vrozených glykosylace

Glykobiologie
Glykoproteomika
Funkční glykomika
„Glycobiology – how sweet it is!“
Monosacharidy (glukosa, fruktosa, galaktosa…)
Oligosacharidy (maltosa, isomaltosa, sacharosa,
laktosa.., oligosacharidové řetězce tzv. glykany v
glykoproteinech a glykolipidech)
Polysacharidy (celulosa, škrob, pektin, chitin,
glykogen, hyaluronová kyselina atd.) mají podíl na
architektuře buňky – strukturní funkce, slouží jako
zásobárna energie, významná role v metabolismu
1
Glykosylace je nejběžnější posttranslační modifikací
proteinů: membránově vázané receptory, mnoho rozpustrozpustných proteinů a dokonce i nukleoproteiny.
nukleoproteiny Posttranslační
glykosylace proteinů probíhá v endoplasmatickém retikulu
s katalytickou účastí glykosylačních enzymů
N-glykany jsou vázány přes N-acetyl-β-D-glukosamin
(βGlcNAc) na amidový dusík v L-asparaginu. Pro tuto
glykosylaci musí být přítomná signální sekvence Asn-XxxSer/Thr, přičemž Xxx může být jakákoli aminokyselina s
vyjímkou Pro a Asp.
O-glykany jsou vázány na hydroxylovou skupinu L-serinu
nebo L-threoninu, a to přes N-acetyl-α-D-galaktosamin
(αGalNAc). Na základě současných vědomostí pro Oglykany neexistuje žádná signální sekvence.
2
3
O-glykany
4
V glykosylaci téhož glykoproteinu existuje běžně
variabilita daná přítomnosti více glykosylačních míst.
Glykoformy jediného glykoproteinu mají shodnou sekvenci
polypeptidového řetězce. Rozmanitost v umístění, stupni
saturace na jednotlivých glykosylačních místech a složení
glykanových řetězců však přispívá k mikroheterogenitě v
molekulové hmotnosti a náboji.
Glykosylace proteinů vykazuje čtyři typy specifičnosti.
Druhová specifičnost - odlišnosti mezi analogickými
proteiny např. lidskými a jinými savčími. Tkáňová
specifičnost:
specifičnost glykosylační typ ledvinových glykoproteinů
se liší od typu charakteristického pro pojivovou tkáň.
Buněčná specifičnost je dána vlastnostmi a funkcí určité
buňky. Proteinová specifičnost (nejnižší úroveň), kdy
proteiny produkované např. stejnou buněčnou linií za
stejných kultivačních podmínek mají různou glykosylaci.
5
Peptidoglykany u bakterií
6
Sialové kyseliny
Sialové kyseliny u člověka a živočichů představují zakončení
oligosacharidů na povrchu buněk.
7
Monosacharidy běžné v glykoproteinech
8
Jaké informace se získávají při analýze glykoproteinů?
1.Glykosylační místa – počet;
2.Jejich obsazení oligosacharidovými řetězci;
3.Sekvence řetězců;
4.Místa větvení;
5.Vazebné propojení a konfigurace monosacharidů;
6.Odlišení izobarických struktur.
9
Afinitní chromatografie s použitím lektinů
10
APTS značení glykanů před separací kapilární elfo
– výsledkem stejný náboj (po předchozí desialylaci,
rozdílná velikost má vliv na migraci
11
Permethylace
Methylace oligosacharidů pro MS analýzu
– umožňuje současně analyzovat neutrální a sialylované
struktury;
-umožňuje RP-HPLC separaci permethylovaných
struktur;
- zdokonaluje výsledky MS/MS a zjednodušuje jejich
interpretaci;
Provedení:
dimethylsulfoxidem smíseným s práškovým hydroxidem
sodným a methyljodidem.
Ciucanu I, Kerek F Carbohydr. Res. 1984,131, 209-217
12
Hmotnostní spektrometrie glykanů
Zejména MALDI-TOF MS.
1. Měření intaktních molekul (velikost).
2. Fragmentace (pro určení struktury).
tři typy fragmentačních experimentů:
- PSD (post-source decay), fragmenty vznikají po
extrakci iontů z iontového zdroje
ISD (in-source decay), fragmenty vznikají uvnitř
iontového zdroje
- CID (collision-induced dissociation), fragmenty
vznikají v kolizní cele pomocí kolizního plynu
13
14
15
Určení N-glykosylačních míst a heterogenity
Ann et al., Anal. Chem. 75 (2003) 5628.
Amidasová reakce N-glykosidasy F (PNGasa F)
Deglykosylace použitím hydrazinu
16
β-Eliminace s použitím amoniaku
Enzymová sekvenční analýza
17
18
19
On-plate sekvencování
20
Funkční glykomika
Některé nemoci spojené s glykokonjugáty
1.Oslabení imunity díky infekčním chorobám, včetně
AIDS;
2.Revmatická artritida (ovlivněno složení IgG a
hladina MBP v séru – mannose-binding protein);
3.Prionové choroby;
4.Vrozené choroby glykosylace (vzácné, poškození
CNS);
5.Choroby ústní dutiny;
6.Cystická fibrosa;
7.Srdeční choroby;
8.Rakovina.
Jak se projevuje rakovina?
1. Zvýšené větvení a sialylace N-glykanů; fukosylace
2. Zvýšená sialylace O-glykanů
3. Výskyt polysialylace
4. Zkrácení některých O-glykanů
21
Mapování glykanů pro diagnostické účely
22
Lipidy
ve vodě nerozpustné látky, které mají v živém
organismu řadu funkcí:
1) udržování elektrochemického gradientu
2) tvorba subcelulárních struktur (kompartmentace)
3) úloha v buněčné signalizaci (první a druhý posel)
4) uchovávání energie
5) transport proteinů a jejich kotvení v membránách
Řada onemocnění souvisí s poruchami metabolismu
lipidů např. atheroskleróza, diabetes, obezita,
Alzheimerova choroba.
tuky
1
fosfolipidy
Sójový lecithin
2
Tukové buňky
(fat cells)
3
Biosyntéza hlavních fosfolipidů v savčí buňce
kinasy
transferasy
Lipidomika - definice
Journal of Lipid Research, Vol. 47, 2101-2111, October 2006
Lipidomics: a global approach to lipid analysis in
biological systems
by
Andrew D. Watson
Lipidomika, která je odvětvím vědecké disciplíny zvané
metabolomika, znamená systematické studium všech
lipidů, jejich struktury, zastoupení a funkce v buňce,
a dále molekul se kterými interagují (z těchto se
myslí zejména proteiny).
4
Nedávná zdokonalení měkkých ionizačních technologií pro
hmotnostní spektrometrii v kombinaci se zavedenými
separačními technikami (LC, GC) umožnila rychlou a citlivou detekci rozmanitých lipidových látek s minimalizovanou
náročností přípravy vzorku.
Pojmem "lipidový profil" surového lipidového extraktu
(buň. či tkáňová kultura) se myslí hmotnostní spektrum,
které ukazuje složení a abundanci obsažených lipidů.
Lipidový profil můžeme použít k monitorování změn v čase
a v rámci odezvy na určité podněty.
Lipidomika spolu s genomikou, proteomikou a metabolomikou přispěje k pochopení funkce lipidů v biologickém systému a bude mocným nástrojem pro vysvětlení mechanismů nemocí spojených s lipidy, sledování biomarkerů a
monitorování farmakoterapie.
5
J. Lipid Res. (2005), Vol. 46, 839-861.
SP
GP
6
7
Extrakce lipidů
Protokoly v literatuře, např.
„Lipid analyses were carried out according to the
methods of Kates (1986). Briefly, lipids were extracted
from the washed whole cells obtained by centrifugation
by stirring three times in chloroform-methanol (2:1
[vol/vol]), and each time the cells were separated by
filtration. The filtrates were accumulated together,
purified by the method of Folch et al. (1957), and used
as total extractable lipid (TEL).“
„Mouse myocardial lipids were extracted by a modified
Bligh & Dyer (1959) method.“
Směs chloroform-methanol, přídavek LiCl/LiOH nebo
NH4Cl/NH4OH.
GC separace
8
HPLC separace
hmotnostní spektrometrická analýza surového extraktu
bez separace
9
SHOTGUN
Lipidomics
Hmotnostní spektrometrie lipidů
10
Hmotnostní spektrum extraktu (MS), „lipidový profil“
negativní mód
Strategie
MS/MS v lipidomice
Product ion scan
Precursor ion scan
Neutral loss scan
11
2-D
PI scan
MS/MS
12
Biomarkery – Alzheimerova choroba (AD)
plasmalogeny
oxidace!
13
LIPID MAPS
Lipid Metabolites and Pathways Strategy
cíle LIPID MAPS
(1) Separovat a detekovat všechny lipidy v dané
buňce, objevit a charakterizovat nové lipidy,
které by navíc mohly být přítomné.
(2) Kvantifikovat každý z přítomných lipidových
metabolitů a změny v jeho hladinách a lokalizaci
během buněčného života.
(3) Definovat metabolické dráhy vlastní každému
lipidu a vytvořit z nich lipidové mapy, které by
ukazovaly sítě vzájemných interakcí.
14
Klasifikace lipidů
FA
GL
GP
SP
–
–
–
–
Fatty acyls
Glycerolipids
Glycerophospholipids
Sphingolipids
www.lipidmaps.org
ST – Sterol lipids
PR – Prenol lipids
SL – Saccharolipids
PK – Polyketides
15
The LIPID MAPS Structure Database (LMSD)
http://www.lipidmaps.org/data/structure/index.html
The LIPID MAPS Proteome Database (LMPD)
Proteinové sekvence mající souvislost s lipidy; k tomu
anotace z databází UniProt, EntrezGene, ENZYME, GO,
KEGG a dalších veřejně dostupných zdrojů.
16
17
Kyselina arachidonová, MS/MS spektrum
18
Cholesterol, MS/MS spektrum
2,3-Bis-(3R-hydroxy-tetradecanoyl)-αDglucosamine-1-phosphate tzv. Lipid X, MS/MS spektrum
[M-H]-
19
20