopicky ve fázovém kontrastu)
■ sledování průběhu nefrologických onemocnění
včetně event. reakce na terapii
■ doplnění morfologické informace z histopatologického nálezu
■ upozornění ošetřujícího lékaře na vhodnost
invazivního vyšetření, např. renální biopsie
V následujícím miniseriálu bychom vás rádi
seznámili s tímto systémem hodnocení proteinurií;
nejprve s jednotlivými tzv. indikátorovými bílkovinami v moči a jejich výpovědní hodnotou a poté
s možnostmi hodnocení proteinurie a hematurie
na podkladě exkrece tzv. indikátorových bílkovin.
Albumin
je (s výjimkou některých paraproteinurií) v různé
míře součástí prakticky všech proteinurií. Jedná se
o protein s Mr 67 kD, který je filtrovaný glomeruly.
Albumin se ve filtrátu váže na receptorovou bílkovinu megalin (s nízkou afinitou, ale vysokou kapacitou). Transtubulárně se většina intaktního
albuminu dostává do extracelulární tekutiny
a v kartáčovém lemu tubulárních buněk se váže na
receptorovou molekulu cubulinu (s vysokou afinitou, ale nízkou kapacitou), která zprostředkovává
transport albuminu do lyzosomů, kde probíhá jeho
degradace. Degradační produkty, kterých je
cca 1 300 mg/d, zatím neumíme rutinně stanovit.
Na izolovaný vzestup exkrece albuminu (mikroalbuminurii) se donedávna pohlíželo jako na projev
poklesu nebo zániku účinnosti elektrostatické
repulze glomerulární stěny a projev generalizované
dysfunkce endotelu. Podle novějších poznatků
patologická albuminurie (mikro- i makroalbuminurie) odráží také změny mezi exkrecí intaktního
a degradovaného albuminu.
Jako normální exkrece albuminu při klidovém
režimu se udává koncentrace 4 -12 mg/l s horní
hranicí 20 mg/l (20 μg/min), resp. 30 mg/d při průměrné diuréze 1,5 l/24 hod, v přepočtu na močový
kreatinin 2,26 g/mol (20 mg/g), pokud budeme
exkreci vztahovat podle pohlaví, uvádí se jako horní hranice u mužů 2,0 g/mol, u žen 2,8 g/mol kreatininu. Exkrece albuminu močí má velkou intraindividuální variabilitu (průměrně 30 %).
Mikroalbuminurie je vylučování malého
množství albuminu 30-300 mg/d (20-200 μg/min;
resp. 2,8-22,8 g/mol kreatininu) pod detekčním
limitem močových reagenčních proužků pro bílkovinu (obvykle 150 mg/l), které lze prokázat citlivými
metodami na bázi imunoturbidimetrie a imunonefelometrie. Exkrece albuminu je ovlivněna řadou
fyziologických faktorů (příjem tekutin a míra kon-
centrace moče, fyzická aktivita, stres, …), proto se
jako mikroalbuminurie označuje až přítomnost
pozitivních alespoň dvou ze tří nezávislých vzorků
vyšetřených během 6 měsíců. Při nálezu zvýšené
exkrece albuminu nad horní fyziologickou mez je
třeba vyloučit jiné příčiny – infekci močových cest,
fyzickou námahu, systémovou infekci, srdeční
selhávání, špatně kontrolovanou nebo dosud nepoznanou hypertenzi apod.
Stanovení mikroalbuminurie má několik klinických
indikací. V první řadě je jedním z diagnostických kritérií diabetické nefropatie. U 30-40 % nemocných
s diabetem I. typu se po průměrné době trvání diabetu 15 let vyvíjí nefropatie, více než 80 % nemocných s diabetem I. typu a perzistentní mikroalbuminurií progreduje do diabetické nefropatie,
u nemocných s diabetem II. typu jen 25 %. U nemocných s diabetem II. typu je však perzistentní mikroalbuminurie především rizikovým faktorem kardiovaskulární morbidity a mortality. Při současné
prevalenci cca 7 % diabetu v populaci je 40 % pacientů v chronickém dialyzačním programu pro
chronické renální selhání na podkladě pokročilé diabetické nefropatie. Nemocní s mikroalbuminurií
představují pacienty rizikové a pacienty s nefropatií
v časném stadiu (stadium III diabetické nefropatie),
kdy adekvátní terapie (striktní normotenze, optimalizace kompenzace diabetu včetně metabolických
poruch, terapie inhibitory angiotenzin konvertujícího
enzymu) může zabránit nebo alespoň zpomalit progresi poklesu renálních funkcí. Přítomnost makroalbuminurie (více než 300 mg/d) je obvykle spojena
se IV. a V., již ireverzibilním, stupněm diabetické nefropatie a manifestní glomerulární nebo smíšenou
glomerulotubulární proteinurií prokazatelnou testačními proužky pro bílkovinu. Mikroalbuminurie je
rovněž rizikovým faktorem rozvoje vaskulární nefropatie u nemocných s hypertenzí, při úspěšné terapii
a kompenzaci hypertenze mizí. Mikroalbuminurie je
obecným indikátorem endoteliální dysfunkce
(nejen v ledvině), je nezávislým rizikovým faktorem
pro kardiovaskulární morbiditu, tak jako např.
nadměrná tělesná hmotnost, dyslipidémie, kouření,
hypertenze, inzulinová rezistence apod.
lektivity při strukturních změnách glomerulární stěny (např. u glomerulonefritid) nebo při funkční aktivaci zkratových pórů bazální membrány (např.
u ponámahové proteinurie). V obou případech se exkrece IgG zvyšuje souběžně
a proporcionálně s exkrecí albuminu a permeabilita glomerulární stěny zůstává
v určité reziduální míře zachována. Proporcionální vzestup exkrece IgG (současně
s plazmatickými makroproteiny) je rovněž projevem postrenální proteinurie při
krvácení a zánětech v močových cestách. Permeabilita kapilární sítě vývodných
močových cest je vysoká a nedokáže zabránit úniku plazmatických makroproteinů do moče. Izolovaný vzestup exkrece IgG je projevem jeho lokální syntézy
v ledvinách při zánětlivých intersticiálních nefropatiích.
IgG v moči se používá rovněž pro posuzování tzv. selektivity glomerulární
proteinurie. Za předpokladu, že určujícími momenty renální exkrece bílkovin je
jejich filtrace podle efektivního hydrodynamického poloměru, tzv. index selektivity vyjadřuje procentuální podíl clearance bílkoviny s větší Mr (obvykle IgG)
na clearanci referenční plazmatické bílkoviny s menší Mr (obvykle albuminu).
Hodnoty indexu menší než 0,1 (10 %) charakterizují vysokou selektivitu, hodnoty větší než 0,2 (20 %) neselektivní glomerulární proteinurii. Výsledky vyšetření je třeba hodnotit s určitou rezervou, protože mohou být ovlivněny tubulární resorpcí bílkovin a změnou Mr vylučovaných bílkovin. V klinické praxi má
význam průkaz vysoké selektivity u nefrotického syndromu s minimálními
změnami.
Alfa-2-makroglobulin
je makromolekulární protein s Mr 720-900 kD, který se fyziologicky v moči
vyskytuje jen ve stopovém množství, zřejmě důsledkem jeho difúze stěnou
kapilár vývodných močových cest (stejně tak jako apoAI, který se však rutinně
nestanovuje). Ve zvýšeném množství ho lze detekovat v moči jen při její kontaminaci alfa-2-makroglobulinem z krve, protože vzhledem ke své molekulové
hmotnosti alfa-2-makroglobulin nepřestupuje bazální membránu glomerulu.
Vzestup jeho exkrece je tedy indikátorem postrenálních proteinurií při zánětech a krvácení ve vývodných močových cestách. Stanovení se využívá především pro diferenciaci renálních a postrenálních hematurií. Průměrná
exkrece se pohybuje kolem 2,1 mg/d, jako horní hranice se nejčastěji udává
7 mg/g (0,79 g/mol kreatininu)
NAG (N-acetyl-D-glukozaminidáza)
je některými autory doporučován jako citlivější
indikátor funkce elektrostatické repulze, vzestup
jeho clearance může předcházet změnám v exkreci
albuminu v nejčasnějších fázích vývoje glomerulárních proteinurií. Jako horní hranice fyziologické
exkrece se udává 1,2 mg/l (2 mg/d), resp. 1,9 mg/g
kreatininu; střední hodnoty exkrece se pohybují
kolem 0,2 mg/d.
je enzym lokalizovaný v lyzosomech tubulárních buněk. Podílí se na štěpení
glykoproteidů ve fagolysosomech obsahujících bílkoviny z ultrafiltrátu. Rezidua štěpení společně s NAG jsou uvolňována do moče. Vzestup exkrece NAG
močí je často prvním, ale nespecifickým indikátorem změn v tubulech. Zvýšená
exkrece může být vyvolána nejen apoptózou nebo nekrózou tubulárních
buněk působením nefrotoxických látek (léků, bakteriálních toxinů, kontrastních
látek apod.), ale i zvýšenou metabolickou aktivitou tubulárních buněk při
jejich regeneraci (např. po akutním selhání ledvin) nebo intenzivní resorpcí
bílkovin z ultrafiltrátu při jejich vysoké nabídce (u nefrotické proteinurie
nebo tzv. overflow proteinurie při vysoké nabídce např. volných lehkých řetězců imunoglobulinů při některých monoklonálních gamapatiích (mnohočetný
myelom, primární systémová AL-amyloidóza, light chain deposition disease),
hemoglobinu při intravaskulární hemolýze nebo myoglobinu při rhabdomyolýze) nebo intersticiálními změnami v rámci pokročilých onemocnění ledvin.
Stanovení NAG je proto vhodné kombinovat s vyšetřeními méně citlivými, ale
specifičtějšími – zejména exkrecí některé z tzv. volně filtrovatelných bílkovin
(v praxi alfa-1-mikroglobulinu) a albuminu. Jako horní fyziologická hranice se
udává 6,3 U/l, tj. 5 U/g resp. 0,56 U/mol kreatininu.
Imunoglobulin IgG
Beta-2-mikroglobulin
je protein, který se vyskytuje ve více molekulárních
formách, hlavní složka 7S s Mr 150 kD. Vzestup jeho
exkrece je nejčastěji projevem glomerulární nese-
je mikroprotein o Mr 11,8 kD, který vykazuje strukturní analogii s částmi
těžkého řetězce IgG. Je nekovalentně vázaný na glykoproteinový řetězec HLA
antigenů I. třídy na membráně jaderných buněk. Procesy spojené s prolifera-
Transferin
informační magazín číslo 6 - 2007
19
cí buněk (hematologické malignity, některé záněty) mohou ve svém důsledku
zvyšovat plazmatickou koncentraci beta-2-mikroglobulinu, stejně tak jako
všechna onemocnění, která vedou k poklesu glomerulární filtrace. Beta-2mikroglobulin je totiž podobně jako alfa-1-mikroglobulin vylučován převážně glomerulární filtrací; udává se, že se může v určité míře uplatňovat i tubulární sekrece. Beta-2-mikroglobulin z ultrafiltrátu je resorbován
a katabolizován v buňkách proximálních tubulů. Při překročení tubulárního
resorpčního maxima se zvyšuje jeho exkrece močí, stejně tak jako při toxickém poškození tubulárních buněk nebo při vysoké nabídce jiných bílkovin
z ultrafiltrátu.
Jako horní hranice fyziologické exkrece se udává hodnota 0,3 mg/d (0,22
mg/g kreatininu), střední hodnota exkrece se pohybuje kolem 0,07 mg/d. Exkrece nezávisí na pohlaví, s věkem a fyziologickým poklesem glomerulární filtrace
se hodnoty mírně zvyšují. Hodnoty beta-2-mikroglobulinu v moči jsou významně ovlivněny jeho nestabilitou. Při pH moče < 5,5 dochází k jeho rychlé a kvantitativně významné dekompozici. Dekompozici lze omezit alkalizací před sběrem moče (p.o. 10 g/d NaHCO3, jako méně spolehlivá varianta se udává
krátkodobý sběr s alkalizací moče těsně po mikci pomocí NaOH na pH moče
≥6). K dekompozici beta-2-mikroglobulinu dochází i vyšším pH se současnou
leukocyturií při infekcích močových cest (vlivem proteolytických enzymů z leukocytů), může se uplatňovat i teplota v močovém měchýři při sběru přes noc.
S přihlédnutím k uvedeným preanalytickým faktorům je stanovení beta-2mikroglobulinu v moči jako indikátoru funkce proximálního tubulu stále
častěji nahrazováno stanovením jiných bílkovin, v praxi nejčastěji alfa-1-mikroglobulinu.
Beta-2-mikroglobulin v moči je však v některých studiích zmiňován jako
časný ukazatel virové infekce (CMV aj.) u nemocných s transplantovanou
ledvinou. Udává se, že izolovaný vzestup exkrece beta-2-mikroglobulinu močí
předchází pozitivitu serologických markerů infekce o 12-40 dnů.
dne na den může být redukována po vztažení
hodnot exkrece jednotlivých proteinů na močový
kreatinin (který odráží stupeň koncentrace moče)
až na 30%. Koncentrace vykazují dobrou srovnatelnost s hodnotami ze 24-hod sběru. Tzv. standardizovaná 2. ranní porce je za podmínek lačnění
a vyloučení fyzické aktivity do vymočení (ranní
cvičení může vést k relativní dehydrataci, krátkodobému zvýšení filtračního tlaku a cvičením indukované benigní proteinurii), někteří autoři doporučují mírnou, kofeinem indukovanou vodní
diurézu. Prosté koncentrace (nevztažené na
močový kreatinin) jsou použitelné jen za předpokladu relativně stabilní diurézy a stupně koncentrace moče.
Srovnání beta-2mikroglobulinu
a alfa-1-mikroglobulinu
jako markerů funkce
proximálního tubulu,
resp. tubulárního
poškození
Alfa-1-mikroglobulin
je glykoprotein s Mr 26-33 kD. Syntetizuje se v hepatocytech a lymfocytech a jeho fyziologická funkce v krvi není zcela jasná. V plazmě je z větší
části vázaný na monomer IgA a albumin; současně se vyskytuje i volný
alfa-1-mikroglobulin asi v 10 x nižší koncentraci než vázaná forma. Alfa-1mikroglobulin patří mezi tzv. volně filtrovatelné bílkoviny, z ultrafiltrátu je
z více než 90 % zpětně resorbován a následně katabolizován v buňkách
proximálních tubulů. Močí je denně vyloučeno 2-9 mg/l volného alfa-1mikroglobulinu. Udává se, že exkrece se mírně liší podle pohlaví s maximem
ve 4.-5. deceniu u mužů a 6.-7. deceniu u žen. Jako horní hranice fyziologické exkrece se udává ve věku do 40 let 11,2 mg/g (resp. 1,27 g/mol kreatininu), nad 40 let 19,4 mg/g (2,2 g/mol kreatininu), bez věkového rozlišení
je nejčastější hranice 12 mg/l, resp. 20 mg/d, což odpovídá hodnotě
14 mg/g (1,58 g/mol).
Stanovení alfa-1-mikroglobulinu v moči se využívá v současnosti jako
metoda volby při hodnocení změn resorpce tzv. volně filtrovatelných bílkovin, resp. jako jednoho z indikátorů funkce proximálního tubulu. Při toxickém poškození proximálního tubulu a všech formách intersticiálních nefropatií včetně sekundárních tubulointersticiálních lézí při pokročilých stadiích
onemocnění postihujících primárně glomeruly nacházíme v moči zvýšenou
exkreci alfa-1-mikroglobulinu.
Objem moče závisí na řadě faktorů – teplotě okolí, příjmu stravy a tekutin,
míře a intenzitě fyzické aktivity, stresu apod. a během 24 hod vykazuje vysokou intraindividuální variabilitu. Obecně je tedy doporučován 24-hod sběr
moče. Vzhledem k tomu, že sběr moče je zatížený značnou chybou (spolupráce nemocného, dodržení podmínek skladování, správná doba a objem), jako
ideální vzorek se doporučuje druhá ranní moč (za předpokladu vyloučení
nadměrné fyzické aktivity a není-li polyurie). Intraindividuální variabilita ze
20
i n f o r m a č n í m a g a z í n č í s l o 56 - 2 0 0 7
Je obecně známé, že alfa-1-mikroglobulin je vzhledem ke stabilnějším preanalytickým podmínkám lepším indikátorem funkce proximálního tubulu. V letech
2003-2005 se naše laboratoř podílela na výzkumné
studii společně s klinikou nefrologie a klinikou anesteziologie a resuscitace IKEM Praha. Studie se týkala
sledování renálních funkcí v perioperačním období po
ortodopické transplantaci jater. V rámci studie jsme
měřili také exkrece některých proteinů močí (celkovou
proteinurii, koncentraci močového kreatininu, albuminu, alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu v moči). V době designu studie naše laboratoř ještě
nestanovovala alfa-1-mikroglobulin; stanovení jsme
zavedli až koncem roku 2004. U části pacientů, jejichž
vzorky močí jsme v rámci studie vyšetřovali, jsme tedy
měli možnost porovnat hodnoty alfa-1-mikroglobulinu (imunonefelometricky na analyzátoru IMMAGE,
Beckman Coulter) a beta-2-mikroglobulinu (LEIA na
analyzátoru Immulite-1, BioVendor, resp. DPC).
Jednalo se o 188 vyšetření od 51 pacientů provedených v průběhu 5-7 dnů. Jako horní hranici fyziologické exkrece jsme uvažovali obecně doporučenou hodnotu pro beta-2-mikroglobulin 0,3 mg/l, resp. 0,22
mg/g kreatininu, pro alfa-1- mikroglobulin 12 mg/l,
resp. 14 mg/g kreatininu. Hodnoty exkrece beta-2mikroglobulinu v souboru se pohybovaly v rozmezí 020,5 mg/l (resp. 0-199,2 mg/g kreatininu), exkrece
alfa-1-mikroglobulinu v rozmezí 0-317,9 mg/l (resp.
0-634,2 mg/g kreatininu). Z původního souboru všech
pacientů (n=216) jsme vyřadili výsledky pacientů
s exkrecí beta-2-mikroglobulinu vyšší než 20,5 mg/l,
protože hodnoty přesahující rozsah měření nebyly
vyčíslovány (pro potřeby studie nebylo požadováno).
Pokud jsme porovnali párové hodnoty a stanovili
regresní funkci, je vidět malá lineární závislost hodnot
(r = 0,396 pro hodnoty vyjádřené v mg/l (p < 0,01), pro
hodnoty vztažené na kreatinin je vztah o něco těsnější, r = 0,525, p < 0,001).
Počet vyšetření, která byla v jednom testu pozitivní
(resp. výsledek nad dohodnutou rozhodovací mezí)
a v druhém negativní (resp. v rámci fyziologického
rozmezí) jsme porovnávali pomocí koeficientu kappa.
Koeficient kappa udává míru spolehlivosti dvou veličin, resp. nakolik je pozitivní výsledek jedné metody
shodný s pozitivním výsledkem druhé metody při
použití určitých diskriminačních mezí. Hodnota koeficientu κ = 0,4-0,75 odpovídá dobré, κ > 0,75 velmi
dobré shodě.
Pro diskriminační mez 0,3 mg/l u beta-2-mikroglobulinu a 12 mg/l u alfa-1-mikroglobulinu je κ = 0,622,
pro diskriminační hodnoty vztažené na exkreci močo-
Pro exkrece tubulárních indikátorových proteinů s diskriminační hranicí vyjádřenou
jako prostá koncentrace v mg/l (cut-off 0,3 mg/l pro beta-2-mikroglobulin a 12 mg/l
pro alfa-1-mikroglobulin):
beta-2-mikroglobulin
n = 188
pozitivní (> 0,3 mg/l)
negativní (≤ 0,3 mg/l)
pozitivní (> 12,0 mg/l)
109
26
negativní (≤ 12,0 mg/l)
8
45
alfa-1-mikroglobulin
Pro exkrece tubulárních indikátorových proteinů s diskriminační hranicí vyjádřenou jako koncentrace vztažená na močový kreatinin v mg/g (cut-off 0,22
mg/g pro beta-2-mikroglobulin a 14 mg/g pro alfa-1-mikroglobulin:
n = 188
beta-2-mikroglobulin
pozitivní (> 0,22 mg/l) negativní (≤ 0,22 mg/l)
alfa-1-mikroglobulin
pozitivní (> 14,0 mg/l)
134
8
negativní (≤ 14,0 mg/l)
12
31
Závislost hodnot alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu vyjádřených v mg/l, regresní funkce
y = 5,3x+32,5, r = 0,396 (p < 0,01)
Závislost hodnot alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu vyjádřených v mg/g močového kreatininu,
regresní funkce y = 3,01x+93,4, r = 0,525 (p < 0,001).
informační magazín číslo 6 - 2007
21
vého kreatininu 0,22 mg/g pro beta-2-mikroglobulin
a 14 mg/g pro alfa-1-mikroglobulin dokonce κ = 0,700.
Tato shoda ovšem předpokládá správné preanalytické
i analytické hodnocení, což je u stanovení beta-2-mikroglobulinu v praxi obtížně dosažitelné. Porovnáním
párových hodnot při vyjádření exkrece v mg/l bylo možné označit jako hodnoty ovlivněné pravděpodobnou
dekompozicí beta-2-mikroglobulinu minimálně 17 ze
188 výsledků (9,0 %), při vztažení na exkreci močového
kreatininu pak minimálně 7 z 188 (3,7 %).
Závěrem lze tedy říci, že stanovení alfa-1-mikroglobulinu v moči je metodou volby při automatizovaném screeningovém posuzování tubulární funkce
(namísto dříve stanovovaného beta-2-mikroglobulinu).
Stanovení má některé analytické výhody:
■ koncentrace alfa-1-mikroglobulinu v moči je stabilní, nezávisí na pH ani teplotě moče,
■ rozsah měření je mnohem širší bez nutnosti ředění, ve srovnání s beta-2-mikroglobulinem jsou koncentrace obecně vyšší,
■ korelace konkrétních hodnot alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu je velmi slabá.
Pro posouzení přítomnosti/nepřítomnosti tubulárního poškození je citlivějším indikátorem exkrece
alfa-1-mikroglobulinu vztažená na močový kreatinin než prostá koncentrace.
Za statistické zhodnocení patří poděkování ing. Věře
Lánské, CSc., IKEM
(POKRAČOVÁNÍ PŘÍŠTĚ)
MUDR. JANA GRANÁTOVÁ, OKB, FAKULTNÍ
THOMAYEROVA NEMOCNICE
VÍDEŇSKÁ 800, 140 59 PRAHA 4,
E-MAIL: [email protected]
Použitá literatura:
Teplan, V.: Praktická nefrologie, Grada, Praha, 1998
Schück, O., Tesař, V., Teplan, V.: Klinická nefrologie, Medprint, Praha, 1995
Engliš, M.: Proteinurie, Stapro, Pardubice, 1993
Boege, F.: Urinary proteins, in Thomas, L.: Clinical Laboratory Diagnostics, TH Books, 1 st English Edition, Frankfurt am M., 1998
Thomas, L.: Proteindiagnostik, Diagnose und Therapiekontrolle, Behring Diagnostika, Frankfurt am M., 1991
Hofmann, W., Guder, W.G.: A diagnostic programme for
quantitative analysis of proteinuria. J. Clin. Chem. Clin.
Biochem., Vol. 27, 1989, 589-600
Hofmann, W. et al.: Diagnostic strategies in urinanalysis, Kidney Int., Vol. 46, Suppl. 47 (1994), 111-114
Ivandič, M. et al: Development and evaluation of an
urin protein expert system. Clin. Chem. 42:8 (1996),
1214-1126
Dati, F., Lammers, M.: Immunochemical methods for
determination of urinary protein (albumin and α1microglobulin) in kidney diseases. J. Int. Fed. Clin. Chem.,
1989; 1: 68-76
Nováčková, L.: Proteinurie včera a dnes, Uživatelské dny
Beckman Coulter, Přerov, 3/2007
22
informační magazín číslo 6 - 2007
Slavnostní otevření laboratoře
v Nemocnici Kyjov
Dne 21. března 2007 byla v areálu nemocnice v Kyjově slavnostně
otevřena laboratoř na oddělení klinické biochemie.
omuto otevření byli přítomni zástupci vedení
nemocnice v čele s ředitelem ing. Igorem Kalixem, pracovníci laboratoře i s primářem ing.
Rostislavem Kotrlou a zástupci firmy Beckman
Coulter včetně obchodního ředitele RNDr. Štěpána Tintěry.
V laboratoři dosluhovaly přístroje Hitachi,
a proto vedení nemocnice vypsalo výběrové řízení
na dodávku diagnostik pro stanovení biochemických
a imunochemických vyšetření a laboratorního vyšetřovacího systému.
Firma Beckman Coulter jako přední dodavatel diagnostik a laboratorních systémů se tohoto výběrového řízení samozřejmě zúčastnila a nabídla komplexní řešení vybavení laboratoře. Tato nabídka byla
vyhodnocena jako nejlepší, a tak koncem roku 2006
došlo k instalaci biochemických analyzátorů UniCel
DxC 800 a UniCel DxC 600 a imunochemických analyzátorů UniCel DxI 800 a Access 2. Součástí dodávky byla také centrifuga Spinchron a řídící systém
Remisol, který umožňuje řízení všech analyzátorů
z jednoho místa.
Takto navržená konfigurace přístrojů a metod plně
dostačuje provozu a laboratoř je schopna analyzovat
mnohem větší množství vzorků než dříve. Biochemická laboratoř v Nemocnici Kyjov je tudíž už teď
připravena na nárůst vzorků nebo nárůst jednotlivých rutinních či speciálních analýz.
Instalace všech přístrojů proběhla za chodu laboratoře ve velmi krátké době včetně zaškolení obsluhy.
Již na konci roku 2006 laboratoř plně přešla na rutinní diagnostiku na nových analyzátorech firmy Bec-
kman Coulter. Dle pracovníků laboratoře jsou tyto přístroje „o něčem jiném“
a všichni jsou s prací na nových systémech velmi spokojeni. „Přístroje mají co do
počtu možných analýz dvakrát větší rychlost a třikrát větší kapacitu než jejich
o čtrnáct let starší předchůdci. Urgentní vzorky jsme schopni zpracovat a vydat do
šedesáti minut, rutinní stíháme do dvou až tří hodin“ říká primář Rostislav Kotrla.
Celá laboratoř byla od 13 hodin otevřena a přístrojové vybavení bylo představeno kolegům z jiných oddělení nemocnice a také pracovníkům laboratoří z okolních zdravotnických zařízení. Všem zúčastněným bylo předvedeno, že stačí „naskládat vzorky do stojanu, vložit do analyzátoru a stisknout start“.
Po „oficiálním“ slavnostním otevření laboratoře následovalo společné bowlingové klání pracovníků nemocnice a firmy Beckman Coulter.
Celý den byl protkán pracovní, ale přátelskou atmosférou.
Nové vybavení laboratoře přispěje k lepší práci celého oddělení a v podstatě
i celé nemocnice. Firma Beckman Coulter k tomu chce přispívat rozšiřováním
další spolupráce a partnerskou pomocí Nemocnici Kyjov.
FRANTIŠEK VIČAR
[email protected]
informační magazín číslo 6 - 2007
23
Kde se můžeme setkat
(červen – září 2007)
Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku
1. 6. 2007
11. - 12. 6. 2007
13. - 14. 9. 2007
ESTOOLS
Brno
Seminář Moravskoslezského kraje
Žermanice
XVIII. Izakovičov memoriál
Košice
1. - 2. 6. 2007
16. - 19. 6. 2007
V. dvoudenní konference imunologických
laborantů
Brno
XI. Olomoucké hematologické dny
Olomouc
19. - 21. 9. 2007
21. - 22. 9. 2007
23. - 26. 6. 2007
4. 6. 2007
Pracovní konference sekce biochemických
laborantů
Hradec Králové
40. výroční cytogenetická konference
Praha
Česká společnost analytické cytometrie
Brno
Severočeský imunologický seminář
Ústí nad Labem
23. - 25. 9. 2007
6. - 7. 9. 2007
VIII. Slovensko-české dni laboratórnej
hematológie a transfuziológie
Šamorín - Čilistov
VIII. Celostátní sjezd ČSKB
České Budějovice