Pro diagnostické použití in-vitro Kód výrobku: FS217.A

OPIČÍ VARLATA
SUBSTRÁTOVÁ SKLA PRO IFA
Czech
8.2
Další potřebné materiály
8.2.1
Tlumivý roztok PBS pro ředění vzorků a promývání.
8.2.2
Láhev na tlumivý roztok PBS.
8.2.3
Mikropipety a špičky na jedno použití pro nanášení pacientských
vzorků.
8.2.4
Vlhká komůrka pro inkubační kroky (např. komůrka s příchytnými
magnetickými pásky („Magnetic staining chamber“, kódové označení
BD010).
8.2.5
Fluorescenční mikroskop s excitačním filtrem 495nm a bariérovým
filtrem 515nm.
8.2.6
Plastová střička pro počáteční opláchnutí skel PBS.
8.2.7
Další složky lze objednat od firmy The Binding Site: PBS (CON 3.3),
negativní kontrola (CON 92), pozitivní kontrola na steroidní buňky
(FA168), protilátka proti lidskému IgG (H+L) vysycená opičími
sérovými proteiny – konjugát s FITC (FA003.M), 1% Evansova modř
(CON 93) a montovací médium (CON195).
8.3
Pracovní postup testu
Pro diagnostické použití in-vitro
Kód výrobku: FS217.A
Vyrobeno společností:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Telefon: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
1
Kontrola jakosti.
Při každém testování vzorků je nutné vždy použít pozitivní
a negativní kontrolní vzorky.
POUŽITÍ
Řezy opičích varlat jsou určeny pro screening cirkulujících protilátek proti
steroidním buňkám v lidském séru metodou nepřímé imunofluorescence (IFA).
2
SOUHRN A VÝKLAD
8.3.1
Montovací médium: Vyjměte montovací médium z lednice tak, aby
před použitím dosáhlo laboratorní teploty (18-28°C).
8.3.2
Ředění pacientských vzorků
Screening: Pacientské vzorky řeďte 1/5 přidáním 40µL séra ke
160µL tlumivého roztoku PBS.
Titrace: Screening-pozitivní vzorky nařeďte geometrickou řadou
tlumivým roztokem PBS (např. 1/10, 1/20, 1/40 a 1/80 apod.).
Například: Pro přípravu ředění 1/10 použijte 100µL vzorku ředěného
1/5 a smíchejte se 100µL tlumivého roztoku PBS. (Opakujte pro další
ředění.)
8.3.3
Substrátová skla. Před tím, než vyjmete substrátová skla
z alobalových sáčků, nechejte je vytemperovat na laboratorní teplotu
(18-28°C). Skla vhodným způsobem označte, umístěte do vlhké
komůrky a přidejte do příslušných jamek pozitivní a negativní
kontrolu. Do zbývajících jamek přidejte 50-100µL naředěných
pacientských vzorků.
8.3.4
Inkubace substrátových skel. Inkubujte skla 30 minut ve vlhké
komůrce při laboratorní teplotě (18-28°C).
8.3.5
Promývání pomocí PBS. Vyjměte skla z vlhké komůrky a krátce je
opláchněte proudem PBS ze střičky. Nestříkejte přímo na jamky. Skla
umístěte do držáku a ponořte je do PBS a třepejte nebo míchejte po
dobu 5-10 minut.
8.3.6
Přidání konjugátu s fluoresceinem. Odklepněte přebytek PBS
a osušte plochu mezi jamkami. Skla vraťte do vlhké komůrky
a každou jamku okamžitě převrstvěte kapkou odpovídajícím
způsobem
naředěného
fluoresceinového
konjugátu.
NENECHÁVEJTE JAMKY PRÁZDNÉ DÉLE NEŽ 15 VTEŘIN.
Zaschnutí substrátu významně ovlivňuje výsledky. Použití konjugátu
vysyceného opičími sérovými proteiny (např. FA003.M) výrazně
zdokonaluje výsledky.
8.3.7
Inkubace skel. Skla inkubujte 30 minut ve vlhké komůrce při
laboratorní teplotě (18-28°C) v temnu.
8.3.8
Promytí v PBS. Skla opět promyjte způsobem popsaným v bodě
8.3.5. DOBARVENÍ POZADÍ PODLE VOLBY UŽIVATELE: Dříve, než
skla ponoříte do PBS, přidejte 2-3 kapky 1% roztoku Evansovy modři
na 100mL PBS.
8.3.9
Montování krycích sklíček. Po uplynutí promývací doby vyjměte jedno
sklo z lázně. Rychle osušte plochu kolem jamek a do každé jamky
přidejte kapku montovacího média. Pozorně přikládejte substrátové
sklo ke krycímu sklíčku tak, abyste zamezili vzniku bublin. Pokud se
však bubliny vytvořily, nesnažte se je odstranit. Přebytek média
kolem okrajů krycího sklíčka otřete.
8.3.10
Prohlížení skel pod fluorescenčním mikroskopem. Hotová skla lze
skladovat při 2-8°C v temnu až po dobu 3 dnů, aniž by došlo
k signifikantní ztrátě fluorescence.
Autoprotilátky proti steroidním buňkám reagují s cytoplazmatickými antigeny
buněk produkujících steroidy: Leydigových buněk varlat, thekálních buněk
vaječníků, stejně jako s antigeny buněk placenty a kůry nadledvinek. Tyto
protilátky třídy IgG se vyskytují u pacientů s Addisonovou chorobou a
u některých pacientů se selháním vaječníků nebo varlat a/nebo ve spojení
s hypoparatyreózou (1-3).
3
PRINCIP
Tato substrátová skla jsou využívána při metodě nepřímé imunofluorescence, při
níž jsou pacientské vzorky a příslušné kontrolní vzorky inkubovány s tkáňovými
řezy. Nenavázané protilátky se odmyjí a potom jsou aplikovány příslušné
konjugáty značené fluoresceinem. Nenavázaný konjugát se odmyje stejně jako
v předešlém kroku. Substrátová skla se vyhodnocují pod fluorescenčním
mikroskopem, pozitivní vzorky poskytují jablkově zelenou fluorescenci, která
odpovídá těm oblastem řezu, kde došlo k navázání autoprotilátky (4).
4
REAGENCIE
Tkáňové řezy opičích varlat na pětijamkových sklech jednotlivě balených
v alobalovém sáčku s vysoušedlem.
5
UPOZORNĚNÍ
Pro testování všech potenciálně infekčních vzorků tímto výrobkem je nutné
zavést správné metody používání a likvidace materiálu. Tyto postupy mohou
provádět pouze pracovníci, kteří byli v těchto metodách odpovídajícím způsobem
proškoleni.
6
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
Neotevřená skla je nutné skladovat při teplotě 2-8°C a lze je používat až do
uvedeného data exspirace. NEZAMRAZUJTE. Jakmile jsou skla vyjmuta
z alobalového sáčku, je nutné je okamžitě použít.
7
ODBĚRY VZORKŮ
Vzorky krve je třeba získat odběrem ze žíly, krev nechat přirozeně zkoagulovat
a sérum oddělit co nejdříve, aby nedošlo k hemolýze. Sérum lze skladovat při
2-8°C po dobu až 7 dnů před testem (7), nebo pro účely delšího skladování je
séra třeba rozplnit po malých množstvích a skladovat při teplotě –20°C nebo
nižší. NIKDY nezamrazujte a nerozmrazujte séra více než jedenkrát. Vyhněte se
použití lipemických, hemolytických nebo mikrobiálně kontaminovaných sér
vzhledem k tomu, že může dojít ke snížení titru nebo výskytu nejasných obrazů
imunofluorescentního barvení.
8
PROVEDENÍ TESTU
8.1
Dodávané materiály
8.1.1
8.1.2
1 x Monkey testis slide – (5-well) (opičí varlata – 5-jamkové sklo).
1 x návod k použití.
Insert code: HIN043.Cz, Version: 1st April 2007, Page 1 of 2
9
9.1
VÝSLEDKY
Kontrola jakosti
Vzorek séra obsahující autoprotilátky proti steroidním buňkám musí vykazovat
zářivé jablkově zelené fluorescentní barvení Leydigových buněk mezi
semenotvornými kanálky varlat.
Negativní kontrola musí vykazovat matně zelené zabarvení všech tkání bez
rozeznatelné fluorescence.
Pokud kontrolní vzorky neposkytují výše popsané obrazy, test je neplatný a je
nutné ho zopakovat.
9.2
Interpretace výsledků
Na barevných fotografiích v odkazech (5 a 6) si prohlédněte příklady těchto
vzorů. Výsledky se vyhodnocují jako pozitivní nebo jako negativní.
Poznámka: Každá laboratoř si musí stanovit mez, od které jsou pozitivní
výsledky z klinického hlediska významné.
10
OMEZENÍ POSTUPU
10.1
Citlivost stanovení bude ovlivněna zdrojem světla, filtry a optikou
různých typů fluorescenčních mikroskopů. Na funkci mikroskopu má
velký vliv správná údržba, zejména vycentrování rtuťové výbojky
a výměna výbojky po doporučené době.
10.2
Endotelové buňky kapilár ve varlatech obsahují substance krevních
skupin a mohou být barveny protilátkami proti antigenům krevních
skupin anti-A a anti-B. Toto barvení může být zaměňováno
s barvením Leydigových buněk (6).
10.3
Vhodnost používání činidel pro IFA od dalších výrobců nebyla
stanovena, ale používání s těmito reagenciemi nemusí být nutně
vyloučeno.
10.4
Tento test sám o sobě nemůže sloužit ke stanovení diagnózy. Je
třeba vzít v úvahu všechny další faktory včetně anamnézy pacienta a
výsledků dalších sérologických nebo bioptických testů.
11
LITERATURA
1.
Sotsiou F. et al (1980). Immunofluorescence studies on
autoantibodies to steroid-producing cells and to germline cells in
endocrine disease and infertility. Clin. Exp. Immunol. 39, 97-111.
2.
Elder M. et al (1981). Gonadal autoantibodies in patients with
hypogonadism and/or Addison's disease. J. Clin. Endocrinol. Metab.
52, 1137-1142.
3.
Ahonen P. et al (1987). Adrenal and steroidal cell antibodies in
patients with autoimmune polyglandular disease type I and risk of
adrenocortical and ovarian failure. J. Clin. Endocrinol. Metab. 64,
494-500.
4.
Weller T. H. & Coons A. H. (1954). Fluorescent antibody studies with
agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
5.
Bradwell A. R. et al (1997). Atlas of autoantibody patterns on tissues.
Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham UK.
6.
Bradwell A. R. et al (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns.
Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham UK.
7.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed.
A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
12
12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6
12.7
12.8
12.9
12.10
12.11
12.12
SOUHRN PROVEDENÍ TESTU
Vytemperujte montovací médium na laboratorní teplotu.
Nařeďte PBS destilovanou vodou.
Nařeďte pacientská séra 1/5 pomocí PBS.
Vytemperujte substrátová skla na laboratorní teplotu (18-28°C).
Naneste 50-100µL pozitivních a negativních kontrolních vzorků
a naředěných pacientských vzorků do příslušných jamek.
Inkubujte ve vlhké komůrce po dobu 30 minut.
Promývejte v PBS po dobu 5-10 minut.
Okolí jamek osušte a ihned nanášejte do každé jamky po kapce
konjugátu.
Inkubujte stejným způsobem jako v bodě 12.6.
Promývejte stejným způsobem jako v bodě 12.7.
Montujte.
Skla prohlížejte pod fluorescenčním mikroskopem.
Insert code: HIN043.Cz, Version: 1st April 2007, Page 2 of 2