Abstrakt česky - Repozitář VŠCHT Praha

SOUHRN
Mlezivo je komplexní sekret produkovaný mléčnou žlázou v počáteční fázi laktace.
Jeho unikátní složení a možnost využití byly diskutovány v první části této bakalářské
práce. Pro analýzu biologicky aktivních složek kolostra se ukázaly jako nejvhodnější
imunochemické metody, jejichž velkou výhodou je citlivost, specifičnost a mnohdy
i jednoduché provedení, umožňující i zběžnou kontrolu v terénu. V posledních třiceti
letech došlo k velkému vývoji a specializaci imunochemických metod, jejichž současné
trendy jsou zahrnuty v této práci. Teoretická část byla doplněna experimentálním
stanovením koncentrace laktoferinu v mlezivu a mléce metodou radiální imunodifuze.
Množství laktoferinu bylo stanoveno na průměrných 572,0 μg·mL-1 ve vzorku mleziva
a na 21,8 μg·mL-1 v mléce. Tyto výsledky byly diskutovány s poznatky publikovanými
v odborné literatuře.
SUMMARY
Colostrum is a complex secretion produced by the mammary gland in the early stages
of lactation. Its unique composition and usability were discussed in the first part of this
thesis. For the analysis of biologically active components of colostrum were proved
to be the best immunochemical methods, the great advantages are the sensitivity,
specificity and often simple design, enabling even a cursory inspection in the field.
In the last 30 years there have been a number of developments and specialization
immunochemical methods, the current trends are included in this thesis. The theoretical
part was supplemented experimental determination of the concentration of lactoferrin
in colostrum and milk by radial immunodiffusion. The amount of lactoferrin was
determined on an average 572.0 μg·mL-1 in a sample of colostrum and 21.8 μg·mL-1
in milk. These results have been discussed with the findings published in the literature.
PODĚKOVÁNÍ
Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu bakalářské práce Doc. Ing. Ladislavu
Čurdovi, CSc. a konzultantovi Mgr. Volodymyru Skalkovi za cenné rady, věcné
připomínky, odborné vedení a čas, který mi v průběhu vypracování práce poskytli. Dále
bych z celého srdce chtěla poděkovat svým rodičům a manželovi, za jejich láskyplnou
podporu a porozumění po celou dobu studia.
OBSAH
1. ÚVOD .................................................................................................... 1
2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY........................... 2
2.1 MLEZIVO A JEHO SLOŽENÍ .................................................................. 2
2.1.1
Základní informace o mlezivu .......................................................................... 2
2.1.2
Složení mleziva ................................................................................................. 2
2.1.3
Rozdíly mezi mlezivem a zralým mlékem ....................................................... 8
2.2 IMUNOCHEMICKÉ METODY .............................................................. 11
2.2.1
Obecný úvod do imunochemických metod .................................................... 11
2.2.2
Imunoprecipitační metody .............................................................................. 13
2.2.3
Imunoelektroforetické metody ........................................................................ 17
2.2.4
Neprecipitační imunochemické metody se značkou ....................................... 18
2.2.5
Imunoafinitní chromatografie ......................................................................... 22
2.2.6
Imunosenzory.................................................................................................. 23
2.3 ÚPRAVA
VZORKŮ
MLEZIVA
A
KONKRÉTNÍ
VYUŽITÍ
IMUNOCHEMICKÝCH METOD PŘI ANALÝZE BIOLOGICKY
AKTIVNÍCH SLOŽEK MLEZIVA ......................................................... 25
2.3.1
Imunochemické metody pro stanovení imunoglobulinů ................................ 25
2.3.2
Imunochemické metody pro stanovení transformujícího růstového faktoru
(TGF-β2) ......................................................................................................... 26
2.3.3
Imunochemické metody pro stanovení laktoferinu ........................................ 26
2.3.4
Imunochemické stanovení laktoperoxidasy .................................................... 26
2.3.5
Imunochemické stanovení lysozymu .............................................................. 27
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................. 28
3.1 POUŽITÝ MATERIÁL A CHEMIKÁLIE ............................................. 28
3.2 POUŽITÉ PŘÍSTROJE ............................................................................. 28
3.3 PŘÍPRAVA ROZTOKŮ ............................................................................ 28
3.3.1
Příprava 2% kyseliny octové .......................................................................... 28
3.3.2
Příprava SRID 1X pufru ................................................................................. 28
3.4 PRACOVNÍ POSTUPY A POUŽITÉ METODY ................................... 29
3.4.1
Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID) ...................................................... 29
4. VÝSLEDKY ........................................................................................ 31
4.1 STANOVENÍ KALIBRAČNÍ KŘIVKY .................................................. 31
4.2 STANOVENÍ KONCENTRACE LAKTOFERINU ............................... 32
5. DISKUZE ............................................................................................ 33
6. ZÁVĚR ................................................................................................ 34
7. LITERATURA ................................................................................... 35
8. SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK ..................... 45
1. ÚVOD
Mlezivo se stalo díky svému jedinečnému složení a vysokému obsahu biologicky
aktivních látek středem zájmu mnoha vědeckých výzkumů. Profylaktické a terapeutické
použití kolostra pro lidské zdraví není nic nového, ale sahá do vzdálené historie lidstva.
Avšak díky moderním technologiím zpracování a modifikaci jeho potenciální využití
stále roste.
K nejvýznamnějším látkám, podílejících se na ochraně těla vůči útokům
nežádoucích mikroorganismů, patří globulární glykoproteiny imunoglobuliny, dále pak
laktoferin, laktoperoxidasa a lysozym. Tyto bílkoviny podporují rozvoj imunity
a ve sdružení s růstovými faktory (dalšími biologicky aktivními látkami obsaženými
v mlezivu) napomáhají k celkovému správnému vývoji, růstu a fyziologickému
prospívání.
Koncentrace těchto prospěšných látek v kolostru je do značné míry proměnlivá.
To je dáno celou řadou faktorů, mezi které patří mimo jiné i způsob uchování
a zpracování mleziva.
Předpokladem pro případné použití mleziva nebo jeho složek jako potravního
doplňku či léku je jeho spolehlivá kvalitativní a kvantitativní analýza. Vzhledem
ke specifičnosti a citlivosti složek kolostra se jako vhodné analytické techniky ukázaly
imunometody.
Tato práce má za cíl podrobně, přehledně a strukturovaně shrnout současné
poznatky o mlezivu a imunochemických metodách používaných pro stanovení
biologicky aktivních látek v něm.
1
2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
2.1 MLEZIVO A JEHO SLOŽENÍ
2.1.1 Základní informace o mlezivu
Mlezivo, nazývané též kolostrum, je první sekreční produkt mléčné žlázy. Může
být produkováno již několik hodin před porodem a produkce přetrvává další 3 až 4 dny
po porodu, kdy se postupně přeměňuje jeho složení ve složení zralého mléka, které se
liší nejen množstvím jednotlivých složek, ale i pH (pH kolostra je mírně kyselé – 6,3)
a barvou. Pro čerstvě narozené jedince (telata, kůzlata, selata,…) tvoří mlezivo první
zdroj pasivní imunity, jelikož obsahuje velké množství biologicky aktivních látek jako
imunoglobuliny, růstové faktory, antimikrobiální peptidy (např. laktoferin) a další
(Grossa kol., 2014; Csapó a kol., 1996; Gopal a Gill, 2000; Elfstrand a kol., 2002;
Playford a kol., 2000; Jaster, 2005).
V poslední době se zkoumá možnost využití těchto látek ve farmaceutickém
průmyslu k léčbě žaludečních a střevních potíží, hypertenze, trombóz, zubních
onemocnění minerální malabsorpce a imunity. Ale také využití kolostra jakožto doplňku
stravy hlavně pro sportovce, kde má pozitivní vliv na nárůst svalové hmoty, rychlejší
hojení ran a lepší fyzickou zdatnost (Playforda kol., 2000; Séverin a Wenshui, 2005;
Antonio a kol., 2001; Uruakpa a kol., 2002).
2.1.2 Složení mleziva
Kolostrum je tekutina bohatá na živiny a biologicky aktivní látky, již vysoká
účinnost je dána jejím komplexním složením. Látky obsaženy v mlezivu působí
synergicky, tedy se vzájemně doplňují a posilují (Elfstrand a kol., 2002). V kolostru se
vyskytuje vedle cukru (laktosy), tuku (fosfolipidy, nasycené i nenasycené mastné
kyseliny, atd.), kaseinu a běžných syrovátkových bílkovin jako β-laktoglobulinů,
α-laktalbuminů, laktoferinu a sérového albuminu i velké množství imunoglobulinů
(IGs), zvláště IgG1, růstových faktorů, zejména inzulínu podobný růstový faktor IGF-1,
lysozymu, laktoperoxidasy a esenciálních i neesenciálních mastných kyselin
2
(Gappera kol., 2007; Elfstrand a kol., 2002). Dále jsou již v menším množství obsaženy
oligosacharidy a fukosylované oligosacharidy, polypeptidy bohaté na prolín (PRP),
mucin, gangliosidy, cytokiny, nukleosidy a endogenní peptidy vykazující do jisté míry
také určitou biologickou aktivitu (Séverin a Wenshui, 2005).
2.1.2.1 Biologicky aktivní látky
Pro jakýkoliv protein vykazující biologickou aktivitu je kritické jeho trojrozměrné
uspořádání, jež odpovídá nativní struktuře. Při technologickém zpracování mleziva se
proto musí přísně dbát na to, aby nedošlo k jeho znehodnocení případnou denaturací.
Většina biologicky aktivních látek je relativně tepelně labilních (Gapper a kol., 2007;
Elfstrand a kol., 2002).
2.1.2.1.1 Imunoglobuliny
Imunoglobuliny jsou velkou skupinou kulovitých bílkovin s antimikrobiální
aktivitou. Tuto skupinu rozdělujeme do několika tříd, včetně IgM, IgA, IgG, IgE a IgD
(Hurley a Theil, 2011). Imunoglobuliny ze tříd IgG, IgD, IgE jsou monomerní
glykoproteiny (MW cca 150 kDa), kdežto IgA se vyskytuje ve formě monomeru nebo
dimeru (MW cca 385 kDa) a IgM se skládá z pěti podjednotek (MW cca 900 kDa),
které jsou vzájemně propojeny pomoci tzv. J řetězce o molekulové hmotnosti kolem
15 kDa, viz Obr. 1. Tento J řetězec usnadňuje schopnost imunoglobulinů procházet
buněčnými strukturami (Madureira a kol., 2007).
Obr.1: Typy imunoglobulinu a jejich prostorové uspořádání, převzato z www.nature.com, 2015,
on line
3
Imunoglobuliny se běžně vyskytují v různých koncentracích v krevním séru, mléku
a mlezivu, jak je uvedeno v Tab. I. (Gapper a kol., 2007).
Tvoří přibližně 1 % z celkových mléčných bílkovin a přibližně 6 % ze všech
syrovátkových bílkovin.
Tab. I:Koncentrace imunoglobulinu v krevním séru, mlezivu a mléku, převzato z Gapper a kol., 2007
Koncentrace [mg· mL-1]
Celkové IgG
IgG1
IgG2
IgA
IgM
sérum
25,00
14,00
11,00
0,40
3,10
kolostrum
32-212
20-200
12,00
3,50
8,70
mléko
0,72
0,60
0,12
0,13
0,04
Hlavní Ig přítomný v mlezivu je IgG (podtřídy IgG1 a IgG2), který tvoří 80-90 %
veškerých mléčných imunoglobulinů. Avšak imunoglobuliny ze třídy IgA a IgM jsou
také přítomny v nízkých koncentracích.
Nejvyšší množství těchto imunoglobulinů se nachází v mlezivu první den
po porodu (přibližně 50 g· L-1) a během následujících dvou dnů výrazně klesá.
Mezi významné faktory ovlivňující koncentraci Ig v mlezivu patří plemeno, věk, počet
laktací a objem prvního mlezivového nádoje (Elfstrand a kol., 2002; Vacher a Blum,
1993).
Významné rozdíly v koncentraci a hlavně v třídách jednotlivě zastoupených
imunoglobulinů jsou zřejmé z Obr. 2.
Obr. 2: Relativní zastoupení IgM, IgA a IgG v kolostru (vnější kruh) a v mléce (vnitřní kruh),
převzato z Hurley a Theil, 2011
4
Imunoglobuliny patří tedy mezi hlavní látky v mlezivu, které udělují pasivní
imunitu novorozeným mláďatům (Elfstrand a kol., 2002).
2.1.2.1.2 Růstové faktory
Pod pojmem růstové faktory je zahrnuto velké množství látek ovlivňujících
některé
ze základních
životních
procesů,
jako
stimulaci
růstu
a
vývoje
(např. gastrointestinálního traktu novorozených mláďat), dělení a diferenciaci buněk
i apoptózu (Elfstrand a kol., 2002). Mezi hlavní růstové faktory obsažené v mlezivu
patří transformující růstový faktor TGF (podtřídy TGF-β1, TGF-β2, TGF-α), inzulínu
podobný růstový faktor IGF (podtřídy IGF-1 a IGF-2), epidermální růstový faktor EGF
a často je zde řazen i růstový hormon GH (Playford a kol., 2000; Blum a Baumrucker,
2002).
Vyšší biologickou aktivitu vykazují kozí kolostrální růstové faktory oproti
růstovým faktorům v kravském mlezivu.
Nejčastější formou TGF-β je homodimérní protein s molekulovou hmotností
přibližně 25 kDa, i když heterodiméry byly také nalezeny. Více než 90 % z celkového
TGF-β2 nacházejícího se v kolostru je v neaktivní, latentní formě, která může být
aktivována změnou iontové síly, okyselením nebo proteolytickými enzymy (Pakkane,
1998).
Hlavní formou IGF v mlezivu je IGF-1, jež je jednořetězcový polypeptid
s molekulovou hmotností cca 7,6 kDa. Je stabilnější vůči kyselejšímu prostředí i vyšším
teplotám. Inzulínu podobný růstový faktor podtřídy 1 je velmi často ve vazbě se svým
vazebným proteinem (IGFBP). Některé z vazebných proteinů inaktivují IGF-1, další
zvyšují jeho účinnost a některé vazebné proteiny mají vlastní biologickou aktivitu
(Elfstrand a kol., 2002;Pakkanen a Aalto, 1997).
Růstový hormon (GH) je produkován adenohypofýzou a patří k nejvýznamnějším
hormonům podporujících růst (Elfstrand a kol., 2002).
2.1.2.1.3 Laktoferin
Laktoferin, dříve nazývaný jako lactotransverrin, je glykoprotein s molekulovou
hmotností asi 80 kDa a je složen ze 700 aminokyselin. Isoelektrický bod laktoferinu se
nachází v rozmezí pH 8-9. Patří do skupiny transferinu (proteinů schopných vázat
5
a přenášet Fe3+ ionty) a vykazuje rozmanitou řadu biologických aktivit, včetně
antimikrobiální aktivity, protivirové aktivity, antioxidační aktivity, imunomodulace
a modulace buněčného růstu (Adlerova a kol., 2008; Wakabayashi a kol., 2014).
V poslední době se ukázalo, že za antimikrobiálními vlastnostmi laktoferinu stojí
schopnost interagovat s lipopolysacharidy vnější buněčné membrány gramnegativních
bakterií, vyloučit je a tím způsobit buněčnou smrt. Největší citlivost bakterií
na laktoferin je v počátku lag fáze (Farnaud a Evans, 2003).
Laktoferin patří mezi proteiny běžně přítomné v slizničních sekretech (sliny, slzy,
střevní sekret, aj.) a hraje naprosto zásadní roli v imunitě.
V kravském mléce se vyskytuje v koncentraci 20-350 µg· mL-1, ale jeho
koncentrace se výrazně mění v závislosti na stavu dojnice (přítomnosti zánětu
či infekce) a na období laktace (Madureira a kol., 2007; Bengoechea a kol., 2011).
Díky své terciální struktuře (dva hlavní laloky, které jsou dále rozděleny do dvou
oblastí, viz Obr. 3) je schopen koordinovat atom železa na čtyři bílkovinné ligandy
a synergické anionty (HCO3- nebo CO3-).
Laktoferin vykazuje do jisté míry termorezistenci. Tato vlastnost je však odlišná
mezi druhy, např. laktoferin skotu je méně tepelně odolný než lidský. Příčinou je nižší
glykosylace a tedy vyšší náchylnost k degradaci (Conesa a kol., 2008).
Obr.3: Struktura a prostorové uspořádání laktoferinu, převzato z www.chemistry.umeche.maine.edu,
2012, on line
6
2.1.2.1.4 Laktoperoxidasa
Laktoperoxidasa [EC.1.11.1.7.] je hlavní antibakteriální enzym v mlezivu. Jedná
se o základní glykoprotein obsahující hemovou skupinu (Haberska a kol., 2008). Tento
enzym katalyzuje oxidaci thiokyanatanu v přítomnosti peroxidu vodíku a tím inhibuje
bakteriální metabolismus. Laktoperoxidasa je do mléka vylučována epiteliálními
buňkami prsní žlázy a její koncentrace v mlezivu dosahuje hodnot 11-45 mg· mL-1,
což odpovídá maximu během 3. až 5. dne po porodu (Pakkanen a Aalto, 1997;
Kussendrager, 2000).
2.1.2.1.5 Lysozym
Lysozym [EC.3.2.1.17.] je antimikrobiální a lytický enzym vyskytující se
v slzách, slinách, vaječném bílku a kolostru. Do těchto tělních tekutin se dostává
působením lysozymových monocytů a makrofágů. Jedná se o bílkovinu složenou
ze 123-129 aminokyselin, jejichž struktura je stabilizovaná čtyřmi disulfidickými
vazbami (Pakkanen a Aalto, 1997; Hurley a Theil, 2011; Gill, 1995).
Antibakteriální účinek lysozymu je svázán se schopností narušovat β(1-4) vazbu
mezi
N-acetylglukosaminem
a
N-acetylmuramovou
kyselinou
peptidoglykanu
bakteriální buněčné stěny. Z této skutečnosti vyplývá, že jeho působení je převážně
na grampozitivní bakterie, jejichž buněčná stěna je tvořena z 90 % zmíněným
peptidoglykanem. Přidáním chelatačních činidel a detergentů se docílí vyššího účinku
lysozymu i na gramnegativní bakterie (Barbiroli a kol., 2012).
2.1.2.2 Vitaminy
Vitaminy jsou nepostradatelné nízkomolekulární látky, které fungují jako
katalyzátory při biochemických reakcích. V mlezivu se nachází v detekovatelném
množství vitaminy rozpustné v tucích (A, D, E, K3) i vitaminy rozpustné ve vodě (B2,
B9, B12 a C) (Csápo a kol., 1996).
2.1.2.3 Minerály a stopové prvky
Nepochybně je v kolostru obsaženo i nepostradatelné a nezanedbatelné množství
minerálních látek, které mají významnou roli kofaktorů a stavebních kamenů (například
7
kostí a zubů). Mezi významné patří ionty draslíku, sodíku, chlóru, vápníku, fosforu,
hořčíku, železa, zinku, mědi a manganu, jejichž koncentrace se v závislosti na čase
(zralosti mléka) také mění, což je viditelné v níže přiložené tabulce, Tab. II (Csápo
a kol., 1996).
Tab. II: Rozdíly ve složení prasečího zralého mléka a kolostra, převzato z Csápo a kol., 1996
Složka
sušina
K
Na
Ca
P
Mg
Zn
Fe
Cu
Mn
A
D3
Jednotka
g· 100g-1
mg· kg-1
mg· kg-1
-1
mg· kg
-1
mg· kg
-1
mg· kg
mg· kg-1
-1
mg· kg
mg· kg-1
-1
mg· kg
mg· kg-1
mg· kg-1
Kolostrum
0,66
1100,00
685,00
686,00
1017,00
78,50
15,70
1,70
3,77
0,06
1,61
0,02
Zralé mléko
0,84
748,00
387,00
1965,00
1510,00
110,70
6,49
2,44
1,34
0,10
0,92
0,01
E
mg· kg-1
3,69
2,53
-1
0,09
0,09
-1
68,4
45,3
K3
C
mg· kg
mg· kg
2.1.3 Rozdíly mezi mlezivem a zralým mlékem
Jak již bylo výše zmíněno, mlezivo je výživná a komplexní tekutina,
nepostradatelná pro správný vývoj gastrointestinálního traktu, imunitního systému
a celkovou adaptaci mláďat na vnější prostředí po porodu. Postupem času se mění
nároky mláděte na složení mateřského mléka, proto dochází k postupné přeměně
mleziva ve zralé mléko, jehož nutriční složení i obsah imunomodulačních látek je zcela
odlišný (Emmet a kol., 1997; Elfstrand a kol., 2002; Gopal a Gill, 2000; Jaster, 2005).
8
Rozdíly ve složení kolostra a zralého mléka jsou pro přehlednost uvedeny níže
v tabulkách, Tab. III až Tab. VI.
Tab. III: Koncentrace jednotlivých tříd imunoglobulinů v různě starém kravském mléce a mlezivu,
převzato z Elfstrand a kol., 2002
IgG1
Stáří mleziva [h]
IgG2
IgA
IgM
[mg· mL-1]
0 až 6
7 až 10
11 až 20
21 až 30
31 až 40
41 až 50
50 až 80
90,0
79,0
65,0
24,0
31,0
17,0
12,0
2,8
1,9
1,8
1,1
0,5
0,4
0,2
1,6
1,7
0,9
0,7
0,3
0,2
0,1
4,5
4,0
2,3
1,8
1,0
0,8
0,7
Zralé mléko
0,51
0,03
0,02
0,10
Tab. IV: Koncentrace růstových faktorů v různě starém kravském mlezivu, převzato z Elfstrand
a kol., 2002
TGF-β2
Stáří mleziva [h]
IGF-1
[ng· mL-1]
289
310
154
113
72
85
66
0 až 6
7 až 10
11 až 20
21 až 30
31 až 40
41 až 50
50 až 80
870
330
490
290
140
110
150
Tab. V: Rozdíly v celkovém složení kozího kolostra a zralého mléka, převzato z Vašíčková, 2013
Jednotka
Kolostrum
Zralé mléko
Sušina
g· L-1
201,0
89,0
Tuk
g· L
-1
78,0
38,0
Bílkoviny
g· L-1
98,0
34,0
Laktosa
g· L
40,8
41,0
IgA
g· L-1
0,9-2,4
0,03-0,08
IgM
g· L
1,6-5,2
0,01-0,04
IgG
g· L-1
50,0-60,0
1,0-4,0
-1
-1
9
Tab. VI: Rozdíly v celkovém složení kravského mleziva a mléka, převzato z Ontsouka a kol., 2003
Jednotka
Mlezivo (2. den)
Zralé mléko (4. týden)
Sušina
g· kg
159,0 ± 16,0
117,0 ± 12,0
Tuk
g· L
-1
70,5 ± 8,5
57,6 ± 6,7
Bílkoviny
g· L
-1
52,0 ± 3,2
32,5 ± 1,0
Laktosa
g· L-1
-1
43,9 ± 0,9
49,9 ± 0,5
Na
mmol· L
-1
27,0 ± 1,0
20,0 ± 1,0
K
mmol· L-1
44,0 ± 1,0
41,0 ± 1,0
Cl
mmol· L
38,0 ± 2,0
29,0 ± 1,0
-1
IGF-1
μg· L-1
103,0 ± 21,0
4,0 ± 1,0
Insulín
μg· L
4,55 ± 1,04
0,37 ± 0,02
Prolaktin
μg· L-1
120,0 ± 16,0
15,4 ± 1,0
IgG
g· L-1
28,3 ± 5,7
1,5 ± 0,1
-1
Z tabulek je patrné, že v průběhu času postupně klesá množství imunoglobulinů a tím
potažmo i celkové množství bílkovin. Také množství tuku a celkové sušiny se s časem
snižuje, kdežto koncentrace laktosy ve zralém mléce mírně vzrůstá.
10
2.2 IMUNOCHEMICKÉ METODY
2.2.1 Obecný úvod do imunochemických metod
Imunochemické metody jsou metody založené na selektivní, reverzibilní
a nekovalentní vazbě antigenu a protilátky (uplatňující se interakce – Coulombovy síly,
Van der Waalsovy síly, vodíkové vazby a hydrofobní interakce). Jedná se o jednoduché,
rychlé, přesto citlivé metody, které mohou být použity pro rutinní analýzy v klinických
laboratořích i v terénu (Koivunen a Krogsrud, 2006; Jung a kol., 1998).
Tyto metody se využívají k detekci či kvantifikaci antigenů nebo protilátek
a v současné době patří k velmi využívaným (European Pharmacopoeia, 2004).
Imunochemické metody lze dělit podle rozličných kritérií do několika skupin:

Podle povahy vytvořeného imunokomplexu (precipitační, neprecipitační)

Podle použitého systému imunoanalýzy (se značkou- bez značky,
heterogenní -homogenní, kompetitivní – nekompetitivní)

Podle účelu analytické procedury

Podle testovaného subjektu
(Králová a kol., 2008).
2.2.1.1 Antigen
Jako antigeny označujeme různé polymery (polysacharidy, proteiny, polypeptidy
i nukleové kyseliny), které jsou rozpoznávány imunitním systémem. Malá oblast
molekuly antigenu, která je rozeznávána imunitními receptory, se nazývá epitop.
Antigeny mají 2 základní vlastnosti:

navozují specifickou imunitní odpověď (buněčného nebo protilátkového typu)

specificky reagují s produkty této imunitní odpovědi (s protilátkami)
(Hořejšek a Bartůňková, 2009;Vanemon a Lopezavila,1992).
2.2.1.2 Hapten
Hapteny jsou nízkomolekulární látky, které nemohou samy navodit imunitní
odpověď, ale jsou schopny specificky reagovat s protilátkami. Jedná se tedy
11
o nekompletní antigeny, které jsou schopny vyvolat imunitní odpověď, pouze pokud
jsou ve vazbě s vysokomolekulárním nosičem (Singh a kol., 2004).
2.2.1.3 Protilátka
Protilátky jsou heterogenní skupinou glykoproteinů, které zaujímají globulární
strukturu, proto jsou označovány jako imunoglobuliny. Nejběžnější protilátkou je
imunoglobulin třídy G, jehož základní struktura obsahuje čtyři polypeptidové řetězce
(dva identické těžké – označené H, a dva identické lehké – označené L), které jsou
spojené intra- a inter- molekulárními disulfidickými můstky, což má za následek
klasický Y-tvar imunoglobulinů (Mix a kol., 2006). Počet a umístění disulfidových
vazeb závisí na třídě imunoglobulinů (Hurley a Theil, 2011). Každý polypeptidový
řetězec obsahuje jak konstantní (Fc), tak i variabilní (Fab) oblast aminokyselinových
sekvencí. Ve variabilní N-koncové oblasti (Fab) se u každého imunoglobulinu nachází
dvě vazebná místa pro antigen. Popsaná struktura imunoglobulinů je zřetelná na Obr. 4
(Gapper a kol., 2007; Mix a kol., 2006).
Obr. 4: Struktura molekuly imunoglobulinu IgG, převzato z Gapper a kol., 2007
2.2.1.3.1 Polyklonální protilátky
Polyklonální protilátky se připravují imunizací zvířat, nejčastěji králíků, myší
a koz. Imunitní systém organismu produkuje proti aplikovanému antigenu specifické
12
protilátky (směs více či míně odlišných molekul imunoglobulinů), jejichž nejvyšší
množství je přítomno v krvi. Krevní sérum imunizovaného zvířete je v běžné praxi
označováno jako antisérum (Ritter, 2000; Králová a kol., 2008; Hořejšek a Bartůňková,
2009; Hendriksen a Hau, 2003).
2.2.1.3.2 Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátky se připravují hybridomovou technologií. Její podstatou je
buněčná fúze nádorových (myelomových) buněk s lymfocyty sleziny imunizovaných
zvířat. Monoklonální protilátky jsou tedy identické molekuly s totožnou strukturou,
specifitou i afinitou vůči antigenu. Tyto protilátky však špatně precipitují (Ritter, 2000;
Králová a kol., 2008; Hořejšek a Bartůňková, 2009; Hendriksen a Hau, 2003).
2.2.1.3.3 Rekombinantní protilátky
Díky zavedení technik jako PCR a pokrokům v oblasti genového inženýrství bylo
v posledních letech možno připravovat protilátky i rekombinantními technologiemi.
To umožnilo častější využití imunologických metod při jednotlivých analýzách díky
rychlejší přípravě, vyšší kvalitě a možnosti cílené manipulace vazebných vlastností
protilátek.
Naklonované protilátky jsou exprimovány na povrchu fágů nebo buněk
(Hoogenboom, 2005).
2.2.2 Imunoprecipitační metody
V imunoprecipitačních metodách dochází při interakci antigenu se specifickou
protilátkou za vzniku imunokomplexu a jeho vysrážení z roztoku v podobě viditelného
precipitátu.
13
K vytvoření rozpustného imunokomplexu dochází při jakékoliv koncentraci antigenu
a protilátky,
ale
k nejvýraznější
sraženině
(imunoprecipitátu)
dochází
právě
při nejpříhodnějším poměru (při ekvivalentním množství) reagentů, viz obrázek
precipitační křivky (Heidelbergerova - Kendallovakřivka), Obr. 5. Proto je při analýze
využívající těchto metod vhodné testovat různé ředění antigenů a protilátek. (European
Pharmacopoeia, 2004; Koivunen a Krogsrud, 2006).
Obr. 5: Precipitační křivka s vyznačenými zónami poměrů koncentrací, převzato
z www.enclabmed.cz, 2004, on line
2.2.2.1 Imunoprecipitační metody v roztoku
Jedná se o nejjednodušší princip sledování imunochemické reakce. Průběh vzniku
imunoprecipitátu lze pozorovat prostřednictvím změny v optické hustotě reakčního
roztoku. Při smíchání antigenu a protilátky dojde časem k zakalení roztoku a světlo
procházející zakaleným roztokem je rozptylováno (Siedel a kol., 1988; Králová a kol.,
2008).Množství vzniklé imunosraženiny v roztoku stanovujeme kvantitativně pomocí:

Imunoturbidimetrie - měření intenzity světla prošlého přímým směrem

Imunonefelometrie
-
měření
intenzity rozptýleného světla (nejčastěji
pod úhlem 45 ° a 90 °)
14
Podle dohody se tyto techniky provádějí v roztoku s nadbytkem protilátky, neboť
identickou hodnotu absorbance mohou vykazovat dvě rozdílné koncentrace antigenu,
jež je vidět na precipitační křivce (Koivunen a Krogsrud, 2006; Gapper a kol., 2007).
Citlivost precipitačních metod v roztoku je možno zvýšit navázáním imunochemických
reagencií na latexové či jiné částice, které zintenzivňují rozptyl světla (Liu a kol., 2008).
2.2.2.2 Imunoprecipitační metody v gelu
Při těchto technikách dochází k prostupování obou nebo alespoň jednoho
účastníka imunochemické reakce gelovou vrstvou. Jako reakční prostředí nejčastěji
slouží tenká vrstva agarového či agarosového gelu, kde vzniká v místě ekvivalence
precipitační linie tvaru obloučku, přímky či prstence (European Pharmacopoeia, 2004;
Králová a kol., 2008; Hillyer a kol., 1985).
Tyto
difuzní
metody
v jakémkoliv
uspořádání
jsou
velmi
jednoduché
na provedení, proto jsou často využívané jako metody pro srovnání výsledků. Jejich
velkou nevýhodou je značná doba potřebná pro vytvoření precipitátu – zdlouhavost
metody (Lee a kol., 2008; Gapper a Copestake, 2007).
2.2.2.2.1 Jednoduchá radiální imunodifuze
Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID) je prováděná v uspořádání, kdy gelem
difunduje pouze jeden partner imunochemické reakce (nejčastěji antigen), a druhý je
v prostředí rovnoměrně rozptýlen (Wu a kol., 1986; Lee a kol.,2008).
Jedná se o kvantitativní metodu bez velkých nároků na přístrojové vybavení.
Vzorky nebo standardní roztoky jsou nanášeny do jamek vyřezaných v gelu,
z nichž se šíří radiálně, až do dosažení zóny ekvivalence, kde vznikne precipitační
prstenec. Plocha prstence nebo druhá mocnina průměru precipitačního prstence je přímo
úměrná koncentraci vzorku (Rivero a kol., 2012; European Pharmacopoeia, 2004;
Králová a kol., 2008; Gapper a kol.,2007).
15
Výsledek radiální imunodifuze je viditelný na přiloženém obrázku, Obr. 6.
Obr. 6: Výsledné uspořádání testu jednoduché radiální imunodifuze, převzato z che1.lf1.cuni.cz,
2011, on line
2.2.2.2.2 Dvojitá radiální imunodifuze
Jak již plyne z názvu, při tomto uspořádání difundují gelem obě komponenty
imunochemické reakce. Antigen se pipetuje do jedné a protilátka do druhé kruhové
jamky. Při radiálním prostupu reaktantů gelem se vytvoří jejich koncentrační gradient
a k tvorbě precipitační linie dojde pouze při optimálním koncentračním poměru obou
látek. V případě, kdy vzorek obsahuje více antigenů, rozeznáváme mezi jamkami
několik linií, což je patrné na Obr. 7 (European Pharmacopoeia, 2004; che1.lf1.cuni.cz,
2011, on line).
Dvojitá radiální imunodifuze se především používá jako kvalitativní metoda
k identifikaci antigenu. (Kleist a kol., 1972).
Obr. 7: Dvojitá radiální imunodifuze, převzato z Káš a kol., 2005
16
2.2.3 Imunoelektroforetické metody
Tyto
techniky kombinují
elektroforézu
a
imunodifuzi.
Díky působení
stejnosměrného elektrického pole dochází k urychlení celé analýzy.
2.2.3.1 Imunoelektroforéza
Jedná se o metodu, která se dá rozdělit na dvě fáze. Během první fáze dojde
k separaci směsi antigenů v gelu podle jejich náboje. V druhé fázi se do žlábku nanese
antisérum a nechá se proběhnout dvojitá imunodifuze. Výsledkem imunoelektroforézy
je elektroforeogram s precipitačními obloučky, viz Obr. 8.
Imunoelektroforéza se dá provádět i v protisměrném uspořádání (European
Pharmacopoeia, 2004; Káš a kol., 2005).
Obr. 8: Průběh imunoelektroforézy, převzato z publi.cz, 2008, on line
2.2.3.2 Elektroimunodifuze
Tato metoda je často nazývaná jako raketová technika (díky precipitačním liniím
ve tvaru raket). I zde je aplikované jednosměrné napětí pro urychlení difuze antigenu.
Jádrem této techniky je ustavičné rozpouštění imunoprecipitátu přebytkem putujícího
antigenu. Při použití kalibrační závislosti lze tuto metodu použít pro zjištění
koncentrace antigenu (European Pharmacopoeia, 2004; Králová a kol., 2008; Axelsen
a Bock, 1983).
17
2.2.3.3 Dvojrozměrná imunoelektroforéza
Jedná se o metodu získanou kombinací výše zmíněných. Za pomoci elektroforézy
se nejprve rozdělí směs antigenů, poté se neobarvený proužek gelu stane startem difuze
v prostředí gelu obsahující rovnoměrně rozptýlenou směs protilátek (European
Pharmacopoeia, 2004; Chua a Blomberg, 1979; Králová a kol., 2008).
2.2.4 Neprecipitační imunochemické metody se značkou
Tento
moderní
soubor
imunoanalytických
metod
je
řádově
citlivější
než imunoprecipitační techniky (detekční limity těchto metod dosahují hodnot 10-15
až 10-20 mol· L-1). Vysoká schopnost určit tak nízké koncentrace antigenu a protilátky
(komplexu antigen-protilátka) je umožněna navázáním vhodné značky na jednoho
z imunoreaktantů. Jako značka muže být použit vhodný enzym (enzymová
imunoanalýza, zkráceně EIA), radionuklid (radioimunoanalýza, RIA) či fluorescenční
nebo chemiluminiscenční látka (fluorescenční imunoanalýza, FIA).
Významným přínosem těchto metod je možnost stanovení analytů charakteru
haptenu .
Neprecipitační imunochemické metody lze podle různých kritérií dělit:
A. Na kompetitivní a nekompetitivní (záleží, zda se uplatňuje soutěž značeného
a neznačeného reaktantu s partnerem z imunokomplexu)
B. Na homogenní a heterogenní (záleží, zda je potřeba separovat značené
imunoreaktanty vázané v komplexu od nenavázaných)
(Káš a kol., 2005; Seydack, 2008; Warsinke a kol., 2000)
2.2.4.1 Enzymová imunoanalýza - EIA
Jedná se o velmi běžnou techniku, kdy je pro zviditelnění vzniklého
imunokomplexu použita enzymová reakce, přičemž je enzym (nejčastěji peroxidása
a alkalická fosfatása) kovalentně navázán na některý z komponentů komplexu (antigen,
hapten, protilátka, druhá protilátka) nebo se v homogenním uspořádání přidává
do reakční směsi až po vytvoření imunokomplexu. Finální určení množství analytu vždy
představuje měření změny absorbance reakčního roztoku, kterou způsobil vznikající
produkt enzymové reakce (Koivunen a Krogsrud, 2006; Králová a kol., 2008; Káš
a kol., 2005; Shan, 2011).
18
2.2.4.1.1 Enzyme-Linked ImmunoSorrbent Assay - ELISA
Jednoznačně nejčastěji využívaným uspořádáním enzymové imunoanalýzy je
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, zkráceně ELISA. Jedná se o heterogenní
imunoanalýzu, která může být provedena jak v kompetitivní, tak nekompetitivní úpravě.
V tomto typu metody je jedna komponenta ukotvena nejčastěji na stěnách mikrotitrační
destičky,
což usnadňuje
oddělení
vázaných
a
volných
enzymem
značených
imunoreaktantů.
Výhodou této metody je možnost analýzy velkého množství vzorků v krátkém
čase, automatizace a dostatečně vysoká přesnost (screening). Hodnota koncentrace
analytu se určuje z kalibrační křivky sestrojené pomocí standardů (Koivunen
a Krogsrud, 2006; Králová a kol., 2008; Káš a kol., 2005; Shan, 2011).
 Nekompetitvní ELISA s imobilozovanými protilátkami (SENDVIČOVÁ)
Tato metoda je využívána pro stanovení koncentrace antigenu ve vzorku.
Podmínkou pro toto stanovení je polyvalentnost antigenu (molekula antigenu
nese 2 a více epitopů pro specifické protilátky).
První protilátka je v nadbytku imobilizovaná na pevném nosiči. K té protilátce je
přidán vyšetřovaný vzorek obsahující antigen. Po inkubaci a promytí je přidána
druhá protilátka značená enzymem. Takto dojde k vytvoření sendvičového
komplexu, znázorněného na Obr. 9. Množství antigenu se určí měřením
absorbance produktu vzniklého ze substrátu přeměněného enzymatickou reakcí.
Koncentrace antigenu je úměrná absorbanci (Káš a kol., 2005; Shan, 2011;
Koivunen a Krogsrud, 2006; Islam a kol., 2011; che1.lf1.cuni.cz, 2011, on line).
Obr. 9: Princip nekompetitivní ELISA- sendvičové uspořádání, převzato
z www.images.slideplayer.cz, 2000, on line
19
 Nekompetitivní ELISA s imobilizovaným antigenem
Modifikace metody ELISA v tomto uspořádání je využívána pro stanovení
protilátek.Antigen je pomoci specifických „držadel“ ukotven na pevnou fázi
a v prvním kroku reaguje se specifickou protilátkou ve vzorku. Vzniklý
imunokomplex dokazujeme za pomoci druhé protilátky značené enzymem
(Koivunen a Krogsrud, 2006).
 Přímá kompetitivní ELISA (rovnovážná saturační metoda)
Podstatou této techniky je kompetice značeného antigenu s antigenem
z testovaného vzorku o omezený počet vazebných míst imobilizované protilátky.
Čím větší množství neznačeného antigenu vzorek obsahuje, tím menší množství
značeného antigenu se naváže na protilátku. V indikační reakci se přidá
chromogenní substrát, který reaguje s enzymovou značkou a následně je
proměřena absorbance. Intenzita vzniklého zbarvení je nepřímo úměrná
koncentraci antigenu ve vzorku (Káš a kol., 2005; Koivunen a Krogsrud, 2006).
 Nepřímá kompetitivní ELISA
Tato metoda se používá pro stanovení antigenu ve vzorku a její provedení se dělí
na dvě fáze. První fáze je kompetitivní, kdy navázaný antigen soutěží s volným
antigenem ve vzorku o omezené množství volných vazebných míst na protilátce,
která je přidávána v roztoku (čím méně antigenu obsahuje vzorek, tím více
protilátek se naváže na imobilizovaný antigen). Druhá fáze je již nekompetitivní,
kdy se imunokomplex dokazuje nadbytkem druhé značené protilátky proti první
protilátce. Přínosem tohoto uspořádání je vysoká citlivost a univerzálnost použití
značené protilátky (Káš a kol., 2005; Zhao a kol., 2006).
2.2.4.1.2 Enzyme Multiplied Immunoassay Techniquie - EMIT
Jedná se o imunochemickou homogenní enzymovou analýzu běžně využívanou
pro kvalitativní a kvantitativní stanovení léků a některých proteinů v moči a séru.
Principem této metody je soutěž neznačeného antigenu (ze vzorku) s konjugátem
(antigen spojený s enzymem) o navázání na omezené množství protilátky. Při vazbě
konjugovaného antigenu na protilátku ztrácí enzym svou aktivitu. Proto čím je
20
ve vzorku více neznačeného antigenu, tím zůstane více zachované enzymové
aktivity,která se následně měří.Popsaný princip této techniky je znázorněn na Obr. 10.
Při EMIT je nejčastěji používaným enzymem glukoso-6-fosfátdehydrogenása nebo
maltátdehydrogenása (Rosethal a kol., 1976; Koivunen a Krogsrud, 2006).
Obr. 10: Princip Enzyme Multiplied Immunoassay Techniquie, převzatoz www.boomer.org, 2010,
on line
2.2.4.2 Radioimunoanalýza – RIA
Jako RIA jsou označeny imunochemické neprecipitační techniky, v nichž je jeden
z imunoreaktantů označen radionuklidem. Ke značení se nejčastěji používají
125
I a 3H.
Většina běžně využívaných metod jsou heterogenní (vyžadují separační krok)
a v kompetitivním uspořádání. Pro kvantitativní stanovení určité látky ve vyšetřovaném
vzorku je zapotřebí vytvořit kalibrační křivku, která odráží závislost výsledného signálu
na známé koncentraci dané látky (standardu).
Určitou nevýhodou této metody je práce s radioaktivními látkami a tím i vyšší
zdravotní riziko ozáření (Králová a kol., 2008; Daussant a Desvaux, 2007).
2.2.4.3 Fluorescenční imunoanalýza – FIA
Veškerá fluorescenční imunoanalýza je založená na schopnosti některých látek
fluoreskovat.Fluorescence je fyzikální jev, kdy je látka schopna po absorpci energie
z excitačního záření část této energie zpětně vyzářit ve formě emisního záření o vyšší
vlnové délce (nižší energii).
Nejpoužívanější fluoroforní značkou jsou fluoresceinizothiokyanát, fykoerytrin,
tetramethylrodaminizothiokyanát, které jsou vizualizovány za použití fluorescenčního
mikroskopu či fluorometru.
21
Tak jako výše zmíněné metody je i FIA běžně uplatňovaná v kompetitivním
homogenním i heterogenním uspořádání, avšak citlivost těchto technik bývá často
snížená interferencí balastních látek z biologických materiálů. Řešením toho může být
časově modulovaná detekce fluorescence, založená na použití nových fluorescenčních
indikátorů, lanthanidových chalátů (Koivunen a Krogsrud, 2006; Králová a kol., 2008).
2.2.4.4 Imunoblotovací techniky (Western Blot)
Při těchto metodách se kloubí separační účinky gelové elektroforézy
(SDS-PAGE) a imunodetekční schopnosti komplexu antigen-protilátka. Nejprve je
vzorek rozdělen v jednosměrném elektrickém poli na polyakrylamidovém gelu.
Následně je elektroforeogram otisknut na nitrocelulózovou membránu, kde po vysycení
volných míst inertní bílkovinou dojde k detekci antigenu specifickou protilátkou
značenou enzymem.
Tyto techniky jsou i přes vyšší časovou a finanční náročnost hojně využívané,
díky své vysoké přesnosti (Koivunen a Krogsrud, 2006; Králová a kol., 2008).
2.2.5 Imunoafinitní chromatografie
Základem imunoafinitní chromatografie je specifická nekovalentní interakce mezi
imobilizovaným ligandem a izolovanou látkou z roztoku. Nejčastějším použitím je
izolace antigenu ze vzorku pomocí imunosorbentu - kotvené protilátky (Henriksen
a kol., 2014).
V poslední době se tato technika nepoužívá pouze jako frakcionační,
ale i k důkazu antigenů ve vzorku. Při tomto uspořádání antigen přítomný ve vzorku
konjuguje s činidlem za vzniku komplexu antigen-činidlo. Tento komplex migruje
k protilátce ukotvené na porézní membráně, kde po vazbě antigen-činidlo-protilátka
vznikne specifický band, signalizující pozitivní test. Nadbytek činidla putuje dál,
kde s jiným navázaným proteinem reaguje a signalizuje konec testu. Toto uspořádání je
například používáno pro detekci bakteriálních toxinů (Thongprachun a kol., 2010).
22
2.2.6 Imunosenzory
Imunosenzory jsou polovodičová zařízení, v nichž je zakotvená a propojená
imunochemická reakce s převodníkem, viz Obr. 11. To umožňuje sledovat přímo nebo
nepřímo interakci protilátky s antigenem. Jelikož je vývoj v oblasti imunochemie
v posledních pár letech zaměřen právě na imunosenzory, je možno se setkat
s imunosenzory obsahující převodníky elektrochemickými, optickými, akustickými
a kalorimetrickými (Morgan a kol., 1996; Luppa a kol., 2001).
Obr. 11: Schéma konstrukce obecného imunosenzoru, převzato z Luppa a kol., 2001
2.2.6.1 Přímé imunosenzory
Tyto senzory umožňují monitorování koncentrace analytu v reálném čase
a to díky detekci změny optických či elektrických vlastností vyvolané interakcí antigenu
s protilátkou, která je zakotvená ve vrstvě speciálního materiálu. Přímé senzory jsou
nejčastěji konstruovány s využitím optických vláken, odrazové techniky či povrchové
plazmové rezonance. Výhodou takovýchto senzorů je rychlý detekční čas, žádné
separační kroky a velmi malé množství spotřebovaných reagentů. Značným problémem
je dostatečný přístup analytu k zakotvené protilátce (Morgan a kol., 1996; Nellen
a Lukosz, 1991; Luppa a kol., 2001).
23
2.2.6.2 Nepřímé imunosenzory
Nepřímé imunosenzory využívají vhodné značky (fluorescenční, luminiscenční
či enzymu) a následného potenciometrického či amperometrického stanovení. V tomto
uspořádání je nejprve imunokomplex zachycen na citlivém povrchu převodníku,
následně je odstraněna reakční směs a po promytí je změřeno množství zachycené
značky (Luppa a kol., 2001; Dolatabadi a Guardia, 2014).
24
2.3 ÚPRAVA VZORKŮ MLEZIVA A KONKRÉTNÍ VYUŽITÍ
IMUNOCHEMICKÝCH METOD PŘI ANALÝZE
BIOLOGICKY AKTIVNÍCH SLOŽEK MLEZIVA
Mnoho komponent kolostra vykazuje vedle své nutriční hodnoty i značnou
specifickou biologickou aktivitu. V průběhu posledních dvaceti let se zájem o tyto
fyziologicky prospěšné látky zvýšil a tím i vzrostla potřeba vývoje přesných
analytických
metod
a propracovaných
technologických
postupů
pro
kontrolu
a zpracování kolostra (při zpracování pro humánní použití musí být zajištěna maximální
bezpečnost a minimální riziko výskytu patogenů).
Zkušenosti týkající se vlivu zpracování a separačních postupů na biologicky
aktivní látky v kolostru a mléce jsou však omezené (Elfstrand a kol., 2002).
Před samotnou analýzou mleziva jsou vzorky z prvních nádojů po porodu
nejčastěji okamžitě zmraženy. Po rozmražení je pomocí centrifugace odstraněna tuková
frakce a sýřením je mlezivo zbaveno kaseinu (Brody, 2000; Elfstrand a kol., 2002).
Pro zajištění minimálního mikrobiálního znečištění je kolostrální syrovátka tepelně
ošetřena nebo je provedena mikrofiltrace. Následné kroky zpracování se liší podle
finální podoby vzorku pro analýzu.
Několik vědeckých studií se zabývalo vlivem jednotlivých,výše zmíněných, kroků
zpracování
kolostra
účinnou
na
formu
imunoglobulinů,
růstových
faktorů,
laktoperoxidásy či laktoferinu. Závěry těchto studií jsou shodné a vyplývá z nich
postupné snižování obsahu biologicky aktivních látek v kolostru po filtračním
a tepelném ošetření, ale i po odstranění tuku, kaseinu, laktózy a solí (Sousa a kol., 2013;
Gosch, 2013; Elfstrand a kol., 2002).
2.3.1 Imunochemické metody pro stanovení imunoglobulinů
Jednou
z nejjednodušších
používaných
metod
pro
určování
množství
imunoglobulinů ve vzorcích kolostra je radiální imunodifuze. Pro tuto analýzu jsou
již komerčně běžně dostupné kity s homogenně rozptýlenými protilátkami v gelu.
Pro provedení
analýzy
je
pouze
zapotřebí
25
správně
naředit
vzorek,
nanést
ho do vyřezaných jamek, nechat inkubovat a následně odečíst průměr precipitačního
kruhu (Elfstrand a kol., 2002; Burton a kol., 1989).
Pro stanovení množství se může dále používat ELISA a to v různém uspořádání.
Tato metoda je finančně i časově náročnější a vyžaduje tzv. zkoncentrování vzorku.
Kvantifikace je prováděna spektrofotometrickým měřením (Liu a kol., 2010; Pfeffer
a kol., 2005).
2.3.2 Imunochemické
metody
pro
stanovení
transformujícího
růstového faktoru (TGF-β2)
Stejně jako pro imunoglobuliny je nejčastěji využívanou technikou pro detekci
a kvantifikaci růstového faktoru TGF-β2 metoda ELISA. Značnou roli při studiu
množství přítomného TGF- β2 hraje neaktivní forma zmíněného faktoru, která tvoří
více než 90 % z celkového TGF-β2 (Pakkanen, 1998).
2.3.3 Imunochemické metody pro stanovení laktoferinu
Přestože je koncentrace laktoferinu obsaženého v mléce dosti proměnlivá, oproti
jiným biologicky aktivním látkám je řádově nižší a díky tomu je jeho analytické
stanovování značně obtížnější. Vedle již výše zmíněné metodě ELISA (patřící mezi
hojně využívané metody analýzy v běžné praxi) bývají při studiu laktoferinu
uplatňovány biosenzory (Indyk a Filonzi, 2005; Dupont a kol., 2006).
2.3.4 Imunochemické stanovení laktoperoxidasy
Pro analýzu laktoperoxidasy se, i přesto že se jedná o biologicky aktivní látku,
nevyužívají klasické imunochemické metody. Ukázalo se, že je pro její separaci
a kvantifikaci
výhodnější
použít
gelovou
afinitní
chromatografii,
SDS-PAGE
elektroforézu a spektrofotometrické metody (Atasever a kol., 2013; Shin a kol., 2000).
26
2.3.5 Imunochemické stanovení lysozymu
Analytické stanovení lysozymu může být do jisté míry komplikováno a ovlivněno
schopností lysozymu vázat se na mléčné bílkoviny. Důsledkem toho může být jeho
množství zdánlivě menší po oddělení syrovátky a mléčných bílkovin. Přesto se ukázalo,
že vhodnou a dostatečně přesnou metodou je ELISA v sendvičovém uspořádání
(Kerkaert a kol., 2010).
27
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1 POUŽITÝ MATERIÁL A CHEMIKÁLIE

Kyselina octová, 98% (Lachner, ČR)

Demineralizovaná voda

SRID pufr (IDBiotech)

KitIDBiotech
3.2 POUŽITÉ PŘÍSTROJE

Čtečka IDRing®Viewer S120
3.3 PŘÍPRAVA ROZTOKŮ
3.3.1 Příprava 2% kyseliny octové
Pro přípravu 100 mL 2% kyseliny octové bylo použito 1,95 mL 98% kyseliny
octové, která byla do 100 mL doplněna demineralizovanou vodou.
3.3.2 Příprava SRID 1X pufru
V čisté zásobní lahvi bylo smícháno 10mL SRID 5X pufru (součást kitu pro SRID
IDBiotech) s 40 mL demineralizované vody.
28
3.4 PRACOVNÍ POSTUPY A POUŽITÉ METODY
3.4.1 Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID)
K provedení jednoduché radiální imunodifuze byl použit komerčně dostupný kit
IDBiotech (Francie). Set IDBiotech obsahoval agarovou destičku, 4standardní roztoky
o dané koncentraci a základní SRID pufr 5X, který se po naředění na SRID 1X používá
pro ředění vzorků.
Radiální imunodifuze je imunochemická metoda založená na interakci
stanovovaného proteinu (antigenu) se specifickou protilátkou (antisérem), která je
homogenně rozptýlená v agarovém gelu. Pro aplikaci vzorků a standardů se využívá
již předem vyřezaných jamek v gelu, do nichž se pomoci mikropipety přenese přesně
definované množství roztoku. Při aplikaci nesmí dojít ke kontaktu pipetové špičky
a vzorkové jamky či poškození agaru. Po nanesení roztoků a jejich absorpci do gelu, je
destička umístěna do termostatu, kde je při 37 °C inkubována. Během inkubace se díky
difuzi roztoků z jamek do gelu vytvoří precipitační kruhy, jejichž průměr je úměrný
koncentraci stanovovaného proteinu ze vzorku. Pro číselné vyjádření koncentrace je
zapotřebí sestavit kalibrační křivku na základě získaných průměrů precipitačních kruhů
standardů.
3.4.1.1 Stanovení koncentrace laktoferinu pomoci SRID
3.4.1.1.1 Příprava vzorků
Pro stanovení koncentrace laktoferinu byl zvolen jeden vzorek mléka (farma
Linhart Roblín), který nebyl nijak upravován, a jeden vzorek kravského mleziva
z prvního nádoje (ZD Kojčice). Před analýzou byl vzorek mleziva ředěný 2krát a 8krát
s využitím SRID pufru 1X.
Pro přípravu 2krát ředěného mleziva bylo použito 500 µL SRID pufru 1X
a 500 µL kolostra.
Pro přípravu 8krát ředěného mleziva bylo použito 500 µL 2krát ředěného mleziva
a 1500 µL SRID pufru 1X. Výsledné roztoky byly řádně promíchány.
29
3.4.1.1.2 Postup stanovení koncentrace laktoferinu pomoci SRID
Nejprve byly do prvních 4 jamek naneseny standardy kravského laktoferinu
v dávkách o objemu 15 µL. Po sobě jdoucí standardy měly koncentraci: 12,5 µg· mL-1,
25 µg· mL-1, 50 µg· mL-1 a 100 µg· mL-1. Následně byly ve stejném objemu aplikovány
vzorky mléka, 2krát a 8krát ředěného mleziva.
Destička byla po absorpci vzorků do gelu umístěna do vzduchotěsné krabičky
obsahující vlhkou buničinu (obrana proti vyschnutí gelu) a inkubována při 37 °C
po dobu 48 hodin. Po stanovené době inkubace byla precipitační reakce zastavena
pomoci roztoku 2% kyseliny octové, která byla po jedné minutě vymyta
demineralizovanou vodou. Pro dostatečné zviditelnění precipitátu byla destička ještě
dalších 10 až 15 minut přelita dostatečným množstvím demineralizované vody.
Průměr precipitačních kruhů byl odečítán s využitím IDRing®Viewer čtečky.
Koncentrace laktoferinu byla stanovená z kalibrační křivky.
30
4. VÝSLEDKY
4.1 STANOVENÍ KALIBRAČNÍ KŘIVKY
Pro určení koncentrace laktoferinu bylo potřeba stanovit kalibrační křivku, která
byla získána vynesením odmocniny koncentrace standardů vůči odečtu velikostí
příslušných precipitačních kruhů, viz Tab. VII a Obr. 12.
Tab. VII: Hodnoty koncentrací standardů a příslušných odečtených průměrů precipitačních kruhů
Standardy
4
3
2
1
c1/2
c
[µg· µL ]
-1
[µg · µL
1/2
100
50
25
12,5
d
-1/2
[mm]
]
10,0
7,1
5,0
3,5
13,00
9,75
7,25
5,50
14
12
d [mm]
10
8
6
y = 1,1555x + 1,4795
R² = 0,9998
4
2
0
0
2
4
6
Druhá odmocnina koncentrace
8
[µg1/2·
10
µL-1/2]
Obr.12: Kalibrační přímka pro laktoferin
31
12
Matematické vyjádření kalibrační křivky je pro přehlednost uvedeno v Tab. VII.
Tab. VIII: Rovnice vyplývající z kalibrační přímky,
d…průměr, a…směrnice přímky, c…koncentrace, b…posun na ose y, R2…hodnota spolehlivosti
d = a . c1/2 + b
a=
1,1555
b=
1,4795
R2=
0,9998
4.2 STANOVENÍ KONCENTRACE LAKTOFERINU
Koncentrace laktoferinu v mlezivu a v mléce byla získána dosazením do rovnice
kalibrační křivky. Pro přehlednost jsou výsledky uvedeny v Tab. IX.
Tab. IX: Tabulka výsledků
d
Jamka
Vzorek
[mm]
c
[µg· mL-1] [µg· mL-1]
5
mléko
6,75
20,80
6
mléko
7,00
22,83
7
2x řed. kol. neměřitelné
-
8
2x řed. kol. neměřitelné
-
9
8x řed. kol.
11,25
71,50
10
8x řed. kol.
11,25
71,50
Obr. 13: Výsledek experimentu
32
průměr
21,82
-
71,50
5. DISKUZE
Metodou jednoduché radiální imunodifuze bylo množství laktoferinu stanoveno
na průměrných 572,0 μg· mL-1 ve vzorku mleziva a na 21,8 μg· mL-1 v mléce.
Koncentrace laktoferinu v 2krát ředěném vzorku mleziva byla tak vysoká, že se pomocí
čtečky nedal správně odečíst průměr precipitačního kruhu, a tím pádem ani správně
vypočítat množství laktoferinu (ukázka toho, že pro precipitační metody je nutno volit
správné ředění vzorku).
Jak již bylo výše uvedeno, množství obsaženého laktoferinu v mléce a kolostru se
výrazně mění, a to v závislosti na období laktace popřípadě i na přítomnosti infekce
u producentky. Díky tomu se i do značné míry liší hodnoty koncentrací laktoferinu
publikované v odborné literatuře. Toto tvrzení je podloženo výzkumem zveřejněným
v článku
Lactoferrin concentrations in milk from normal and subclinical mastitic cos
od Hagiwara a kol., 2003, jenž uvádí 1,15–485,63 μg· mL-1 laktoferinu v mléce
a 1000-5000 μg· mL-1 laktoferinu v kolostru.
Výsledky mého měření nejvíce odpovídají hodnotám 820 ± 540 μg· mL-1
laktoferinu ve vzorkách mleziva, které ve svém odborném článku uvádí Kehoe a kol.,
2007. Naměřené množství tohoto antimikrobiálního glykoproteinu ve vzorku mléka
spadá do intervalu koncentrací udávaného autory Madureira a kol., 2007 ve své práci
Bovine whey proteins-Overview on their main biological properties.
33
6. ZÁVĚR
Tato bakalářská práce shrnuje současné poznatky o kolostru a imunochemických
metodách, jež jsou využívány pro studium biologicky aktivních látek mleziva.
Kolostrum má díky svému jedinečnému složení velké uplatnění v modulaci
imunitního systému nejen mláďat, ale i konzumentů potravinářských doplňků. Tyto
přípravky z kolostra hrají významnou roli v oblasti zdravotní péče, neboť kromě výše
zmíněné imunitní podpoře vykazuje mlezivo pozoruhodné schopnosti týkající se
svalové a kosterní opravy, růstu a ochrany střevní sliznice.
Aby mohlo být kolostrum průmyslově využíváno je zapotřebí sledovat jeho
proměnlivé složení a aktivitu příslušných látek. Vzhledem k náročnosti technologického
procesu a nároku na co nejkratší dobu produkce daných přípravků je vhodné
pro analýzu a kontrolu využívat metody, které jsou jednoduché, názorné a pokud možno
co nejméně technicky a finančně náročné. Jako nejschůdnější se ukázaly být
imunochemické metody.
Velkými
výhodami
těchto
metod
je
jejich
specifičnost,
dána
reakcí
protilátka-antigen, technická nenáročnost a mnohdy možná analýza více vzorků
najednou (screening). V poslední době je velká pozornost soustředěna na biosenzory,
jež umožňují okamžitou analýzu bez prodlení času a nutnosti separace komlexu.
Součástí této bakalářské práce bylo i ověření běžně používané metody jednoduché
radiální imunodifuze pro stanovení koncentrace laktoferinu v kolostru. Získané
výsledky, 572.0 μg· mL-1 laktoferinu ve vzorku mleziva a 21,8 μg· mL-1 v mléce,
odpovídají hodnotám uváděným v odborné literatuře. Metoda SRID je vhodnou
metodou analýzy v provozních podmínkách díky své jednoduchosti a přístrojové
nenáročnosti. Provádí se pomoci komerčně dostupných kitů. Jedinou nevýhodou této
metody je časové prodlení potřebné pro difuzi vzorků gelem a tvorby precipitátu.
34
7. LITERATURA
Adlerova L., Bartoskova A., Faldyna M. (2008): Lactoferrin: a review, Veterinarni
Medicina, 53, str. 457-468.
Antonio J., Sanders M.S., Gammeren D.V. (2001): The effects of bovine
colostrumsupplementation on body composition and exercise performance in active
men and women, Nutrition, 17, str. 243-247.
Atasever A., Ozdemir H., Gulcin I., Kufrevioglu O.I. (2013): One-step purification
of lactoperoxidase from bovine milk byaffinity chromatography, Food Chemistry, 136,
str. 864-870.
Axelsen N.H., Bock E. (1983): Electroimmunoassay (Rocket Immunoelectrophoresis),
Scandinavian Journal of Immunology, 17, str. 103-106.
Barbiroli A., Bonomi F., Capretti G., Iametti S., Manzoni M., Piergiovanni L., Rollini
M. (2012): Antimicrobial activity of lysozyme and lactoferrin incorporated
in cellulose-based food packaging, Food Control, 26, str. 387-392.
Bengoechea C., Peinado I., McClements D. J. (2011): Formation of protein
nanoparticles by controlled heat treatmentof lactoferrin: Factors affecting particle
characteristics, Food Hydrocolloids, 25, str. 1354-1360.
Blum J.W., Baumrucker C.R. (2002): Colostral and milk insulin-like growth factors
and related substances: Mammary gland and neonatal(intestinal and systemic) targets,
Domestic Animal Endocrinology, 23, str. 101-110.
Brody E.P. (2000): Biological activities of bovine glycomacropeptide, British Journal
of Nutrition, 84, str. 39-46.
35
Burton J.L., Kennedy B.W., Burnside E.B., Wilkie B.N., Burton J.H. (1989): Variation
in serum concentrations of immunoglobulins G, A, and M in Canadian
Holstein-Friesian calves, Journal of dairy science, 72, str. 135-49.
Conesa C., Sánchez L., Rota C., Pérez M.-D., Calvo M., Farnaud S., Evans R.W.
(2008): Isolation of lactoferrin from milk of different species: Calorimetric
and antimicrobial studies, Comparative Biochemistry and Physiology, 150,str. 131-139.
Csapó J., Martin T.G., Csapó-Kiss Z.S., Hhzas Z. (1996): Protein, fats, vitamin
and mineral concentrations in porcine colostrum and milk from parturition to 60 days,
International Dairy Journal, 6, str. 881-902.
Daussant J., Desvaux F.-X. (2007): Introduction to Immunochemical Techniques
for Medical Diagnosis, Food Quality Control and Environmental Testing, ICT Prague,
Praha, 84 stran.
Dolatabadi J.E.N., de la Guardia M. (2014): Nanomaterial-based electrochemical
immunosensors as advanced diagnostic tools, Analytical Methods, 6, str. 3891-3900.
Dupont D., Arnould C., Rolet-Repecaud O., Duboz G., Faurie F., Martin B., Beuvier E.
(2006): Determination of bovine lactoferrin concentrations in cheese with specific
monoclonal antibodies, International Dairy Journal, 16, str. 1081-1087.
Elfstrand L., Lindmark-Månsson H., Paulsson M., Nyberg L., Åkesson B. (2002):
Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum
and the effects of processing, International Dairy Journal, 12, str. 879-887.
Emmett P.M., Rogers I.S. (1997): Properties of human milk and their relationship with
maternal nutrition, Early Human Development, 49, str. 7-28.
Farnaud S., Evans R.W. (2003): Lactoferrin - a multifunctional protein with
antimicrobial properties, Molecular Immunology, 40, str. 395-405.
36
Gapper L.W., Copestake D.E.J., Otter D.E., Indyk H.E. (2007): Analysis of bovine
immunoglobulin G in milk, colostrums and dietary supplements: a review, Analytical
and Bioanalytical Chemistry, 389, str. 93-109.
Gill J. (1995): Serum lysozyme level in the European bison, Bison bonasus (L.),
Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular
Biology, 110, str. 235-240.
Gopal P. K., Gill H. S. (2000): Oligosaccharides and glycoconjugates in bovine milk
and colostrums, British Journal of Nutrition, 84, str. 69-74.
Gosch T., Apprich S., Kneifel W., Novalin S. (2013): Improved isolation of bioactive
components of bovine colostrum using cross-flow microfiltration, International Journal
of Dairy Technology, 66, str. 175-181.
Gross J.J., Kessler E.C., Bruckmaier R.M. (2014): Colour measurement of colostrum
for estimation of colostral IgG and colostrum composition in dairy cows, Journal
of Dairy Research, 81, str. 440-444.
Haberskaa K., Svenssona O., Shleeva S., Lindhc L.,Arnebranta T., Ruzgasa T. (2008):
Activity of lactoperoxidase when adsorbed on protein layers, Talanta, 76,
str. 1159-1164.
Hagiwara S., Kawai K., Anri A., Nagahata H. (2003): Lactoferrin concentrations
in milk from normal and subclinical mastitic cos, The Journal of Veterinary Medical
Science, 65, str. 319-323.
Hendriksen C., Hau J. (2003): Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies
(Handbook of Laboratory Animal Science, Hau J., Hoosier G.L.V., Eds.) CRC Press,
Boca Raton, str. 392-407.
Henriksen M.L., Madsen K.L., Skjoedt K., Hansen S. (2014): Calcium-sensitive
immunoaffinity chromatography: Gentleand highly specific retrieval of a scarce plasma
antigen, collectin-LK (CL-LK), Journal of Immunological Methods, 413, str. 25-31.
37
Hillyer G.V., Sanchez Z., de Leon D. (1985): Immunodiagnosis of Bovine Fascioliasis
by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoprecipitation Methods,
The Journal of parasitology, 71, str. 449-454.
Hoogenboom H.R. (2005): Selecting and screening recombinant antibody libraries,
Nature Biotechnology, 23, str. 1105-1116.
Hořejší V., Bartůňková J. (2009): Základy imunologie, TRITON, Praha, 316 stran.
Hurley W.L., Theil P.K. (2011): Perspectives on Immunoglobulins in Colostrum
and Milk, Nutrients, 3, str. 442-474.
Chua N.-H., Blomberg F. (1979): Immunochemical Studies of Thylakoid Membrane
Polypeptides from Spinach and Chlamydomonas reinhardtii, The Journal of Biological
Chemistry, 254, str. 215-223.
Indyk H.E., Filonzi E.L. (2005): Determination of lactoferrin in bovine milk, colostrum
and infantformulas by optical biosensor analysis, International Dairy Journal, 15,
str. 429-438.
Islam K.N., Ihara M., Dong J.-H., Kasagi N., Mori T., Ueda H. (2011):
Direct Construction of
an Open-Sandwich
Enzyme
Immunoassay
for OneStep
Noncompetitive Detection of Thyroid Hormone T4, Analytical Chemistry, 83,
str. 1008-1014.
Jaster E.H. (2005): Evaluation of Quality, Quantity, and Timing of Colostrum Feeding
on Immunoglobulin G1 Absorption in Jersey Calves, Journal of Dairy Science, 88,
str. 296-302.
Jung F., Gee S.J., Harrison R.O., Goodrow M.H., Karu A.E., Braun A. L., Li Q.X.,
Hammock B.D. (1989): Use of immunochemical techniques for the analysis
of pesticides, Pesticide Science, 26, str. 303-317.
38
Káš J., Kodíček M., Valentová O. (2005): Laboratorní techniky biochemie, VŠCHT
Praha, Praha, 258 stran.
Kehoe S.I., Jayarao B.M., Heinrichs A.J. (2008): A Survey of Bovine Colostrum
Composition and Colostrum Management Practices on Pennsylvania Dairy Farms,
Journal of Dairy Science, 90, str. 4108-4116.
Kerkaert B., Mestdagh F., Meulenaer B.D. (2010): Detection of hen’s egg white
lysozyme in food: Comparison between a sensitive HPLC and a commercial ELISA
method, Food Chemistry, 120, str. 580-584.
Kleist S., Chavanel G., Burtin P. (1972): Identification of an Antigen from Normal
Human Tissue That Crossreacts with the Carcinoembryonic Antigen, Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, 69,
str. 2492-2494.
Koivunen M.E., Krogsrud R.L. (2006): Principles of Immunochemical Techniques
Used in Clinical Laboratories, Labmedicine, 37, str. 490-497.
Králová B., Fukal L., Rauch P., Ruml T. (2008): Bioanalytické metody, VŠCHT Praha,
Praha, 254 stran.
Kussendrager K. D., Hooijdonkvan A. C. M (2000): Lactoperoxidase: physico-chemical
properties, occurrence, mechanism of action and applications, British Journal
of Nutrition, 84, str. 19-25.
Lee S.-H., Jaekal J., Bae C.-S., Chung B.-H., Yun S.-C., Gwak M.-J., Noh G.-J., Lee
D.-H. (2008): Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Single Radial Immunodiffusion,
and Indirect Methods for the Detection of Failureof Transfer of Passive Immunity
in Dairy Calves, Journal of Veterinary Internal Medicine, 22, str. 212-218.
Liu G., Zhang Ch., Wang J., Bu D., Zhou L., Zhao S., Li S. (2010): Canonical
correlation of milk immunoglobulins, lactoferrin concentration and Dairy Herd
Improvement data of Chinese Holstein cow, Livestock Science, 128, str. 197-200.
39
Liu X., Dai Q., Austin L., Coutts J., Knowles G., Zou J., Chen H., Huo Q. (2008):
A One-Step Homogeneous Immunoassay for Cancer Biomarker Detection Using Gold
Nanoparticle Probes Coupled with Dynamic Light Scattering, Journal of the American
Chemical Society, 130, str. 2780-2782.
Luppa
P.B.,
Sokoll
L.J.,
Chan
D.W.
(2001):
Immunosensors—principles
and applications to clinical chemismy, Clinica Chimica Acta, 314, str. 1-26.
Madureira A.R., Pereira C.I., Gomes A.M.P., Pintado M.E., Malcata F.X. (2007):
Bovine whey proteins – Overview on their main biological properties, Food Research
International, 40, str. 1197-1211.
Mix E., Goertsches R., Zettl U.K. (2006): Immunoglobulins – Basic considerations,
Journal of Neurology, 253, str. 9-17.
Morgan C.L., Newman D.J., Price Ch. P. (1996): Immunosensors: Technology
and opportunities in laboratory medicine, Clinical chemistry, 42, str. 193-209.
Nellen P.M., Lukosz W. (1991): Model experiments with integrated optical input
grating couplers as direct immunosensors, Biosensors & bioelectronics, 6, str. 517-25.
Ontsouka C.E., Bruckmaier R.M., Blum J.W. (2003): Fractionized Milk Composition
During Removal of Colostrum and Mature Milk, Journal of Dairy Science, 86,
str. 2005-2011.
Pakkanen R. (1998): Determination of Transforming Growth Factor-β2 (TGF-β2)
in Bovine Colostrum Samples, Journal of Immunoassay, 19, str. 23-37.
Pakkanen R., Aalto J. (1997): Growth factors and antimicrobial factors of bovine
colostrum, International Dairy Journal, 7, str. 285-297.
40
Pfeffer A., Shaw R.J., Green R.S., Phegan M.D. (2005): The transfer of maternal IgE
and other immunoglobulins specific for Trichostrongylus colubriformis larval
excretory/secretory
product
to
the
neonatal
lamb,
Veterinary
Immunology
and Immunopathology, 108, str. 315-323.
Playford R.J., Macdonald Ch.E., Johnson W.S. (2000): Colostrum and milk-derived
peptide growth factors for the treatment of gastrointestinal disorders, American Journal
of Clinical Nutrition, 72, str. 5-14.
Ritter M.A. (2000): Polyclonal and Monoclonal Antibodies (Diagnostic and Therapeutic
Antibodies, George A.J.T., Urch C.E., Eds.) Humana Press, Totowa, New Jersey,
str. 23-34.
Rivero
M.J.,
Valderrama
X.,
Haines
D.,
Alomar
D.
(2012):
Prediction
of immunoglobulin G content in bovine colostrum by near-infrared spectroscopy,
Journal of Dairy Science, 95, str. 1410-1418.
Rosenthal A.F., Vargas M.G., Klass C.S. (1976): Evaluation of Enzyme-Multiplied
Immunoassay Technique (EMIT) for Determination of Serum Digoxin, Clinical
chemistry, 22, str. 1899-902.
Séverin S., Wenshui X. (2005): Milk Biologically Active Components as
Nutraceuticals: Review, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45,
str. 645-656.
Seydack M. (2008): Particle-Based Assays: Applications and Unresolved Issues
(Standardization
and
Quality
Assurance
in
Fluorescence
Measurements
II,
Resch-Genger U., Ed.), Springer, Berlin, str. 449-468.
Shan G., Ed. (2011): Immunoassays in agricultural biotechnology, John Wiley & Sons,
Hoboken, New Jersey, 350 stran.
Shin K., Tomita M., Lönnerdal B. (2000): Identification of lactoperoxidase in mature
human milk, Journal of Nutritional Biochemistry, 11, str. 94-102.
41
Siedel J., Schiefer S., Rosseneu M., Bergeaud R.,De Keersgieter W., Pautz B.,
Vinaimont N., Ziegenhorn J. (1988:) Immunoturbidimetric Method for Routine
Determinations of Apolipoproteins A-I, A-Il, and B in Normo- and Hyperlipemic Sera
Compared with Immunonephelometr, Clinical Chemistry, 34, str. 1821-1825.
Singh K.V., Kaur J., Varshney G.C., Raje M., Suri C.R. (2004): Synthesis
and Characterization of Hapten-Protein Conjugates for Antibody Production against
Small Molecules, Bioconjugate Chemistry, 15, str. 168-173.
Sousa S.G., Delgadillo I., Saraiva J.A. (2014): Effect of thermal pasteurisation
and high-pressure
processing
on
immunoglobulin
content
and
lysozyme
and lactoperoxidase activity in human colostrum, Food Chemistry, 151, str. 79–85.
Thongprachum A., Khamrin P., Chaimongkol N., Malasao R., Okitsu S., Mizuguchi M.,
Maneekarn N., Ushijima H. (2010): Evaluation of an immunochromatography method
for rapid detection of noroviruses in clinical specimens in Thailand, Journal of medical
virology, 82, str. 2106-2109.
Uruakpa F.O., Ismond M.A.H., Akobundu E.N.T. (2002): Colostrum and its benefits:
a review, Nutrition Research, 22, str. 755-767.
Vacher P.Y., Blum J.W. (1993): Age dependency of insulin-like growth factor 1, insulin
protein and immunoglobulin concentrations and gamma glutamyl transferase activity in
first colostrums of dairy cows, Milchwissenschaft-milk science international, 48,
str. 423-426.
Vanemon J.M., Lopezavila V. (1992): Immunochemical Methods for Environmental
Analysis, Analytical Chemistry, 64, str. 79-88.
Vašíčková M. (2013): Analýza biologicky aktivních látek mleziva, VŠCHT Praha,
Ústav mléka, tuků a kosmetiky, 128 stran.
42
Wakabayashi H., Oda H., Yamauchi K., Abe F. (2014): Lactoferrin for prevention
of common viral infections, Journal of Infection and Chemotherapy, 20, str. 666-671.
Warsinke A., Benkert A., Scheller F.W. (2000): Electrochemical immunoassays,
Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 366, str. 622-634.
Wu J.T., Clayton F., Myers S., Knight J. (1986): A Simple Radial Immunodiffusion
Method for Assay of β2-Microglobulin in Serum, Clinical Chemistry, 32,
str. 2070-2073.
Zhao J., Li G., Yi G.-X., Wang B.-M., Deng A.-X., Nan T.-G., Li Z.-H., Li Q.-X.
(2006): Comparison between conventional indirect competitive enzyme-linked
immunosorbent assay (icELISA) and simplified icELISA for small molecules,
Analytica Chimica Acta, 571, str. 79-85.
Anonym (2004) European Pharmacopoeia 5.0: Vol-2, Council of Europe, 2727 stran.
Boomer- EMIT [on line]. Datum vytvoření 26.5.2010 [28.5.2015]. Dostupné
z: http://www.boomer.org/c/p3/c03/c0308.html
Department of chemistry - Conformational Changes in Proteins [on line]. Poslední
aktualizace 2.3.2012 [12.4.2015].
Dostupné z: http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Conformation3.html
ELISA-pevný nosič [on line]. Datum vytvoření 5.8.2000 [14.6.2015]. Dostupné
z: http://images.slideplayer.cz/9/2507547/slides/slide_28.jpg
Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi [on line]. Poslední aktualizace
9.10.2004 [4.6.2015].
Dostupné z: http://www.enclabmed.cz/encyklopedie/A/BAADI.htm
Imunochemické metody [on line]. Poslední aktualizace 12.5.2011 [4.6.2015]. Dostupné
z: http://che1.lf1.cuni.cz/html/imuno.pdf
43
Nature reviews
Molecular Cell Biology [on line]. Poslední aktualizace 23.5.2015
[27.6.2015]. Dostupné z:
http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n12/images/nrm972-i1.jpg
Publi-Rozdělení elektroforetických metod [on line]. Poslední aktualizace 18.10.2008
[4.6.2015]. Dostupné z: publi.cz/books/140/02.html
44
8. SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK
EGF
epidermální růstový faktor
EIA
enzymová imunoanalýza
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorrbent Assay
EMIT
Enzyme Multiplied Immunoassay Techniquie
Fab
variabilní oblast polypeptidového řetězce imunoglobulinu
Fc
konstantní oblast polypeptidového řetězce imunoglobulinu
FIA
fluorescenční imunoanalýza
GH
růstový hormon
H
těžký řetězec imunoglobulinu
Ig
imunoglobuliny
IgA
imunoglobuliny třídy A
IgD
imunoglobuliny třídy D
IgE
imunoglobuliny třídy E
IGF
inzulínu podobný růstový faktor
IGFBP
vazebné proteiny inzulínu podobného růstového faktoru
IgG
imunoglobuliny třídy G
IgM
imunoglobuliny třídy M
kDa
kilo Daltony
L
lehký řetězec imunoglobulinu
PCR
polymerázová řetězová reakce
PRP
na prolín bohaté peptidy
RIA
radioimunoanalýza
SDS-PAGE
elektroforéza
v
polyakrylamidovém
dodecylsíranu sodného
SRID
jednoduchá radiální imunodifuze
TGF
transformující růstový faktor
TGF-α
transformující růstový faktor podtřídy α
TGF-β
transformující růstový faktor podtřídy β
45
gelu
v přítomnosti